We would like to thank Ainara Ruiz de Sabando for providing H&amp;E images. This work was supported by grants from the National Institutes of Health (DK052230, DK093680 and CA172113) awarded to Dr. Vincent W. Yang.

1. Fare <ol><li> fareler içeren tüm çalışmalar Stony Brook Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Fareler 12:12 saat ışık-karanlık döngüsünde tutulmuştur. <ol><li> Ticari olarak C57BL / 6 fareleri elde edin. LoxP siteleri tarafından çevrili Klf5 allelleri (Klf5 f l / f l) taşıyan C57BL / 6 fareler elde edin. Bu fareler, daha önce 21 tarif nazikçe Dr. Ryozo Nagai tarafından temin edildi. </li></ol></li><li> Lgr5 organizatörü (Lgr5 EGFP / CreERT2 fareler) düzenlemesi altında indüklenebilir Cre rekombinaz geni taşıyan C57BL / 6 fareler satın alın. </li><li> Lgr5 EGFP / CreER T2 / Klf5 f l / f l fareler kurmak, çapraz Klf5 fl / f Lgr5 EGFP / CreER T2 fareler ve daha sonra Klf5 fl / f l döl geri-melez l fareler </sup&gt; fareler. </li><li> Protokole göre tamoksifen ile muamele fareler daha önce 22 nitelendirdi. Birbirini takip eden 5 gün süre ile, steril bir mısır yağı içinde çözülmüş tamoksifen 1 mg (10 mg / ml), 8 haftalık bir deney ve kontrol fareleri intraperitonal (İP) enjekte edilir. </li><li> İlk tamoksifen enjeksiyondan sonra 14. günde, 2. gaz kaynağı CO bağlı bir bölme yerleştirerek CO2 boğulmaya kullanılarak fareler kurban. fareler bilinçsiz ve tüm hareketleri sona erene kadar gaz odasına akmasına izin verin. ötanazi servikal dislokasyon gerçekleştirmek sağlamak. </li></ol> 2. Doku Hazırlama ve İsviçre Rolling <ol><li> diseksiyon forseps ve makas kullanılarak, karın tarafı deride bir kesi kesti. forseps bir çift ile, kesi cildi tutun ve yavaşça karın kas dokusundan çekin. karın kasları, karın cildi kesip maruz bir makas kullanın. </li><li> Tutun ve pe yukarı çekinforseps ile ritoneum. tutan ve bağırsakların çekerek olmamak emin olun. Dikkatle periton dokusunda bir kesi yapmak ve karın kasları ortaya çıkarmak için cildi kesilip devam ediyor. Dikkatle karın kaslarının bir kesi yapmak ve bağırsakları maruz onları uzak kesme devam ediyor. </li><li> kolon tanımlamak ve rektum / anüs katıldı uzak ucuna iz. bir makas ile, mümkün olduğu anal açıklık yakın olarak kesilir. </li><li> mide tanımlamak ve ince bağırsak ile birleştiği yerde iz. bir makas ile yaklaşık 1 cm uzakta mideden bağırsak özgür kesmek. fosfat tamponlu tuz (PBS) ihtiva eden temiz Petri kabı serbest ince bağırsak ve kolon tüm uzunluğu aktarın. </li><li> Bir yandan ya da forseps bir çift ile, kolon distal ucunu tutun ve yavaşça herhangi mezenterik bağ ve / veya yağ dokusundan kolonun tüm uzunluğu çözülmeye diğer elinizi kullanın. </li><li> çekum tanımlamak(Küçük ince ve kalın bağırsak arasındaki kese) ve çekum ve kolon kolon serbest (kolon proksimal ucunu) katılmak nerede kesti. </li><li> Bir yandan ya da forseps bir çift, küçük bağırsak tutun ve yavaşça herhangi mezenterik bağ ve / veya yağ dokusundan ince bağırsağın tüm uzunluğu çözülmeye diğer elinizi kullanın. çekum kesip ve bunun için gerek varsa atın. Bir gecede süreç (dH 2 O% 50 etanol /% 5 asetik asit) modifiye Bouin fiksatif dışarı disseke bağırsak kuluçkaya burada durdurulabilir ve ertesi gün prosedürü devam Not:. </li><li> bağırsak (ince bağırsak ya da kolon) bir kesimi Taşıma, modifiye Bouin fiksatif ile 10 ml şırınga doldurmak ve bunun için bir sonda iğne takılır. barsak segmentinin ön açılışında yarım santimetre hakkında iğne takın. </li><li> Bir alet ile firma basınç uygulayarak bağırsak segmenti içinde gavaj iğne tutunbarsak segmenti üzerinde. Öte yandan şırınga tutarken, modifiye Bouin fiksatif kullanarak barsak segmentinin içeriğini temizlemek için yumuşak ama tutarlı baskı uygulayın. Bu adım bağırsak segmenti ve hemen tespitin eşzamanlı temizlenmesini sağlar. akış atıkları toplamak için bir Petri kabı kullanın. Tespit opak çevirerek kolon renk ile görülebilir. Not: ateş basması ya da bağırsak segmenti açık patlama olabilir sırasında çok fazla baskı uygulamak için değil emin olun. </li><li> makas kullanarak, mezenterik hat boyunca uzunlamasına bağırsak segmenti açmak kesti. forseps bir çift ile tutun ve PBS içeren bir Petri kabındaki kısaca durulayın. <ol><li> proksimal, orta ve distal: 3 eşit parça halinde ince bağırsak kesti. proksimal parça mide hemen sonra biridir ve distal segmenti kolon hemen önce bir tanesidir. proksimal segmenti için duodenum, jejunum orta ve distale eşdeğerdirileum. </li><li> Her segment için proksimal ve distal ucunu işaretleyin. Proksimal uç başlangıçta mide doğru işaret ediyordu biri ve kolon işaret etti uzak olduğunu. </li></ol></li><li> temizlenmeli ve açılan bağırsak segmenti yerleştirmek için Petri kabı üst kullanın. lümen tarafı yukarı bakacak şekilde bağırsak segmenti yerleştirin. <ol><li> kolon, genişliği boyunca çalışan variegations / sırtlar lümen yan belirlemek ve yakın ucunda yer almaktadır. orta ve distal bölgelerde uzunlamasına çalışan bazı variegations var. ince bağırsak için, villuslar işaretleri kaba görünen yüzeyi ile luminal yan tespit. Not: ince bağırsak için, proksimal, orta ve distal bölgelerde harici makroskopik anatomik sınır vardır. Bununla birlikte, bu bölgeler mikroskop altında bölümlerde tanımlanan de bağlanabilir. Nerede olduklarını villus distalde giderek daha kısa proksimal bölgede uzun ve olmakuzunluğunda kısa. Mikroskopik olarak, kolon kriptler da, sırtlar varlığı ile tespit edilebilir yakın bölgede kısa bulunmaktadır. Kolon kriptler henüz yakın bölgede hala daha uzun uzak bölgede Midsection en yüksek ve daha kısadır. </li></ol></li><li> İsviçreli kolon haddeleme devam edin: <ol><li> düz açık kolon tutmak ve Petri kabı kenarına doğru proksimal ucundan forseps ile çekin. </li><li> yukarı bakacak şekilde lümen tarafını tutmak ve tek elle forseps ile proksimal ucunu tutun ve diğer elinizle bir kürdan tutun. </li><li> forseps kullanarak kürdan etrafında ucunun kenarı sarın ve hafifçe yerinde tutmak için kürdan karşı sarılmış kenar çimdik. </li><li> Ve yavaşça bir İsviçreli rulo oluşturacak şekilde kürdan etrafında kolon rulo parmaklarıyla kürdan haddeleme başlar. </li><li> Tüm kolon uzunluğu sıvadı edildikten sonra, dikkatlice c slayt forseps bir çift kullanınkürdan kapalı ve bir doku işleme / katıştırma kasete Olon İsviçre rulo. gece boyunca oda sıcaklığında% 10 tamponlu formalin içine kaseti yerleştirin. </li></ol></li><li> İsviçre ince bağırsak haddeleme devam edin: <ol><li> Bir seferde bir kesimi Taşıma, luminal kenarında düz açık segmenti tutmak ve Petri kabı kenarına doğru proksimal ucundan forseps ile çekin. </li><li> kolon için anlatıldığı gibi İsviçre haddeleme ile devam edin. </li></ol></li><li> parafine için formalin ile fikse dokular işleme devam edin. Aşağıdaki adımları takip edin: NOT: (detaylar için malzeme ve ekipmanlar görelim) otomatik işlemcisi kullanın. <ol><li> Doku kasetinde iken sabitleştirici tamamen kaldırılması, PBS ile doku yıkayın. </li><li> Aşağıdaki sırayla etanol kullanılarak doku kurutmak:% 50 etanol, 10 dakika,% 70 etanol 10 dakikada,% 80 etanol için 10 dakika, 10 dakika süre ile,% 95 etanol, 10 dakika boyunca% 100 etanol,% 100 etanol 10 dakika boyunca ve 110 dakika boyunca% 00 etanol. </li><li> aşağıdaki sırayla ksilen Exchange etanol: 2: 1 etanol: 10 xylene - 15 dakikada, 1: 1 etanol: 10 xylene - 15 dakikada, 1: 2 etanol: 10 xylene - 10 15 dakika,% 100 iksilen - 15 dakika, 10% 100 iksilen - 15 dakika, 10% 100 iksilen - 15 dakika. DİKKAT: Ksilen böylece işyeri uygun bir başlık ve personel tarafından giydi gereken uygun koruyucu ekipman ile bir lokal egzoz havalandırması ile donatılmış olmalıdır bir sağlık tehlikesi vardır. </li><li> parafin Exchange ksilen. 2: 1: ksilen: 30 dakika için parafin, 1: 1 ksilen: 30 dakika için parafin, 1: 2 ksilen: 30 dakika için parafin,% 100 parafin 58 ° C - Fırın 54 bir vakum, aşağıdaki adımları 1 - 2 saat ve 1% 100 parafin - 2 saat veya gece. Not: Bu parafin polimerler aşağılamak ve sert ve kırılgan hale getirecek, çünkü parafin uzun süre için 60 ° C&#39;yi izin vermeyin. </li><li> de taze yeni parafin ve şark dokusunda gömparafin sertleşir önce sired. İsviçre rulo, doku paraffinization ardından, parafine sırasında yana her rulo yeniden konumlandırmak için önemlidir. Bu kesme işlemi sırasında, her bir rulonun tüm uzunluğu bölümleri imal edilmesini sağlar. </li></ol></li><li> boyama için, mikrotom kullanılarak 5-mikron kalınlığında kesitler halinde kesilmiştir. ; Yüklü slaytlar üzerinde bölümleri toplayın ve fırın gecede 65 ° C onları (fırında) kurutmak oda sıcaklığına soğutun ve daha sonra boyama için onları kullanmış olsun. Not: pişirme süresi 1 kısaltılmış olabilir - slaytlar nasıl taze kesilmiş bağlı 2 saat. kesit beri bir aydan daha az ise, o zaman bir gecede pişirmek için tavsiye edilir. Bir aydan fazla olmuş, o zaman 1 - pişirme 2 saat zaman kazanmak için yeterlidir. Zaman tükeniyor ise, gecede destek her zaman kullanılabilir. </li></ol> 3. Histolojik Analiz ve Immunoflorasan Boyama Histolojik analiz ve immunoflu gerçekleştirmeorescence boyama daha önce modifikasyonlarla, 23,24 tarif. gelişmiş yeşil floresan protein (EGFP) immünofloresan için: <ol><li> 1 saat boyunca 65 ° C fırın içinde slaytlar fırında endojen alkali fosfataz etkinliğini aktif hale getirmesi ve daha sonra ksilen deparaffinize. </li><li> endogen dokunun peroksidazlar engellemek için, metanol içinde% 3 hidrojen peroksit banyosunda bölümleri inkübe; daha sonra 10 dakika boyunca 125 ° C &#39;de sitrat tampon çözeltisi içinde, antijen alma ve ardından azalan alkol banyosu serisi (% 100,% 95,% 70) içinde inkübe edilerek, (10 mM sodyum sitrat,% 0.05 Tween-20, pH 6.0) rehidrate bir decloaking odacığı kullanılarak. </li><li> hidrofobik bariyer sağlar kalem işareti kullanılarak doku bölümleri etrafında bir daire çizin ve (EGFP karşı birincil antikor ile daha sonra seyreltme 1 37 ° C sıcaklıkta 30 dakika boyunca (TBS-Tween içinde% 2.5 büyükbaş hayvan serum albümini [BSA]) bloklama tamponu ile bölümleri inkübe : gece boyunca nemlendirilmiş bir odada 4 ° C&#39;de 500) hafifçe çalkalandı.</li><li> bölümleri yıkayın ve 37 ° C&#39;de 30 dakika boyunca uygun bir konsantrasyonda flüoresan etiketli ikincil antikor ile inkübe edin. </li><li> Hoechst ile sekonder antikor tedavisi ve leke çekirdekleri sonra slaytlar yıkayın ve montaj medya ile monte edin. <ol><li> Klf5 / EGFP / Ki-67 eş-boyama için, işlem slaytlar adımları 3.1 de tarif edildiği gibi - 3.3 ve Klf5 antikor (seyreltme 1: 150) ile inkübe edilerek Klf5 boyama yerine gece boyunca karıştırılmıştır. </li><li> protokole göre slaytlar tavşan AP polimer algılama uygulayın. </li><li> Klf4 üreticinin protokol başına kadar kromojen immünohistokimyasal boyama ile boyanarak ortaya koymaktadır. </li><li> Daha önce tarif edilen protokol 25 kullanılarak antikor elüsyon gerçekleştirin. Glisin-SDS içinde 50 ° C&#39;de (pH 2.0), 1 saat boyunca çalkalama ile çözüme slaytlar inkübe edin. </li><li> Yıkama damıtılmış su ile iyice kayar ve 37 ° C sıcaklıkta 30 dakika boyunca (TBS-Tween içinde% 2.5 BSA) tampon engelleme inkübe edin. </li><li> Ki-67 ekleyin (seyreltme 1: 500) ve EGFP (seyreltme 01:500) eş zamanlı olarak antikor ve 1 saat 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> (Veriler gösterilmemiştir) Hoechst ile boyamadan önce uygun bir sekonder antikor ile flüoresan tespiti gerçekleştirmek ve yerleştirme ortamı ile monte edilir. </li></ol></li><li> Hematoksilen ve eozin (H &amp; E) 26 5-mikron bölümleri boyanarak üzerine dokuların histolojik morfolojisini gözlemleyin. Floresan görüntüler için, sırası ile, EGFP, Klf5, Ki-67 renklendirme görselleştirmek için 535, 646 ve 700 emisyon dalga boylarını kullanır. </li></ol>

<ol>
	<li>van der Flier, L. G., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells,+self-renewal,+and+differentiation+in+the+intestinal+epithelium.">Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium.</a> Annu Rev Physiol. 71, 241-260 (2009).</li><li>Bjerknes, M., Cheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+isolation+of+intact+epithelium+from+the+mouse+intestine.">Methods for the isolation of intact epithelium from the mouse intestine.</a> Anat Rec. 199, 565-574 (1981).</li><li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+stem+cells+in+small+intestine+and+colon+by+marker+gene+Lgr5.">Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5.</a> Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).</li><li>van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OLFM4+is+a+robust+marker+for+stem+cells+in+human+intestine+and+marks+a+subset+of+colorectal+cancer+cells.">OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells.</a> Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).</li><li>van der Flier, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+achaete+scute-like+2+controls+intestinal+stem+cell+fate.">Transcription factor achaete scute-like 2 controls intestinal stem cell fate.</a> Cell. 136 (5), 903-912 (2009).</li><li>Sangiorgi, E., Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmi1+is+expressed+in+vivo+in+intestinal+stem+cells.">Bmi1 is expressed in vivo in intestinal stem cells.</a> Nat Genet. 40 (7), 915-920 (2008).</li><li>Montgomery, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+telomerase+reverse+transcriptase+(mTert)+expression+marks+slowly+cycling+intestinal+stem+cells.">Mouse telomerase reverse transcriptase (mTert) expression marks slowly cycling intestinal stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (1), 179-184 (2011).</li><li>Takeda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interconversion+between+intestinal+stem+cell+populations+in+distinct+niches.">Interconversion between intestinal stem cell populations in distinct niches.</a> Science. 334 (6061), 1420-1424 (2011).</li><li>May, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+putative+gastrointestinal+stem+cell+and+adenoma+stem+cell+marker,+doublecortin+and+CaM+kinase-like-1,+following+radiation+injury+and+in+adenomatous+polyposis+coli/multiple+intestinal+neoplasia+mice.">Identification of a novel putative gastrointestinal stem cell and adenoma stem cell marker, doublecortin and CaM kinase-like-1, following radiation injury and in adenomatous polyposis coli/multiple intestinal neoplasia mice.</a> Stem Cells. 26 (3), 630-637 (2008).</li><li>Powell, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pan-ErbB+negative+regulator+Lrig1+is+an+intestinal+stem+cell+marker+that+functions+as+a+tumor+suppressor.">The pan-ErbB negative regulator Lrig1 is an intestinal stem cell marker that functions as a tumor suppressor.</a> Cell. 149 (1), 146-158 (2012).</li><li>Pearson, R., Fleetwood, J., Eaton, S., Crossley, M., Bao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kruppel-like+transcription+factors:+a+functional+family.">Kruppel-like transcription factors: a functional family.</a> Int J Biochem Cell Biol. 40 (10), 1996-2001 (2008).</li><li>McConnell, B. B., Yang, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+Kruppel-like+factors+in+health+and+diseases.">Mammalian Kruppel-like factors in health and diseases.</a> Physiol Rev. 90 (4), 1337-1381 (2010).</li><li>McConnell, B. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diverse+functions+of+Kruppel-like+factors+4+and+5+in+epithelial+biology+and+pathobiology.">The diverse functions of Kruppel-like factors 4 and 5 in epithelial biology and pathobiology.</a> Bioessays. 29 (6), 549-557 (2007).</li><li>Nandan, M. O., Ghaleb, A. M., Bialkowska, A. B., Yang, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kruppel-like+factor+5+is+essential+for+proliferation+and+survival+of+mouse+intestinal+epithelial+stem+cells.">Kruppel-like factor 5 is essential for proliferation and survival of mouse intestinal epithelial stem cells.</a> Stem Cell Res. 14 (1), 10-19 (2015).</li><li>Gelberg, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+anatomy,+physiology,+and+mechanisms+of+disease+production+of+the+esophagus,+stomach,+and+small+intestine.">Comparative anatomy, physiology, and mechanisms of disease production of the esophagus, stomach, and small intestine.</a> Toxicol Pathol. 42 (1), 54-66 (2014).</li><li>De Robertis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AOM/DSS+murine+model+for+the+study+of+colon+carcinogenesis:+From+pathways+to+diagnosis+and+therapy+studies.">The AOM/DSS murine model for the study of colon carcinogenesis: From pathways to diagnosis and therapy studies.</a> J Carcinog. 10 (9), (2011).</li><li>Magnus, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+the+presence+of+intestinal+epithelium+in+the+gastric+mucosa.">Observations on the presence of intestinal epithelium in the gastric mucosa.</a> The Journal of Pathology and Bacteriology. 44 (2), 389-398 (1937).</li><li>Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+"Swiss+roll":+a+simple+technique+for+histological+studies+of+the+rodent+intestine.">The "Swiss roll": a simple technique for histological studies of the rodent intestine.</a> Lab Anim. 15 (1), 57-59 (1981).</li><li>Park, C. M., Reid, P. E., Walker, D. C., MacPherson, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+practical+'swiss+roll'+method+of+preparing+tissues+for+paraffin+or+methacrylate+embedding.">A simple, practical 'swiss roll' method of preparing tissues for paraffin or methacrylate embedding.</a> J Microsc. 145, 115-120 (1987).</li><li>Summersgill, B., Clark, J., Shipley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+and+chromogenic+in+situ+hybridization+to+detect+genetic+aberrations+in+formalin-fixed+paraffin+embedded+material,+including+tissue+microarrays.">Fluorescence and chromogenic in situ hybridization to detect genetic aberrations in formalin-fixed paraffin embedded material, including tissue microarrays.</a> Nat Protoc. 3 (2), 220-234 (2008).</li><li>Takeda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+fibroblasts+are+essential+for+the+adaptive+response+of+the+murine+heart+to+pressure+overload.">Cardiac fibroblasts are essential for the adaptive response of the murine heart to pressure overload.</a> J Clin Invest. 120 (1), 254-265 (2010).</li><li>el Marjou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+and+inducible+Cre-mediated+recombination+in+the+gut+epithelium.">Tissue-specific and inducible Cre-mediated recombination in the gut epithelium.</a> Genesis. 39 (3), 186-193 (2004).</li><li>McConnell, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kruppel-like+factor+5+is+important+for+maintenance+of+crypt+architecture+and+barrier+function+in+mouse+intestine.">Kruppel-like factor 5 is important for maintenance of crypt architecture and barrier function in mouse intestine.</a> Gastroenterology. 141 (4), 1302-1313 (2011).</li><li>Nandan, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kruppel-like+factor+5+is+a+crucial+mediator+of+intestinal+tumorigenesis+in+mice+harboring+combined+ApcMin+and+KRASV12+mutations.">Kruppel-like factor 5 is a crucial mediator of intestinal tumorigenesis in mice harboring combined ApcMin and KRASV12 mutations.</a> Mol Cancer. 9 (63), (2010).</li><li>Pirici, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+elution+method+for+multiple+immunohistochemistry+on+primary+antibodies+raised+in+the+same+species+and+of+the+same+subtype.">Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype.</a> J Histochem Cytochem. 57 (6), 567-575 (2009).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematoxylin+and+eosin+staining+of+tissue+and+cell+sections.">Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

İsviçre haddeleme tekniği büyük ölçüde, histolojik ve morfolojik değerlendirmesi için bağırsak doku hazırlanması için güçlü bir yöntemdir. Ilk dondurulmuş bölümleri 18,19 hazırlanması için geliştirilmiş daha önce tarif edilen Swiss-haddeleme tekniği, aksine, burada sunulan prosedür formalinle tespit ve parafine (FFPE) istemi bağırsak doku hazırlanması ve tespit sağlar. Dondurulmuş doku ile karşılaştırıldığında, FFPE dokusu çok daha uzun bir raf ömrüne sahiptir ve...

Memeli bağırsak epitel sütun hücrelerinin tek bir katman ihtiva eder. farklılaşmış hücreler villus bölgesini işgal ederken ince bağırsakta, proliferatif hücreler crypts sınırlıdır. kalın bağırsakta hiçbir villus olduğundan Ancak, proliferatif hücreler kriptalarının altına lokalize ve farklılaşmış hücrelerin kriptalarının üst bölgesini işgal edilmiştir. crypts içinde proliferatif hücrelerin sürekli bölünmesi ile tahrik edilir - (5 gün yaklaşık 3) bağırsak epiteli hızlı ikmal uğrar. Kript proliferatif hücrelerin homojen popülasyon değildir ve daha fazla kök hücre ve transit amplifiye (TA) hücreleri 1 bölünür. 2 çok alttan 5 hücreleri - kök hücreler ilk 4 içinde, crypt dibinde bulunur. crypt baz sütunlu (CBC) kök hücre ve rezerv hareketsiz kök hücreleri: Mevcut model iki kök hücre tiplerinin varlığını destekler. CBC sTEM hücreleri etkin bir şekilde çoğalan ve Lösin açısından zengin tekrar içeren, G-proteine ​​akuple bir reseptör 5 (Lgr5) 3, Olfactomedin 4 (Olfm4) 4 ile Achaete Scute benzeri 2 (Ascl2) 5 ile işaretlenmiştir. Öte yandan, rezerv hareketsiz kök hücreleri, B hücre spesifik, Moloney kemirgen lösemi virüsü entegrasyon Bölge 1 (Bmi1) 6 fare telomeraz ters transkriptaz (mTert) 7 ile etiketlenir, HOP Homeobox (Hopx) 8 doublekortin-mi CAM Kinaz benzeri 1 (Dclk1) 9, ve lösin -Cys ve immünoglobülin benzeri sahalar 1 (Lrig1) 10. etkin bir şekilde çoğalan kök hücreler daha sonra emme hücreleri (enterositler) ve salgılayıcı hücreler (enteroendokrin, kadeh, Paneth ve Elyaf hücreleri) içine daha fazla farklılaşma tabi ta hücrelere yol açar. onlar apoptoz geçmesi ve olan villus, üst ulaşana kadar proliferatif bölgede sürekli hücre bölünmesi crypt-villus ekseni boyunca epitel hücrelerinin yukarı doğru hareketi ile sonuçlanırepitelyum yüzeyinden dökülür. Intestinal epitelyal hücrelerin farklı (örneğin, barsak goblet hücrelerinin lizozim karşı antikorla bir MUC2 ve Paneth hücrelerine karşı bir antikorla boyama ile tanınabilir) farklı proteinlerin ekspresyonu ile işaretlenir. Biz bağırsak epiteli 11-13 homeostazında ve patobiyolojisinde Kruppel benzeri faktörler (KLFs) rolünü incelemek. Değiştirilmiş Swiss-haddeleme tekniğinin fizibilitesini destekleyici Burada sunulan sonuçlar etkin bir şekilde çoğalan bağırsak epitel kök hücrelerin 14 bakımında Kruppel benzeri faktör rolü 5 (KLF5) önceki çalışmalara dayanmaktadır. KLF5 yüksek ölçüde aktif, bağırsak kök ve ta hücreleri 12 olarak ifade edilen bir çinko parmak kopyalama faktörüdür. Daha önceki çalışmalar, KLF5 Ki-67, bağırsak kript bilinen bir proliferatif işaretleyici ile birlikte ifade olduğunu göstermiştir. gastrointestinal tr<html> hareket bir yapısal veya işlevsel homojen bir doku değildir. ince barsak proksimal, orta ve distal parçaya bölünmüş ikinci, bundan başka, duodenum, jejunum ve ileum ve çekum ve kolon içine kalın bağırsak ayrılmıştır. Bu bölümlerin her biri kendine özgü histolojik özellikleri vardır ve farklı roller 15 oynar. Bu nedenle, hakaret etkileri ve bağırsak epiteli tepkisinin derecesi çalışılan dokuda 16 bölgeye bağlı olabilir. Buna ek olarak, farklı fare suşları, çalışmalarda 16 kullanılan hasara türüne göre histolojik düzeyde yanıt çeşitliliği gösterir. Bu durumda, dokunun hazırlama yakışır uygun histolojik ve bağırsak dokuları moleküler analizi izin vermek için gereklidir. Bu nedenle, İsviçre rulo tekniği hibe tek seferde bağırsak epiteli tam uzunlukta analizi ve böylece kapsamlı bilgilere dayanarak bilgili sonuçlar tespit eder. e_content &quot;&gt; Swiss-haddeleme tekniği ilk Magnus 17 tarafından belirtildiği ve Moolenbeck ve RUITENBERG and Park ve arkadaşları tarafından ayrıntılı olarak tarif edilmiştir. dokuların hazırlanması ve histolojik gerçekleştirmek için bir yöntem olup, kemirgen bağırsak 18,19 sırasıyla. protokolü analizleri olarak tanılama amacıyla zamanında ve güvenilir doku hazırlanması için izin orjinal yöntemin geliştirilmiş bir versiyonu, bu yayında sunulur tarif. Bu modifiye edilmiş tekniğin etkin koleksiyonları ve immünohistokimya, immünofloresans, hem de evrensel kullanılan teknikler, intestinal epitel hazırlanmasını sağlar ek değerlendirme (floresan ve kromojenik 20), in situ hibridizasyon gibi. Ayrıca, Hazırlama yöntemi örneği değiştirilmiş doku hızlı doku fiksasyon bir yöntem sunan hazır ve nispeten ucuz reaktifler kullanır ve protein, DNA elde sağlar ve RNA. Alınan birlikte, this tekniği bağırsak epiteli, histopatolojik patolojik ve moleküler özelliklerinin kapsamlı değerlendirme için mükemmeldir.

<table><tbody><tr><td>Stainless Steel Dissecting Kits</td><td>VWR</td><td>25640-002</td><td></td></tr><tr><td>Decloaking Chamber</td><td>Biocare Medical</td><td>DC2012</td><td></td></tr><tr><td>Syringe 10 ml</td><td>VWR</td><td>89215-218</td><td></td></tr><tr><td>Swingsette Tissue embedding/processing cassette with lid</td><td>Simport</td><td>M515</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Slides [size: 25 x 75 x 1 mm]</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Manual Slide Staining Set</td><td>Tissue-Tek/Sakura</td><td>4451</td><td></td></tr><tr><td>Staining Dish Green</td><td>Tissue-Tek/Sakura</td><td>4456</td><td></td></tr><tr><td>Staining Dish White</td><td>Tissue-Tek/Sakura</td><td>4457</td><td></td></tr><tr><td>24-Slide Slide Holder with Detachable Handle</td><td>Tissue-Tek/Sakura</td><td>4465</td><td></td></tr><tr><td>Oven</td><td>Thermo Scientific</td><td>6243</td><td>for baking slides at 65 degree</td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000C</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence Microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse 90i</td><td>Bright and fluoerescent light, with objectives: 10X, 20X</td></tr><tr><td>PAP Pen Super-Liquid Blocker Mini</td><td>Fisher Scientific</td><td>DAI-PAP-S-M</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 200 proof</td><td>AAPR</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>VWR</td><td>BDH1135-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Glacial acetic acid</td><td>AAPR</td><td>281000ACS</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher Scientific</td><td>X5P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide 25% solution in water</td><td>ACROS</td><td>202465000</td><td></td></tr><tr><td>10% bufered formalin</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-026-213</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum fraction V, heat shock</td><td>Roche</td><td>3116956001</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7949</td><td></td></tr><tr><td>Sodium citrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>S279</td><td></td></tr><tr><td>Gavage needle</td><td>VWR</td><td>20068-624</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti Klf5 antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-22797</td><td>Dilution 1:150</td></tr><tr><td>Chicken anti EGFP antibody</td><td>Millipore</td><td>AB16901</td><td>Dilution 1:500</td></tr><tr><td>Rabbit anti Ki67 antibody</td><td>Biocare Medical</td><td>CRM325B</td><td>Dilution 1:500</td></tr><tr><td>Mach3 rabbit AP polymer detection kit</td><td>Biocare Medical</td><td>M3R533L</td><td></td></tr><tr><td>Warp red chromogen kit</td><td>Biocare Medical</td><td>WR806 H</td><td></td></tr><tr><td>Lgr5-EGFP/CreER&lt;sup&gt;T2&lt;/sup&gt; mice&amp;nbsp;</td><td>Jackson labs</td><td>008875&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Automated processor</td><td>Leica</td><td>Leica TP1020</td><td></td></tr></tbody></table>

improved swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current literature describes several different methodological approaches to obtain images of intestinal tissues for data validation. In this paper, we delineate a common protocol relating to the derivation and processing of mouse intestinal tissues. Proper fixation of intestinal tissues and Swiss-roll techniques that enhance intestinal epithelial morphology are discussed. Postresection processing and reorientation of embedded intestinal tissues are critical in obtaining paraffin-embedded blocks that display intact intestinal structural features after sectioning. The Swiss-rolling technique helps in histological assessment of the complete intestinal or colonic sections examined. An ability to differentiate intestinal structural features can be vital in quantitative measurements of intestinal inflammation and tumorigenesis along the entire length. Finally, paraffin-embedded sections are ideal for robust processing using both immunohistochemical and immunofluorescent detection methods. Nonfluorescent immunohistochemical sections provide a vibrant image of the tissue detailing different cellular structural features but do not provide flexibility for intracellular co-localization experiments. Multiple fluorescent channels can be appropriately utilized with immunofluorescent detection for co-localization experiments, lending support to mechanistic studies.

immünohistokimyasal boyama ile birlikte İsviçreli haddeleme tekniği küçük veya büyük bağırsak dokusunun kapsamlı bir analiz sağlar. Bir C57BL / 6 fare (Şekil 1) bir kalın barsak H &amp; E boyama örnek fizibilite bir tasviridir ve bu tekniğin etkinliğidir. Proksimal, orta ve distal: Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, görüntü kolon tüm bölümlerini yakalamak edebilmektedir. Bu nedenle, bu kapsamlı bir histolojik değerlendirmesi ...

Watch this Scientific Journal Video about Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses at JoVE.com

Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

Doğru kimlik ve bağırsak mukoza zarının üzerinde epitel hücreleri konumu farklı hücre soyları tanımlamak için gereklidir. bağırsak dokuların uygun görüntüleme maksimum çözünürlük ile protein ekspresyonu belirlenmesi için çok önemlidir. Bu çalışma işleme fare bağırsak dokuları için en uygun yöntem ve koşulları belirginleştiren amaçlamaktadır.

Immünohistokimyasal ve immünofloresan Analizleri için Bağırsak Doku Hazırlama için geliştirilmiş Swiss-haddeleme Tekniği

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current ...

improved-swiss-rolling-technique-for-intestinal-tissue-preparation

Research

JoVE Journal

Biology

68.1K Görüntüleme.  Stony Brook University School of Medicine.  Doğru kimlik ve bağırsak mukoza zarının üzerinde epitel hücreleri konumu farklı hücre soyları tanımlamak için gereklidir. bağırsak dokuların uygun görüntüleme maksimum çözünürlük ile protein ekspresyonu belirlenmesi için çok önemlidir. Bu çalışma işleme fare bağırsak dokuları için en uygun yöntem ve koşulları belirginleştiren amaçlamaktadır. 

Video: Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

Murine Colitis Modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS)

Colitis can occur from viral or bacterial infections, ischemic insult, or autoimmune disorders; most notably Ulcerative Colitis and the colonic variant of Crohn&rsquo;s Disease - Crohn&rsquo;s Colitis. Acute colitis may present with abdominal pain and distention, malabsorption, diarrhea, hematochezia and mucus in the stool. We are beginning to understand the complex interactions between the environment, genetics, and epithelial barrier dysfunction in Inflammatory Bowel Disease and animal models of colitis have been essential in advancing our understanding of this disease. One popular model involves supplementing the drinking water of mice with low-molecular weight Dextran Sodium Sulfate (DSS), resulting in epithelial damage and a robust inflammatory response in the colon lasting several days 1.Variations of this approach can be used to model acute injury, acute injury followed by repair, and repeated cycles of DSS interspersed with recovery modeling chronic inflammatory diseases 2. After a single four-day treatment of 3% DSS in drinking water, mice show signs of acute colitis including weight loss, bloody stools, and diarrhea. Mice are euthanized at the conclusion of the treatment course and at necropsy dissected colons are processed and can be 'Swiss rolled" 3 to allow microscopic analysis of the entire colon or infused with formalin as "sausages" to allow macroscopic analysis. Tissue is then embedded in paraffin, sectioned, and stained for histologic review.

Murine Colitis Modeling using Dextran Sulfate Sodium DSS

Dextran sulfate sodium (DSS) administered in the drinking water is an established murine inflammatory injury model of acute colitis. This protocol outlines the method for DSS treatment and the preparation of tissues.

Dekstran Sülfat Sodyum (DSS) kullanarak murin Kolit Modelleme

Colitis can occur from viral or bacterial infections, ischemic insult, or autoimmune disorders; most notably Ulcerative Colitis and the colonic variant of ...

Biyoloji

A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine

Preparing whole mounts of the mouse small intestine and colon for subsequent analysis or quantification can be time consuming and difficult. We describe the use of a simple device to cut and &#8216;roll&#8217; mouse intestines to rapidly prepare whole mount preparations of superior and uniform quality to that which can be achieved by hand. The device comprises a base that holds 4 stainless steel rods and a top, which acts a cutting guide. The rods are inserted into the lumen of the small intestine [divided into thirds] and the colon. The rods and samples are then placed over a piece of filter paper or card into the holding slots in the base of the device. The top of the device is then positioned and serves as a cutting guide. The two angled sections in the center of the top piece are used to guide a knife or scalpel and cut the intestines longitudinally on the top of the rods. Once the intestinal sections have been cut, the top is removed and the card,&#160;tissue and rods gently removed from the device and placed on the bench. The rods are then gently rolled sideways to flatten and stick the intestinal segments onto the underlying piece of filter paper or card. The final preparation can then be examined or fixed and stored for later analysis. The preparations are invaluable for the study of intestinal changes in normal or genetically modified mouse models. The preparations have been used for the study and quantification of the effects of inflammation (colitis), damage, pre-cancerous lesions (aberrant crypt foci (ACFs) and mucin depleted foci (MDFs)) and polyps or tumors.

The use of a simple device to cut and &#8216;roll&#8217; mouse intestines to rapidly prepare whole mount preparations is described.

Basit Aygıt Hızla Fare Bağırsak Tüm Mounts Hazırlanır

Preparing whole mounts of the mouse small intestine and colon for subsequent analysis or quantification can be time consuming and difficult. We describe ...

Tıp

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). We have identified five steps in the workflow that are crucial for obtaining RNA isolates from enteric ganglia with sufficiently high quality and quantity for RNA-seq. First, when preparing intestinal tissue, each sample must have all excess liquid removed by blotting prior to flattening the serosa as much as possible across the bottom of large base molds. Samples are then quickly frozen atop a slurry of dry ice and 2-methylbutane. Second, when sectioning the tissue, it is important to position cryomolds so that intestinal sections parallel the full plane of the myenteric plexus, thereby yielding the greatest surface area of enteric ganglia per slide. Third, during LCM, polyethylene napthalate (PEN)-membrane slides offer the greatest speed and flexibility in outlining the non-uniform shapes of enteric ganglia when collecting enteric ganglia. Fourth, for distinct visualization of enteric ganglia within sections, ethanol-compatible dyes, like Cresyl Violet, offer excellent preservation of RNA integrity relative to aqueous dyes. Finally, for the extraction of RNA from captured ganglia, we observed differences between commercial RNA extraction kits that yielded superior RNA quantity and quality, while eliminating DNA contamination. Optimization of these factors in the current protocol greatly accelerates the workflow and yields enteric ganglia samples with exceptional RNA quality and quantity.

The goal of this protocol is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia isolated from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). This protocol involves preparing flash-frozen samples of human intestinal tissue, cryosectioning, ethanolic staining and dehydration, LCM, and RNA extraction.

Lazer-yakalama mikrodiseksiyon optimizasyonu gelen insan dokusu taze donmuş enterik gangliyon yalıtım için

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

Nörobilim

Systematic Scoring Analysis for Intestinal Inflammation in a Murine Dextran Sodium Sulfate-Induced Colitis Model

Murine colitis models are tools that are extensively employed in studies focused on understanding the pathobiology of inflammatory intestinal disorders. However, robust standards for objective and reproducible quantification of disease severity remain to be defined. Most colitis analysis methods rely on limited histological scoring of small segments of intestine, leading to partial or biased analyses. Here, we combine high-resolution image acquisition and longitudinal analysis of the entire colon to quantify intestinal injury and ulceration in the dextran sodium sulfate (DSS) induced model of murine colitis. This protocol allows for the generation of objective and reproducible results without extensive user training. Here, we provide comprehensive details on sample preparation and image analysis using examples of data from DSS induced colitis. This method can be easily adapted to other models of murine colitis that have significant inflammation associated with mucosal injury. We demonstrate that the fraction of inflamed/injured and eroded/ulcerated mucosa relative to the complete length of the colon closely parallels clinical findings such as weight loss amid DSS-induced disease progression. This histological protocol provides a reliable time and cost-effective aid to standardize analyses of disease activity in an unbiased way in DSS colitis experiments.

Systematic scoring of intestinal inflammation using a free computer-assisted system is a powerful tool to quantitatively compare histopathological changes in colitis models characterized by the presence of ulcers and inflammatory changes. Histological colitis score evaluation strengthens clinical observations and facilitates data interpretation.

Murine Dextran Sodyum Sülfat Kaynaklı Kolit Modelinde Bağırsak İltihabı İçin Sistematik Puanlama Analizi

Murine colitis models are tools that are extensively employed in studies focused on understanding the pathobiology of inflammatory intestinal disorders. ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Visualization of Gut Microbiota-host Interactions via Fluorescence In Situ Hybridization, Lectin Staining, and Imaging

Measuring the localization of microbes within their in vivo context is an essential step in revealing the functional relationships between the microbiota and the vertebrate gut. The spatial landscape of the gut microbiota is tightly controlled by physical features - intestinal mucus, crypts, and folds - and is affected by host-controlled properties such as pH, oxygen availability, and immune factors. These properties limit the ability of commensal microbes and pathogens alike to colonize the gut stably. At the micron-scale, microbial organization determines the close-range interactions between different microbes as well as the interactions between microbes and their host. These interactions then affect large-scale organ function and host health.
This protocol enables the visualization of the gut microbiota spatial organization from distances between cells to organ-wide scales. The method is based on fixing gut tissues while preserving intestinal structure and mucus properties. The fixed samples are then embedded, sectioned, and stained to highlight specific bacterial species through fluorescence in situ hybridization (FISH). Host features, such as mucus and host cell components, are labeled with fluorescently labeled lectins. Finally, the stained sections are imaged using a confocal microscope utilizing tile-scan imaging at high magnification to bridge the micron to centimeter length scales. This type of imaging can be applied to intestinal sections from animal models and biopsies from human tissues to determine the biogeography of the microbiota in the gut in health and disease.

Visualization of Gut Microbiota-host Interactions via Fluorescence In Situ Hybridization, Lectin Staining, and Imaging

This streamlined protocol details a workflow to detect and image bacteria in complex tissue samples, from fixing the tissue to staining microbes with fluorescent in situ hybridization.

Floresan In Situ Hibridizasyon, Lectin Boyama ve Görüntüleme Yoluyla Gut Mikrobiyota-konak Etkileşimlerinin Görselleştirilmesi

Measuring the localization of microbes within their in vivo context is an essential step in revealing the functional relationships between the microbiota ...

Induction of Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of CBir1 TCR Transgenic CD4+ T Cells to Immunodeficient Mice

With the increase of incidence, inflammatory bowel diseases (IBD), which are chronic diseases affecting the gastrointestinal tract, impose a considerable health and financial burden on individuals and society. Therefore, it is critical to investigate the mechanisms underlying the pathogenesis and development of IBD. Here, a gut microbiota antigen-specific T cell transfer colitis model is described. CBir1 flagellin has been recognized as the immunodominant gut bacterial antigen in experimental colitis and patients with Crohn&#39;s disease. CBir1 TCR transgenic na&#970;ve CD4+ T cells, specific to CBir1 flagellin, can induce chronic colitis after adoptive transfer into immune-deficient Rag1-/- mice. The disease severity is assessed by histopathology. The CD4+ T cell phenotypes in colonic lamina propria are also determined. This model closely resembles the development of IBD, which provides an ideal murine model for investigating the mechanisms driving the pathogenesis of IBD and testing the potential drugs for treating IBD.

Induction of Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of CBir1 TCR Transgenic CD4+ T Cells to Immunodeficient Mice

In this protocol, a gut microbiota antigen-specific T cell adoptive transfer colitis model is described. CD4+ T cells are isolated from CBir1 TCR transgenic mice. These are specific for an immunodominant gut microbiota antigen CBir1 flagellin, which is transferred into recipient Rag1-/- mice, leading to intestinal inflammation.

CBir1 TCR Transgenik CD4+ T Hücrelerinin İmmün Yetmezlikçi Farelere Benimsenen Transferi ile Bağırsak İltihabının İndüksiyonu

With the increase of incidence, inflammatory bowel diseases (IBD), which are chronic diseases affecting the gastrointestinal tract, impose a considerable ...

Use of Anti-phospho-girdin Antibodies to Visualize Intestinal Tuft Cells in Free-Floating Mouse Jejunum Cryosections

The actin binding protein girdin is a cytosolic protein that is required for actin remodeling to trigger cell migration in various tissues. Girdin is phosphorylated by both receptor and non-receptor tyrosine kinases at tyrosine 1798. Omori et al. developed site- and phosphorylation status-specific antibodies against human girdin at tyrosine-1798 (pY1798), which specifically bind to phosphorylated tyrosine-1798, but not to unphosphorylated tyrosine-1798. pY1798 antibodies have been used to specifically label tuft cells (TCs) that are present in mammalian gastrointestinal tissues, but the function of these cells is unclear. This protocol allows the robust visualization of TCs in the jejunum using pY1798 antibodies and immunofluorescence. To ensure successful and simple TC visualization, this protocol includes two histological techniques: production of free-floating cryosections from gelatin-filled jejunum tissue, and low-temperature antigen retrieval at 50 &#176;C for 3 h. Filling the jejunum with gelatin maintains the shape of free-floating sections throughout the staining procedure, whereas low-temperature antigen retrieval ensures robust signals from TCs. Successful use of this protocol results in pY1798 staining of TCs distributed from villus tip to crypt. Stained TCs have a spool-shaped soma and fluorescent signals condense at the lumenal tip, which corresponds to the protruding &#39;tuft.&#39;&#160;Phalloidin staining colocalized with pY1798-positive TCs at the thickened brush border, and corresponds to a rootlet mass extending from the TC tuft. This protocol could be used to examine TCs in human biopsy samples collected with gastrointestinal endoscopes. Furthermore, TCs were recently reported to accumulate following parasite infection in mice, suggesting that this protocol could have applications for diagnosis of parasite infections in the human gut.

Kuga et al. discovered that phosphorylation-status specific antibodies against the actin binding protein girdin phosphorylated at tyrosine 1798 (pY1798) can be used to label tuft cells (TCs). This protocol allows robust visualization of TCs using immunofluorescent staining of free-floating jejunum cryosections with pY1798 antibodies.

Serbest dalgalanma fare değişir Cryosections hücrelerde bağırsak tutam görselleştirmek için Anti-fosfo-girdin antikor kullanımı

The actin binding protein girdin is a cytosolic protein that is required for actin remodeling to trigger cell migration in various tissues. Girdin is ...

Evaluation and Quantification of Micro Epithelial Gaps in the Colonic Mucosa using Immunofluorescence Staining

Epithelial cells lining the intestinal mucosa create a physical barrier that separates the luminal content from the interstitium. Epithelial barrier impairment has been associated with the development of various pathologies such as inflammatory bowel diseases (IBD). In the inflamed mucosa, superficial erosions or micro-erosions that corrupt epithelial monolayers correspond to sites of high permeability. Several mechanisms have been implicated in the formation of micro-erosions including cell shedding and apoptosis. These micro-erosions often represent microscopic epithelial gaps randomly distributed in the colon. Visualization and quantification of those epithelial gaps has emerged as an important tool to investigate intestinal epithelial barrier function. Here, we describe a new method to visualize the specific location of where transcellular and paracellular permeability is enhanced in the inflamed colonic mucosa. In this assay, we apply a 10 kDa fluorescent dye conjugated to a lysine fixable dextran to visualize high permeability regions (HPR) in the colonic mucosa. Additional use of cell death markers revealed that HPR encompass apoptotic foci where epithelial extrusion/shedding occurs. The protocol described here provides a simple but effective approach to visualize and quantify micro-erosions in the intestine, which is a very useful tool in disease models, in which the intestinal epithelial barrier is compromised.

Here, we describe a new method to visualize the specific location of where transcellular and paracellular permeability is enhanced in the inflamed colonic mucosa. In this assay, we apply a 10 kDa fluorescent dye conjugated to a lysine fixable dextran to visualize high permeability regions (HPR) in the colonic mucosa.

Epithelial cells lining the intestinal mucosa create a physical barrier that separates the luminal content from the interstitium. Epithelial barrier ...

Bağırsak dokusunun yüksek kalitede immün boyanması için verimli Swiss Roll yöntemi

Optimized Protocol for Intestinal Swiss Rolls and Immunofluorescent Staining of Paraffin Embedded Tissue

The intestine is a complex organ composed of the small and the large intestines. The small intestine can be further divided into duodenum, jejunum, and ileum. Each anatomical region of the intestine has a unique function that is reflected by differences in cellular structure. Investigating changes in the intestine requires an in-depth analysis of different tissue regions and cellular alterations. To study the intestine and visualize large pieces of tissue, researchers commonly use a technique known as intestinal Swiss rolls. In this technique, the intestine is divided into each anatomical region and fixed in a flat orientation. Then, the tissue is carefully rolled and processed for paraffin embedding. Proper tissue fixation and orientation is an often-overlooked laboratory technique but is critically important for downstream analysis. Additionally, improper Swiss rolling of intestinal tissue can damage the fragile intestinal epithelium, leading to poor tissue quality for immunostaining. Ensuring well-fixed and properly oriented tissue with intact cellular structures is a crucial step that ensures optimal visualization of intestinal cells. We present a cost-effective and simple method for making Swiss rolls to include all sections of the intestine in a single paraffin-embedded block. We also describe optimized immunofluorescence staining of intestinal tissue to study various aspects of the intestinal epithelium. The following protocol provides researchers with a comprehensive guide to obtaining high-quality immunofluorescence images through intestinal tissue fixation, Swiss-roll technique, and immunostaining. Employing these refined approaches preserves the intricate morphology of the intestinal epithelium and fosters a deeper understanding of intestinal physiology and pathobiology.

Yazar Spotlight: Bağırsak Hücre Biyolojisi Araştırmaları için Etkili İmmünofloresan Boyama Protokolü

The intestine is vital for digestion and absorption. Each region-duodenum, jejunum, ileum, colon-serves distinct functions due to unique cellular structures. Studying intestinal physiology demands meticulous tissue analysis. This protocol outlines tissue fixation and processing using the Swiss roll technique, ensuring accurate immunostaining through proper tissue preservation and orientation.

Bağırsak İsviçre ruloları ve parafine gömülü dokunun immünofloresan boyaması için optimize edilmiş protokol

The intestine is a complex organ composed of the small and the large intestines. The small intestine can be further divided into duodenum, jejunum, and ...

Immünohistokimyasal ve immünofloresan Analizleri için Bağırsak Doku Hazırlama için geliştirilmiş Swiss-haddeleme Tekniği

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Dekstran Sülfat Sodyum (DSS) kullanarak murin Kolit Modelleme

Basit Aygıt Hızla Fare Bağırsak Tüm Mounts Hazırlanır

Lazer-yakalama mikrodiseksiyon optimizasyonu gelen insan dokusu taze donmuş enterik gangliyon yalıtım için

Murine Dextran Sodyum Sülfat Kaynaklı Kolit Modelinde Bağırsak İltihabı İçin Sistematik Puanlama Analizi

Floresan In Situ Hibridizasyon, Lectin Boyama ve Görüntüleme Yoluyla Gut Mikrobiyota-konak Etkileşimlerinin Görselleştirilmesi

CBir1 TCR Transgenik CD4⁺ T Hücrelerinin İmmün Yetmezlikçi Farelere Benimsenen Transferi ile Bağırsak İltihabının İndüksiyonu

Serbest dalgalanma fare değişir Cryosections hücrelerde bağırsak tutam görselleştirmek için Anti-fosfo-girdin antikor kullanımı

Evaluation and Quantification of Micro Epithelial Gaps in the Colonic Mucosa using Immunofluorescence Staining

Bağırsak İsviçre ruloları ve parafine gömülü dokunun immünofloresan boyaması için optimize edilmiş protokol

Bağırsak İsviçre ruloları ve parafine gömülü dokunun immünofloresan boyaması için optimize edilmiş protokol