The work was funded by the Fund for Medical Research and Education, Wayne State University, Detroit, MI.

Cultura 1. celular <ol><li> Semente 3x10 5 células HUVEC em 10 ml de meio de crescimento completo 10 em um frasco de 75 cm. </li><li> Incubar as células a 37 ° C em 5% de CO 2 a 70-80% de confluência. </li></ol> 2. ensaio de formação de túbulos <ol><li> Descongelar ou o crescimento da matriz extracelular reduzida-fator (TFG) ou matriz extracelular normal, durante a noite em gelo a 4 ° C. Nota: Por uma questão de brevidade &#39;matriz extracelular&#39; passarão a ser usado para fazer referência tanto TFG e matriz extracelular normal. O processo para prepará-los é idêntico. </li><li> Mantenha a placas de cultura de 96 poços sobre gelo, e adicionar 50 ul de matriz extracelular refrigerada por poço usando pontas pré-arrefecida. Prepare triplicado de 5 poços contendo apenas a matriz extracelular normal. Prepare outra triplicado de 5 poços contendo apenas TFG matriz extracelular. </li><li> Incubar a placa de 96 poços a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Lava-se a HUVECsuma vez com uma solução tamponada com fosfato sem cálcio e magnésio (PBS), e adicionar 1 ml de 0,05% de tripsina-EDTA. Incubar a placa a 37 ° C durante 1-5 minutos, verificando as células a cada hora até que a maioria das células arredondar para cima. Desalojar as células tocando o frasco uma vez. <ol><li> Adicionar 5 ml de meio basal (ie, meio de crescimento de células endoteliais sem nada (por exemplo, suplementos) adicionado) com 1% de soro fetal bovino (FBS). Recolher as células no frasco através de pipetagem e transferir para um tubo de 15 ml. Centrifugar as células a 200 xg durante 5 min e desprezar o sobrenadante. </li><li> Re-suspender com 2 ml de meio basal, contar as células utilizando um hemocitómetro, e ajustar a concentração de células a 2-3 x 10 5 culas / ml. </li></ol></li><li> Preparação de 100 ul da concentração de inibidor 10x CXCR2 SB225002 seguintes em meio basal: 11 uM, 5,6 uM, 1,1 uM, 0,56 uM e 0 uM (controlo). </li><li> Pipetar 300 ul da suspensão de HUVEC em cada 5 micrtubos ocentrifuge. Adicionar 33 ul de as concentrações de inibidor (11 uM, 5,6 uM, 1,1 uM, 0,56 uM e 0 pM) em um tubo de cada uma contendo a HUVEC, e vortex. </li><li> Pipetar 50 ul de cada uma das suspensões celulares (1-1,5 x 10 4 células) a poços individuais de matriz extracelular. Placa cada suspensão em triplicado e incubar durante 4-16 hr a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Após 4-16 horas, tome 4 imagens dos tubos formados por poço usando uma câmera microscópio invertido 11 (aumento original x 100). </li></ol> 3. Tubule Ensaio Disruption <ol><li> Preparar a matriz extracelular e as placas de acordo com as mesmas especificações, como a formação do tubo de ensaio (os passos 2.1 a 2.3). </li><li> Prepare suspensão de HUVEC como descrito nos Passos 2.4- 2.4.2 Formação do tubo de ensaio e alíquota numa placa de 96 poços contendo a matriz extracelular, a 50 uL por poço. Nota: Placa suficientes poços sO que há 3 poços por tratamento de droga. </li><li> Cultivar células em matriz extracelular durante 4 h a 37 ° C, 5% de CO 2. Tire fotos antes do início do tratamento medicamentoso. </li><li> Prepare concentrações 2x da SB225002 inibidor CXCR2 conforme descrito no Passo 2.5 do ensaio de formação do tubo, e adicionar 50 uL de cada concentração por poço da placa de 96 poços contendo a HUVEC. Placa cada concentração em triplicado. </li><li> Incubar a placa durante mais 2-12 horas a 37 ° C, 5% de CO 2. Tomar 4 imagens dos tubos formados em cada poço usando um microscópio invertido câmara (ampliação original x 100) 11. </li></ol> 4. Dados Quantificação <ol><li> Avaliar a formação de tubo capturado nas imagens, medindo o comprimento total do tubo de tubos em quatro campos aleatórios utilizando o software da câmara microscópio. </li><li> Abra a imagem no software da câmera microscópio, e clique em &quot;Anotações e Medições9 ;. Na seção &#39;tamanho&#39;, selecione a ferramenta &quot;linha simples&quot;. Clique na imagem, em seguida, desenhar uma linha ao longo do comprimento do tubo, em seguida, clique direito. Nota: O software calcula automaticamente o comprimento da linha em pixels e colocar os dados em um arquivo. </li><li> Repita o procedimento para todas as linhas de metro na imagem, selecionando a ferramenta &quot;linha simples&quot;. Clique na imagem, em seguida, desenhar uma linha ao longo do comprimento do tubo, em seguida, clique direito. Nota: O software gravar o comprimento de cada linha e exibir os dados no ecrã. </li><li> Depois de medir cada tubo na foto, clique em &quot;Export&quot;, em seguida, escolheu &#39;Comprimento de planilha&#39;. Nota: Os dados de comprimento serão exportados para uma planilha. </li><li> Adicione todos os comprimentos de tubo a partir da folha de cálculo para obter o comprimento total do tubo. Calcular e registrar o comprimento médio dos tubos. Nota: Quatro repetições são recomendados com média e desvio padrão determinado. </li></ol> 5. recuperação das células da Matriz Extracelular Cultura <ol><li> Cultura e realizar um ensaio de formação de tubo (ver secção 2) numa escala maior como uma placa de 96 poços não irá produzir a contagem de células suficiente. Para placas de 12 poços, 500 ul de usar matriz extracelular e 500 ul da suspensão de células HUVEC (5 1,5x10 células). </li><li> Incubar as células durante 4-16 horas de modo a formar tubos. Em seguida, aspirar o meio de cultura celular. Lavar as células com 1 ml de frio 1x PBS sem cálcio e magnésio. </li><li> Adicionar 1 ml de PBS frio-2,5-tampão de EDTA mM de gelo sobre a cultura e manter em gelo durante 10 min. </li><li> Desalojar as células e mistura de matriz extracelular do prato usando uma ponteira 1.000 l com a ponta cortada, e depois transferir para um resfriado tubo de 15 ml, lavar bem com 4 ml de PBS gelado-2.5 ​​EDTA mM e colocar no tubo . </li><li> Colocar os tubos em gelo durante 1-4 horas e inverter o tubo várias vezes até que todo o extracelularmatriz é dissolvido. </li><li> Centrifugar durante 10 minutos a 1620 xg à temperatura de 0 ° C </li><li> Re-suspender as pelotas de células com PBS frio 1 ml para um tubo de 1.ml em gelo. </li><li> Centrifugar novamente durante 5 min a 3000 xg à temperatura de 0 ° C, em seguida, descartar o sobrenadante. </li><li> Armazenar as células em -80 ° C. </li></ol>

<ol>
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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+human+endothelial+cells+for+derived+from+umbililcal+veins.+Identification+by+morphologic+and+immunologic+criteria.">Culture of human endothelial cells for derived from umbililcal veins. Identification by morphologic and immunologic criteria.</a> J Clin Invest. 52 (11), 2745-2756 (1973).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Ao realizar este ensaio, é essencial para manter a matriz extracelular em gelo ou a 4 ° C em todos os momentos, a menos que especificado de outra forma. Se a matriz extracelular é deixada aquecer acima de 4 ° C, ele irá polimerizar, e o ensaio será arruinado. É também importante assegurar que qualquer coisa que vem em contacto (por exemplo, pontas de pipeta, a placa), com a matriz extracelular é pré-arrefecida para a razão acima mencionada. O número de células semeadas em cada poço é crítica, muito poucas células não vai dar a teia esperado na amostra de controlo, muitas células irá formar grandes aglomerados de células ou uma monocamada e o ensaio não será válido. Outro factor importante para o sucesso deste ensaio é o número de passagens de células da HUVEC. O número de passagens deve ser sempre menor do que dez, caso contrário, a formação do tubo robusto pode não ocorrer. Além disso, deve-se assegurar que o meio de cultura celular a ser usado não expirou, ou as células não será viável. alternattivamente, pode-se alíquota do meio e dos seus componentes e armazená-las a -20 ° C para preservar, por um período de tempo após a data de validade. É claro, é ainda preferível utilizar a forma anterior à data de expiração Como todos os procedimentos, existem algumas desvantagens para a realização do ensaio de formao de tubo endotelial celular. Um problema importante é que, porque existem diferentes tipos de células endoteliais e matrizes de suporte, os resultados do ensaio podem variar muito dependendo de qual é utilizado o tipo de célula e matriz. As células endoteliais usadas (HUVECs, HAECs ou HMVECs) são células primárias, que são dispendiosos e têm de obter a variabilidade em relação a células imortalizadas. As células primárias têm passagens limitadas para utilização, e, por conseguinte, não são adequados para as experiências de angiogénese de longa duração 14. Para dados fiáveis, deve-se sempre usar os mesmos tipos para o ensaio. Tal como com outros ensaios in vitro, os resultados de um ensaio de formação de tubo deve ser confirmado in vivo, porque os resultados das condições controladas e artificiais de cultura de tecidos de duas dimensões não podem sempre ser reflectida na Biosystem complexo de um organismo vivo. É também importante ter em mente que este tipo de ensaio só pode ser utilizado para demonstrar a formação de tubos de células endoteliais, e não deve ser usada para testar outros, não endotelial, células tubo de formação. Este ensaio é um método bastante simples e rápido para quantificar o potencial angiogénico de um composto. Também constitui uma plataforma para outras experiências, como por si só, não fornecem informação a respeito do mecanismo específico pelo qual o composto atinge efectivamente o processo de formação de vasos. No entanto, a utilização de matrizes extracelulares variadas é um exemplo de como criar ainda uma estrutura para questões de investigação que não é vulgarmente utilizado. Existem abordagens para estudar os mecanismos de bio-químicas específicas do composto, incluindo os inibidores específicos de componentes que têm como alvoa via de angiogénese. Outra abordagem pode ser para extrair ARN a partir das células endoteliais e utilizar RT-PCR (PCR em tempo real) 12 analisar as alterações da expressão do gene que podem causar o comportamento de crescimento observada no ensaio. As aplicações futuras deste método incluem transfectadas HUVECs para criar knock-down ensaios para passos específicos da via da angiogénese. Existe potencial para aplicar esta abordagem para o estudo da via linfangiogénese. Ao alterar os componentes da matriz extracelular, a interacção da matriz e o processo celular de apoio angiogénese no cancro podem ser mais elucidado. A extração de RNA e proteínas a partir de células endoteliais sob estas condições específicas fornecer dados quantificáveis ​​adicional correspondente à imagem latente de dados.

A fim de obter os nutrientes necessários para a sobrevivência, tumores malignos requerem acesso à corrente sanguínea do paciente. Para obter esse acesso, as células tumorais libertar sinais químicos que estimulam o crescimento de novos vasos sanguíneos no tumor, sequestrando assim o processo fisiológico normal conhecido como angiogénese 2. É também através dos vasos sanguíneos criados através de angiogénese que a metástase (isto é, a propagação do cancro para outros órgãos) pode ocorrer. Uma vez que o processo de angiogénese é tão vital para a progressão de uma grande variedade de cancros, é um alvo atractivo na investigação terapia antineoplásica 3. Um dos métodos utilizados para quantificar a angiogénese é medir a capacidade da célula endotelial progenitor para formar tubos quando colocado sobre uma matriz extracelular. Uma vez que a formação desses tubos é um passo crítico na angiogénese precoce, teste de condições ambientais (por exemplo, presença ou ausência de um determinado acordompound) que pode estimular ou inibir a formação do tubo fornece insights sobre os passos específicos que podem ser direcionados para inibir a angiogênese. O ensaio de formação de tubo de células endoteliais é um dos 4 métodos mais amplamente utilizados in vitro que mede a capacidade das células para formar tubos. É um ensaio simples, que requer relativamente poucos componentes e um período de cultura de curto 5. Talvez mais importante, no entanto, é que os dados obtidos a partir deste tipo de ensaio é quantificável. Um exemplo para a utilização do ensaio de formao de tubo consiste em comparar o desenvolvimento de tubos a partir de células endoteliais vasculares cultivadas em matriz extracelular contra o factor de crescimento reduzida (TFG) da matriz extracelular. A matriz extracelular é um material de membrana do tipo cave isolado a partir de células de sarcoma e os seus principais componentes são laminina, colagénio tipo IV, factores de crescimento e proteoglicanos. Alguns compostos têm diferentes efeitos sobre a capacidade da célula para formar tubos quando emum ambiente com fatores de crescimento reduzidas e reduzidas proteoglicanos de sulfato de heparano (HSPGs). HSPGs são um componente da matriz extracelular que é significativamente reduzida em TFG matriz extracelular. Como um exemplo, se a hipótese é a de que os inibidores de angiogénese, tais como SB225002, que bloqueia o receptor CXCR2, têm capacidade consideravelmente mais fraca para interromper a formação do tubo quando HSPGs são abundantes, em seguida, uma comparação entre a actividade de formação do tubo na matriz extracelular e a TFG matriz extracelular é importante em explorar a possibilidade de inibição da angiogênese através do controle de HSPGs. Outros ensaios que são vulgarmente utilizados para determinar os efeitos dos compostos sobre a angiogénese são métodos in vivo. Exemplos notáveis ​​disto são o pinto membrana corioalantï¿½ca (CAM) Ensaio 6 usando ovos de galinha, eo in vivo Matrigel ligar ensaio de angiogénese 7 utilizando camundongos. Enquanto os métodos in vivo medir a angiogénese em três dimensões e são mais representativas do corpo humano em comparação com o ensaio de formação in vitro de tubo, eles sofrem o defeito de que requer muito mais tempo e é consideravelmente mais difícil de executar. Tanto o ensaio de CAM e o ensaio de tampão extracelular demorar pelo menos uma semana 8 para fazer, enquanto que na comparação, o ensaio de formação de tubo pode ser feito de um único dia e que não requer o uso de animais. É importante notar que as células endoteliais usadas neste relatório são células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC). Estas células desempenham um papel chave em broto vascular e o crescimento de vasos sanguíneos, e são suficientemente semelhante às células endoteliais em cancros a ser utilizado para avaliar a actividade anti-angiogénese, tanto in vitro e in vivo 9. podem também ser utilizadas outras células, tais como células endoteliais microvasculares primárias. É também importante notar que, além de ter baixaníveis de HSPGs, a matriz extracelular de GFR também tem níveis reduzidos de muitos componentes, quando comparado com a matriz extracelular normal. Isto inclui, mas não está limitado a: EGF, IGF-1, PDGF e TGF-beta. Esses realização de experimentos que estudam o significado destes compostos em relação à angiogênese pode estar interessado em usar GFR matriz extracelular.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>EGM-2 complete growth medium (EGM-2 bullet kit CC-3162 )</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9525043</td>
			<td>HUVEC complete growth medium: EGM-2 base medium mixed with BBE (Bovine Brain Extract), hEGF (Human Epidermal Growth Factor), Hydrocortisone, GA-1000 (Gentamicin, Amphotericin-B), 2% FBS (Fetal Bovine Serum), VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), hFGF-&#946; (Human Fibroblast Growth Factor Beta), R3-IGF-1 (Long R Insulin-like Growth Factor One), Ascorbic Acid, and Heparin.&#160; Aliquot the medium and its components and store them at -20 oC, warm&#160; in 37 oC&#160; before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATRIGEL MATRIX 10ML Growth Factor Reduced (GFR); 10mL; LDEV-Free</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>CB-40230&#160;</td>
			<td>Growth Factor Reduced (GFR) extracellular matrix, keep in&#160;&#160; -20 oC , warm in 4 &#176;C&#160; before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATRIGEL MATRIX 10ML ; 10mL; LDEV-Free</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>CB-40234&#160;</td>
			<td>extracellular matrix, keep in&#160;&#160; -20 oC, warm in 4 &#176;C&#160; before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB225002</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>559405</td>
			<td>CXCR2 inhibitor, keep in&#160;&#160; -20 oC, warm in room temperature&#160; before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)&#160;</td>
			<td>ScienCell Research Laboratories&#160;</td>
			<td>8000</td>
			<td>culture it according reference&#160; 10.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.05%-EDTA phenol red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>keep in 4 oC, warm&#160; in 37 oC&#160; before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon ECLIPSE Ti</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Inverted Research Microscope.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR 4.20.02 64 bit</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Inverted Research Microscope software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graph-pad Prism 5</td>
			<td>GraphPad Software, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>scientific 2D graphing and&#160;statistics software, to calculate IC50.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

strategic endothelial cell tube formation assay: comparing extracellular matrix and growth factor reduced extracellular matrix

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by hijacking the process of angiogenesis, in which new blood vessels are formed from existing blood vessels. The CXCR2 (chemokine (C-X-C motif) receptor 2) receptor is a transmembrane G-protein-linked molecule found in many cells that is closely associated with angiogenesis1. Specific blockade of the CXCR2 receptor inhibits angiogenesis, as measured by several assays such as the endothelial tube formation assay. The tube formation assay is useful for studying angiogenesis because it is an excellent method of studying the effects that any given compound or environmental condition may have on angiogenesis. It is a simple and quick in vitro assay that generates quantifiable data and requires relatively few components. Unlike in vivo assays, it does not require animals and can be carried out in less than two days. This protocol describes a variation of the extracellular matrix supporting endothelial tube formation assay, which tests the CXCR2 receptor.

formação do tubo considerável, saudável endotelial pode ser facilmente contrastadas para a formação do tubo inibida nas imagens de microscopia. Formação do tubo saudável aparece como uma teia organizada das estruturas do tipo capilar (Figura 1). Em comparação, a formação do tubo inibida manifesta-se como células dispersas (Figura 2). Tubo de ensaio de formao de dados é quantificada medindo o comprimento total do tubo de tubos capilares (Tabela 1). Além disso o comprimento total do tubo, o comprimento médio do tubo, o número total de tubos, ou o número total de pontos de ramificação pode ser medido. formação do tubo estruturado produz uma maior comprimento do tubo de líquido do que o crescimento do tubo inibido dispersos. Na Figura 3, uma curva de resposta à dose permite o cálculo da IC 50 sob as condições experimentais de células HUVEC na matriz extracelular de GFR e um inibidor de CXCR2 SB225002. Figura 1. endotelial formação t Ube na matriz extracelular e crescimento (GFR) matriz extracelular reduzida-fator. Duas imagens mostram a formação do tubo de sucesso na matriz extracelular (A) e GFR matriz extracelular (B). A rede interligada de tubos mostra claramente que o crescimento dos tubos é saudável nestas células HUVEC. Barra de escala = 10 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54074/54074fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54074/54074fig2.jpg" /> Figura 2. A inibição da formação do tubo em extracelular e crescimento reduzido fatores (TFG) da matriz extracelular por um SB225002 inibidor CXCR2 (5,6 mM). Duas imagens mostram tuboformação que foi inibida por um inibidor de SB225002 CXCR2 (5,6 ^ M) na matriz extracelular (A) e GFR matriz extracelular (B). Os aglomerados isolados de células HUVEC visto nesta imagem mostra que as células não foram capazes de formar os tubos necessários para conectar uns aos outros. Barra de escala = 10 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54074/54074fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54074/54074fig3.jpg" /> Figura 3. curva de resposta à dose sobre o crescimento (GFR) matriz extracelular reduzida do factor. O eixo dos X mostra o comprimento do tubo e o eixo Y mostra a concentração de um inibidor de CXCR2. A curva de resposta à dose que mostra a resposta de HUVEC ao inibidor em GFR CXCR2 matriz extracelular é dependente da dose. A (inibidor máximo metade IC50Y concentração) foi calculada usando o software 13 e pode ser comparado com uma curva de resposta à dose para a matriz extracelular, por exemplo. IC50 é a concentração do inibidor que reduz a resposta a 50%. As barras de erro representam o desvio padrão. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Fator de Crescimento reduzida (TFG) da matriz extracelular e inibidor (4 repetições cada) </td><td> Total de tubo comprimento médio (pixels) (1 pixel = 0,34 mm) </td><td> Desvio padrão </td><td> P Valor </td></tr><tr><td> controle de matriz extracelular GFR </td><td> 2447 </td><td> 168,174 </td><td></td></tr><tr><td> GFR extracelular SB225002 matriz + 0,56 mM </td><td> 1422,5 </td><td> 185.4218 </td><td> 0.000395 </td></tr><tr><td>TFG extracelular SB225002 matriz + 1,1 uM </td><td> 1004 </td><td> 126.1784 </td><td> 2,14 x 10 -5 </td></tr><tr><td> TFG extracelular SB225002 matriz + 5,6 uM </td><td> 519,25 </td><td> 129.6368 </td><td> 4,19 x 10 -6 </td></tr><tr><td> TFG extracelular SB225002 matriz + 11 uM </td><td> 393.75 </td><td> 212.6857 </td><td> 1,21 x 10 -5 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Quantificação comprimentos totais do tubo sobre o crescimento (GFR) matriz extracelular reduzida-fator sob várias condições. Uma porção de uma tabela usando comprimentos totais do tubo gravadas em amostras crescidas na matriz extracelular de GFR com concentrações variáveis ​​de inibidor de CXCR2. Os dados indicam que o inibidor de CXCR2 inibe a formação do tubo. Incluem-se os valores associados, tais como média de quatro repetições, desvio padrão e valor P. Medido em pixels para mostrarOs dados que são exportados. CI 50 podem ser calculados usando software estatístico 13. (1 pixel = 0,34 uM)

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Strategic Endothelial Cell Tube Formation Assay: Comparing Extracellular Matrix and Growth Factor Reduced Extracellular Matrix

This manuscript describes a tube formation assay to quantify the effects of a given compound or condition on angiogenesis by using endothelial cell tube formation in a controlled environment.

Endotelial estratégica Assay formação de células do tubo: Comparando Matriz Extracelular e Fator de Crescimento Reduzido Matriz Extracelular

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by ...

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JoVE Journal

Medicine

13.3K visualizações.  Wayne State University School of Medicine. This manuscript describes a tube formation assay to quantify the effects of a given compound or condition on angiogenesis by using endothelial cell tube formation in a controlled environment.

Vídeo: Strategic Endothelial Cell Tube Formation Assay: Comparing Extracellular Matrix and Growth Factor Reduced Extracellular Matrix

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events in cardiac myocytes such as proliferation and apoptosis require an accurate identification of cardiac myocyte nuclei to analyze cellular renewal in homeostasis and in pathological conditions2. Here, we provide a method to isolate cardiomyocyte nuclei from post mortem tissue by density sedimentation and immunolabeling with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) and subsequent flow cytometry sorting. This strategy allows a high throughput analysis and isolation with the advantage of working equally well on fresh tissue and frozen archival material. This makes it possible to study material already collected in biobanks. This technique is applicable and tested in a wide range of species and suitable for multiple downstream applications such as carbon-14 dating3, cell-cycle analysis4, visualization of thymidine analogues (e.g. BrdU and IdU)4, transcriptome and epigenetic analysis.

Cardiac nuclei are isolated via density sedimentation and immunolabeled with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) to identify and sort cardiomyocyte nuclei by flow cytometry.

Isolamento dos núcleos dos cardiomiócitos a partir de Post-mortem de tecidos

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Medicina

Matrix-assisted Autologous Chondrocyte Transplantation for Remodeling and Repair of Chondral Defects in a Rabbit Model

Articular cartilage defects are considered a major health problem because articular cartilage has a limited capacity for self-regeneration 1. Untreated cartilage lesions lead to ongoing pain, negatively affect the quality of life and predispose for osteoarthritis. During the last decades, several surgical techniques have been developed to treat such lesions. However, until now it was not possible to achieve a full repair in terms of covering the defect with hyaline articular cartilage or of providing satisfactory long-term recovery 2-4. Therefore, articular cartilage injuries remain a prime target for regenerative techniques such as Tissue Engineering. In contrast to other surgical techniques, which often lead to the formation of fibrous or fibrocartilaginous tissue, Tissue Engineering aims at fully restoring the complex structure and properties of the original articular cartilage by using the chondrogenic potential of transplanted cells. Recent developments opened up promising possibilities for regenerative cartilage therapies.
The first cell based approach for the treatment of full-thickness cartilage or osteochondral lesions was performed in 1994 by Lars Peterson and Mats Brittberg who pioneered clinical autologous chondrocyte implantation (ACI) 5. Today, the technique is clinically well-established for the treatment of large hyaline cartilage defects of the knee, maintaining good clinical results even 10 to 20 years after implantation 6. In recent years, the implantation of autologous chondrocytes underwent a rapid progression. The use of an artificial three-dimensional collagen-matrix on which cells are subsequently replanted became more and more popular 7-9.
MACT comprises of two surgical procedures: First, in order to collect chondrocytes, a cartilage biopsy needs to be performed from a non weight-bearing cartilage area of the knee joint. Then, chondrocytes are being extracted, purified and expanded to a sufficient cell number in vitro. Chondrocytes are then seeded onto a three-dimensional matrix and can subsequently be re-implanted. When preparing a tissue-engineered implant, proliferation rate and differentiation capacity are crucial for a successful tissue regeneration 10. The use of a three-dimensional matrix as a cell carrier is thought to support these cellular characteristics 11.
The following protocol will summarize and demonstrate a technique for the isolation of chondrocytes from cartilage biopsies, their proliferation in vitro and their seeding onto a 3D-matrix (Chondro-Gide, Geistlich Biomaterials, Wollhusen, Switzerland). Finally, the implantation of the cell-matrix-constructs into artificially created chondral defects of a rabbit's knee joint will be described. This technique can be used as an experimental setting for further experiments of cartilage repair.

An experimental technique for the treatment of chondral defects in the rabbit's knee joint is described. The implantation of autologous chondrocytes seeded on a matrix is a well-accepted method for the remodeling and repair of articular cartilage lesions providing satisfying long-term results. Matrix-assisted autologous chondrocyte transplantation (MACT) offers a standardized and clinically established implantation method.

Matrix-assistida Transplante autólogo de condrócitos para remodelação e reparação de lesões condrais em um modelo de coelho

Articular cartilage defects are considered a major health problem because articular cartilage has a limited capacity for self-regeneration 1. Untreated ...

Focus Formation: A Cell-based Assay to Determine the Oncogenic Potential of a Gene

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent growth potential, and the ability to form tumors in experimental animals1. In NIH 3T3 cells, the Ras signal transduction pathway is known to trigger many of these events, what is known as Ras transformation. The introduction of an overexpressed gene in NIH 3T3 cells may promote morphological transformation and loss of contact inhibition, which can help determine the oncogenic potential of that gene of interest. An assay that provides a straightforward method to assess one aspect of the transforming potential of an oncogene is the Focus Formation Assay (FFA)2. When NIH 3T3 cells divide normally in culture, they do so until they reach a confluent monolayer. However, in the presence of an overexpressed oncogene, these cells can begin to grow in dense, multilayered foci1 that can be visualized and quantified by crystal violet or Hema 3 staining. In this article we describe the FFA protocol with retroviral transduction of the gene of interest into NIH 3T3 cells, and how to quantify the number of foci through staining. Retroviral transduction offers a more efficient method of gene delivery than transfection, and the use of an ecotropic murine retrovirus provides a biosafety control when working with potential human oncogenes.

The Focus Formation Assay provides a straightforward method to assess the transforming potential of a candidate oncogene.

Concentre Formação: Um Ensaio Celular para Determinar o Potencial oncogénica de um Gene

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent ...

Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from cirrhosis to cardiovascular diseases). There is no effective treatment and the in vitro tools available do not mimic the in vivo situation rendering the progress of the out of control wound healing process still enigmatic.
To date, 2D and 3D cultures of fibroblasts derived from DD patients are the main experimental models available. Primary cell cultures have many limitations; the fibroblasts derived from DD are altered by the culture conditions, lack cellular context and interactions, which are crucial for the development of fibrosis and weakly represent the derived tissue. Real-time PCR analysis of fibroblasts derived from control and DD samples show that little difference is detectable. 3D cultures of fibroblasts include addition of extracellular matrix that alters the native conditions of these cells. 
As a way to characterize the fibrotic, proliferative properties of these resection specimens we have developed a 3D culture system, using intact human resections of the nodule part of the cord. The system is based on transwell plates with an attached nitrocellulose membrane that allows contact of the tissue with the medium but not with the plastic, thus, preventing the alteration of the tissue. No collagen gel or other extracellular matrix protein substrate is required. The tissue resection specimens maintain their viability and proliferative properties for 7 days. This is the first &#8220;organ&#8221; culture system that allows human resection specimens from DD patients to be grown ex vivo and functionally tested, recapitulating the in vivo situation.

Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Dupuytren&#8217;s disease (DD) is a fibroproliferative disease of the palm of the hand. Here, we present a protocol to culture resection specimens from DD in a three-dimensional (3D) culture system. Such short-term culture system allows preservation of the 3D structure and molecular properties of the fibrotic tissue.

Dupuytren Humano do<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura para o Estudo da Miofibroblastos e Matriz Extracelular Interações

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from ...

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that self-renew while giving rise to more differentiated progeny. Understanding and targeting these cancer stem cells in breast cancer, which may possess enhanced chemo- and radio-resistance compared to the non-stem tumor bulk, has become an important research area. Markers including CD44, CD24, and ALDH activity can be assessed using fluorescence activated cell sorting (FACS) to prospectively isolate cells that display enhanced tumorigenicity when implanted into immunocompromised mice: the mammosphere assay has also become widely used for its ability to retrospectively identify sphere-forming cells that develop from single stem cell-like clones. Here we outline approaches for the appropriate culturing of mammospheres from cell lines or primary patient samples, their passaging, and calculations to estimate sphere forming efficiency (SFE). First we discuss key considerations and pitfalls in the appropriate planning and interpretation of mammosphere experiments.

Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.

Formação Mammosphere Ensaio de cancro da mama humano tecidos e linhas celulares

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...

Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea

In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest signaling pathways shown to be associated with ciliary function was the non-canonical Wnt signaling pathway, also referred to as planar cell polarity (PCP) signaling. One of the best places in which to study the effects of planar cell polarity (PCP) signaling during vertebrate development is the mammalian cochlea. PCP signaling disruption in the mouse cochlea disrupts cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, all of which are affected by cilia dysfunction. The goal of this protocol is to describe the analysis of PCP signaling in the developing mammalian cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy. Defects in convergence and extension are manifested as a shortening of the cochlear duct and/or changes in cellular patterning, which can be quantified following dissection from developing mouse mutants. Changes in stereociliary bundle orientation and kinocilia length or positioning can be observed and quantitated using either immunofluorescence or scanning electron microscopy (SEM). A deeper insight into the role of ciliary proteins in cellular signaling pathways and other biological phenomena is crucial for our understanding of cellular and developmental biology, as well as for the development of targeted treatment strategies.

Primary cilia influence various signaling pathways. The mammalian cochlea is ideal for examining planar cell polarity (PCP) signaling. Cilia dysfunction affects cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, readouts of PCP. Our goal is to analyze PCP signaling in mouse cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy.

Avaliação da Planar-Cell-Polaridade fenótipos em Ciliopathy rato mutante cóclea

In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest ...

Three-Dimensional Culture Assay to Explore Cancer Cell Invasiveness and Satellite Tumor Formation

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells often generates unwanted artifacts. Therefore, cell culture in a three-dimensional (3D) environment, often using extracellular matrix components, emerged as an interesting alternative due to its close similarity to the native in vivo tissue or organ. We developed a 3D cell culture system using two compartments, namely (i) a central compartment containing cancer cells embedded in a collagen gel acting as a pseudo-primary macrospherical tumor and (ii) a peripheral cell-free compartment made of a fibrin gel, i.e. an extracellular matrix component different from that used in the center, in which cancer cells can migrate (invasion front) and/or form microspherical tumors representing secondary or satellite tumors. The formation of satellite tumors in the peripheral compartment is remarkably correlated to the known aggressiveness or metastatic origin of the native tumor cells, which makes this 3D culture system unique. This cell culture approach might be considered to assess cancer cell invasiveness and motility, cell-extracellular matrix interactions and as a method to evaluate anti-cancer drug properties.

Cancer cells are embedded in a collagen gel and then sandwiched in an acellular fibrin gel to generate a 3D culture system in which the invasiveness and formation of satellite tumors may be monitored.

Tridimensional Cultura Ensaio para Explorar Cancer Invasividade celular e formação de tumor Satélite

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells ...

Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation

Von Willebrand factor (VWF) is a multimeric glycoprotein coagulation factor that mediates platelet adhesion and aggregation at sites of endothelial damage and that carries factor VIII in the circulation. VWF is synthesized by endothelial cells and is either released constitutively into the plasma or is stored in specialized organelles, called Weibel-Palade bodies (WPBs), for on-demand release in response to hemostatic challenge. Procoagulant and proinflammatory stimuli can rapidly induce WPB exocytosis and VWF release. The majority of VWF released by endothelial cells circulates in the plasma; however, a proportion of VWF is anchored to the endothelial cell surface. Under conditions of physiological shear, endothelial-anchored VWF can bind to platelets, forming a VWF-platelet string that may represent the nidus of thrombus formation. A flow chamber system can be used to visually observe the release of VWF from endothelial cells and the subsequent platelet capture in a manner that is reproducible and relevant to the pathophysiology of VWF-mediated thrombus formation. Using this methodology, endothelial cells are cultured in a flow chamber and are subsequently stimulated with secretagogues to induce WPB exocytosis. Washed platelets are then perfused over the activated endothelium. The platelets are activated and subsequently bind to elongated VWF strings in the direction of fluid flow. Using extracellular histones as a procoagulant and proinflammatory stimulus, we observed increased VWF-platelet string formation on histone-treated endothelial cells compared to untreated endothelial cells. This protocol describes a quantitative, visual, and real-time assessment of the activation of VWF-platelet interactions in models of thrombosis and hemostasis.

In this paper, we describe a method to assess endothelial von Willebrand factor release and the subsequent platelet capture under fluid shear stress in response to inflammatory stimuli using an in vitro flow chamber system.

Investigando a von Willebrand Factor fisiopatologia usando um modelo de câmara de fluxo de von Willebrand Factor-plaquetas String formação

Von Willebrand factor (VWF) is a multimeric glycoprotein coagulation factor that mediates platelet adhesion and aggregation at sites of endothelial damage ...

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Mitochondria are essential organelles for the cellular metabolism and survival. A variety of key events take place in mitochondria, such as cellular respiration, oxidative metabolism, signal transduction, and apoptosis. Consequently, mitochondrial dysfunction is reported to play an important role in the antifungal drug tolerance and virulence of pathogenic fungi. Recent data have also led to the recognition of the importance of the mitochondria as an important contributor to fungal pathogenesis. Despite the importance of the mitochondria in fungal biology, standardized methods to understand its function are poorly developed. Here, we present a procedure to study the basal oxygen consumption rate (OCR), a measure of mitochondrial respiration, and extracellular acidification rates (ECAR), a measure of glycolytic function in C. albicans strains. The method described herein can be applied to any Candidaspp. strains without the need to purify mitochondria from the intact fungal cells. Furthermore, this protocol can also be customized to screen for inhibitors of mitochondrial function in C. albicans strains.

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Here, we present a stepwise protocol to investigate the mitochondrial respiration and glycolytic function in Candida Albicans using an extra flux analyzer.

Investigação de bio-energética de Candida albicans usando real-time extracelular fluxo análise

Mitochondria are essential organelles for the cellular metabolism and survival. A variety of key events take place in mitochondria, such as cellular ...

Immunofluorescence Labelling of Human and Murine Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Tissue

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They mature in the bone marrow and are released into the peripheral blood, where they circulate for about 6&#8722;8 h; however, in tissue, they can survive for days. By diapedesis through the endothelium, they leave the blood stream, enter tissues, and migrate towards the site of an infection following chemotactic gradients.&#160;Neutrophils can combat invading microorganisms by phagocytosis,&#160;degranulation, and generation of neutrophil extracellular traps (NETs). This protocol will help to detect NETs in paraffin-embedded tissue. NETs are the result of a process called NETosis, which leads to the release of nuclear, granular, and cytoplasmic components either from living (vital NETosis) or dying (suicidal NETosis) neutrophils. In vitro, NETs form cloud-like structures, which occupy a space several times larger than that of the cells from which they descended. The backbone of NETs is chromatin, to which a selection of proteins and peptides originating from granules and cytoplasm are bound. Thereby, a high local concentration of toxic compounds is maintained so that NETs can capture and inactivate a variety of pathogens including bacteria, fungi, viruses, and parasites, while diffusion of the highly active NET components leading to damage in neighboring tissue is limited. Nevertheless, in recent years it has become apparent that NETs, if generated in abundance or cleared insufficiently, do have pathological potential ranging from autoimmune diseases to cancer. Thus, detection of NETs in tissue samples may have diagnostic significance, and the detection of NETs in diseased tissue can influence the treatment of patients. Since paraffin-embedded tissue samples are the standard specimen used for pathological analysis, it was sought to establish a protocol for fluorescent staining of NET components in paraffin-embedded tissue using commercially available antibodies.

Neutrophil extracellular traps (NETs) are three-dimensional structures generated by stimulated neutrophil granulocytes. It has become clear in recent years that NETs are involved in a wide variety of diseases. Detection of NETs in tissue may have diagnostic relevance, so standardized protocols for labelling NET components are required.

Rotulagem de imunofluorescência de armadilhas extracelulares de neutrófilos humanos e murinos em tecido embebido em parafina

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They ...