The work was funded by the Fund for Medical Research and Education, Wayne State University, Detroit, MI.

Cultura 1. cellulare <ol><li> Seme 3x10 5 cellule HUVEC in 10 ml di mezzo di crescita completo 10 in un pallone 75 cm. </li><li> Incubare le cellule a 37 ° C in 5% CO 2 al 70-80% di confluenza. </li></ol> 2. tubulo saggio Formazione <ol><li> Scongelare sia il fattore di crescita ridotta (GFR) matrice extracellulare o matrice extracellulare normale durante la notte sul ghiaccio a 4 ° C. Nota: Per brevità &#39;matrice extracellulare&#39; d&#39;ora in poi essere utilizzato per fare riferimento sia GFR e della matrice extracellulare normale. Il processo per prepararli è identico. </li><li> Mantenere piastre di coltura a 96 pozzetti su ghiaccio, e aggiungere 50 ml di matrice extracellulare refrigerata per pozzetto con punte pre-raffreddato. Preparare triplice copia di 5 pozzetti contenenti solo la matrice extracellulare normale. Preparare un triplice copia di 5 pozzetti contenenti solo GFR matrice extracellulare. </li><li> Incubare la piastra a 96 pozzetti a 37 ° C per 30 min. </li><li> Lavare il HUVECsuna volta con soluzione tamponata con fosfato senza calcio e magnesio (PBS), e aggiungere 1 ml di 0,05% tripsina-EDTA. Incubare il piatto a 37 ° C per 1-5 minuti, controllando le cellule ogni minuto fino a quando la maggior parte delle cellule completano. Sloggiare i cellule toccando il pallone una volta. <ol><li> Aggiungere 5 ml di mezzo basale (vale a dire, endoteliali terreno di coltura cellulare senza nulla (ad esempio, supplementi) aggiunto) con 1% siero fetale bovino (FBS). Raccogliere le cellule nel pallone pipettando e trasferire in una provetta da 15 ml. Centrifugare le cellule a 200 xg per 5 minuti e scartare il surnatante. </li><li> Risospendere con 2 ml di media basale, contare le cellule utilizzando un emocitometro e regolare la concentrazione cellulare a 2-3 x 10 5 cellule / ml. </li></ol></li><li> Preparare 100 ml di 10x seguenti concentrazioni di inibitore CXCR2 SB225002 in terreno di base: 11 micron, 5,6 micron, 1,1 micron, 0,56 micron e 0 micron (controllo). </li><li> Dispensare 300 microlitri della sospensione HUVEC in ogni 5 MICRtubi ocentrifuge. Aggiungere 33 ml di concentrazioni inibitori (11 mM, 5,6 mM, 1,1 mM, 0,56 mM e 0 pM) in una provetta ciascuna contenente la HUVEC, e vortex. </li><li> Pipettare 50 ml di ciascuna delle sospensioni cellulari (1-1,5 x 10 4 cellule) a singoli pozzetti di matrice extracellulare. Piatto ogni sospensione in triplicato e incubare per 4-16 ore a 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Dopo 4-16 ore, prendere 4 immagini dei tubi formati per pozzetto utilizzando una fotocamera microscopio invertito 11 (ingrandimento originale x 100). </li></ol> 3. tubulo Turbativa Assay <ol><li> Preparare la matrice extracellulare e le piastre secondo le stesse specifiche come il tubo di saggio Formazione (passaggi da 2.1 a 2.3). </li><li> Preparare la sospensione HUVEC come descritto nei passaggi 2,4 2.4.2 del tubo saggio Formazione e aliquota in una piastra a 96 pozzetti contenente la matrice extracellulare a 50 ml per pozzetto. Nota: Piatto abbastanza pozzi so che ci sono 3 pozzetti per trattamento farmacologico. </li><li> Crescere le cellule sulla matrice extracellulare per 4 ore a 37 ° C, 5% CO 2. Prendere le immagini prima dell&#39;inizio del trattamento farmacologico. </li><li> Preparare concentrazioni 2x del inibitore SB225002 CXCR2 come descritto al punto 2.5 del saggio tubo Formazione, e aggiungere 50 ml di ciascuna concentrazione per pozzetto della piastra ben 96 contenente il HUVECs. Piastra ogni concentrazione in triplice copia. </li><li> Incubare la piastra per un altro 2-12 ore a 37 ° C, 5% CO 2. Prendere 4 immagini dei tubi formate in ciascun pozzetto utilizzando una fotocamera microscopio invertito (ingrandimento originale × 100) 11. </li></ol> 4. Quantificare dati <ol><li> Valutare formazione del tubo catturati nelle immagini misurando la lunghezza totale del tubo di tubi in quattro campi microscopici casuali utilizzando il software della fotocamera microscopio. </li><li> Aprire l&#39;immagine nel software della fotocamera microscopio, e fare clic su &#39;annotazioni e misure9 ;. Nella sezione &#39;lunghezza&#39;, selezionare lo strumento &#39;semplice linea&#39;. Clicca sull&#39;immagine, quindi tracciare una linea lungo la lunghezza del tubo, quindi fare clic destro. Nota: Il software calcola automaticamente la lunghezza della linea in pixel e mettere i dati in un file. </li><li> Ripetere la procedura per tutte le linee della metropolitana nell&#39;immagine selezionando lo strumento &#39;semplice linea&#39;. Clicca sull&#39;immagine, quindi tracciare una linea lungo la lunghezza del tubo, quindi fare clic destro. Nota: Il software registrare la lunghezza di ogni linea e visualizzare i dati sullo schermo. </li><li> Dopo aver misurato ogni tubo nella foto, fare clic su &#39;Esporta&#39;, poi ha scelto &#39;Lunghezza al foglio di calcolo&#39;. Nota: I dati di lunghezza saranno esportati in un foglio di calcolo. </li><li> Aggiungere tutti le lunghezze dei tubi dal foglio di calcolo per ottenere la lunghezza del tubo totale. Calcolare e registrare la lunghezza media dei tubi. Nota: quattro repliche sono consigliati con media e deviazione standard determinati. </li></ol> 5. Recupero cellule dalla matrice extracellulare Cultura <ol><li> Cultura e eseguire un test di formazione del tubo (vedere la sezione 2) su una scala più ampia, come un piatto ben 96 non produrrà conta delle cellule sufficiente. Per piastre da 12 pozzetti, utilizzare 500 ml di matrice extracellulare e 500 microlitri della sospensione cellulare HUVEC (1,5x10 5 cellule). </li><li> Incubare le cellule per 4-16 ore per formare tubi. Poi, aspirare il mezzo di coltura cellulare. Lavare le cellule con 1 ml di PBS freddo 1x senza calcio e magnesio. </li><li> Aggiungere 1 ml di ghiaccio freddo PBS-2,5 mM EDTA sulla cultura e tenere in ghiaccio per 10 minuti. </li><li> Rimuovere le cellule e la miscela matrice extracellulare dal piatto con una punta della pipetta 1000 ml con punta tagliata, e poi trasferire in una provetta da freddo 15 ml, lavare il bene con 4 ml di ghiaccio freddo PBS-2,5 mM EDTA e posta in un tubo . </li><li> Mettere i tubi in ghiaccio per 1-4 ore e invertire il tubo di un paio di volte fino a quando tutte le extracellularematrice viene disciolto. </li><li> Centrifugare per 10 minuti a 1.620 xg a 0 ° C </li><li> Risospendere il pellet di cellule con 1 ml di PBS freddo ad un tubo 1.ml sul ghiaccio. </li><li> Centrifugare ancora per 5 min a 3000 xga 0 ° C, quindi smaltire il surnatante. </li><li> Conservare le cellule a -80 ° C. </li></ol>

<ol>
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S., Chandrasekhar, K. B., Reddy, N. D., Kulkarni, N. M., Narayanan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphodiesterase+inhibitor,+pentoxifylline+enhances+anticancer+activity+of+histone+deacetylase+inhibitor,+MS-275+in+human+breast+cancer+in+vitro+and+in+vivo.">Phosphodiesterase inhibitor, pentoxifylline enhances anticancer activity of histone deacetylase inhibitor, MS-275 in human breast cancer in vitro and in vivo.</a> Eur J Pharmacol. 764, 508-519 (2015).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper+improves+the+anti-angiogenic+activity+of+disulfiram+through+the+EGFR/src/VEGF+pathway+in+gliomas.">Copper improves the anti-angiogenic activity of disulfiram through the EGFR/src/VEGF pathway in gliomas.</a> Cancer Lett. Aug. , (2015).</li><li>Park, H. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+human+endothelial+cells+for+derived+from+umbililcal+veins.+Identification+by+morphologic+and+immunologic+criteria.">Culture of human endothelial cells for derived from umbililcal veins. Identification by morphologic and immunologic criteria.</a> J Clin Invest. 52 (11), 2745-2756 (1973).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Nell&#39;effettuare questa analisi, è essenziale per mantenere la matrice extracellulare in ghiaccio oa 4 ° C in ogni momento se non diversamente specificato. Se la matrice extracellulare è lasciata riscaldare superiore a 4 ° C, si polimerizza, e il saggio sarà rovinato. E &#39;anche importante assicurare che tutto ciò che entra in contatto (ad esempio, puntali, piatto) con la matrice extracellulare è pre-raffreddata per il motivo suddetto. Il numero di cellule seminate in ogni pozzetto è critico, troppo poche cellule non darà il web previsto nel campione di controllo, troppe cellule si formano grandi gruppi di cellule o un monostrato e il test non saranno valide. Un altro fattore importante per il successo di questo saggio è il numero cellulare di passaggio del HUVECs. Il numero di passaggio deve essere sempre inferiore a dieci, altrimenti robusta formazione del tubo non può verificarsi. Inoltre, si dovrebbe assicurare che il terreno di coltura cellulare in uso non è scaduto, o le cellule non sarà praticabile. Alternativavamente, si può Aliquotare il mezzo ei componenti e conservare a -20 ° C per mantenere per un periodo di tempo dopo la data di scadenza. Naturalmente, è ancora preferibile usare il mezzo prima della data di scadenza Come tutte le procedure, ci sono alcuni svantaggi per lo svolgimento del test formazione del tubo delle cellule endoteliali. Un problema importante è che, perché ci sono diversi tipi di cellule endoteliali e matrici di supporto, i risultati del dosaggio può variare notevolmente a seconda che si utilizza il tipo di cellula e la matrice. Le cellule endoteliali utilizzati (HUVECs, HAECs o HMVECs) sono cellule primarie, sono costosi da ottenere e avere variabilità rispetto alle cellule immortalizzate. Le cellule primarie hanno passaggi limitati per l&#39;uso, e quindi non sono adatti per gli esperimenti angiogenesi lungo termine 14. Per i dati affidabili, si dovrebbe sempre usare gli stessi tipi per il saggio. Come con altri saggi in vitro, i risultati di un test di formazione del tubo deve essere conconfermato in vivo, in quanto risulta dalle condizioni controllate e artificiali di coltura dei tessuti bidimensionali non possono sempre essere riflesse nel complesso biosistema di un organismo vivente. E &#39;anche importante tenere presente che questo tipo di test può essere utilizzato solo per dimostrare endoteliali formazione del tubo cellule, e non dovrebbe essere usato per testare altri, non-endoteliali, cellule tubo formatore. Questo test è un metodo piuttosto semplice e rapido per quantificare il potenziale angiogenico di un composto. Esso costituisce anche una piattaforma per ulteriori esperimenti, come solo, non produce informazioni riguardanti il ​​meccanismo specifico con cui il composto in realtà colpisce il processo di formatura recipiente. Tuttavia, l&#39;uso di varie matrici extracellulari è un esempio di come creare ulteriormente un quadro per questioni di ricerca che non è comunemente utilizzato. Ci sono approcci per studiare i meccanismi bio-chimici specifici del composto, tra cui gli inibitori specifici che colpiscono i componenti diil percorso angiogenesi. Un altro approccio può essere per estrarre l&#39;RNA dalle cellule endoteliali e utilizzando RT-PCR (Real Time PCR) 12 per analizzare alterazioni dell&#39;espressione genica che possono causare il comportamento di crescita osservata nel saggio. Le future applicazioni di questo metodo includono trasfettate HUVECs per creare saggi smontabili per le fasi specifiche del percorso di angiogenesi. Esiste la possibilità di applicare questo approccio per studiare il percorso linfoangiogenesi. Modificando i componenti della matrice extracellulare, l&#39;interazione tra matrice e processo cellulare supporto angiogenesi nel tumore può essere ulteriormente chiarita. L&#39;estrazione di RNA e proteine ​​dalle cellule endoteliali in queste condizioni specifiche forniscono dati quantificabili supplementari corrispondenti a l&#39;imaging dei dati.

Per ottenere i nutrienti necessari per la sopravvivenza, tumori maligni richiedono l&#39;accesso al flusso sanguigno del paziente. Per ottenere l&#39;accesso, le cellule tumorali rilasciano segnali chimici che stimolano la crescita di nuovi vasi sanguigni del tumore, dirottando così il processo fisiologico normale noto come angiogenesi 2. È anche attraverso i vasi sanguigni creati tramite angiogenesi che le metastasi (cioè, la diffusione del cancro ad altri organi) può verificarsi. Poiché il processo di angiogenesi è così vitale per la progressione di una così ampia varietà di tumori, è un obiettivo attraente nella ricerca terapia antitumorale 3. Un metodo utilizzato per quantificare l&#39;angiogenesi è misurare la capacità delle cellule progenitrici endoteliali a formare tubi quando posto su una matrice extracellulare. Poiché la formazione di questi tubi è un primo passo critico nella angiogenesi, testando condizioni ambientali (ad esempio, presenza o assenza di un dato compound) in grado di stimolare o inibire la formazione del tubo permette di comprendere misure specifiche che possono essere mirate per inibire l&#39;angiogenesi. Il saggio formazione del tubo delle cellule endoteliali è uno dei 4 metodi più utilizzati in vitro che misura la capacità delle cellule di formare tubi. Esso è un test semplice, richiede relativamente pochi componenti e un breve periodo di coltura 5. Forse la cosa più importante, tuttavia, è che i dati ottenuti da questo tipo di test è quantificabile. Un esempio per l&#39;utilizzo del test formazione del tubo comporta il confronto lo sviluppo di tubi da cellule endoteliali vascolari coltivate su matrice extracellulare vs fattore di crescita ridotta (GFR) matrice extracellulare. La matrice extracellulare è un materiale di membrana simile seminterrato isolati da cellule di sarcoma e dei suoi principali componenti sono laminina, collagene di tipo IV, fattori di crescita e proteoglicani. Alcuni composti hanno effetti diversi sulla capacità della cellula di formare tubi quando inun ambiente con fattori di crescita ed un ridotto proteoglicani eparan solfato (HSPGs). HSPGs sono una componente della matrice extracellulare che è significativamente ridotto in matrice extracellulare GFR. Ad esempio, se l&#39;ipotesi è che gli inibitori dell&#39;angiogenesi, come SB225002, che blocca il recettore CXCR2, hanno notevolmente più debole capacità di interrompere la formazione del tubo quando HSPGs sono abbondanti, quindi un confronto tra l&#39;attività formazione del tubo della matrice extracellulare e la matrice extracellulare GFR è importante per esplorare la possibilità di inibizione dell&#39;angiogenesi tramite il controllo di HSPGs. Altri test che vengono comunemente utilizzati per determinare gli effetti dei composti sulla angiogenesi sono metodi in vivo. Notevoli esempi di questo sono il pulcino membrana corioallantoidea (CAM) saggio 6 utilizzando uova di gallina, e in vivo Matrigel spina saggio di angiogenesi 7 utilizzando topi. Mentre i metodi in vivo misurano angiogenesi in tdimensioni hree e sono più rappresentativi del corpo umano rispetto alla vitro formazione in tubo, soffrono il difetto di richiedere molto più tempo e sono molto più difficili da eseguire. Sia il test CAM e il test spina extracellulare prendono almeno una settimana 8 da fare, mentre in confronto, il saggio di formazione del tubo può essere fatto in un solo giorno e non richiede l&#39;utilizzo degli animali. È importante notare che le cellule endoteliali qui utilizzati sono vena ombelicale cellule endoteliali umane (HUVEC). Queste cellule svolgono un ruolo chiave nel germoglio e crescita dei vasi sanguigni vascolare e sono sufficientemente simili alle cellule endoteliali nei tumori ad essere utilizzato per valutare l&#39;attività anti-angiogenesi sia in vitro ed in vivo 9. Altre cellule, come le cellule endoteliali microvascolari primari possono anche essere utilizzati. E &#39;anche importante notare che oltre ad avere minorelivelli di HSPGs, la matrice extracellulare GFR ha anche ridotto i livelli di molti componenti rispetto alla matrice extracellulare normale. Questo include, ma non è limitata a: EGF, IGF-1, PDGF e TGF-beta. Quegli esperimenti che svolgono studiano il significato di questi composti in relazione alla angiogenesi possono essere interessati ad utilizzare GFR matrice extracellulare.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>EGM-2 complete growth medium (EGM-2 bullet kit CC-3162 )</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9525043</td>
			<td>HUVEC complete growth medium: EGM-2 base medium mixed with BBE (Bovine Brain Extract), hEGF (Human Epidermal Growth Factor), Hydrocortisone, GA-1000 (Gentamicin, Amphotericin-B), 2% FBS (Fetal Bovine Serum), VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), hFGF-&#946; (Human Fibroblast Growth Factor Beta), R3-IGF-1 (Long R Insulin-like Growth Factor One), Ascorbic Acid, and Heparin.&#160; Aliquot the medium and its components and store them at -20 oC, warm&#160; in 37 oC&#160; before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATRIGEL MATRIX 10ML Growth Factor Reduced (GFR); 10mL; LDEV-Free</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>CB-40230&#160;</td>
			<td>Growth Factor Reduced (GFR) extracellular matrix, keep in&#160;&#160; -20 oC , warm in 4 &#176;C&#160; before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATRIGEL MATRIX 10ML ; 10mL; LDEV-Free</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>CB-40234&#160;</td>
			<td>extracellular matrix, keep in&#160;&#160; -20 oC, warm in 4 &#176;C&#160; before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB225002</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>559405</td>
			<td>CXCR2 inhibitor, keep in&#160;&#160; -20 oC, warm in room temperature&#160; before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)&#160;</td>
			<td>ScienCell Research Laboratories&#160;</td>
			<td>8000</td>
			<td>culture it according reference&#160; 10.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.05%-EDTA phenol red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>keep in 4 oC, warm&#160; in 37 oC&#160; before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon ECLIPSE Ti</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Inverted Research Microscope.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR 4.20.02 64 bit</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Inverted Research Microscope software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graph-pad Prism 5</td>
			<td>GraphPad Software, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>scientific 2D graphing and&#160;statistics software, to calculate IC50.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

strategic endothelial cell tube formation assay: comparing extracellular matrix and growth factor reduced extracellular matrix

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by hijacking the process of angiogenesis, in which new blood vessels are formed from existing blood vessels. The CXCR2 (chemokine (C-X-C motif) receptor 2) receptor is a transmembrane G-protein-linked molecule found in many cells that is closely associated with angiogenesis1. Specific blockade of the CXCR2 receptor inhibits angiogenesis, as measured by several assays such as the endothelial tube formation assay. The tube formation assay is useful for studying angiogenesis because it is an excellent method of studying the effects that any given compound or environmental condition may have on angiogenesis. It is a simple and quick in vitro assay that generates quantifiable data and requires relatively few components. Unlike in vivo assays, it does not require animals and can be carried out in less than two days. This protocol describes a variation of the extracellular matrix supporting endothelial tube formation assay, which tests the CXCR2 receptor.

Notevole, sana formazione del tubo endoteliale può essere facilmente contrastata alla formazione tubo inibito nelle immagini di microscopia. Formazione del tubo sano appare come una rete organizzata di strutture capillari simili (Figura 1). In confronto, formazione del tubo inibito si manifesta come cellule sparse (Figura 2). Tubo dati dosaggio formazione è quantificato misurando la lunghezza totale del tubo di tubi capillari (Tabella 1). Oltre lunghezza totale del tubo, la lunghezza media del tubo, il numero totale di tubi, o il numero totale di punti di ramificazione possono essere misurati. formazione del tubo strutturato produce una maggiore lunghezza del tubo rete di dispersi crescita tubo inibito. In figura 3, una curva dose-risposta permette calcolo IC 50 nelle condizioni sperimentali di HUVEC su GFR matrice extracellulare e un inibitore CXCR2 SB225002. Figura 1. endoteliale formazione t Ube sulla matrice extracellulare e il fattore-ridotta (GFR) matrice extracellulare crescita. Due immagini mostrano la formazione del tubo di successo su matrice extracellulare (A) e GFR matrice extracellulare (B). La rete interconnessa di tubi mostra chiaramente che la crescita dei tubi è sano in questi HUVECs. Barra di scala = 10 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54074/54074fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54074/54074fig2.jpg" /> Figura 2. L&#39;inibizione della formazione del tubo su extracellulare e fattore di crescita-ridotta (GFR) matrice extracellulare da un SB225002 inibitore CXCR2 (5,6 micron). Due immagini mostrano tuboformazione che è stata inibita da un inibitore CXCR2 SB225002 (5.6 mM) sulla matrice extracellulare (A) e GFR matrice extracellulare (B). I ciuffi isolati di cellule HUVEC visto in questa mostra immagine che le cellule non erano in grado di formare i tubi necessari per collegare tra loro. Barra di scala = 10 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54074/54074fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54074/54074fig3.jpg" /> Figura curva di risposta 3. Dose sul fattore di crescita ridotto (GFR) matrice extracellulare. L&#39;asse X indica la lunghezza del tubo e l&#39;asse Y indica la concentrazione di un inibitore CXCR2. La curva dose-risposta dimostra che la risposta HUVEC per l&#39;inibitore CXCR2 sulla matrice extracellulare GFR è dose-dipendente. L&#39;(inibitore massimo la metà IC50y concentrazione) è stato calcolato utilizzando il software 13 e può essere confrontato con una curva dose-risposta per matrice extracellulare, per esempio. IC50 è la concentrazione di inibitore che diminuisce la risposta al 50%. barre di errore rappresentano la deviazione standard. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Fattore di crescita ridotta (GFR) matrice extracellulare e inibitore (4 replicati ciascuno) </td><td> Tubo totale lunghezza media (pixel) (1 pixel = 0,34 micron) </td><td> Deviazione standard </td><td> P Valore </td></tr><tr><td> GFR di controllo matrice extracellulare </td><td> 2447 </td><td> 168,174 </td><td></td></tr><tr><td> GFR extracellulare SB225002 matrice + 0,56 micron </td><td> 1.422,5 </td><td> 185.4218 </td><td> 0.000395 </td></tr><tr><td>GFR extracellulare SB225002 matrice + 1,1 micron </td><td> 1004 </td><td> 126.1784 </td><td> 2.14 x 10 -5 </td></tr><tr><td> GFR extracellulare SB225002 matrice + 5,6 micron </td><td> 519,25 </td><td> 129.6368 </td><td> 4.19 x 10 -6 </td></tr><tr><td> GFR extracellulare SB225002 matrice + 11 micron </td><td> 393,75 </td><td> 212.6857 </td><td> 1.21 x 10 -5 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Quantificare lunghezza totale tubo sul fattore di crescita ridotta (GFR) matrice extracellulare in condizioni variabili. Una parte di una tabella utilizzando le lunghezze dei tubi totali registrate nei campioni cresciuti su matrice extracellulare GFR con concentrazioni variabili di inibitore CXCR2. I dati indicano che l&#39;inibitore CXCR2 inibisce la formazione del tubo. Sono inclusi valori associati come la media di quattro repliche, la deviazione standard, e il valore P. Misurato in pixel per mostrareI dati che vengono esportati. IC 50 può essere calcolato utilizzando il software statistico 13. (1 pixel = 0,34 micron)

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Strategic Endothelial Cell Tube Formation Assay: Comparing Extracellular Matrix and Growth Factor Reduced Extracellular Matrix

This manuscript describes a tube formation assay to quantify the effects of a given compound or condition on angiogenesis by using endothelial cell tube formation in a controlled environment.

Strategico cellule endoteliali tubo saggio Formazione: Confronto tra matrice extracellulare e fattore di crescita ridotto matrice extracellulare

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by ...

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Research

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Medicine

13.3K Views.  Wayne State University School of Medicine. This manuscript describes a tube formation assay to quantify the effects of a given compound or condition on angiogenesis by using endothelial cell tube formation in a controlled environment.

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Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events in cardiac myocytes such as proliferation and apoptosis require an accurate identification of cardiac myocyte nuclei to analyze cellular renewal in homeostasis and in pathological conditions2. Here, we provide a method to isolate cardiomyocyte nuclei from post mortem tissue by density sedimentation and immunolabeling with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) and subsequent flow cytometry sorting. This strategy allows a high throughput analysis and isolation with the advantage of working equally well on fresh tissue and frozen archival material. This makes it possible to study material already collected in biobanks. This technique is applicable and tested in a wide range of species and suitable for multiple downstream applications such as carbon-14 dating3, cell-cycle analysis4, visualization of thymidine analogues (e.g. BrdU and IdU)4, transcriptome and epigenetic analysis.

Cardiac nuclei are isolated via density sedimentation and immunolabeled with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) to identify and sort cardiomyocyte nuclei by flow cytometry.

Isolamento dei Nuclei Cardiomyocyte dal post-mortem del tessuto

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Ricerca

Medicina

Matrix-assisted Autologous Chondrocyte Transplantation for Remodeling and Repair of Chondral Defects in a Rabbit Model

Articular cartilage defects are considered a major health problem because articular cartilage has a limited capacity for self-regeneration 1. Untreated cartilage lesions lead to ongoing pain, negatively affect the quality of life and predispose for osteoarthritis. During the last decades, several surgical techniques have been developed to treat such lesions. However, until now it was not possible to achieve a full repair in terms of covering the defect with hyaline articular cartilage or of providing satisfactory long-term recovery 2-4. Therefore, articular cartilage injuries remain a prime target for regenerative techniques such as Tissue Engineering. In contrast to other surgical techniques, which often lead to the formation of fibrous or fibrocartilaginous tissue, Tissue Engineering aims at fully restoring the complex structure and properties of the original articular cartilage by using the chondrogenic potential of transplanted cells. Recent developments opened up promising possibilities for regenerative cartilage therapies.
The first cell based approach for the treatment of full-thickness cartilage or osteochondral lesions was performed in 1994 by Lars Peterson and Mats Brittberg who pioneered clinical autologous chondrocyte implantation (ACI) 5. Today, the technique is clinically well-established for the treatment of large hyaline cartilage defects of the knee, maintaining good clinical results even 10 to 20 years after implantation 6. In recent years, the implantation of autologous chondrocytes underwent a rapid progression. The use of an artificial three-dimensional collagen-matrix on which cells are subsequently replanted became more and more popular 7-9.
MACT comprises of two surgical procedures: First, in order to collect chondrocytes, a cartilage biopsy needs to be performed from a non weight-bearing cartilage area of the knee joint. Then, chondrocytes are being extracted, purified and expanded to a sufficient cell number in vitro. Chondrocytes are then seeded onto a three-dimensional matrix and can subsequently be re-implanted. When preparing a tissue-engineered implant, proliferation rate and differentiation capacity are crucial for a successful tissue regeneration 10. The use of a three-dimensional matrix as a cell carrier is thought to support these cellular characteristics 11.
The following protocol will summarize and demonstrate a technique for the isolation of chondrocytes from cartilage biopsies, their proliferation in vitro and their seeding onto a 3D-matrix (Chondro-Gide, Geistlich Biomaterials, Wollhusen, Switzerland). Finally, the implantation of the cell-matrix-constructs into artificially created chondral defects of a rabbit's knee joint will be described. This technique can be used as an experimental setting for further experiments of cartilage repair.

An experimental technique for the treatment of chondral defects in the rabbit's knee joint is described. The implantation of autologous chondrocytes seeded on a matrix is a well-accepted method for the remodeling and repair of articular cartilage lesions providing satisfying long-term results. Matrix-assisted autologous chondrocyte transplantation (MACT) offers a standardized and clinically established implantation method.

Matrix-assistito trapianto autologo di condrociti per il rimodellamento e la riparazione dei difetti condrali in un modello di coniglio

Articular cartilage defects are considered a major health problem because articular cartilage has a limited capacity for self-regeneration 1. Untreated ...

Focus Formation: A Cell-based Assay to Determine the Oncogenic Potential of a Gene

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent growth potential, and the ability to form tumors in experimental animals1. In NIH 3T3 cells, the Ras signal transduction pathway is known to trigger many of these events, what is known as Ras transformation. The introduction of an overexpressed gene in NIH 3T3 cells may promote morphological transformation and loss of contact inhibition, which can help determine the oncogenic potential of that gene of interest. An assay that provides a straightforward method to assess one aspect of the transforming potential of an oncogene is the Focus Formation Assay (FFA)2. When NIH 3T3 cells divide normally in culture, they do so until they reach a confluent monolayer. However, in the presence of an overexpressed oncogene, these cells can begin to grow in dense, multilayered foci1 that can be visualized and quantified by crystal violet or Hema 3 staining. In this article we describe the FFA protocol with retroviral transduction of the gene of interest into NIH 3T3 cells, and how to quantify the number of foci through staining. Retroviral transduction offers a more efficient method of gene delivery than transfection, and the use of an ecotropic murine retrovirus provides a biosafety control when working with potential human oncogenes.

The Focus Formation Assay provides a straightforward method to assess the transforming potential of a candidate oncogene.

Concentrarsi Formazione: Un test cellulare per determinare il potenziale oncogeno di un gene

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent ...

Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from cirrhosis to cardiovascular diseases). There is no effective treatment and the in vitro tools available do not mimic the in vivo situation rendering the progress of the out of control wound healing process still enigmatic.
To date, 2D and 3D cultures of fibroblasts derived from DD patients are the main experimental models available. Primary cell cultures have many limitations; the fibroblasts derived from DD are altered by the culture conditions, lack cellular context and interactions, which are crucial for the development of fibrosis and weakly represent the derived tissue. Real-time PCR analysis of fibroblasts derived from control and DD samples show that little difference is detectable. 3D cultures of fibroblasts include addition of extracellular matrix that alters the native conditions of these cells. 
As a way to characterize the fibrotic, proliferative properties of these resection specimens we have developed a 3D culture system, using intact human resections of the nodule part of the cord. The system is based on transwell plates with an attached nitrocellulose membrane that allows contact of the tissue with the medium but not with the plastic, thus, preventing the alteration of the tissue. No collagen gel or other extracellular matrix protein substrate is required. The tissue resection specimens maintain their viability and proliferative properties for 7 days. This is the first &#8220;organ&#8221; culture system that allows human resection specimens from DD patients to be grown ex vivo and functionally tested, recapitulating the in vivo situation.

Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Dupuytren&#8217;s disease (DD) is a fibroproliferative disease of the palm of the hand. Here, we present a protocol to culture resection specimens from DD in a three-dimensional (3D) culture system. Such short-term culture system allows preservation of the 3D structure and molecular properties of the fibrotic tissue.

Umana Dupuytren di<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura per lo Studio dei miofibroblasti e matrice extracellulare Interazioni

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from ...

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that self-renew while giving rise to more differentiated progeny. Understanding and targeting these cancer stem cells in breast cancer, which may possess enhanced chemo- and radio-resistance compared to the non-stem tumor bulk, has become an important research area. Markers including CD44, CD24, and ALDH activity can be assessed using fluorescence activated cell sorting (FACS) to prospectively isolate cells that display enhanced tumorigenicity when implanted into immunocompromised mice: the mammosphere assay has also become widely used for its ability to retrospectively identify sphere-forming cells that develop from single stem cell-like clones. Here we outline approaches for the appropriate culturing of mammospheres from cell lines or primary patient samples, their passaging, and calculations to estimate sphere forming efficiency (SFE). First we discuss key considerations and pitfalls in the appropriate planning and interpretation of mammosphere experiments.

Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.

Mammosphere saggio Formazione di Human Breast Cancer tessuti e linee cellulari

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...

Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea

In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest signaling pathways shown to be associated with ciliary function was the non-canonical Wnt signaling pathway, also referred to as planar cell polarity (PCP) signaling. One of the best places in which to study the effects of planar cell polarity (PCP) signaling during vertebrate development is the mammalian cochlea. PCP signaling disruption in the mouse cochlea disrupts cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, all of which are affected by cilia dysfunction. The goal of this protocol is to describe the analysis of PCP signaling in the developing mammalian cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy. Defects in convergence and extension are manifested as a shortening of the cochlear duct and/or changes in cellular patterning, which can be quantified following dissection from developing mouse mutants. Changes in stereociliary bundle orientation and kinocilia length or positioning can be observed and quantitated using either immunofluorescence or scanning electron microscopy (SEM). A deeper insight into the role of ciliary proteins in cellular signaling pathways and other biological phenomena is crucial for our understanding of cellular and developmental biology, as well as for the development of targeted treatment strategies.

Primary cilia influence various signaling pathways. The mammalian cochlea is ideal for examining planar cell polarity (PCP) signaling. Cilia dysfunction affects cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, readouts of PCP. Our goal is to analyze PCP signaling in mouse cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy.

Valutazione della Planar-Cell-polarità fenotipi in Ciliopathy mouse Mutant Coclea

In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest ...

Three-Dimensional Culture Assay to Explore Cancer Cell Invasiveness and Satellite Tumor Formation

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells often generates unwanted artifacts. Therefore, cell culture in a three-dimensional (3D) environment, often using extracellular matrix components, emerged as an interesting alternative due to its close similarity to the native in vivo tissue or organ. We developed a 3D cell culture system using two compartments, namely (i) a central compartment containing cancer cells embedded in a collagen gel acting as a pseudo-primary macrospherical tumor and (ii) a peripheral cell-free compartment made of a fibrin gel, i.e. an extracellular matrix component different from that used in the center, in which cancer cells can migrate (invasion front) and/or form microspherical tumors representing secondary or satellite tumors. The formation of satellite tumors in the peripheral compartment is remarkably correlated to the known aggressiveness or metastatic origin of the native tumor cells, which makes this 3D culture system unique. This cell culture approach might be considered to assess cancer cell invasiveness and motility, cell-extracellular matrix interactions and as a method to evaluate anti-cancer drug properties.

Cancer cells are embedded in a collagen gel and then sandwiched in an acellular fibrin gel to generate a 3D culture system in which the invasiveness and formation of satellite tumors may be monitored.

Three-Dimensional Cultura Assay per esplorare Cancer Cell invasività e formazione di tumori Satellite

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells ...

Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation

Von Willebrand factor (VWF) is a multimeric glycoprotein coagulation factor that mediates platelet adhesion and aggregation at sites of endothelial damage and that carries factor VIII in the circulation. VWF is synthesized by endothelial cells and is either released constitutively into the plasma or is stored in specialized organelles, called Weibel-Palade bodies (WPBs), for on-demand release in response to hemostatic challenge. Procoagulant and proinflammatory stimuli can rapidly induce WPB exocytosis and VWF release. The majority of VWF released by endothelial cells circulates in the plasma; however, a proportion of VWF is anchored to the endothelial cell surface. Under conditions of physiological shear, endothelial-anchored VWF can bind to platelets, forming a VWF-platelet string that may represent the nidus of thrombus formation. A flow chamber system can be used to visually observe the release of VWF from endothelial cells and the subsequent platelet capture in a manner that is reproducible and relevant to the pathophysiology of VWF-mediated thrombus formation. Using this methodology, endothelial cells are cultured in a flow chamber and are subsequently stimulated with secretagogues to induce WPB exocytosis. Washed platelets are then perfused over the activated endothelium. The platelets are activated and subsequently bind to elongated VWF strings in the direction of fluid flow. Using extracellular histones as a procoagulant and proinflammatory stimulus, we observed increased VWF-platelet string formation on histone-treated endothelial cells compared to untreated endothelial cells. This protocol describes a quantitative, visual, and real-time assessment of the activation of VWF-platelet interactions in models of thrombosis and hemostasis.

In this paper, we describe a method to assess endothelial von Willebrand factor release and the subsequent platelet capture under fluid shear stress in response to inflammatory stimuli using an in vitro flow chamber system.

Indagando von Willebrand fattore patofisiologia utilizzando un modello di flusso di camera di von Willebrand Factor-PIASTRINOGENESI. String

Von Willebrand factor (VWF) is a multimeric glycoprotein coagulation factor that mediates platelet adhesion and aggregation at sites of endothelial damage ...

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Mitochondria are essential organelles for the cellular metabolism and survival. A variety of key events take place in mitochondria, such as cellular respiration, oxidative metabolism, signal transduction, and apoptosis. Consequently, mitochondrial dysfunction is reported to play an important role in the antifungal drug tolerance and virulence of pathogenic fungi. Recent data have also led to the recognition of the importance of the mitochondria as an important contributor to fungal pathogenesis. Despite the importance of the mitochondria in fungal biology, standardized methods to understand its function are poorly developed. Here, we present a procedure to study the basal oxygen consumption rate (OCR), a measure of mitochondrial respiration, and extracellular acidification rates (ECAR), a measure of glycolytic function in C. albicans strains. The method described herein can be applied to any Candidaspp. strains without the need to purify mitochondria from the intact fungal cells. Furthermore, this protocol can also be customized to screen for inhibitors of mitochondrial function in C. albicans strains.

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Here, we present a stepwise protocol to investigate the mitochondrial respiration and glycolytic function in Candida Albicans using an extra flux analyzer.

Indagine di bio-energetica di Candida albicans utilizzando extracellulare Flux analisi Real-Time

Mitochondria are essential organelles for the cellular metabolism and survival. A variety of key events take place in mitochondria, such as cellular ...

Immunofluorescence Labelling of Human and Murine Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Tissue

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They mature in the bone marrow and are released into the peripheral blood, where they circulate for about 6&#8722;8 h; however, in tissue, they can survive for days. By diapedesis through the endothelium, they leave the blood stream, enter tissues, and migrate towards the site of an infection following chemotactic gradients.&#160;Neutrophils can combat invading microorganisms by phagocytosis,&#160;degranulation, and generation of neutrophil extracellular traps (NETs). This protocol will help to detect NETs in paraffin-embedded tissue. NETs are the result of a process called NETosis, which leads to the release of nuclear, granular, and cytoplasmic components either from living (vital NETosis) or dying (suicidal NETosis) neutrophils. In vitro, NETs form cloud-like structures, which occupy a space several times larger than that of the cells from which they descended. The backbone of NETs is chromatin, to which a selection of proteins and peptides originating from granules and cytoplasm are bound. Thereby, a high local concentration of toxic compounds is maintained so that NETs can capture and inactivate a variety of pathogens including bacteria, fungi, viruses, and parasites, while diffusion of the highly active NET components leading to damage in neighboring tissue is limited. Nevertheless, in recent years it has become apparent that NETs, if generated in abundance or cleared insufficiently, do have pathological potential ranging from autoimmune diseases to cancer. Thus, detection of NETs in tissue samples may have diagnostic significance, and the detection of NETs in diseased tissue can influence the treatment of patients. Since paraffin-embedded tissue samples are the standard specimen used for pathological analysis, it was sought to establish a protocol for fluorescent staining of NET components in paraffin-embedded tissue using commercially available antibodies.

Neutrophil extracellular traps (NETs) are three-dimensional structures generated by stimulated neutrophil granulocytes. It has become clear in recent years that NETs are involved in a wide variety of diseases. Detection of NETs in tissue may have diagnostic relevance, so standardized protocols for labelling NET components are required.

Immunofluorescenza Etichettatura delle trappole extracellulari di neutrofilo umano e murino nel tessuto incorporato di paraffina

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They ...