Üçüncü nesil nanopore sıralama çok kolay örnekleri geniş bir yelpazede dizi bilgi elde etmenizi sağlayan güçlü bir roman sıralama teknolojisidir. Bu tekniğin başlıca avantajları sıralama aygıtının taşınabilirliği, son derece uzun okuma uzunluğu ve verilerin gerçek zamanlı kullanılabilirliğidir. Nanopore sıralama uzak yerlerde hastalık salgınları sırasında özellikle yararlı bir teknolojidir.
Batı ve Orta Afrika'daki Ebola virüsü salgınları sırasında ve sonrasında saha laboratuvarlarında başarıyla kullanılmaktadır. Nanospor eki ve minIon cihazının bu amaçla kullanımı oldukça kolaydır, kütüphane hazırlama ve akış hücresi yükleme sırasında dikkatli olunmalıdır. Bu prosedürü başlatmak için, bir mikrolitre şablonu ile 50 mikrolitre reaksiyon hacmi uygun reaksiyon tamponu ile sıcak bir başlangıç yüksek sadakat DNA polimeraz kullanarak astar seti ile cDNA yükseltmek için bir touchdown PCR ayarlayın.
Mümkünse, buz üzerinde veya serin bir blok ta dört santigrat derece de reaksiyon ayarlayın. Metin protokolünde belirtildiği gibi reaksiyonu bir termocycler'da kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, PCR ürününün 50 mikrolitresini 1,5 mililitrelik DNA düşük bağlama reaksiyon tüpüne aktarın.
Girdap ederek manyetik boncukları iyice yeniden askıya alın. Sonra PCR reaksiyona boncuk 50 mikrolitre ekleyin ve iyice karıştırın. 15 RPM'de dönerken numuneyi oda sıcaklığında beş dakika boyunca dönen bir mikserüzerinde kuluçkaya yatırın.
Kısaca örnek aşağı spin ve sonra manyetik boncuk pelet için bir manyetik raf üzerine tüp yerleştirin. Devam etmeden önce süpernatant tamamen açıklığa kavuşana kadar bekleyin. Sonra, boncuk pelet rahatsız etmeden supernatant aspire ve atın.
Pipet 200 mikrolitre 70% etanol reaksiyon tüpü içine ve oda sıcaklığında 30 saniye kuluçka. Boncuk peletini bozmadan etanol aspire edin ve atın. Toplam iki yıkama için bu yıkama işlemini bir kez daha etanol ile tekrarlayın.
Hava oda sıcaklığında bir dakika pelet kuru. Daha sonra reaksiyon tüpünü manyetik raftan çıkarın. Peleti 30 mikrolitre nükleazsız suda yeniden askıya alın ve oda sıcaklığında iki dakika kuluçkaya yatırın.
Reaksiyon tüpünü manyetik rafa geri yerleştirin ve reaksiyon boncukları tamamen peleted kadar bekleyin. Bundan sonra, pelet rahatsız etmeden supernatant çıkarın ve yeni bir 1.5 mililitre reaksiyon tüpüne aktarın. Birkaç örnek aynı anda sıralanacaksa, barkodlar daha önce gösterildiği gibi DNA temizliği nin ardından iki ek PCR adımı yla eklenebilir.
İlk olarak, 0,2 mililitrelik bir reaksiyon tüpünde 45 mikrolitrelik bir hacimde toplam bir mikrogram DNA için her örnekten eşit miktarda barkodlu DNA'yı birleştirin. dA-Tailing için, son hazırlık reaksiyon arabelleği yedi mikrolitre, son hazırlık enzim karışımı üç mikrolitre ve çekirdeksiz su beş mikrolitre ekleyin. Yavaşça karıştırmak için tüp flick.
Bir termocycler, 20 santigrat derece beş dakika boyunca reaksiyon kuluçka ve 65 santigrat derece beş dakika takip. Ardından, metin protokolünde belirtildiği gibi tepkime ürününün PCR arınmasını gerçekleştirin. İsteğe bağlı olarak, uv spektrofotometre kullanarak numunenin konsantrasyonu ölçmek için bir mikrolitre alın.
Daha önce elde edilmiş saflaştırılmış DNA'nın 22,5 mikrolitresini 1D2 adaptörü2,5 mikrolitre ve Blunt/TA Ligase Master Mix'in 25 mikrolitresini yeni bir 1,5 mililitrelik DNA düşük bağlama reaksiyon tüpünde birleştirin. Yavaşça karıştırmak için tüp flick. Kısaca karışımı aşağı spin ve 10 dakika oda sıcaklığında kuluçka.
Daha sonra metin protokolünde belirtildiği gibi reaksiyon ürün PCR arıtma gerçekleştirin. Reaksiyon ürününün 45 mikrolitresini beş mikrolitre barkod adaptörü karışımı ve 50 mikrolitre Blunt/TA Ligase Master Mix'i DNA düşük bağlayıcı reaksiyon tüpünde birleştirin. Yavaşça karıştırmak ve oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın.
Metin protokolünde açıklandığı gibi reaksiyon ürünarındırın ve kullanıma hazır olana kadar buz veya dört santigrat derece üzerinde saklayın. Başlamak için, kullanmadan önce akış hücresi üzerinde bir kalite denetimi gerçekleştirin. Bu amaçla, sıralama aygıtını ana bilgisayara bağlayın ve yazılımı açın.
Sıralama cihazına bir akış hücresi yerleştirin. Ardından seçici kutusundan akış hücresi türünü seçin ve onaylamak için kullanılabilir'i tıklatın. Ekranın alt kısmında, akış hücresini denetle'yi tıklatın ve doğru akış hücresi türünü seçin.
Kalite denetimini başlatmak için testi başlat'ı tıklatın. Akış hücresinin kullanılabilir olabilmesi için toplam da en az 800 aktif nanogözenek gereklidir. İlk olarak, saat yönünde kaydırarak astar bağlantı noktası kapağını açın.
P1000 pipeti 200 mikrolitreye ayarlayın ve ucu astar bağlantı noktasına takın. Daha sonra pipeti 230 mikrolitreye ayarlayarak ucu astar bağlantı noktasında tutarak 20 ila 30 mikrolitre tampon toplayın ve hava kabarcıklarını çıkarın. Yeni bir 1.5 mililitre DNA düşük bağlama reaksiyon tüpünde, 576 mikrolitre RBF tamponu ile 624 mikrolitre nükleaz içermeyen suyu birleştirerek astar karışımını hazırlayın.
Özenle hazne 800 mikrolitre hazırlanan astar karışımı astar bağlantı noktasına ve beş dakika bekleyin. Bundan sonra, numune port kapağını ve pipeti, hazırlanan astar karışımının 200 mikrolitrelik ek kısmını astar bağlantı noktasına kaldırın. Pipet 35 mikrolitre RBF tampon yeni bir temiz içine 1.5 mililitre DNA düşük bağlama reaksiyon tüpü.
Iyice pipetleme tarafından LLB boncuk karıştırın ve RBF tampon boncuk 25,5 mikrolitre ekleyin. Daha sonra, 2,5 mikrolitre çekirdeksiz su ve 12 mikrolitre DNA kitaplığı ekleyin ve pipetleme ile karıştırın. Örnek bağlantı noktası üzerinden akış hücresine yavaş bir damla akıllıca moda örnek karışımı 75 mikrolitre ekleyin.
Ardından örnek bağlantı noktası kapağını değiştirin, astar bağlantı noktasını kapatın ve sıralama cihazının kapağını kapatın. Yazılım içinde, akış hücresinin hala kullanılabilir olduğunu doğrulayın. Yeni bir deneme açın ve kullanılan kiti seçerek çalışma parametrelerini ayarlayın.
Canlı taban araması'nı seçin. Denemeyi başlat'ı tıklatarak çalıştırmayı başlatın. Yeterli deneysel veri toplanana kadar sıralama çalışmasına devam edin.
Temsili bir deneyde, RNA beş hayvan türünden 10 farklı kan örneğinden elde edilir. RNA konsantrasyonları mikrolitre başına 43 nanogram ile 543 nanogram arasında gözlenmektedir. RT-PCR tarafından amplifikasyon sonra, MPC1 PCR ürünlerinin jel analizi örnekleri BC01 ve BC02 için belirgin zayıf bantları ile çeşitli sonuçlar gösterir.
Farklı türlerin MCP1 genine astar bağlanmasındaki farklılıklar nedeniyle PCR etkinliğindeki farklılıklar dışlanamamakla birlikte, bu farklılıklar büyük olasılıkla numune kalitesindeki farklılıklardan kaynaklanmaktadır. Ancak, verim ve/veya amplifikasyon verimliliğindeki bu farklılıklar genel sıralama sonucunu belirgin bir şekilde etkilemez. Elde edilen 10,000 okumaalt kümesi seçilir ve daha fazla analiz için demultiplexed.
Analiz edilen 10,000 okumadan 5,457'si, iş akışımızın bir parçası olarak yükseltilen PCR parçaları için beklenen boyutlarla eşleşen 1, 750 ve 2, 000 nükleotit arasında bir uzunluk göstermektedir. Okuma uzunluğu dağılımında 250 ile 500 nükleotit arasında spesifik olmayan PCR ürünlerine atfedilen ek bir tepe gözlenir. Okumaların demultiplexing analiz 10 örneklerinden birine okuma% 87.6 atama sağlar.
Bu yöntem oldukça güvenilir olmakla birlikte, alan koşullarında, PCR amplifikasyon en sorunlu adımdır. Deneyimlerimiz sırasında, hedef dizilerini yükseltmek için iç içe protokoller genellikle gerekliydi. Hayvan konak genleri sıralama yanı sıra, bu yöntem de viral veya bakteriyel patojenler de dahil olmak üzere herhangi bir DNA veya RNA diziiçin kullanılabilir.
Nanopore sıralama bu nedenle giderek hastalık salgınları sırasında veya uzak yerlerde bilimsel çalışmalar için değil, aynı zamanda uzun okuma uzunlukları heyecan verici yeni araştırma olanakları açmak düzenli laboratuvarlarda sadece kullanılır. Kullanılan reaktiflerin hiçbiri özellikle tehlikeli olmamakla birlikte, standart iyi laboratuvar uygulamaları takip edilmelidir. Açıkçası hastalık ajanları sıralarken, bu ajanları n için gerekli tüm önlemlere uyulmalıdır.
