This research was supported by Advanced Research Projects Agency - Energy (ARPA-E) Award No. DE-AR0000313.

Süspansiyon Hücre Kültürleri 1. kurulması <ol><li> BY-2 ortamı PO4 4.43 g Linsmaier ve Skoog bazal ortamı, sukroz, 30 gr, 200 mg KH 2 ekleyerek sıvı hazırlayın ve damıtılmış 200 ug ila 900 2,4-diklorofenoksiasetik asit (2,4-D) mi su ve 0.1 M KOH ile pH değeri 5.8&#39;e. pH ayarlandıktan sonra damıtılmış su ve otoklav ile 1000 ml nihai hacim ayarlayın. Ortam, 4 ° C&#39;de 2 hafta kadar saklanabilir. </li><li> % 1 ilave By-2 ortamı, 250 ml&#39;lik bir Erlenmeyer bir katı İLE-2 ortamı üzerinde yetiştirilen 100 ile-2 ortamı sıvı ml x 2 yara dokusunun tek bir parça (&gt; 1 cm çaplı) ile balonun (sıvı inoküle ağar) ve alüminyum folyo ile kapatın. 5 gün çalkalanarak 28-30 ° C &#39;de kültür inkübe edin. NOT: Sıvı kültürler hızla büyümek gibi BY-2 kallus, uzun süreli depolama için katı ortam üzerinde muhafaza edilir. Kültür hacmi, tipik olarak, 100 ml kültür üç otuz 6-w yükleme kapasitesine sahip olacaktır, gerektiğinde ayarlanabilirarşın plakalar. </li><li> Transferi 2 x 2 Kültür Fresh-2 ortamı 98 ml log fazı ml çalkalanarak 28-30 ° C&#39;de 5-7 gün süreyle inkübe edilir. Not: kallus 100, 5-7 günlük kültür dilüsyonları yerine aşı: kurulan sıvı kültürlerin Alt kültür düzenli 1 kullanılarak gerçekleştirilebilir. </li><li> Hücreler hızla yerleşmek gibi, iyice karıştırın kültür, ve transfer hücre kültürü 6 ml 15 ml konik alt santrifüj tüpüne ve hücreler en az 10 dakika süreyle razı olsun. Süpernatan uzaklaştırılmış, toplam hacminin% 50&#39;si için paketlenmiş hücre hacmi ayarlayın. </li><li> sindirim için, 6 gözlü bir plakanın her bir oyuğuna, 500 ul çevrilerek ve bir pipet ile tüp çalkalayın. Onlar yoğun olarak, bu aşamada hücreler aktarmak için geniş çaplı pipetleri kullanın ve standart pipet ipuçları yapışmasına neden olacaktır. </li></ol> 2. Protoplast İzolasyonu <ol><li> Robot sistemi (Şekil 1A) tüm bileşenleri açın ve yumuşak zamanlama plaka taşıyıcı görevi açmakware. görev zamanlama programı her ekipman parçasının arasına plakaların transferini sağlamak için diğer ekipman ile mikroplağı değişenlerden bütünleştirir. </li><li> Aşağıdaki gibi önceki deney için, plaka taşıyıcı yazılım laboratuvar her bir parça, teknik protokolde kullanılan laboratuvar özelliklerini (örneğin, tabak, kapaklar), hem de başlangıç ve bitiş pozisyonları tanımlamak: <ol><li> Plaka taşıyıcı yazılımı ana araç çubuğundan Kur&#39;u tıklatın ve Yönet Konteyner Çeşitleri komutunu seçin. </li><li> konteyner tipi mevcut konteyner tipi kitaplığında listede varsa, o zaman uygun bir kap seçin. </li><li> Konteyner tipi mevcut konteyner tipi kitaplığında yer almıyorsa o zaman yeni bir konteyner türünü belirtmek için Ekle &#39;yi tıklatın. </li><li> Yeni bir konteyner tipi ekledikten sonra, uygun sekmeler halinde (ofset yükseklik, genişlik, istifleme boyutları ve kavrayıcı) yeni konteyner boyutları eklemek ve Kaydet&#39;i tıklatın.<ol><li> Doğru boyutlar üreticinin mevcut değilse, o zaman doğru kumpas kullanılarak en yakın milimetreye kadar tüm boyutlarını belirlemek. konteyner boyutları ölçmek hatalar plaka taşıyıcı başarısızlıkla sonuçlanacaktır. </li></ol></li><li> Tekrarlayın plaka taşıyıcı karşılaşacak tüm konteyner tipleri için 2.2.4.1 ile 2.2.2 adımları. Tüm laboratuvar Bu aşamanın tamamlanmasından sonra, her bir kabın (aşama 2.2.6) için başlangıç ​​ve bitiş konumunu tanımlamak için gereklidir. NOT: Bu protokol için laboratuvar 6-plaka derin oyuklu plaka ve 96 oyuklu flüoresan görüntüleme plaka içerir. </li><li> Her kabın başlangıç ve bitiş konumunu tanımlamak için, belirli bir protokol Başlangıç / Bitiş sekmesini tıklatın. İlk olarak, her kabın başlangıç ​​konumu seçin. Sonraki, başlangıç ve bitiş pozisyonunda hem de Kapaklı / Unlidded kutusunu işaretleyin. tüm konteynerler için tekrarlayın. NOT: Konteyner equ başka bir parça sol edilecek iseipment (yerine levha taşıyıcı içinde) son konumu boş bırakılabilir. </li></ol></li><li> Bu aşamada el ile tüm iş akışı için başlangıç ​​pozisyonuna tüm plakaları yükleyin. , Otel 3&#39;e BY-2 hücreleri ile otel haline levha ısıtıcı / soğutucu yuva 2 üzerine transformasyonu için kullanılacak bir 96 kuyulu plaka ve 50 ml konik 2, 6 oyuklu plakalar 96 oyuklu flüoresan görüntüleme levhaları yük çok modlu dağıtıcı üzerine enzim solüsyonu (Company Dosya, Bölüm 1.2.2 bakınız) içeren tüp. <ol><li> Transformasyon protokolü içinde gerçekleştirilebilir olacaksa, oyuk başına plasmid DNA, 10 ul 96 kuyulu plaka ön yük (1 ug / ml, A 260/280&gt; 1.8) OFP raportör konstruktunu ihtiva eden ve levha üzerinde inkübe 4 ° C&#39;de ısıtma / soğutma. Her iyi, tek bir dönüşüm için deney düzeneği bağlıdır dolu kuyuların böylece sayıda kullanılacaktır. </li></ol></li><li> otomatikleştirmek tüm malzemeleri ve tabak yükleyinbelirlenmiş yerlerde d sıvı taşıma platformu ve otomasyon kontrol yazılımı (Şekil 1B) her öğenin konumunu tanımlar. <ol><li> Sütun 1 mmg içinde% 40 PEG 200 ul (0.4 M manitol, 100 mM MgCl2, 4 mM MES, pH 5.7), propidyum iyodür 200 ul ile önceden yüklenmiş, 96 oyuklu bir plaka yükleme (p, ve 1 ng / ml) 2. sütun ve sütun 3 (yuva 2) etanol 200 ul ve yuva 8 pipet uçları bir kutu içinde. </li><li> Menüden otomatik sıvı taşıma platformunun yazılımında laboratuvar konumunu Araçlar tanımlamak ve Laboratuvar Editör tıklayın. </li><li> Açılan menüden laboratuvar türünü seçin veya Yeni Laboratuvar düğmesini kullanarak yeni bir laboratuvar türü tanımlar. </li><li> Ana Protokol sekmesini seçip yapılandırma laboratuvar tıklayarak seçilen laboratuvar her parçasının konumunu tanımlayın. Otomatik sıvı taşıma platformu üzerine yerleştirilen laboratuvar her parça olduğundan emin olunprotokol çalıştırmadan önce tanımlanmış. </li><li> Otomatik protokolleri tetiklemek için, Profil Explorer penceresini tıklayın ve çalıştırmak için protokolü (Protoplast İzolasyonu, Hücre Sayımı ve PEG-aracılı Dönüşüm) adını seçin. </li><li> Protokolünde kullanılacak olan tüm cihazların başlatmak için Çalıştır&#39;ı tıklatın. </li><li> Son olarak, Çalışma Explorer penceresinde, sistemdeki tüm konteynerler / laboratuar aletlerinin doğrulamak ve otomatikleştirilmiş protokol başlamak için Çalışma Birimi Ekleme tıklayın. NOT: Otomatik protokollerin tam açıklamaları Company Dosya yer almaktadır. </li></ol></li></ol> 3. Hücre Sayımı için Standart Eğrisi oluşturulması <ol><li> El ile 1 ml&#39;lik bir hacim içinde, 1 x 10 6 protoplastlar / ml&#39;lik bir konsantrasyonda protoplast konsantre. Santrifüj 10 dakika boyunca 1.000 xg&#39;de protoplastlannda ve süpernatant kaldırmak. </li><li> El ile protoplast pelet (4 ° C&#39;de),% 70 etanol içinde 900 ulve pelet yeniden askıya. hücrelerin tespit edilmeleri için, buz üzerinde 10 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> çekirdekleri etiket ve plaka okuyucu tarafından fark edilmesine olanak vermek için protoplast için PI, 100 ul (1 ug / ml) eklenir. </li><li> Yük sütununda 2 başlayarak 96-iyi floresan tarama plakasının her sütun ve satır içine BY-2 medya sıvının 80 ul. </li><li> 96 oyuklu bir flüoresan görüntüleme plaka sütun 1 de, her bir kuyucuğa İLE-2 ortamı protoplast 70 ul ve 50 ul ekle. </li><li> otomatik sıvı taşıma platformunun yuva 6 plaka koyun ve 2-kat seri seyreltme çalıştırın. <ol><li> Otomatik sıvı taşıma platformu üzerinde bir seri seyreltme yapmak için, Seri Sulandırma Sihirbazı başlatın tıklayın ve transfer hacmi (60 ul), karışımları ve hacim (2, 70 ul), ilk kuyu sayısı (sütun 1, Satırlar AF), seyreltme ayarlamak kuyular (Sütunlar 2-11, Satırlar AF) ve aspire ve dağıtmak özellikleri (kuyu alt 0,5 mm). </li><li> parametreleri ayarladıktan sonra, bir kaydetmeprotokolü çalıştırmak d. NOT: Tüm protoplastlar (nedeniyle hücrelerin fiksasyon) PI ile etiketlenmiş beri, floresan protoplast konsantrasyonu ile orantılıdır. </li><li> seri seyreltme işlemi tamamlandıktan sonra, yuva 9&#39;dan plaka kaldırmak ve plaka okuyucu içine yerleştirin ve plaka okuyucu yazılımı standart eğri protokolünü çalıştırın. Not: bir standart eğri daha sonra bilinen protoplast konsantrasyonu her bir PI den (eksitasyon 536 nm / emisyon 620 nm) floresan karşılaştırılarak oluşturulur. </li></ol></li><li> plaka okuyucu protokolünün tamamlanmasının ardından, plaka kaldırmak ve otoklav veya &quot;biyo-güvenlik protokolleri de tanımlandığı gibi de-canlandırma prosedürlerinin herhangi bir transgenik hücreleri toplamak. </li></ol> Dönüşüm 4. Mikroskobik Analizi <ol><li> Dönüştürülmüş protoplastların robot sisteminin Otel 1 (Otomatik Protokolünün 3, Ek Dosya ürünü) ile plakasını sökün. </li><li> dönüşinverted mikroskop, kamera ve floresan lamba. </li><li> , Protoplastlar odaklanan ilk için 10X objektif seçmek halojen lamba açmak ve floresan lamba için deklanşöre kapatın. </li><li> aydınlık kullanarak protoplastlar mikroskobik sistemi ve odak üzerine yük plakası. </li><li> protoplastlar odaklanarak sonra, halojen ampul kapatın ve floresan lamba için deklanşöre açın. </li><li> Transgenik protoplastlar tarafından ifade pporRFP proteinin görselleştirme için belirlenen CY3 / TRITC filtresini seçin. </li><li> pporRFP floresan işaretleyici ifade protoplastlar sayısını belirlemek için de her tarayın. </li><li> floresan işaretleyici protoplast sayısı ifade protoplast toplam sayısı olarak transformasyon etkinliğini hesaplayın. </li><li> otoklav ya da &#39;biyogüvenlik protokollerde tanımlanan diğer de-yaşatma işlemleri için onaylanmış biyogüvenlik torbalarda transgenik hücre içeren herhangi bir levha toplayın. </li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali ilgi var olduğunu beyan ederiz.

Yukarıda açıklanan protokol başarıyla protoplast izolasyon, numaralandırma ve dönüşüm BY-2 tütün süspansiyon hücre kültürü kullanarak valide edilmiştir; Ancak, protokol kolayca herhangi bir bitki süspansiyon kültürü için uzun olabilir. Şu anda, protoplast izolasyon ve dönüşüm mısır (Zea mays), 10, havuç (Daucus carota) 32, kavak (Populus euphratica) 33, üzüm (Vitis vinifera) 34, palmiye yağı (Elaeis guineensis) 35 de dahil olmak üzere pek çok bitki, elde edilmiştir , salata (Lactuca sativa) 36, hardal (Brassica Juncea) 37, pirinç (Oryza sativa) 38 ve darı (dallı darı) 39,40. Kültür ve sindirim koşulları varyasyon da manşet koşulları kültür ortamı yerine veya değiştirilmesi, bu işin geliştirilen protokol açısından, türden türe meydanaSorusuna temel protokol değiştirmemelisiniz. böylece bu bileşenleri takas önemsiz, önceki protokol başlatma için operatör tarafından yüklenen sindirim için gerekli olan farklı türler, kültür ortamı ve enzimlere ayarlamak için. Ek bir avantaj olarak, protokol sistemi ile ölçülen protoplastların verimi ile birden sindirim koşulları tarama için amendable olduğunu. düşük enzim kullanımı, yüksek hacimli uygulamalar için gerekli olan bu nedenle sindirim kullanılan enzimlerin miktarı en aza indirmek için önemlidir, temel bir bileşenidir. Farklı bitki türlerinden izole edilmiş protoplastların dönüşümü için bir sistem kabul ederken kültür ve sindirim benzer şekilde, şekil değiştirme protokolüne modifikasyonlar gerekli olacaktır. Bir husus da şudur dönüşüm verimini etkileyen çeşitli faktörler, bitki protoplast 16,35 PEG aracılı transformasyon optimizasyonu üzerinde yürütülmüştür. wo akımdönüşüm verimini etkileyen rk bir sınırlayıcı faktör ikili testi plazmid büyük boyutu, bir genom düzenleme plazmid boyutu modelleme amacıyla kullanılan 16.028 bp. X 2 protoplast PEG aracılı transformasyon önceki çalışmalarda,% 40-60 dönüşüm elde edilmiştir; Ancak, bu çalışmalar küçük 5,000 bp plazmidler 41,42 kullanılır. Türler arasında, PEG aracılı transformasyon birincil modifikasyonlar PEG ve MgCl2, miktarı ve DNA konsantrasyonu, konsantrasyon, ve reaksiyon süresi bulunmaktadır. PEG ve MgCl2 çözeltileri reaktif plaka sistemi içine ve DNA önceden yüklenmiş kuyulu plaka gibi olduğu protokolü, yukarıda tarif edilen, bu koşullar, kolayca değiştirilebilir. Ek olarak, tam robot platform tarafından kontrol edilebilir, olabilir, artan veya karıştırma hızlarının değiştirilmesi ile birlikte inkübasyon süresi azalmaktadır. transformasyon protokolü akım sınırlama olmamasınedeniyle x 2 protoplastlarda PEG-aracılı dönüşümün düşük verimlilik, floresan raportör tespit etmek için plaka okuyucusu kullanılarak tarama. Bu Arabidopsis thaliana ve mısırın 16 gibi diğer türlerin, PEG aracılı transformasyon% 40-90 etkilidir. Bu tür sistemlerde transformantlar hızlı robot plaka okuyucusu kullanılarak karakterize edilebilir. Bu durumda, pozitif transformantlar ile kuyu tespit ve aynı zamanda ifade seviyesini ölçmek için mümkün olacaktır. promotör tarama gibi uygulamalar için, bu özellik mevcut protokolün yarar artıracak ve sistemin daha sonraki iterasyon eklenecektir. X 2, protoplastlar için dönüşüm verimliliği optimize edilmesine ek olarak, çeşitli modifikasyonlar sisteminin etkinliğini ve genel verimi arttırabilir. protoplast transformasyonu izin protoplastların otomasyon Önceki çalışmalar öncesinde olduğu ilavesinden, kuyu dibine yerleşmeyeh çözümleri 43. Mevcut protokolde, protoplastlar çökelme önleme ve düz tabanlı oyuklu plakalar kullanılarak süspansiyon içinde tutmak için protoplast plaka karıştırıcısı üzerinde karıştırıldı. Ayrıca, dönüşüm sırasında, protoplastlar, derin kuyu plakaları yerleşmek uzun süre maruz üzerinde toksik olabilir PEG maruziyeti azaltmak için izin verilmemiştir. 96 gözlü flüoresan görüntüleme plaka derin oyuklu plakaya transfer edildiğinde Bu haliyle, protoplastlar, göz başına 1.23 x 10 3 ± 4.66 x 10 1 protoplastlarında sonuçlanan ~ W5 çözeltisi ile 10 kat seyreltildi. dönüşümden sonra transfer protoplast sayısını artırmak amacıyla, bir inkübasyon aşaması protoplastlar yerleşmesine izin eklenebilir ve süpernatan sıvı ile-2 ortamı daha küçük bir hacimde ilave edilir kaldırıldı. Bir plaka bazlı santrifüj sistemi ilave edildi Buna ek olarak, bu adım, daha hızlı bir şekilde elde edilebilir. t işlevsellik eklemek olabilir başka bir değişikliko sistem dönüştürmeden önce izole protoplastlar canlılığı belirlemek için canlı / ölü floresan testinin kullanımı olacaktır. mevcut protokol, floresandiasetat (FDA), canlı bir boya olarak test edilmiştir; Ancak, BY-2 protoplast eşiğe FDA sinyali gizlenmiş. Daha kararlı bir canlılığı boya kullanılmış ise, o zaman protoplast canlılığı kırmızıdan yeşile (PI) oranı (Calcein AM, vb) floresans ve hücre sayımı protokolüne standart benzeri tespit edilebilir. Bu modifikasyonlar sisteme daha fazla işlevsellik eklemek istiyorum, ve gelecekteki protokoller dahil edilecektir. mevcut protokole ilgili olarak, protokol başarılı olmasını sağlamak için takip edilmesi gereken birkaç kritik adımlar vardır. Ilk önce, 2-kültürlerin yaş / sağlık bu canlı protoplastlar sonraki adım için izole edilebilir garanti etmek için gereklidir. Bir de taze bir balona bir log fazı kültürü aktararak, adım 1.3 olarak açıklandığı üzereKültür 5-7 gün boyunca büyümeye izin veren 1:50 taze ortam hücre oranı ve canlı protoplast en fazla izole edilebilir. kültürlerinin önemli bir protoplast veriminin azalmasına ve daha sonraki protokollerin başarısız olmasına neden olur belirtilen inokulum kullanarak uzun veya daha kısa süreler için büyümeye izin verir. İkinci kritik bir adım yerine belirtilen geniş çaplı pipetlemeyin ipuçları, standart pipet ipuçları kullanımı, çünkü ipuçları yapışmasına neden olabilir ve transfer edilen hatalı hacimleri almasına neden olur, adım 1.5 olduğunu. Robotik sistemin kurulumu ile ilgili olarak, otomatik sıvı taşıma platformu üzerinde levha düzeneği, 2.4 adım 6 çukurlu bir levha üzerinde her kuyu ulaşan sıvı işleyici baş engelleyen bir tadil edilmiş ayarı ile, kritik öneme sahiptir. Nedeniyle otomatik sıvı taşıma platformunun tasarımı, 6-plaka yuvaya 5 yerleştirilmesi gerekir veya bu enstrüman için seçilen protokoller başarısız olur. Benzer şekilde, başarısızlık doğru plakadaki laboratuar aletlerinin tanımlamak içintaşıyıcı yazılımı, adım 2.2, enstrüman kapmak için başarısız, ya da protokolün feshi sonuçlanan laboratuar aletlerinin bırakmasına neden olur. hücre sayımı protokolü için, kritik bir adım etanol, adım 3.2 ile hücrelerin tespiti içerir. Hücreler PI ile etiketleme önce sabit değildir, yalnızca cansız hücreler yerine protoplast tüm nüfusun, etiketli olacak ve izole protoplastlar sayısını saymak mümkün olmayacaktır. son kritik adım adım 4.6 pporRFP floresan markör ifade mikroskopik analiz için floresan filtrelerin seçimini içerir. Diğer &quot;kırmızı&quot; filtre setleri kullanımı önemli ölçüde dönüşüm verimliliği hesaplama önlenmesi, tüm kloroplast içeren protoplastlarda sinyali artan klorofil gelen eşiğe sağlar. Dikkatle bu kritik adımda özelliklerine bağlı kalarak başarı için büyük bir fırsat ve en tekrarlanabilir verilerin nesil garantive.

Son yıllarda, bitkisel beslenme 6 bilmek biyokütle verimi 7 geliştirmek, ve hücre duvarı rekalsitrantların azaltmak kuraklık 3,4 ve tuz tolerans 5 iletmektedir, herbisite karşı direnç 2 kavuşturulması, çeşitli hastalıkların 1 üstesinden gelmek için transgenik bitkileri tasarım yerleştirilen önemli ivme olmuştur 8. Bu eğilim dsRNA 10, miRNA 11 ve siRNA 12 üzerinden susturma CRISPR ve Talens 9 kullanarak genom düzenleme ve gen dahil olmak üzere transgenik bitkiler, üretmek için yeni moleküler araçlar geliştirilmesi ile yardım görmüştür. Bu teknolojilerin transgenik bitkilerin üretimini basitleştirilmiş olsa da, onlar da transgenik bitkilerin çokluğu bitki rejenerasyonu güveniyor geleneksel sistemler kullanılarak taranabilir olamaz oluşturulan bir darboğaz oluşturduk. Birçoğu susturma ve genom düzenleme konstruktları hızlı bitkilere sokulabilir ise, bu dar ilişkinhedeflenen özellikleri bitkiler serada analiz kadar sık ​​tespit edilmez arzu edilen etkiyi üretmek için başarısız olur. Bu çalışmada, özellikle hedef susturulması genom düzenleme ve genin çok sayıda erken tarama mevcut darboğaz gidermek için, bitki protoplast hızlı, otomatik, yüksek verimli tarama için bir yöntem geliştirdik. sağlam bitki hücrelerine karşı protoplast kullanımı, otomatik bir platformun geliştirilmesi için pek çok avantajı vardır. İlk olarak, protoplastlar, bitki hücre duvarının sindirilmesinden sonra izole edilir, ve bundan sonra, bu, bu bariyer, dönüşüm etkinliği 13 arttırılır. Sağlam bitki hücrelerinde 14 ve Agrobacterium aracılı transformasyon 15 Biolistics transformasyonu için sadece iki yaygın olarak kullanılan yöntemler vardır. biyolistik TRANSFO için özel ekipman gerektirir olarak bu yöntemlerin hiçbiri kolayca sıvı taşıma platformları tercüme edilebilirım, Agrobacterium ise aracılı transformasyon ko-kültür ve bakterilerin sonraki çıkarılmasını gerektirir. Ne yüksek verimli yöntemleri için uygundurlar. Protoplast durumda, dönüşüm rutin ancak birkaç çözeltisi değişimini gerektiren ve ideal olarak sıvı kullanım platformlar için uygundur, polietilen glikol (PEG) aracılı transfeksiyon 16 kullanılarak yapılır. İkinci olarak, protoplastlar, tanımı gereği, tek hücre kültürleri, ve böylece bitki hücresi kültürlerinde topaklanma ve zincir oluşumu ile bağlantılı problemler, protoplastlarda gözlenmez. Bir plaka bazlı spektrofotometre hücre topaklanma kullanılarak süratle taranması açısından ya da birden çok sayıda düzlemde hücre tutarlı ölçümler elde zorluk yol açacaktır. protoplastlar kendi kültür ortamı daha da yoğun oldukları için, plaka tabanlı spektrofotometresi için elverişli bir tek tabaka oluşturan, kuyu dibine tortu. Son olarak, bitki hücre süspansiyon kültürleri Primar ikenily kallustan 17 türetilmiş, protoplastlar dokuya özgü ifade tespit etmek potensitesi, bitki dokularının bir dizi hasat edilebilir. Örneğin, özelliği fenotipi tahmin için çok önemli olabilir kök veya bir genin yaprağa özel ifadesini analiz etmek. Bu nedenlerle, bu işin geliştirilen protokol yaygın olarak kullanılan tütün (Nicotiana tabacum L.) parlak sarı bir &#39;2 (x 2) süspansiyon kültüründen izole edilen protoplastlardan kullanılarak doğrulanmıştır. X 2 süspansiyon kültürü, bitki hücrelerinin 18 moleküler analizlerde her yerde kullanımı sayesinde, daha yüksek bir bitki &quot;, HeLa&quot; hücre olarak tanımlanmıştır. Son zamanlarda, BY-2 hücreleri bitkinin etkilerini incelemek için kullanılır olmuştur hücre içi protein lokalizasyonu 23,24 ve bitki biyolojisinde bu kültürlerin geniş bir kullanım gösteren temel hücre biyolojisi 25-27, 19-22 Stresörler. X 2 kültürlerin ilave bir avantajı, birGen ifadesi için geliştirilmiş tekrarlanabilirlik yol açabilir, aphidicolin ile kültürleri senkronize yeteneği 28 inceler. Ayrıca, araştırılan yöntemler, geleneksel protoplastlar üretilmesi için kullanılan enzimler, maliyeti yüksek olan sistemlerin için engelleyici olarak, düşük maliyetli enzimler 29,30 kullanarak-2 protoplast çıkarılması için geliştirilmiştir. Bu nedenle, aşağıda açıklanan protokol BY-2 süspansiyon kültürü kullanılarak valide edilmiş, ancak herhangi bir bitki hücre süspansiyonu kültürüne amendable olmalıdır. Korumalı kavram deneyleri sabit Poritesin turuncu bir flüoresan proteini (OFP) raportör geni (pporRFP) CaMV 35S promoterinin kontrolü altında 31 Porites kullanılarak gerçekleştirilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="763">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Orbitor RS Microplate mover</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Bravo Liquid Handler</td>
			<td style="width:157px;">Agilent</td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Synergy H1 Multi-mode Reader</td>
			<td style="width:157px;">BioTek</td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">MultiFlo FX Multi-mode Dispenser</td>
			<td style="width:157px;">BioTek</td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Teleshake</td>
			<td style="width:157px;">Inheco</td>
			<td>3800048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">CPAC Ultraflat Heater/cooler</td>
			<td style="width:157px;">Inheco</td>
			<td>7000190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:255px;">Vworks Automation Software</td>
			<td style="width:157px;">Agilent</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;">Software used to control and write protocols for Agilent Bravo</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:255px;">Momentum Software</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;">Task scheduling software for controlling Orbiter RS</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:255px;">Liquid Handling Control 2.17 Software</td>
			<td style="width:157px;">Biotek</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;">Software used to control and write protocols for MultiFlo FX</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">IX81 Inverted Microscope</td>
			<td style="width:157px;">Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Zyla 3-Tap microscope camera</td>
			<td style="width:157px;">Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">ET-CY3/TRITC Filter Set</td>
			<td style="width:157px;">Chroma Technology Corp</td>
			<td>49004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Rohament CL</td>
			<td style="width:157px;">AB Enzymes</td>
			<td style="width:185px;">sample bottle</td>
			<td>low-cost cellulase</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Rohapect UF</td>
			<td style="width:157px;">AB Enzymes</td>
			<td style="width:185px;">sample bottle</td>
			<td>low-cost pectinase</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Rohapect 10L</td>
			<td style="width:157px;">AB Enzymes</td>
			<td style="width:185px;">sample bottle</td>
			<td>low-cost pectinase/arabinase</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Linsmaier &#38; Skoog Basal Medium</td>
			<td style="width:157px;">Phytotechnology Laboratories</td>
			<td style="width:185px;">L689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">2,4 dichlorophenoxyacetic acid</td>
			<td style="width:157px;">Phytotechnology Laboratories</td>
			<td style="width:185px;">D295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">propidium iodide</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Poly (ethylene glycol) 4000</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">95904-250G-F</td>
			<td>Formerly Fluka PEG</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Propidium Iodide</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">25535-16-4</td>
			<td>Acros Organics</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">CaCl2</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">C7902-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Sodium Acetate</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">BP333-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Mannitol</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">M1902-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Sucrose</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">S5-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">AC424205000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">KOH</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">P1767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Gelzan CM</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">G1910-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">6-well plate</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:185px;">103184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">96-well 1.2 ml deep well plate</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:185px;">AB-0564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">96 well optical bottom plate</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:185px;">165305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Finntip 1000 Wide bore Pipet tips</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:185px;">9405 163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">NaCl</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">BP358-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">KCl</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">P4504-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">MES</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">AC17259-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">MgCl2</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a robotic platform for high-throughput protoplast isolation and transformation

Son on yıl içinde, sinyal transdüksiyon yollarının, transkripsiyonel düzenleyici ağlar, gen ekspresyonu, genom düzenleme ve gen sessizleştirme analizi için, tür kırpmak için örnek türlerin arasında değişen bitki protoplastlarına kullanımında bir şekilde arttığı gözlenmiştir. Ayrıca, önemli bir ilerleme bitki genomik için bu sistemlerin kullanımında bile daha fazla ilgi üretti protoplast bitkilerin rejenerasyonu, ilerleme kaydedilmiştir. Bu çalışmada, bir protokol bir robot platformu kullanılarak bir &quot;açık san &#39;2 (x 2), tütün süspansiyon kültüründen protoplast izolasyon ve dönüşüm otomasyonu için geliştirilmiştir. dönüşüm yöntemleri Karnabahar mozaik virüsü 35S promoteri (35S) kontrolü altında portakal renkli bir floresan protein (OFP) raportör geni (pporRFP) kullanılarak doğrulanmıştır. protoplastlarda OFP sentezleme epifloresans mikroskopisi ile teyit edilmiştir. Analizler aynı zamanda propidiu kullanarak protoplast üretim verimliliği yöntemleri dahilm iyodür. Son olarak, düşük maliyetli bir yiyecek cinsi enzimler maliyet açısından çok pahalı protoplast izolasyon ve analizi otomatik yüksek verimli olan laboratuvar dereceli enzimler gerektiren gereksinimin ortadan kaldırılmasının, protoplast izolasyon prosedürü kullanılmıştır. Bu çalışmada geliştirilen protokolüne göre, dönüşüm, protoplast izolasyon bütün yöntemi operatörün herhangi bir giriş olmadan 4 saat altında yapılabilir. Bu çalışmada geliştirilen protokol BY-2 hücre kültürü ile doğrulandı iken, prosedürler ve yöntemler ekin genomik araştırma ivmesini etkinleştirmeniz gerekir herhangi bir bitki süspansiyon kültürü / protoplast sistemine çevrilebilir olmalıdır.

Bu çalışmada, x 2 iki katına çıkma oranı 15 saat bir ortalama hücre döngüsü uzunluğu bir önceki raporlar ile uyumludur kültürleri inkübe edildi sıcaklığa bağımlıdır 14-18 saat arasında değişmiştir. Bu katlama oranı ile, 1: 100 Başlangıç ​​aşı 5-7 günde% 50 bir paketlenmiş hücre hacmi (PCV) kültürlerin neden kültürlerini başlatmak için kullanılmıştır. Kültürler ortam 200 ml içinde büyütülmüştür içinde mevcut protokolde dokunun bütünleşmesi, 100 ml&#39;lik bir PCV 33 6 oyuklu plakalar doldurmak için yeterli hücrelerin Resim 7 gün üretilmiştir. Protoplast verim açısından, protokolde belirtilen koşullarda sindirim 6 plaka (Şekil 2A) her 2.82 x 10 6 protoplastlarında sonuçlanan göz başına 4.70 X 10 5 ± 5.77 x 10 3 protoplastlar oluşturulur. Bu verilere dayanarak, 214, 96 oyuklu plakalar (oyuk başına protoplastların 70 ul) potansiyel fo ile tek bir 6-yuvalı plaka sindirimden yüklü olabilirR iki adet 6 oyuklu plakalar iki plaka ısıtıcı / soğutucu istasyonları kullanılarak, aynı anda sindirilmiş olan. Bu nedenle, tek bir üç saat sindirim protokolü esnasında oluşturulabilir protoplast en fazla 5.64 x 10 6. sindirim protokol başına üretilen protoplast toplam sayı sistemi için tek bir metrik sunarken, protoplast protokol farklı adımlarda aktarılır olarak protoplast konsantrasyon kaybı değerlendirmek için de gereklidir. Bu nedenle, protoplastların konsantrasyonu protokolünde, her transfer adımı sonra değerlendirilmiştir. Transformasyon protokolü, ya da 96 oyuklu flüoresan görüntüleme plaka (Şekil 2B) yapılması halinde sindirim protokolü sonra, 1.15 x 10 4 ± 1.35 x 10 2 protoplastlar, 96 çukurlu derin oyuklu plakalar, her transfer edildi. Dönüşüm protokolü tamamlandıktan sonra, 1.23 x 10 3 ± 4.66 x10 1 protoplastlar 96 gözlü flüoresan görüntüleme plaka (Şekil 2C) aktarılmıştır. transfer protoplast sayısına ek olarak, çok pipetleme aşamaları protoplast zarar vermediği sağlamak için protoplast kapasitesini belirlemek önemliydi. protoplast 95.1 ±% 0.04 sindiriminden sonra uygulanabilir olduğu canlılığı deneyi sonuçları, 96 oyuklu flüoresan görüntüleme plaka transfer edildikten sonra 92.1 ±% 0.06, ve dönüşüm protokolü sonra 91.7 ±% 16.67 esas alınmıştır. Birden fazla pipetleme adımlara rağmen, örneklerin hiçbiri arasında anlamlı bir fark bulunmadı (p&gt; 0.44) oldu. canlılığı Bu önlem ek olarak, bir protokol PI ile boyandı protoplastların sayısı ölçülerek prosedürünün herhangi bir aşamasında protoplastların konsantrasyonunun belirlenmesi için geliştirilmiştir. Şekil 3&#39;te gösterildiği gibi, bir standart eğri olarak generatsistemi protoplastların bilinen yoğunlukları için flüoresan yoğunluğu ölçülerek ed. Standart eğri de ortalama 0 30.000 protoplast aralığı kapsayan protoplast toplam sayısı ile iyi bir uyum (= 0,967 R2) idi. Standart eğri, (8125 ve 24.375 hemasitometre kullanarak hesaplanan) protoplast bilinen bir dizi ile örneklerin floresan yoğunluğu elde edildi ve standart eğrinin denklemden hesaplanan protoplast sayısını doğrulamak için. Bu sonuçlara dayanarak, standart eğri, iyi bir 15 ve% 14 hata her 9560 ve 28200 protoplast öngördü. Ayrıca hemasitometre kullanarak hücre sayısını ölçülmesinde değişkenlik olduğunu göz önüne alındığında, bu hata kabul edilebilir görüldü. F - Hücre sayısı ve canlılığı sonuçlarına ek olarak, transformasyon protokolü OFP (Şekil 2D eksprese eden transgenik hücrelerin üretilmesi başarılı oldu). Ne yazık ki kullanılan protokol ~, düşük bu çalışmada ve protokol BY-2 protoplastlar için özel olarak optimize değildi çünkü kullanılan büyük 16028 bp ikili plazmid nedeniyle% 2, dönüşüm verimliliği, sonuçlandı. Tartışma açıklanamamıştır olarak BY-2 protoplastlar için özel reaktifler ve koşulları bakımından dönüşüm protokolü, optimizasyonu, dönüşüm verimliliğini artırmak bekleniyor. Bu protokolün açısından, dönüşüm prosedürü dönüşüme protoplast izolasyondan proof-of-concept yolunu göstermek için tasarlanmış, ve bu hedefe ulaşmada başarılı oldu. başarıyla bireysel prosedürlerin hepsi doğrulayarak sonra, ölçümler dönüşüme protoplast izolasyondan protokol timecourse elde edilmiştir. Şekil 4&#39;te gösterildiği gibi, bir zaman önemli yatırım 3 saat fo gerekli olan sindirim aşaması sırasında harcananprotoplast hücre duvarı ve tahliye tam sindirim r. Bu işlem sırasında, 18 döngüler iki istasyon arasındaki plaka hareketli plaka taşıyıcı ile, plaka çalkalayıcı ve plaka ısıtıcı / soğutucu 1 inkübasyon istasyonu arasında çalıştırılır. plaka karıştırıcısı ve plaka ısıtıcı arasındaki transfer süresi / soğutucu 1 sadece 8.9 sn sürer, ve sindirim işleminin çoğunluğu kuluçkaya ve sallayarak harcanan olmasını sağlar. Çok modlu dağıtıcı tarafından enzim yükleme tamamlamak için prosedürün başlaması toplam süre 2.2 dakikadır. Genel olarak, tam protoplast izolasyon protokolü 3 saat ve 22.8 dakikada tamamlanır. Bu sonuçlara dayanarak, protoplast izolasyon protokolü% 88 sindirerek harcanmaktadır. Protoplast İzolasyon protokolünün tamamlanmasının ardından, transformasyon protokolü başlatılır ve 27.5 dakika içinde tamamlandı. protoplast izolasyon protokolü benzer şekilde, dönüşüm işleminin% 72 reaksiyonunu kuluçkaya harcanmaktadır. protokolde sadece diğer adımBu önemli bir zaman bileşeni (&gt; toplam işlem süresi 10%) prosedürde toplam süre 14% &#39;ini otomatik sıvı taşıma platformu ile protokol başlatma olduğunu vardır. Bu şekilde, protokolün% 86 pipetleme ve transfer adımlar harcanan zaman sadece% 14 ile, başlatma ve inkübasyon harcanmaktadır. protoplast izolasyon ve dönüşümün tam süresi operatör gerekli dış girişi ile, 3 saat, 50 dakika ve 53 saniye idi. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54300/54300fig1.jpg" /> Şekil 1:. Protokol sırasında robotik platformu ve otomatik sıvı taşıma platformu yapılandırma şematik (A) robotik sistem plakası taşıyıcı ulaşılabilir 3 plakalı yığınlarının / otel oluşmaktadır. Otel 1 belirlenen kapatıcı / delidding istasyonu, otel, 2 96-kuyu floresanplaka yığını ve Otel 3 6-plaka yığını olduğunu. Sistem iki sıvı işleyicileri, otomatik bir sıvı taşıma platformu ve bir meme tabanlı çok modlu dağıtıcı vardır. Robotik platformu soğutma, ısıtma / plaka karıştırmak için bir plaka karıştırıcısı ile birlikte iki plaka ısıtma / soğutma birimleri vardır. Son olarak, sistem floresan ölçümü için bir monokromatör tabanlı plaka okuyucusu vardır. Tüm bileşenler bir özel inşa Biyogüvenlik Kurulu yerleştirilmiştir. (B) önce deneysel bir protokol çağırmak için otomatik sıvı taşıma platformu yuva 8. (C) Yapılandırma yerleştirilen reaktif plakası ve uç kutusu tarafından işgal yuva 2 ile otomatik sıvı taşıma platformu yapılandırmasını başlatılıyor. Bir derin oyuklu plaka yuva 4 üzerinde yer almaktadır, 96 oyuklu bir flüoresan görüntüleme plakası yuva 6 bulunur ve protoplast içeren 6 oyuklu plaka yuva 5. bulunur <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54300/54300fig1large.jpg" target="_blank">v burada tıklayın</a><html> Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu iew. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54300/54300fig2.jpg" /> Şekil 2: Her transfer edildikten sonra, turuncu floresan protein bildirici gen ile transformasyondan sonra x 2 protoplast Örnek görüntüleri (A - C) mikrograflar x 2 protoplast yoğunluğu 6-plaka, 70 transferinden sonra 96 oyuklu plaka içerisinde. 6-çukurlu plaka ul ve 96 oyuklu flüoresan görüntüleme plakası, post-Transformation. Dönüşümden sonra x 2 protoplast (D) aydınlık mikrografı. OFP genini ifade (E) Floresan BY-2 protoplast bir Cy3 / TRITC filtre seti kullanılarak görüntülendi. (F) aydınlık Yerleşimi ve floresan mikrograflar dönüşümün düşük verimlilik gösteren. Ölçek çubuğu 50 mikron =.<html> target = &quot;_ blank&quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54300/54300fig3.jpg" /> Şekil 3:. Protoplast sayısını hesaplamak için bir standart eğri de verilen protoplastlarındaki sayısı, standart eğri için denkleme, rasgele birimi (AU) olarak floresans yoğunluğunu karşılaştırarak hesaplanır. Protoplast numarasının doğrulama hemasitometre sayılır 9,561 plaka okuyucusu ile ilgili tanımlanan protoplast ve 8,125 ile grafiğinde gösterilen noktada standart eğrinin ve hemasitometre ile karşılaştırılmıştır. Genel olarak,% 15 oranında bir hata iki teknik arasında ilişki saptanmadı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54300/54300fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> 4 re &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54300 / 54300fig4.jpg &quot;/&gt; Şekil 4:. X 2 protoplast ve genetik dönüşümün üretimi için tarif edilen prosedüre Gantt şeması protokolü çoğunluğu, ~ 3 saat, protoplast oluşturmak için İLE-2 hücrelerinin sindirim harcanmaktadır. enzim çözeltisi ve inaktivasyon yükleme genel prosedür süresi sadece 12% gerektirir. Benzer şekilde, plaka çalkalayıcı üzerinde dönüşüm reaksiyonunun kuluçka dönüşüm protokolü% 72 oluşturmaktadır. Genel olarak, genetik transformasyon elde edilene kadar protoplast izolasyondan prosedür 4 saat (3 saat, 50 dakika ve 53 saniye) altındadır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54300/54300fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Yan İçerik: protoplast izolasyon, hücre sayımı, ve PEG-aracılı transformasyon için otomatik protokolleri &lt;.Bu dosyada yer almaktadır yukarıda listelenen görevlerin her gerçekleştirmek için robot platformu kullanılmak üzere geliştirilmiş / strong&gt; Tam protokoller. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54300/Supplemental_File_Revised.docx" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation at JoVE.com

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Bir yüksek verimlilik, otomatik, tütün protoplast üretim ve dönüşüm metodolojisi açıklanmıştır. Robotik sistem dışı bir model ürünlere çevrilebilir olmalıdır modeli BY-2 sistemde güçlü paralel gen ifadesi ve keşif sağlar.

Yüksek verim Protoplast İzolasyonu ve Dönüşüm için Robotik Platformu

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

a-robotic-platform-for-high-throughput-protoplast-isolation

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

14.2K Görüntüleme.  University of Tennessee, Knoxville.  Bir yüksek verimlilik, otomatik, tütün protoplast üretim ve dönüşüm metodolojisi açıklanmıştır. Robotik sistem dışı bir model ürünlere çevrilebilir olmalıdır modeli BY-2 sistemde güçlü paralel gen ifadesi ve keşif sağlar. 

Video: A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in a single reaction. The miRNA assay counts transcripts by directly imaging and digitally counting miRNA molecules that are labeled with color-coded fluorescent barcoded probe sets (a reporter probe and a capture probe). Barcodes are hybridized directly to mature miRNAs that have been elongated by ligating a unique oligonucleotide tag (miRtag) to the 3&#39; end. Reverse transcription and amplification of the transcripts are not required. Reporter probes contain a sequence of six color positions populated using a combination of four fluorescent colors. The four colors over six positions are used to construct a gene-specific color barcode sequence. Post-hybridization processing is automated on a robotic prep station. After hybridization, the excess probes are washed away, and the tripartite structures (capture probe-miRNA-reporter probe) are fixed to a streptavidin-coated slide via the biotin-labeled capture probe. Imaging and barcode counting is done using a digital analyzer. The immobilized barcoded miRNAs are visualized and imaged using a microscope and camera, and the unique barcodes are decoded and counted. Data quality control (QC), normalization, and analysis are facilitated by a custom-designed data processing and analysis software that accompanies the assay software. The assay demonstrates high linearity over a broad range of expression, as well as high sensitivity. Sample and assay preparation does not involve enzymatic reactions, reverse transcription, or amplification; has few steps; and is largely automated, reducing investigator effects and resulting in high consistency and technical reproducibility. Here, we describe the application of this technology to identifying circulating miRNA perturbations in irritable bowel syndrome.

We describe the use of a multiplexed high-throughput gene expression platform that quantitates gene expression by barcoding and counting molecules in biological substrates without the need for amplification. We used the platform to quantitate microRNA (miRNA) expression in whole blood in subjects with and without irritable bowel syndrome.

İrritabl Bağırsak Sendromu içinde miRNA&#39;lar Sirkülasyon tedirginlikler bir Çoklanmış Yüksek verim Gen İfadesi Platformu Kullanma Algılanan

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

Genetik

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the conventional approaches of permanent gene deletion cannot be applied to essential genes. We have pioneered a unique collection of ~70 temperature-sensitive (ts) lethal mutants for studying cell cycle regulation in the unicellular green algae Chlamydomonas reinhardtii1. These mutations identify essential genes, and the ts alleles can be conditionally inactivated by temperature shift, providing valuable tools to identify and analyze essential functions. Mutant collections are much more valuable if they are close to comprehensive, since scattershot collections can miss important components. However, this requires the efficient collection of a large number of mutants, especially in a wide-target screen. Here, we describe a robotics-based pipeline for generating ts lethal mutants and analyzing their phenotype in Chlamydomonas. This technique can be applied to any microorganism that grows on agar. We have collected over 3000 ts mutants, probably including mutations in most or all cell-essential pathways, including about 200 new candidate cell cycle mutations. Subsequent molecular and cellular characterization of these mutants should provide new insights in plant cell biology; a comprehensive mutant collection is an essential prerequisite to ensure coverage of a broad range of biological pathways. These methods are integrated with downstream genetics and bioinformatics procedures for efficient mapping and identification of the causative mutations that are beyond the scope of this manuscript.

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Temperature-sensitive (ts) lethal mutants are valuable tools to identify and analyze essential functions. Here we describe methods to generate and classify ts lethal mutants in high throughput.

Sıcaklık duyarlı Öldürücü Mutants Yüksek Verim robotik Destekli İzolasyonu içinde<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution based analysis methodology (nucleosome density ChIP-seq; ndChIP-seq) that enables the generation of combined measurements of micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification genome-wide. Nucleosome position and local density, and the posttranslational modification of their histone subunits, act in concert to regulate local transcription states. Combinatorial measurements of nucleosome accessibility with histone modification generated by ndChIP-seq allows for the simultaneous interrogation of these features. The ndChIP-seq methodology is applicable to small numbers of primary cells inaccessible to cross-linking based ChIP-seq protocols. Taken together, ndChIP-seq enables the measurement of histone modification in combination with local nucleosome density to obtain new insights into shared mechanisms that regulate RNA transcription within rare primary cell populations.

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) methodology for the generation of sequence datasets suitable for a nucleosome density ChIP-seq analytical framework integrating micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification measurements.

Nucleosome yoğunluk analiz için kitaplıklarına sıralama yerli Kromatin Immunoprecipitation nesil

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have been directed toward elucidation of the location and timing of initiation of genome duplication rather than its completion. However, it is critical that we understand regions of the genome that are last to complete replication, because these regions suffer elevated levels of chromosomal breakage and mutation, and they have been associated with both disease and aging. Here we describe how we have extended a technique that has been used to monitor replication initiation to instead identify those regions of the genome last to complete replication. This approach is based on a combination of flow cytometry and high throughput sequencing. Although this report focuses on the application of this technique to yeast, the approach can be used with any cells that can be sorted in a flow cytometer according to DNA content.

We describe a technique for combining flow cytometry and high throughput sequencing to identify late replicating regions of the genome.

G2-seq: geç genom bölgelerinde çoğaltma tanımlamak için bir yüksek işlem hacmi-dayandırılmış tekniği

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with a number of challenges including sample preservation quality, degraded DNA, and destructive sampling of rare specimens. In order to more effectively use herbarium material in large sequencing projects, a dependable and scalable method of DNA isolation and library preparation is needed. This paper demonstrates a robust, beginning-to-end protocol for DNA isolation and high-throughput library construction from herbarium specimens that does not require modification for individual samples. This protocol is tailored for low quality dried plant material and takes advantage of existing methods by optimizing tissue grinding, modifying library size selection, and introducing an optional reamplification step for low yield libraries. Reamplification of low yield DNA libraries can rescue samples derived from irreplaceable and potentially valuable herbarium specimens, negating the need for additional destructive sampling and without introducing discernible sequencing bias for common phylogenetic applications. The protocol has been tested on hundreds of grass species, but is expected to be adaptable for use in other plant lineages after verification. This protocol can be limited by extremely degraded DNA, where fragments do not exist in the desired size range, and by secondary metabolites present in some plant material that inhibit clean DNA isolation. Overall, this protocol introduces a fast and comprehensive method that allows for DNA isolation and library preparation of 24 samples in less than 13 h, with only 8 h of active hands-on time with minimal modifications.

This article demonstrates a detailed protocol for DNA isolation and high-throughput sequencing library construction from herbarium material including rescue of exceptionally poor-quality DNA.

Sağlam DNA izolasyon ve yüksek işlem hacmi sıralama kitaplığı inşaat sulak numuneler için

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our entire society's ability to treat systemic infections. In the United States alone, antibiotic-resistant infections kill approximately 23,000 people a year and cost around 20 billion USD in additional healthcare. One approach to combat antimicrobial resistance is combination therapy, which is particularly useful in the critical early stage of infection, before the infecting organism and its drug resistance profile have been identified. Many antimicrobial treatments use combination therapies. However, most of these combinations are additive, meaning that the combined efficacy is the same as the sum of the individual antibiotic efficacy. Some combination therapies are synergistic: the combined efficacy is much greater than additive. Synergistic combinations are particularly useful because they can inhibit the growth of antimicrobial drug resistant strains. However, these combinations are rare and difficult to identify. This is due to the sheer number of molecules needed to be tested in a pairwise manner: a library of 1,000 molecules has 1 million potential combinations. Thus, efforts have been made to predict molecules for synergy. This article describes our high-throughput method for predicting synergistic small molecule pairs known as the Overlap2 Method (O2M). O2M uses patterns from chemical-genetic datasets to identify mutants that are hypersensitive to each molecule in a synergistic pair but not to other molecules. The Brown lab exploits this growth difference by performing a high-throughput screen for molecules that inhibit the growth of mutant but not wild-type cells. The lab's work previously identified molecules that synergize with the antibiotic trimethoprim and the antifungal drug fluconazole using this strategy. Here, the authors present a method to screen for novel synergistic combinations, which can be altered for multiple microorganisms.

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Synergistic drug combinations are difficult and time-consuming to identify empirically. Here, we describe a method for identifying and validating synergistic small molecules.

Sinerjik uyuşturucu kombinasyonları örtüşme2 yöntemi tarafından yüksek üretilen iş tanımlaması

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus allowing a single investigator to screen more treatments or conditions over the same amount of time without loss of data quality. The method requires common equipment found in most laboratories working with C. elegans and is thus simple to adopt. The approach centers on assaying independent samples of a population at each observation point, rather than a single sample over time as with traditional longitudinal methods. Scoring entails adding liquid to the wells of a multi-well plate, which stimulates C. elegans to move and facilitates quantifying changes in healthspan. Other major benefits of the Replica Set method include reduced exposure of agar surfaces to airborne contaminants (e.g. mold or fungus), minimal handling of animals, and robustness to sporadic mis-scoring (such as calling an animal as dead when it is still alive). To appropriately analyze and visualize the data from a Replica Set style experiment, a custom software tool was also developed. Current capabilities of the software include plotting of survival curves for both Replica Set and traditional (Kaplan-Meier) experiments, as well as statistical analysis for Replica Set. The protocols provided here describe the traditional experimental approach and the Replica Set method, as well as an overview of the corresponding data analysis.

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

Here we describe the Replica Set method, an approach to quantitatively measure C. elegans lifespan/survival and healthspan in a high-throughput and robust manner, thus allowing screening of many conditions without sacrificing data quality. This protocol details the strategy and provides a software tool for analysis of Replica Set data.

Yineleme kümesi yöntemi: Bir yüksek-den geçerek yaklaşım kantitatif ölçü Caenorhabditis elegans ömrü

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and effect sizes of regulatory elements to a target gene. Some progress has been made with the bioinformatic prediction of the existence and function of proximal epigenetic modifications associated with activated gene expression using conserved transcription factor binding sites. Chromatin conformation capture studies have revolutionized our ability to discover physical chromatin contacts between sequences and even within an entire genome. Circular chromatin conformation capture coupled with next-generation sequencing (4C-seq), in particular, is designed to discover all possible physical chromatin interactions for a given sequence of interest (viewpoint), such as a target gene or a regulatory enhancer. Current 4C-seq strategies directly sequence from within the viewpoint but require numerous and diverse viewpoints to be simultaneously sequenced to avoid the technical challenges of uniform base calling (imaging) with next generation sequencing platforms. This volume of experiments may not be practical for many laboratories. Here, we report a modified approach to the 4C-seq protocol that incorporates both an additional restriction enzyme digest and qPCR-based amplification steps that are designed to facilitate a greater capture of diverse sequence reads and mitigate the potential for PCR bias, respectively. Our modified 4C method is amenable to the standard molecular biology lab for assessing chromatin architecture.

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

The identification of physical interactions between genes and regulatory elements is challenging but has been facilitated by chromosome conformation capture methods. This modification to the 4C-seq protocol mitigates PCR bias by minimizing over-amplification of PCR templates and maximizes the mappability of reads by incorporating an addition restriction enzyme digest step.

Gen düzenleyici dizileri dairesel kromozom Conformation yeni nesil sıralama kullanarak yüksek üretilen iş tanımlaması yakalama (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often performed at low throughput, it is moreover time-consuming and error-prone, even more so when multiplexing several plasmids. We developed an easy, fast, and accurate method to perform cell transfection in a 384-well plate layout using acoustic droplet ejection (ADE) technology. The nanodispenser device used in this study&#160;is based on this technology and allows precise nanovolume delivery at high speed from a source well plate to a destination one. It can dispense and multiplex DNA and transfection reagent according to a predesigned spreadsheet. Here we present an optimal protocol to perform ADE-based high-throughput plasmid transfection which makes it possible to reach an efficiency of up to 90% and a nearly 100% cotransfection in cotransfection experiments. We extend initial work by proposing a user-friendly spreadsheet-based macro, able to manage up to four plasmids/wells from a library containing up to 1,536 different plasmids, and a tablet-based pipetting guide application. The macro designs the necessary template(s) of the source plate(s) and generates the ready-to-use files for the nanodispenser and tablet-based application. The four-steps transfection protocol involves i) a diluent dispense with a classical liquid handler, ii) plasmid distribution and multiplexing, iii) a transfection reagent dispense by the nanodispenser, and iv) cell plating on the prefilled wells. The described software-based control of ADE plasmid multiplexing and transfection allows even nonspecialists in the field to perform a reliable cell transfection in a fast and safe way. This method enables rapid identification of optimal settings for a given cell type and can be transposed to higher-scale and manual approaches. The protocol eases applications, such as human ORFeome protein (set of open reading frames [ORFs] in a genome) expression or CRISPR-Cas9-based gene function validation, in nonpooled screening strategies.

This protocol describes high-throughput plasmid transfection of mammalian cells in a 384-well plate using acoustic droplet ejection technology. The time-consuming, error-prone DNA dispensing and multiplexing, but also the transfection reagent dispensing, are software-driven and performed by a nanodispenser device. The cells are then seeded in these prefilled wells.

Akustik Nanodispensing teknolojisini kullanarak yüksek verim DNA Plasmid multiplexing ve transfeksiyon

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often ...

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to perform and its ability to standardize the fitness of many strains to a wild-type organism. The technique is limited, however, by available phenotypic markers and the number of strains that can be assessed simultaneously, creating the need for a great number of replicate experiments. Concurrent with large numbers of experiments, the labor and material costs for quantifying bacteria based on phenotypic markers are not insignificant. To overcome these negative aspects while retaining the positive aspects, we have developed a molecular-based approach to directly quantify microorganisms after engineering genetic markers onto bacterial chromosomes. Unique, 25 base pair DNA barcodes were inserted at an innocuous locus on the chromosome of wild-type and mutant strains of Salmonella. In vitro competition experiments were performed using inocula consisting of pooled strains. Following the competition, the absolute numbers of each strain were quantified using digital PCR and the competitive indices for each strain were calculated from those values. Our data indicate that this approach to quantifying Salmonella is extremely sensitive, accurate, and precise for detecting both highly abundant (high fitness) and rare (low fitness) microorganisms. Additionally, this technique is easily adaptable to nearly any organism with chromosomes capable of modification, as well as to various experimental designs that require absolute quantification of microorganisms.

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

This molecular-based approach for determining bacterial fitness facilitates precise and accurate detection of microorganisms using unique genomic DNA barcodes that are quantified via digital PCR. The protocol describes calculating the competitive index for Salmonella strains; however, the technology is readily adaptable to protocols requiring absolute quantification of any genetically-malleable organism.

Salmonella Fitness yüksek verimlilik analizi için dijital PCR tabanlı rekabetçi endeksi

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...