Research reported in this publication was supported by the National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health under award number R01 GM33397. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health. J.G.G. is American Cancer Society Professor of Developmental Genetics.

Genel kurbağalar ve semenderler hakkında bilgi yanı sıra hayvanların kaynakları, aşağıdaki web sitelerinden bulunabilir: Xenbase (http://www.xenbase.org) ve Sal-site (http://www.ambystoma.org). Bu protokol Bilim Carnegie Kurumu Embriyoloji Anabilim Dalı hayvan bakım kuralları takip eder. 1. Çözümler <ol><li> Karıştırılarak 1 M NaHCO 3 deiyonize ya kloru giderilmiş H2O L 10, 1 M CaCl2 ve 10 ml 10 ml ekleyin: 10 L &quot;kurbağa suyu&quot; emin olun. </li><li> 1 L% 20 paraformaldehid Üyeler: 4 mM Na 2 1 L CO 3 yapın. Kimyasal bir kaput çözünmesi yaklaşık 80 o C toz paraformaldehid ve ısı 200 g ekleyin. filtre kağıdı ile serin ve filtre edin. Dikkat: paraformaldehit toksik ve dikkatle ele alınması gerekir. Alternatif olarak, ticari paraformaldehit çözümü satın. </li><li> 1 L amfibi anestezik çözüm olun: etil 3-aminoben 1.5 g ekleyin1 L kurbağa suya zoate metansülfonat. Oda sıcaklığında saklayınız. </li><li> Yap 1 L oosit kültür ortamı OR2 14: 82.5 mM NaCI, 2.5 mM KCI, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1 mM Na 2 HPO 4, 5 mM HEPES (500 mM stok, pH 8.3). Nihai pH yaklaşık pH 7.8 olacaktır. bakteri gelişimini önlemek için 100 mg ampisilin ve 100 mg streptomisin ekleyin. </li><li> 1 L GV yalıtım çözeltisi yapmak: 83 mM KCI, 17 mM NaCI, 6.5 mM Na-2 HPO 4, 3.5 mM KH 2 PO 4, 1 mM MgCl2, 1 mM ditiotreitol (DTT). pH 7.0 ayarlayın. </li><li> 100 mL GV dispersiyon çözeltisi yapmak: 20.7 mM KCI, 4.3 mM NaCI, 1.6 mM Na-2 HPO 4, 0.9 mM KH 2 PO 4, 1 mM MgCl2, 1 mM ditiotreitol (DTT),% 0.1 paraformaldehit. pH 7.0 ayarlayın. Nükleer jel daha hızlı dağılmasını kolaylaştırmak için, 10-50 uM CaCl2 ilave edin. </li><li> 500 mL subbing çözüm olun. 2 ticari jelatinin Şişme 0.5 g10 dakika - 5 0 mL H2O. 500 mL kaynar H 2 O ekleyin ve dikkatlice jelatin çözmek için girdap. Serin ve ekleme 50 mg crk (SO 4) 2 · 12 H 2 O 4 o C&#39;de emme ve mağaza ile Filtre </li><li> orta montaj 10 ml olun. 5 ml PBS içerisinde 10 mg fenilendiamin çözülür (135 mM NaCI, 2.5 mM KCI, 4.3 mM Na 2 HPO 4, 1.5 mM KH 2 PO 4, pH 9&#39;a ayarlanmıştır). 5 ml gliserol ekleyin. C o -80 250 ul alikotları saklayın </li></ol> 2. Malzemeler <ol><li> Altyazılı slaytlar için, yer 3 inç x 1 inç cam mikroskop ticari bir deterjan çözeltisi içinde kayar ve herhangi bir kirleri çıkarmak için onları ovmak. slayt rafa yerleştirilir ve daha sonra deiyonize su içinde musluk suyu ile durulayın. , Subbing çözeltide slaytlar daldırma bir açıyla drenaj ve 60 o C&#39;de gece boyunca fırında </li><li> Plastik kareler için, 1 mm kalınlığında poli (metil metakrilat) bir tabaka 25 mm&#39;lik kareler kesilir. Matkap birHer bir karenin merkezinde 5 mm yuvarlak delik. Kum yüzleri ve meydanda yanı sıra deliğin çevresi kenarları hem. Not: bir sonraki paragrafta tarif edildiği gibi, plastik kareler ve de slaytlar yapımı için bir başka seçenek olarak, in situ, PCR ve hibridizasyon odaları (25 uL) ticari bir yapıştırıcı kullanır. Bu iyice henüz test edilmemiş olmasına rağmen bir olasılıkla da, hücre kültürü için yeniden kullanılabilir silikon izolatörleri kullanabilirsiniz. </li><li> Sıcak bir plaka üzerinde 50 ml bir cam beher içinde - (57 o C 56) parafın balmumu 30 g - de slaytlar için 20 eritebilir. Bir 20 uL pipet ile, altyazılı slayt merkezinin her iki tarafında parafin biri 5 uL damla yayıldı. parafin içine plastik bir kare basın ve sıcak plaka üzerine slayt yerleştirin. parafin eriyecek ve plastik meydanda altında yayılır gerekir. <ol><li> Sıcak plaka slayt çıkarın ve soğumaya bırakın. sürgünün her iki ucunda küçük bir destek yer, çok kayar tabl temas etmezsoğutma işlemi sırasında ETOP. parafin çok hızlı soğur, o uzakta merkezi delikten çekebilir. 10 veya daha fazla kuyu slaytlar hazırlayın: Her GV hazırlığı yeni bir kuyu slayt kullanır. </li></ol></li><li> santrifüj için slayt taşıyıcıları için, özel olarak kullanılan rotor için taşıyıcılar inşa kullanın. iyi plastik plakalar - Çeşitli üreticilerin 96 için taşıyıcılarla santrifüjler sağlar. Bu firmalar mikroskop slaytlar tutmak için oldukça kolay adapte edilebilir. </li></ol> Oosit 3. İzolasyon <ol><li> Tamamen hayvan karşılamak için yeterli anestezi çözelti içinde Yetişkin bir dişi kurbağa (Xenopus laevis veya Xenopus tropicalis) ya da semenderleri (Ambystoma mexicanum) yerleştirin. hayvan hareketlerini kesildiğinde, o uygun bir kaba yontma buz bir yatakta karın-up yerleştirin. </li><li> cerrahi makas 2 yapmak ile - alt karın bölgesinde 3 cm&#39;lik bir kesi orta hat lateral. (Th kesi tarafında yumurtalık bulmak için yavaşça kenara iç organları Taşıere iki Yumurtalıklar, karnın her iki tarafında bir) bulunmaktadır. Planlanan deneyler için yeterli oosit ile yumurtalığın bir kısmını kesip. oosit binlerce her yumurtalıkta olduğu için, yumurtalık, nispeten küçük bir parça (1-3 cm), genellikle yeterli olacaktır. </li><li> bir ya da daha, oda sıcaklığında büyük bir petri (100 mm) OR2 tuz yumurtalığın birkaç parça yerleştirin. zarar oositin çıkarılması durumunda Oositler, birkaç gün boyunca iyi durumda saklanabilir ve OR2 çözeltisi günlük olarak değiştirildi. </li><li> cerrahi ipek ile kesi dikin ve kurtarma için tek bir cam kase hayvan dönün. bu bilinç (yaklaşık 15 dk) kavuşur kadar hayvan karşılamak için yeterli &quot;kurbağa suyu&quot; ekleyin. Hayvan istemli hareketlerin gösterir sonra, su ile kase doldurun. tatlı su kullanılmalıdır rağmen amfibi ameliyat sonrası enfekte neredeyse asla, kısırlık, gerekli değildir. Arzu edildiği takdirde, neomisin dikiş uygulanabilir. Yara genellikle fe sonra tamamen iyileşirw günler ve aynı hayvan yaklaşık 2 ay sonra tekrar kullanılabilir. </li></ol> Bir torbacığı (GV) 4. Yalıtım <ol><li> OR2 solüsyonu içeren küçük bir petri (35 x 10 mm) - (20 büyük oosit 10) yumurtalık bir kısmını yerleştirin. </li><li> yumurtalık duvara oosit bağlayan doku ince sapı gözyaşı 5. kuyumcu forseps iki çift kullanarak yumurtalıktan bir oosit çıkarın. GV izolasyon ortamı içeren başka bir küçük petri oosit yerleştirin. NOT: LBCs devlet oosit büyüklüğü (vade) bağlıdır. LBCs tam boyutunda biraz daha az olan oosit belirgin döngüler ile maksimum uzunluğa ulaştıracak. en olgun oosit genellikle sözleşmeli döngüler ile kısa kromozom içerir. </li><li> bir diseksiyon mikroskobu (- 20 mm alan çapı yaklaşık 10) düşük büyütme altında aşağıdaki adımları uygulayın. <ol><li> hayvan kutup (koyu yarıküre) yakın forseps iki çift ile oosit kavramak ve bir sm yapmakTüm gözyaşı. şeffaf oosit çekirdeğinde için çekilmiş sarısı bak, ayrıca germinal vezikül veya GV denir. </li><li> Alternatif olarak, forseps bir çift ile hayvan kutbuna yakın büyük bir delik kurcalamak ve yavaşça sarısı (Şekil 2) ile birlikte GV sıkmak. </li><li> Nazikçe sarısı kütlesinden GV yuvarlayın. Genellikle GV sıkıca yapışık sarısı küçük bir miktar olacaktır. </li></ol></li></ol> Nükleer Zarf 5. Kaldırma <ol><li> X. laevis ve X tropicalis için, hala biraz yapışkan sarı olsa bile, izolasyon 60 saniye içinde yayılma ortamına izolasyon ortamından GV aktarın. Not: İzolasyon ortamı içinde ayrıldı ve daha sonraki kademelerde yayılmamış eğer GV, bu iki türün yaklaşık 60 saniye içinde &quot;sertleşmeye&quot;. Xenopus GV içeriğini inceleyerek nedenle hız büyük önem taşımaktadır. <ol><li> bir çift ile GV üst kısmına yakın nükleer zarf kavramakkuyumcu forseps, özen aşağı basmamaya. mümkün olduğunca ilk olarak yakın forseps ikinci bir çift ile zarfı kavrayın. Birbirlerinden uzakta ve GV içerikleri bir veya her iki forseps sıkıca yapışır zarf, dışarı özgür &quot;pop&quot; yapacaklarını forseps iki çift çekin. </li><li> bir cam pipet GV içeriklerini veya ayarlanabilir 20 uL mikropipet Pick up. ayarlanabilir bir pipet kullanarak ise, 10 ul pipet ayarlamak ve jilet plastik ucunun ucu kesilmiş. Kalan 5 uL GV çekme önce sıvı 5 ul çizin. </li><li> Daha önce çözüm yayılan dolu bir kuyu slayt merkezine hala jölelenmişti nükleer içeriğini aktarmak. Lamel eklendiğinde bir baloncuk tuzak değildir, böylece yayılan çözeltisi dışbükey bir yüzeye sahip olmalıdır. </li><li> Bir lamel (18 mm) ekleyin ve nemli bir odada slayt yerleştirin. Nükleer jel yavaş yavaş önümüzdeki 10 üzerinde dağılacaktır - 60 dakika böylece kromozomlar ve nükleer organelleri cam slayt yüzeyinde yalan geliyor. NOT: semenderlerin A. mexicanum ve GV ve N. viridescens haksız yere izolasyon ortamında &quot;sertleşmesine&quot; yoktur. Bu nedenle bir Xenopus ile bir can daha nükleer zarfın kaldırılması ile daha yavaş devam edebilirsiniz. </li></ol></li><li> Bölüm 5.1.1 de tarif edildiği gibi bir semender GV nükleer zarfı kaldırma fakat izolasyon ortamında yaparlar. <ol><li> Bir pipet yardımıyla hafifçe jölelenmişti GV içeriğini Pick up ve yayılma çözeltisi içeren bir petri transfer. </li><li> Çabuk, yayma çözeltide pipet yıkayın nükleer jel pick up ve daha önce çözüm yayılan dolu bir kuyu slayt ortasına yerleştirin. 18 mm&#39;lik bir örtücü cam ekleyin ve nemli bir odada bütün slayt yerleştirin. Nükleer özsuyu yavaş yavaş önümüzdeki 10 üzerinde dağılacaktır - 60 dakika ve kromozomlar ve nükleer organelleri cam yüzeye yalan gelecektir. </li> &lt;/ Ol&gt; </li></ol> LBCs ve Organellerin 6. Ön Gözlem <ol><li> yayma odasında nükleer içeriğinin dağıtılması sonrasında düşük büyütme faz kontrast (konvansiyonel dik mikroskop) tarafından LBCs ve nükleer organelleri görüntüleyin. (- 10X 5X) odası yaklaşık 1 mm derinliğinde ve nükleer içeriği altta olduğundan, uzun bir çalışma mesafesi ile düşük büyütmeli objektif kullanın. NOT: Şu anda hazırlık incelenmesi için başlıca nedeni sonraki adımlarda taşıyan değer olup olmadığını tespit etmektir. İyi bir hazırlık içinde kromozomlar kırılmamış ve odasının tabanına yerleşmiştir. Bu slayt lampbrush kromozom döngüler optimal eki sağlayacak şekilde, hazırlık yapma bir saat içinde santrifüj adıma geçin. </li></ol> Nükleer İçindekiler 7. Santrifüj <ol><li> lamel filtre bir parça kağıt yerleştirin ve bastırınbölmeden fazla sıvının çıkması için. </li><li> Lamel her iki tarafında vazelin yaklaşık olarak 1 mm3 koyun. Altta yatan plastik kare üzerine lamel mühür 80 o C - 70 ısıtılmış bir metal çubuk ile vazelin eritin. </li><li> Yeri santrifüj için slayt taşıyıcılarında slaytlar, yapım emin zıt taşıyıcılar dengelenmiştir. 1 saat - 30 dakika için yaklaşık 4800 xg&#39;de slaytlar santrifüj. 4 o C Kullanımı santrifüj yavaş start özelliği de. </li></ol> 8. Nükleer İçeriği Tespit <ol><li> En sonraki prosedürler için, paraformaldehid ile nükleer içeriğini düzeltmek. </li><li> Standart bir mikroskop lamı boyama çanak içine bir slayt rafa koymak ve daha sonra rafa ayrı ayrı slaytlar yerleştirin. (- OR2 veya PBS içinde% 4 paraformaldehid 2) slaytlar karşılamak için yeterli fiksatif ekleyin. </li><li> Künt forseps bir çift ile yanal lamel itin pick up ve uygun cam çöpe atın.30 dakika - en az 15 için sabitleştirici slaytlar bırakın. In situ hibridizasyon ve en antikor lekeleri, tespitin daha uzun süreler (h veya d) izin verilir. </li><li> plastik kare çıkarmak için, bir yerde bir boyama çanak buz içine bir seferde soğuk OR2 veya PBS bir tane slaytlar. plastik meydanın kenarında keskin bir jilet bıçağı yerleştirin ve Çıkarmak. NOT: İdeal plastik, temiz dökülmek slayt tüm parafin bırakarak olacaktır. Balmumu yararlı bir amaca hizmet eder: nükleer içeriği slayt bağlı olan küçük orta alanı çevreleyen beri, bu küçük hacimleri ile çalışmaya olanak sağlayan bir baraj gibi davranır - vb immün, için ayıraç (5 10 uL). Slaytlar soğuk OR2 veya PBS içinde süresiz yapılabilir. </li></ol> LBCs ve Nükleer Organellerin 9. immün <ol><li> OR2 veya PBS depolama sabit GV hazırlık çıkarın. nemli bir odaya destekler üzerinde aşırı sıvı ve yeri silin. Uygun bir odacıklıer nemli filtre kağıdı 90 mm daire içeren bir 90 x 15 mm petri olduğunu. NOT: Bu noktada, çekirdek içindeki sıkı parafin mumu bilgilerini 5 mm dairesel bir alanda sürgüye bağlıdır. mum su itici olduğundan, bir ekleme ve 20 uL pipet ile orta alanda kenarına sıvı küçük miktarlarda kaldırarak çözüm değiştirebilirsiniz. büyük önlem pipet ile balmumu içermeyen alana dokunmamak için olduğunu. </li><li> reaktiflerin - (20 uL 10), küçük hacimleri ile immün yürütmek. kromozomlar ve nükleer organelleri çok küçük ve ilave edilen belirteçlerle veya hemen temas içinde olduğu için, boyama protokolleri kısa olabilir. Primer ve sekonder antikor boyama süreleri 1 saat ya da daha az gibi kısa olabilir. Bu hazırlık hasara neden olur gibi herhangi bir aşamada deterjan dahil etmeyin. LBCs eksenleri vurgulamak için 20 dakika - Arzu edildiği takdirde, 10 DAPI ile hazırlanması (1 ug / mL) boyanır. </li><li> gliserol Mount veya ticari montajimmünofloresan orta uygun ing. Montaj aşaması sırasında hava kabarcığı yakalama önlemek için, aşağıdaki gibi devam edin. <ol><li> 20 mcL pipet ucu içine montaj orta 15 mcL çekin. (# 1 filtre kağıdı bir 90 mm daireden çok ince üçgen şeklinde kesilmiş) filtre kağıt parçası ile kapalı &quot;esneklik&quot; hemen nükleer yayılma çevresi itibaren çok sıvı mümkün olduğunca kaldırın. </li><li> Nükleer yayılma alanını dokunmamaya dikkat ederek, hazırlık üzerine montaj orta çoğu pipetle. son 1 mcL yerleştirin veya 22 mm lamel (kalınlık # 1.5) merkezinde montaj orta böylece. hazırlık üzerine lamel ters çevirin ve yerine dikkatlice bırakın. </li><li> Geçici bağlar için, bir kaç güne kadar,% 50 gliserol içinde 1 mg / ml fenilendiamin kullanımı. Kalıcı bağlar için, özellikle de superresolution çalışmaları için yaklaşık 1.46 bir kırınım indisi için sertleştirilen bir düşük floresan ortamını kullanmak. </li></ol></li></ol> Situ Hibridizasyon (FISH) LBCs ve Nükleer Organellerin 10. Floresan <ol><li> BALIK protokolleri genellikle yüksek bir sıcaklıkta bir adım gerektirdiğinden, preparattan parafin çıkarın. prosedür sıkıcı ve hazırlık kazara hasarlara yol açabilir, ancak dikkatli bir jilet ile kazımak. Bir elmas noktası ile arka yüze hazırlama alanı işaretlemek için yararlıdır. <ol><li> Seçenek olarak ise, ksilen, parafin mumu çözülür. Coplin kavanoz veya içeren boyama yemekleri bir dizi ayarlama:% 30,% 50,% 70,% 95, ve% 100 etanol; ksilen 3 kaplar; % 100 etanol ve bir aseton 2 daha fazla konteyner. </li><li> (Ajite ise kısa süreler) 5 dakika, her konsantrasyonda - slayt taşıyıcı slaytlar yerleştirin ve 3 slaytlar bırakarak, etanol serisinde bunları kurutmak. </li><li> ksilen 3 kapların içinden slaytlar geçirerek parafin çözülür, yaklaşık 5 dakika her ajite ise. Kaldırİki% 100 etanoller geçirilerek ksilen ve son olarak da aseton ile etanol çıkarıldı. aseton slaytları alın ve kuruması için onları eğin. </li></ol></li><li> Herhangi bir standart protokolü kullanılarak in situ melezleme yürütmek. 15,16 </li></ol> Petrol altında GV 11. İzolasyonu <ol><li> Mümkün olduğunca az çevreleyen dokuda da dahil olmak üzere, kuyumcu forseps ile OR2 çözümünden bir oosit pick up. # 1 filtre kağıdı küçük bir parça üzerinde oosit yerleştirin. Aşırı OR2 çözüm sıvının neredeyse serbest oosit bırakarak, filtre kağıdına aktarılır. &quot;Kuru&quot; oosit pick up ve küçük bir petri (35 x 10 mm) hafif mineral yağ (parafin yağı) yüzeyinin altına yerleştirin. <ol><li> ince bir tungsten iğne veya forseps bir tine ile, karanlık hayvan kutup yakın oosit küçük bir delik açmak. (Ipuçları kaçınarak) forseps bir çift ile oosit pick up ve yavaşça sıkın. GV daha küçük veya l ile birlikte a&#39;ya olacakYüzeyinde sarısı Arger miktarı (Şekil 3). </li><li> yavaşça forseps yüzü GV süpürülerek mümkün olduğu kadar çok yumurta sarısı çıkarın. Çoğu durumda sarısı kaldırmak için zor olur. Bununla birlikte, bir çok amaç için sarısı bir miktar bir sorun değildir. </li></ol></li><li> GV içeriğini gözlemlemek için, az ya da çok ölçüde GV dümdüz. <ol><li> iyi slayt plastik kare çıkarın ve parafin yağı için sığ bir kap olarak kalan parafin kullanın. 10 20 uL pipet parafin yağı ile birlikte GV Pick up ve parafin alanının merkezine transfer. lamel ekleyin ve kısmen düzleşmiş GV içeriğini inceleyin. Bu teknik LBCs zarar vermez. </li></ol></li><li> Alternatif olarak, nükleer organellerin gözlem için yaklaşık 10 mikron kalınlığına GV dümdüz. <ol><li> keskin bir jilet ile bir plastik pipet son 1 mm kesti. içine GV Suckmineral yağ tam 5 uL ile birlikte ucu. 22 mm cam lamel merkezi üzerine GV ve tüm yağ a&#39;ya. </li><li> Sadece petrol damla temas edene kadar yavaşça standart 3 &quot;x 1&quot; cam slayt indirin. damla ve lamel kılcallık yoluyla kalkacak ve petrol lamel kenarlarına yayılacak. damla tamamen yayıldı, petrol yaklaşık 10 mikron kalınlığında olacaktır. LBCs hasar görecek ve büyük nükleol hafifçe sıkıştırılır, ancak sağlam GV (Şekil 3) mevcut gibi küçük nükleer organellerin çoğu az ya da çok görünür. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Purkinje, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Symbolae ad ovi avium historiam ante incubationem. , (1830).</li><li>R&#252;ckert, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zur+Entwickelungsgeschichte+des+Ovarialeies+bei+Selachiern.">Zur Entwickelungsgeschichte des Ovarialeies bei Selachiern.</a> Anat. Anz. 7, 107-158 (1892).</li><li>Callan, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lampbrush Chromosomes. 36, (1986).</li><li>Gall, J. G., Callan, H. G., Wu, Z., Murphy, C., Kay, B. K., Peng, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lampbrush+chromosomes.">Lampbrush chromosomes.</a> Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Vol. 36 Methods in Cell Biology , 149-166 (1991).</li><li>Gall, J. G., Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examining+the+contents+of+isolated+Xenopus+germinal+vesicles.">Examining the contents of isolated Xenopus germinal vesicles.</a> Methods. 51, 45-51 (2010).</li><li>Penrad-Mobayed, M., Kanhoush, R., Perrin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tips+and+tricks+for+preparing+lampbrush+chromosome+spreads+from+Xenopus+tropicalis+oocytes.">Tips and tricks for preparing lampbrush chromosome spreads from Xenopus tropicalis oocytes.</a> Methods. 51, 37-44 (2010).</li><li>Morgan, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Working+with+oocyte+nuclei:+cytological+preparations+of+active+chromatin+and+nuclear+bodies+from+amphibian+germinal+vesicles.">Working with oocyte nuclei: cytological preparations of active chromatin and nuclear bodies from amphibian germinal vesicles.</a> Methods Mol. Biol. 463, 55-66 (2008).</li><li>Paine, P. L., Johnson, M. E., Lau, Y. T., Tluczek, L. J., Miller, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+oocyte+nucleus+isolated+in+oil+retains+in+vivo+structure+and+functions.">The oocyte nucleus isolated in oil retains in vivo structure and functions.</a> Biotechniques. 13, 238-246 (1992).</li><li>Handwerger, K. E., Cordero, J. A., Gall, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cajal+bodies,+nucleoli,+and+speckles+in+the+Xenopus+oocyte+nucleus+have+a+low-density,+sponge-like+structure.">Cajal bodies, nucleoli, and speckles in the Xenopus oocyte nucleus have a low-density, sponge-like structure.</a> Mol Biol Cell. 16, 202-211 (2005).</li><li>Patel, S., Novikova, N., Beenders, B., Austin, C., Bellini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+images+of+RNA+polymerase+II+transcription+units.">Live images of RNA polymerase II transcription units.</a> Chromosome Res. 16, 223-232 (2008).</li><li>Gall, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Octagonal+nuclear+pores.">Octagonal nuclear pores.</a> J Cell Biol. 32, 391-399 (1967).</li><li>L&#246;schberger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+imaging+visualizes+the+eightfold+symmetry+of+gp210+proteins+around+the+nuclear+pore+complex+and+resolves+the+central+channel+with+nanometer+resolution.">Super-resolution imaging visualizes the eightfold symmetry of gp210 proteins around the nuclear pore complex and resolves the central channel with nanometer resolution.</a> J Cell Sci. 125, 570-575 (2012).</li><li>Gottfert, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coaligned+dual-channel+STED+nanoscopy+and+molecular+diffusion+analysis+at+20+nm+resolution.">Coaligned dual-channel STED nanoscopy and molecular diffusion analysis at 20 nm resolution.</a> Biophys J. 105, L01-L03 (2013).</li><li>Wallace, R. A., Jared, D. W., Dumont, J. N., Sega, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+incorporation+by+isolated+amphibian+oocytes:+III.+Optimum+incubation+conditions.">Protein incorporation by isolated amphibian oocytes: III. Optimum incubation conditions.</a> J. Exp. Zool. 184, 321-333 (1973).</li><li>Bridger, J., Spector, D. L., Goldman, R. D., Leinwand, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situhybridization+to+DNA.">Fluorescence in situhybridization to DNA.</a> Cells: A Laboratory Manual. 3, 111.111-111.136 (1998).</li><li>Singer, R. H., Spector, D. L., Goldman, R. D., Leinwand, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+to+RNA.">In situ hybridization to RNA.</a> Cells: A Laboratory Manual. 3, 111-116 (1998).</li><li>Gardner, E. J., Nizami, Z. F., Talbot, C. C., Gall, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+intronic+sequence+RNA+(sisRNA),+a+new+class+of+noncoding+RNA+from+the+oocyte+nucleus+of+Xenopus+tropicalis.">Stable intronic sequence RNA (sisRNA), a new class of noncoding RNA from the oocyte nucleus of Xenopus tropicalis.</a> Genes Dev. 26, 2550-2559 (2012).</li><li>Talhouarne, G. J., Gall, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lariat+intronic+RNAs+in+the+cytoplasm+of+Xenopus+tropicalis+oocytes.">Lariat intronic RNAs in the cytoplasm of Xenopus tropicalis oocytes.</a> RNA. 20, 1476-1487 (2014).</li><li>Duryee, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+nuclei+and+non-mitotic+chromosome+pairs+from+frog+eggs.">Isolation of nuclei and non-mitotic chromosome pairs from frog eggs.</a> Arch. Exp. Zellforsch. 19, 171-176 (1937).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Kurbağalar ve salamanders el-izole GVs gelen &quot;yaşam&quot; LBCs ilk gözlemler floresan immün önce ve FISH önce, Amerikan biyolog William Duryee, faz kontrast ve DIC mikroskopi giriş önce 19 tarafından yaklaşık 80 yıl önce yapılmıştır. gerçekçi bir şekilde bunları düzeltmek için, ve temel morfolojisi bozmadan moleküler teknikler uygulamak için, cam slaytlar LBCs takmak için teknikler bireysel gen düzeyinde gerekli gelişimini kromozom yapısı ve transkripsiyon detaylarını ara?...

Çoğu omurgalıların, keseliler ve plasentalı memelilerin önemli hariç, büyük yolky yumurta üretmek. onların bazen muazzam boyutlarına rağmen, bu yumurtalar dişi yumurtalıkta ise hala nihai bir boyut ulaşmak tek hücrelerdir. Yumurtalık yumurta oosit denir ve her biri tipik sadece germinal vezikül veya GV gibi erken 19. yüzyıldan beri bilinen tek ve dev bir çekirdeğe içerir. Ortak laboratuvar kurbağalar, Xenopus laevis ve Xenopus tropicalis 1 Oositler, 1.2 mm ve 0.8 mm sırasıyla (Şekil 1) bir maksimal çapı ulaşır. Çapı 0.4 mm (Şekil 2, 3) - Bu iki kurbağa olgun oosit gelen GV 0.3 vardır. Salamanders genellikle daha büyük oosit ve GVS var. Meksika Axolotl, Ambystoma mexicanum Tamamen olgun oosit, çapı en fazla 2 mm ve GV 0.5 mm&#39;dir. Bu durumda, bu çekirdekler çıplak göz ve kutu kolaylıkla görebilirTipik somatik hücre çekirdekleri ile imkansız birçok yönden manipüle edilebilir. Eşit olağanüstü GV, 19. yüzyılın sonunda zaten tanınan bir gerçeği içinde kromozomların dev boyutudur. Ambystoma ve diğer semender Bireysel kromozom uzunluğu en fazla 1 mm (Şekil 4, 5) olabilir. 100 um veya daha fazla uzunluğa sahip, en organizmaların normal somatik kromozom cüce, ancak Xenopus olanlar, daha küçük önemli bulunmaktadır. Eşleştirilmiş yanal döngüler yüzlerce (Şekil 5) - oosit kromozom önemli bir özelliği onların en karakteristik morfolojik özelliklerinden biri neden olağanüstü transkripsiyonel aktivite vardır. Her döngü aktif RNA sentez, bir ya da bir kaç transkripsiyon birimi içerir. döngüler oosit onların yüzeysel sonra adı &quot;lampbrush&quot; kromozomun yol açan bir bulanık bir görünüm, kromozom vermekgaz lambası bacaları temizlemek için önceki zamanlarda kullanılan fırçalara benzerliği. 2 Bu çalışmanın odak LBCs ve nükleer organelleri (nükleol, histon eğrisi organları ve benekleri) incelemek için izole GVs kullanımı üzerindedir. İki oldukça farklı teknikler tarif edilecektir. İlk olarak, daha yaygın teknikte, GVs kısa yapışık sarısı uzaklaştırılması için yıkanır, takı forseps kullanılarak bir tuzlu su çözeltisi içinde izole edilmiştir ve çekirdek zarı takı forseps ile tekrar çıkartılır. LBCs ve nükleer organelleri içeren jelatinli içeriği, bir cam mikroskop lamı veya lamel üzerine yerleşmek için izin verilir. Bu gibi terkipler, faz kontrastı ya da DIC mikroskop ile doğrudan incelenebilir. Seçenek olarak ise, preparatlar slayt veya lamel LBCs ve organeller takmak için santrifüj olabilir. Bu gibi preparasyonlar, başta, bağışıklık ve flüoresan olarak, nükleik asitlerin ve proteinlerin ayrıntılı moleküler analiz için işlenebilirin situ hibridizasyon (FISH) t. 3-7 İkinci bir teknik, mineral yağ içinde GV izole edilmesini gerektirmektedir. 8 Yağ izole GVs saatlerce transkripsiyonal olarak aktif kalır ve bir çekirdek içindeki mümkün olduğu kadar gerçekçi olmasını isteyen çalışmalar için potansiyel olarak yararlıdır. Nükleer &quot;sap&quot; kırılma indeksi LBCs ve diğer nükleer organellerin (Şekil 3) birbirine çok yakın olduğu için 9,10, mikroskobik teknikler yağ izole GVs ile bir sorun olabilir. Son olarak, çünkü boyutu ve manipülasyon kolaylığı, GVs çekirdek zarfına ilgili çalışmalar için ideal bir malzemedir. Nükleer gözenek kompleksi ilk amfibi GV zarf 11 ve daha yeni superresolution gözlemlere elektron mikroskobik çalışmalar açıklanan aynı malzemeyi kullandık. 12,13

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1562">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Paraformaldehyde (reagent grade, crystalline)</td>
			<td style="width:301px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:213px;">P6148-500G</td>
			<td style="width:643px;">Despite warnings in many protocols, a concentrated solution can be stored indefinitely at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040-100G</td>
			<td>Sometimes referred to as MS-222</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethicon RB-1 1/2 circle taper point 3-0 sutures</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>95057-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraplast (paraffin wax)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3558-1KG</td>
			<td style="width:643px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">p-Phenylenediamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gelatin</td>
			<td>Grocery Store</td>
			<td></td>
			<td>Commercial Knox gelatin works fine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ProLong Gold antifade mountant</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P10144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gold Seal cover glass&#160; 22 x 22 mm #1 1/2 (0.16-0.19 mm thick)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>63786-01</td>
			<td>These coverslips are the recommended thickness for superresolution microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont forceps #5</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72700-D</td>
			<td>http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_positive_action.aspx</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraffin oil (light)&#160;</td>
			<td>EMD Chemicals</td>
			<td>PX0047-1</td>
			<td>For isolating GVs in oil</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adhesive in situ PCR and hybridization chambers (25 &#181;l).</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>Frame-Seal Slide Chambers #SLF0201</td>
			<td>http://www.bio-rad.com/en-us/sku/slf0201-frame-seal-slide-chambers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone isolators</td>
			<td>Grace-Biolabs</td>
			<td>select from catalog link</td>
			<td>http://www.gracebio.com/life-science-products/microfluidics/silicone-isolators.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coplin jars and staining dishes</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>select from catalog link</td>
			<td>http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/histology/staining.aspx</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of giant lampbrush chromosomes from living oocytes of frogs and salamanders

Biz kurbağa ve semender ve oosit ya da unlaid yumurta, bulunan dev transkripsiyonel olarak aktif lampbrush kromozom (LBCs) çalışmak için yöntemler açıklanmaktadır. Bağımsız LBCs uzunluğu en fazla 1 mm olabilir ve çapı 0.5 mm, dev bir çekirdekte kendisini bulunur. kromozomların büyük boyutlu ışık optik mikroskop ile aktif genlerin eşsiz gözlemleri izin, ama aynı zamanda özel teknikler, çekirdeğin izole nükleer zarfı kaldırarak ve bir mikroskop lamı üzerine kromozom yaymak için gereklidir. Ayrıca, germinal vesicle (GV) olarak adlandırılan oosit çekirdeği, çekirdek aktin kısmi jelleşme izin verir ve LBCs hassas yapısını koruyan bir ortamda izole edilir. Bu adım kuyumcuya forseps kullanarak bir mikroskop altında elle yapılır. Sonraki nükleer zarf kuyumcu forseps ile tekrar el kaldırılır. çekirdek içindeki hızlı bir şekilde dağılma, bir ortama transfer ediliraktin jel RBDÖ ve hasarsız LBCs bir mikroskop lamı üzerine yerleşmek için izin verir. ince ayrıntılar Brown hareketi tarafından gizlenmiş olmasına rağmen bu noktada LBCs ve diğer nükleer organeller, faz kontrast veya diferansiyel girişim kontrast mikroskobu ile görülebilir. yüksek çözünürlüklü mikroskobik gözlem veya moleküler analiz için, tüm hazırlık slayt sıkıca hassas LBCs takmak için santrifüj edilir. Paraformaldehid kısa tespit sonra immunofluorescent boyama ya da in situ hibridizasyon takip edilir. LBCs bir transkripsiyonel olarak aktif durumda olan ve onların büyük boy konfokal ya da süper çözünürlük mikroskopi kullanılarak bireysel gen düzeyinde moleküler analiz izin verir.

Dev lampbrush kromozomlarını inceleyen bir kurbağa ya da semender oosit izole ederek başlar. Şekil 1, kurbağa, Xenopus överden çıkarıldıktan sonra tamponlu tuzlu su çözeltisi içinde, olgun oosit, bir grubu gösterir. Bu oositler, oda sıcaklığında gün iyi durumda kalır. Çekirdeği (ya da germinal vesicle) daha sonra ya bir tuz çözeltisi (Şekil 2) ya da yağ içinde, takı forsepsle bir oosit (Şekil 3) ç?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Giant Lampbrush Chromosomes from Living Oocytes of Frogs and Salamanders at JoVE.com

Isolation of Giant Lampbrush Chromosomes from Living Oocytes of Frogs and Salamanders

Biz kurbağa ve semender ve oosit yaşayan dev transkripsiyonel olarak aktif lampbrush kromozomları izole etmek için basit teknikleri sunuyoruz. Biz faz kontrast ya da diferansiyel girişim kontrast ve nasıl situ hibridizasyon veya immunofluorescent boyama floresan için bunları düzeltmek için tarafından &quot;canlı&quot; bu kromozom gözlemlemek açıklanmıştır.

Kurbağalar ve Salamanderler Yaşayan Oositlerinin Dev Lampbrush Kromozomların İzolasyonu

We describe methods for studying the giant transcriptionally active lampbrush chromosomes (LBCs) found in the oocyte, or unlaid egg, of frogs and ...

isolation-giant-lampbrush-chromosomes-from-living-oocytes-frogs

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Genetics

Unit 1

DNA and Chromosome Structure

SCIENTISTS IN ACTION

12.9K Görüntüleme.  Carnegie Institution for Science.  Biz kurbağa ve semender ve oosit yaşayan dev transkripsiyonel olarak aktif lampbrush kromozomları izole etmek için basit teknikleri sunuyoruz. Biz faz kontrast ya da diferansiyel girişim kontrast ve nasıl situ hibridizasyon veya immunofluorescent boyama floresan için bunları düzeltmek için tarafından "canlı" bu kromozom gözlemlemek açıklanmıştır. 

Video: Isolation of Giant Lampbrush Chromosomes from Living Oocytes of Frogs and Salamanders

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal transduction pathways, transcriptional regulatory networks, gene expression, genome-editing, and gene-silencing. Furthermore, significant progress has been made in the regeneration of plants from protoplasts, which has generated even more interest in the use of these systems for plant genomics. In this work, a protocol has been developed for automation of protoplast isolation and transformation from a &#39;Bright Yellow&#39; 2 (BY-2) tobacco suspension culture using a robotic platform. The transformation procedures were validated using an orange fluorescent protein (OFP) reporter gene (pporRFP) under the control of the Cauliflower mosaic virus 35S promoter (35S). OFP expression in protoplasts was confirmed by epifluorescence microscopy. Analyses also included protoplast production efficiency methods using propidium iodide. Finally, low-cost food-grade enzymes were used for the protoplast isolation procedure, circumventing the need for lab-grade enzymes that are cost-prohibitive in high-throughput automated protoplast isolation and analysis. Based on the protocol developed in this work, the complete procedure from protoplast isolation to transformation can be conducted in under 4 hr, without any input from the operator. While the protocol developed in this work was validated with the BY-2 cell culture, the procedures and methods should be translatable to any plant suspension culture/protoplast system, which should enable acceleration of crop genomics research.

A high-throughput, automated, tobacco protoplast production and transformation methodology is described. The robotic system enables massively parallel gene expression and discovery in the model BY-2 system that should be translatable to non-model crops.

Yüksek verim Protoplast İzolasyonu ve Dönüşüm için Robotik Platformu

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Genetik

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an excellent model for rapid assessment of whole transcriptome from whole animal or individual cell populations due to the ease of isolation of RNA from large numbers of animals. Here a protocol for global gene expression analysis in zebrafish embryos using RNA sequencing (RNASeq) is presented. We describe preparation of RNA from whole embryos or from cell populations obtained using cell sorting in transgenic animals. We also describe an approach for analysis of RNASeq data to identify enriched pathways and Gene Ontology (GO) terms in global gene expression data sets. Finally, we provide a protocol for validation of gene expression changes using quantitative reverse transcriptase PCR (qRT-PCR). These protocols can be used for comparative analysis of control and experimental sets of zebrafish to identify novel gene expression changes, and provide molecular insight into phenotypes of interest.

This protocol presents an approach for whole transcriptome analysis from zebrafish embryos, larvae, or sorted cells. We include isolation of RNA, pathway analysis of RNASeq data, and qRT-PCR-based validation of gene expression changes.

Numune hazırlama ve analiz RNASeq tabanlı gen ifadesi verileri Zebra balığı

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Formaldehyde-assisted Isolation of Regulatory Elements to Measure Chromatin Accessibility in Mammalian Cells

Appropriate gene expression in response to extracellular cues, that is, tissue- and lineage-specific gene transcription, critically depends on highly defined states of chromatin organization. The dynamic architecture of the nucleus is controlled by multiple mechanisms and shapes the transcriptional output programs. It is, therefore, important to determine locus-specific chromatin accessibility in a reliable fashion that is preferably independent from antibodies, which can be a potentially confounding source of experimental variability. Chromatin accessibility can be measured by various methods, including the Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements (FAIRE) assay, that allow the determination of general chromatin accessibility in a relatively low number of cells. Here we describe a FAIRE protocol that allows simple, reliable, and fast identification of genomic regions with a low protein occupancy. In this method, the DNA is covalently bound to the chromatin proteins using formaldehyde as a crosslinking agent and sheared to small pieces. The free DNA is afterwards enriched using phenol:chloroform extraction. The ratio of free DNA is determined by quantitative polymerase chain reaction (qPCR) or DNA sequencing (DNA-seq) compared to a control sample representing total DNA. The regions with a looser chromatin structure are enriched in the free DNA sample, thus allowing the identification of genomic regions with lower chromatin compaction.

The plasticity of nuclear architecture is controlled by dynamic epigenetic mechanisms including non-coding RNAs, DNA methylation, nucleosome repositioning as well as histone composition and modification. Here we describe a Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements (FAIRE) protocol which allows the determination of chromatin accessibility in a reproducible, inexpensive, and straightforward manner.

Düzenleyici elemanlarının ölçü Kromatin erişilebilirlik memeli hücrelerinde formaldehit destekli izolasyon

Appropriate gene expression in response to extracellular cues, that is, tissue- and lineage-specific gene transcription, critically depends on highly ...

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively correlated with maternal age, age alone is not always predictive of the risk of generating an aneuploid embryo. Therefore, gene variants might account for incorrect chromosome segregation during oogenesis. Given that access to human oocytes is limited for research purposes, a series of assays were developed to study human gene function during meiosis I using mouse oocytes. First, messenger RNA (mRNA) of the gene and gene variant of interest are microinjected into prophase I-arrested mouse oocytes. After allowing time for expression, oocytes are synchronously released into meiotic maturation to complete meiosis I. By tagging the mRNA with a sequence of a fluorescent reporter, such as green fluorescent protein (Gfp), the localization of the human protein can be assessed in addition to the phenotypic alterations. For example, gain or loss of function can be investigated by establishing experimental conditions that challenge the gene product to fix meiotic errors. Although this system is advantageous in investigating human protein function during oogenesis, adequate interpretation of results should be undertaken given that protein expression is not at endogenous levels and, unless controlled for (i.e. knocked out or down), murine homologs are also present in the system.

As the genetic variants associated with human disease begin to become uncovered, it is becoming increasingly important to develop systems with which to rapidly evaluate the biological significance of those identified variants. This protocol describes methods for evaluating human gene function during female meiosis I using mouse oocytes.

Mayoz sırasında insan gen işlevini değerlendirmek için fare yumurta kullanarak ben

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such as initial massive cell death and low therapeutic effects, impaired their broad clinical translation. Genetic engineering of stem cells prior to transplantation emerged as a promising method to optimize therapeutic stem cell effects. However, safe and efficient gene delivery systems are still lacking. Therefore, the development of suitable methods may provide an approach to resolve current challenges in stem cell-based therapies.
The present protocol describes the extraction and characterization of human dental follicle stem cells (hDFSCs) as well as their non-viral genetic modification. The postnatal dental follicle unveiled as a promising and easily accessible source for harvesting adult multipotent stem cells possessing high proliferation potential. The described isolation procedure presents a simple and reliable method to harvest hDFSCs from impacted wisdom teeth. Also this protocol comprises methods to define stem cell characteristics of isolated cells. For genetic engineering of hDFSCs, an optimized cationic lipid-based transfection strategy is presented enabling highly efficient microRNA introduction without causing cytotoxic effects. MicroRNAs are suitable candidates for transient cell manipulation, as these small translational regulators control the fate and behavior of stem cells without the hazard of stable genome integration. Thus, this protocol represents a safe and efficient procedure for engineering of hDFSCs that may become important for optimizing their therapeutic efficacy.

This protocol describes the transient genetic engineering of dental stem cells extracted from the human dental follicle. The applied non-viral modification strategy may become a basis for the improvement of therapeutic stem cell products.

Yalıtım, karakterizasyonu ve insan diş kökü kök hücrelerin genetik değişiklik mikroRNA tabanlı

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in telomere biology, including heterochromatin formation and telomere length homeostasis. Recent findings revealed that TERRA molecules also interact with internal chromosomal regions to regulate gene expression in mouse embryonic stem (ES) cells. In line with this evidence, RNA fluorescence in situ hybridization (RNA-FISH) analyses have shown that only a subset of TERRA transcripts localize at chromosome ends. A better understanding of the dynamics of TERRA molecules will help define their function and mechanisms of action. Here, we describe a method to label and visualize single-telomere TERRA transcripts in cancer cells using the MS2-GFP system. To this aim, we present a protocol to generate stable clones, using the AGS human stomach cancer cell line, containing MS2 sequences integrated at a single subtelomere. Transcription of TERRA from the MS2-tagged telomere results in the expression of MS2-tagged TERRA molecules that are visualized by live-cell fluorescence microscopy upon co-expression of a MS2 RNA-binding protein fused to GFP (MS2-GFP). This approach enables researchers to study the dynamics of single-telomere TERRA molecules in cancer cells, and it can be applied to other cell lines.

Here, we present a protocol to generate cancer cell clones containing a MS2 sequence tag at a single subtelomere. This approach, relying on the MS2-GFP system, enables visualization of the endogenous transcripts of telomeric repeat-containing RNA (TERRA) expressed from a single telomere in living cells.

Canlı hücreler içinde tek bir telomer üzerinden ifade Telomeric tekrar içeren RNA TERRA görselleştirmek için kanser hücre klonlar nesil

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in ...

Isolation of Papillary and Reticular Fibroblasts from Human Skin by Fluorescence-activated Cell Sorting

Fibroblasts are a highly heterogeneous cell population implicated in the pathogenesis of many human diseases. In human skin dermis, fibroblasts have traditionally been attributed to the superficial papillary or lower reticular dermis according to their histological localization. In mouse dermis, papillary and reticular fibroblasts originate from two different lineages with diverging functions regarding physiological and pathological processes and a distinct cell surface marker expression profile by which they can be distinguished.
Importantly, evidence from explant cultures from superficial and lower dermal layers suggest that at least two functionally distinct dermal fibroblasts lineages exist in human skin dermis as well. However, unlike for mouse skin, cell surface markers enabling the discrimination of different fibroblast subsets have not yet been established for human skin. We developed a novel protocol for the isolation of human papillary and reticular fibroblast populations via fluorescence-activated cell sorting (FACS) using the two cell surface markers Fibroblast Activation Protein (FAP) and Thymocyte antigen 1 (Thy1)/CD90. This method enables the isolation of pure fibroblast subsets without in vitro manipulation, which was shown to affect gene expression, thus permitting accurate functional analysis of human dermal fibroblast subsets in regard to tissue homeostasis or disease pathology.

This manuscript describes a FACS-based protocol for isolation of papillary and reticular fibroblasts from human skin. It circumvents in vitro culture which was inevitable with the commonly used isolation protocol via explant cultures. The emanating fibroblast subsets are functionally distinct and display differential gene expression and localization within the dermis.

Floresan-aktif hücre sıralama ile ınsan derisinden papiller ve Reiküler fibroblastların izolasyonu

Fibroblasts are a highly heterogeneous cell population implicated in the pathogenesis of many human diseases. In human skin dermis, fibroblasts have ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, and was deployed to West Africa during the recent Ebola virus epidemic, highlighting this possibility. In addition to its practical advantages (low cost, ease of equipment transport and use), this technology also provides fundamental advantages over second-generation sequencing approaches, particularly the very long read length, ability to directly sequence RNA, and real-time availability of data. Raw read accuracy is lower than with other sequencing platforms, which represents the main limitation of this technology; however, this can be partially mitigated by the high read depth generated. Here, we present a field-compatible protocol for sequencing of the mRNAs encoding for Niemann-Pick C1, which is the cellular receptor for ebolaviruses. This protocol encompasses extraction of RNA from animal blood samples, followed by RT-PCR for target enrichment, barcoding, library preparation, and the sequencing run itself, and can be easily adapted for use with other DNA or RNA targets.

Nanopore sequencing is a novel technology that allows cost-effective sequencing in remote locations and resource-poor settings. Here, we present a protocol for sequencing of mRNAs from whole blood that is compatible with such conditions.

Nanopore sıralamayı kullanarak tüm kan mRNA sıralaması

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), quantitative, real-time RT-PCR (RT-qPCR) and RNA sequencing. When these techniques are performed using a single oocyte or embryo, low-copy mRNAs are not reliably detected. To overcome this problem, oocytes or embryos can be pooled together for analysis; however, this often leads to high variability amongst samples. In this protocol, we describe the use of fluorescence in situ hybridization (FISH) using branched DNA chemistry. This technique identifies the spatial pattern of mRNAs in individual cells. When the technique is coupled with Spot Finding and Tracking&#160;computer software, the abundance of mRNAs in the cell can also be quantified. Using this technique, there is reduced variability within an experimental group and fewer oocytes and embryos are required to detect significant differences between experimental groups. Commercially available branched-DNA SM-FISH kits have been optimized to detect mRNAs in sectioned tissues or adherent cells on slides. However, oocytes do not effectively adhere to slides and some reagents in the kit were too harsh resulting in oocyte lysis. To prevent this lysis, several modifications were made to the FISH kit. Specifically, oocyte permeabilization and wash&#160;buffers designed for the immunofluorescence of oocytes and embryos replaced the proprietary buffers. The permeabilization, washes, and incubations with probes and amplifier were performed in 6-well plates and oocytes were placed on slides at the end of the protocol using mounting media. These modifications were able to overcome the limitations of the commercially available kit, in particular, the oocyte lysis. To accurately and reproducibly count the number of mRNAs in individual oocytes, computer software was used. Together, this protocol represents an alternative to PCR and sequencing to compare the expression of specific transcripts in single cells.

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization SM-FISH to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

To reproducibly count the numbers of mRNAs in individual oocytes, single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (RNA-FISH) was optimized for non-adherent cells. Oocytes were collected, hybridized with the transcript specific probes, and quantified using an image quantification software.

Tek molekül floresan ın Situ hibridizasyon (SM-balık) kullanmak için fare yumurta miktarını ve Localize mRNA

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), ...

High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often performed at low throughput, it is moreover time-consuming and error-prone, even more so when multiplexing several plasmids. We developed an easy, fast, and accurate method to perform cell transfection in a 384-well plate layout using acoustic droplet ejection (ADE) technology. The nanodispenser device used in this study&#160;is based on this technology and allows precise nanovolume delivery at high speed from a source well plate to a destination one. It can dispense and multiplex DNA and transfection reagent according to a predesigned spreadsheet. Here we present an optimal protocol to perform ADE-based high-throughput plasmid transfection which makes it possible to reach an efficiency of up to 90% and a nearly 100% cotransfection in cotransfection experiments. We extend initial work by proposing a user-friendly spreadsheet-based macro, able to manage up to four plasmids/wells from a library containing up to 1,536 different plasmids, and a tablet-based pipetting guide application. The macro designs the necessary template(s) of the source plate(s) and generates the ready-to-use files for the nanodispenser and tablet-based application. The four-steps transfection protocol involves i) a diluent dispense with a classical liquid handler, ii) plasmid distribution and multiplexing, iii) a transfection reagent dispense by the nanodispenser, and iv) cell plating on the prefilled wells. The described software-based control of ADE plasmid multiplexing and transfection allows even nonspecialists in the field to perform a reliable cell transfection in a fast and safe way. This method enables rapid identification of optimal settings for a given cell type and can be transposed to higher-scale and manual approaches. The protocol eases applications, such as human ORFeome protein (set of open reading frames [ORFs] in a genome) expression or CRISPR-Cas9-based gene function validation, in nonpooled screening strategies.

This protocol describes high-throughput plasmid transfection of mammalian cells in a 384-well plate using acoustic droplet ejection technology. The time-consuming, error-prone DNA dispensing and multiplexing, but also the transfection reagent dispensing, are software-driven and performed by a nanodispenser device. The cells are then seeded in these prefilled wells.

Akustik Nanodispensing teknolojisini kullanarak yüksek verim DNA Plasmid multiplexing ve transfeksiyon

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often ...