1. Host hücre transfeksiyon <ol><li> Tohum 2 x 10, 15 ml besi (nükleotidler ve nükleosidlerin MEMA (Gibco, katalog numarası 12.571),% 10 γ-ışınlanmış karakterize fetal sığır serumu (cFBS) (HyClone, ile desteklenmiş T75 Corning hücre kültürü şişesi 6 CHO- DXB11 hücreleri. katalog numarası SH30071.03) ve 10 mL / L% 45 glukoz solüsyonu (Sigma, katalog numarası G8769)) transfeksiyon bir gün önce. </li><li> Transfeksiyon zaman, aşağıdaki gibi transfeksiyon kompleksleri hazırlayın: <ol class="lalpha"><li> Steril bir mikrosantrifüj boru serum olmadan büyüme orta 800 ul 8 mg DNA sulandırınız. Yavaşça karıştırın. </li><li> Polistiren tüp serum olmadan büyüme orta ul 800 40 ul Lipofectamine ™ (Invitrogan 18.324.012) sulandırınız. </li><li> Seyreltilmiş Lipofectamine ™ seyreltilmiş DNA ekleyin. Yavaşça karıştırın ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. </li></ol></li><li> T75 hücrelerin büyüme ortamı çıkarın ve büyüme ortamının 6.4 ml serum olmadan yerine. Balona transfeksiyon komplekslerinin 1.6 ml. Plaka sallanan hafifçe karıştırın. </li><li> 6 saat 37 ° C az hücreleri CO 2 inkübatör inkübe edin. </li><li> 37 şişeyi ve inkübe ° C gecede CO 2 inkübatör büyüme orta 8 ml. </li><li> Aspirasyon orta çıkarın ve balona taze besi ekleyin. Bir gecede CO 2 inkübatör 37 ° hücreleri ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> (MEMA orta nükleotidler veya nükleosidlerin olmadan (Gibco, katalog numarası 12561)% 10 γ-ışınlanmış diyaliz fetal sığır serumu (dFBS) (HyClone, katalog numarası SH30079.03) ve 10 mL / L 45 ile desteklenmiş, seçim ortamı ile besi değiştirin % glukoz solüsyonu (Sigma, katalog numarası G8769)). </li><li> 2-3 hafta CO 2 inkübatör 37 ° hücreleri ° C&#39;de inkübe edin. </li></ol> 2. Sitometrisi Aktive Hücre sıralama tarafından Klonlama <ol><li> 5 dakika boyunca 800 rpm&#39;de santrifüj şişeyi ve hücreleri yerinden oynatın 4 ° C </li><li> 01:20 seyreltme% 2 sığır serum albumin ve floresan etiketli anti-insan IgG ile desteklenmiş seçim ortamda hücrelerin tekrar </li><li> 15-30 dakika buz üzerinde inkübe ve ardından soğuk PBS ile iki kez yıkayın. 1x PBS içinde bir polipropilen tüp hücreleri tekrar </li><li> BD FACSAria ™ aseptik sıralama için hazırlayın. Her kuyuda 200 ul seçim ortamı içeren 96-iyi hücre kültürü plakası hazırlayın. </li><li> Aseptik hücreleri ile tüp yük ve BD FACSAria ™ analiz, sırasıyla, lekeli ve lekesiz hücreler için sonuçları kaydedin. </li><li> 96-plaka (ler) tek hücre içine istenen floresan boyama profil sıralamak için kapıları ve ayarları ayarlayın. <ol class="lalpha"><li> Transfekte hücreler ilk forward scatter karşı tarafında dağılım dayalı analiz edilir. Canlı hücreler için bir kapı, bir hücrenin karmaşıklığı ya da ayrıntı ölçen bir hücre boyutu ve yan dağılım, ölçer forward scatter, göre yapılır. </li><li> Bu kapıdan giren hücreler daha sonra PE boyama incelenir. PE negatif kapı lekesiz transfekte hücreler ya da lekeli konak hücreleri için ayarlanır. Lekeli transfekte hücreler FACS tarafından incelenir, &quot;Yüksek PE&quot; kapının ardından PE boyanma pozitif olan tüm hücreleri en üst% 5 kapsayacak şekilde tarif. </li></ol></li><li> Plakalar, iki hafta boyunca 37 ° C inkübatör inkübe edin. </li></ol> 3. CloneSelect ™ Imager koloni oluşumu Dokümantasyon 0. gün, 3. gün, sıralama FACS gün sonra 7 gün 13 CloneSelect Imager ™ 96-kuyucuğu Belge koloni oluşumu. Görüntü belgeleri tek bir hücreden elde edilen klonların seçimi sağlayacaktır. Bu noktada her bir kuyunun sadece bir hücre olmadığı için, bu belgede kritik bir adım, odak düzlemi gün 0 ölçümü için doğru ayarlanmış oluyor. Bu çok önemlidir, bu tek hücre görüntüler odak ve onlara odağı ayarlamak için çalışırken en iyi yanıltıcı olabilir. Odak düzlem plaka markalar arasında önemli farklılıklar ve hatta aynı marka çok çok. Böylece, önceden belirlenmiş bir odak düzlemli kullanılması gerekir. Bu test mikro-boncuk veya kullanılan aynı lottan plakalar üzerinde biriken yüksek yoğunluklu hücreleri odaklanarak yapılabilir. Alternatif olarak, aynı partinin tam olarak yetiştirilen plakaları bu amaç için kullanılıyor olabilir. FACS sıralama sonra, plaka pozisyon &#39;sabit&#39; olacağını, bu yüzden hücrelerin görüntüleme için en az 2 saat önce razı izin vermek de önemlidir. 4. Tarama ve son derece üretken klonların seçimi <ol><li> Alıcı 96-iyi tahlil plakalar Belge örnek konumu. </li><li> 20 ul Tecan Özgürlük EVO 96-iyi tahlil tabak içine supernatant (gerekirse sulandırmak) ® sıvı taşıma sistemi transferi alikotları. Bu esnek ve yetenekli robotic platformu Bu ve diğer otomatik hücre kültürü çalışmaları için adapte edilmiştir. En iyi şekilde yararlanmak ve hücre hattı gelişimi için Özgürlük EVO robotik yeteneklerini geliştirmek için özel programlar yazılmıştır. Buna bir örnek, tek koloniler kuyulardan numune almak için CloneSelect ™ Imager verileri yorumlamak için Tecan ayardır. Diğer programlar gibi ek hücre kültürü görevleri gerçekleştirmek için gerekli yüksek üreten klonlar büyütmek için, gerekirse uygun yorumlamak için alınan numunelerin dilüsyonları, katalog ve örnek manuel olarak işaretlenmiş plakaları, bu programların vb pek çok kolayca 384 tabak gibi orijinal 96 format uygulanır. </li><li> Örneklerinde antikor üretimi Tecan Özgürlük EVO ELISA (Pierce, Rockford, IL) tespit sandviç insan IgG ® sıvı taşıma sistemi tarafından analiz edilir. <ol><li> Örnekler ve standart (İnsan miyelom IgG1, kappa) (Sigma, St Louis, MO) kaplı ön Bio Coat Anti-Human IgG Testi Plakalar (BD Biosciences, San Jose, CA) yüklendi. </li><li> Plakalar üç PBS yıkar takiben iki saat oda sıcaklığında inkübe edildi. </li><li> ImmunoPure Keçi Anti-Human IgG (Fc-gama)-HRP (Pierce, Rockford, IL) 1:2000 dilüsyon plaka eklenir ve oda sıcaklığında bir saat süreyle inkübe edildi. </li><li> Plakalar ABTS substrat (Pierce, Rockford, IL) eklemeden önce üç kez PBS ile yıkandı ve algılama için 405 nm&#39;de absorbans kullanarak bir plaka okuyucu okundu. </li></ol></li><li> Son derece verimli klonlar seçin ve süspansiyon kültüründe verimlilik değerlendirmek. Beslenen-toplu kültür, hücreler 65.578 (SAFC Biosciences, Lenexa, KS) 5 g / L, soya hidrolizat (DMV Uluslararası SE50MAF-UF katalog numarası, lot ile desteklenmiş protein ortamın JRH ani avantaj 0.3X106 hücre / mL ekildi sayısı) ve 37 inkübe ° C,% 7.5 CO 2 . Kültür devam etti ve 2 g / L glikoz (Sigma, katalog numarası G8769, lot numarası 098K2329) 2 g / L altında kültür glukoz artı laktat konsantrasyonu ulaştı ve beslenen 2 mM glutamin (Gibco, katalog numarası 25030 ile takviye edilen glutamin düzeylerinin 200 altında ulaştı lot numarası 568.177) mg / L (YSI Bioanalyzer ile ölçülen metabolitleri). Fed-toplu kültürler gün 14 ve antikor üretimini sona ters faz HPLC ile ölçüldü. </li><li> Floresan in situ hibridizasyon (FISH) 5 aday klonlar Genetik karakterizasyonu. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: Yüksek verim yöntemi ile klonları gelişen antikor üreten bir örnek Şekil 1 ve Şekil 2&#39;de gösterilmiştir. Transfekte hücre havuzu, floresan etiketli anti-insan IgG (Şekil 1A) ile boyandı analiz ve BD FACSAria ™ (Şekil 1B) üzerinde sıralanır. 96-plaka Colony oluşumu CloneSelect Imager ™ (Şekil 1C) görüntülendi. Hücre kültürü süpernatant tek koloni içeren kuyu örneklenmiş ve Tecan Özgürlük EVO ® sıvı taşıma sistemi (Şekil 1D) ELISA yöntemi ile test edildi. Yüksek verimli klonlar floresan etiketli anti-insan IgG ile boyanarak yansıyan yüksek yüzey antikor düzeyi sergiledi hücrelerden bulundu. Ilk transfekte hücre havuzu iki nüfus, kültür (Şekil 2) gözlendi beslenen-toplu verimliliği büyük bir fark elde edilen klonlar kıyaslarken. Hücre popülasyonu yüksek yüzey antikoru (PE yüksek) ifadesi ile elde edilen en iyi iki klonlar için, özel verimlilik 50-70 arasında değişmektedir pg / hücre / gün. Antikor verimlilik iken ~ 20 pg / hücre / gün hücre popülasyonu düşük yüzey antikoru (PE düşük) ifadesi ile elde edilen en iyi iki klonlar. Ayrıca, FACS sıralama tarafından geliştirilen hücre hatları dışında manuel kireçleme seyreltme (Şekil 3A) aracılığıyla klonlanmış olduğunu antikor üretimi açısından daha istikrarlı. Üst klon özel verimlilik, manuel kireçleme seyreltme tarafından oluşturulan &quot;Clone 1&quot; ~ 30 ~ 10, 80 hücre çiftlenmeler kültür sonra pcd pcd düştü. Öte yandan, &quot;Clone 2&quot; sıralama FACS tarafından oluşturulan üst subclone, en az 100 hücre çiftlenmeler için 20 pcd etrafında belirli bir verimlilik koruyabilmiştir. Floresan in situ hibridizasyon (FISH), Clone 1 fenotip oluşan karışık bir nüfus olarak göstermiştir (% 85) ve fenotip B (% 15). Gösterdi Buna karşılık, FACS (klon 2) klon sıralanmış olan hücrelerin% 99,5 ile daha homojen bir nüfus olduğunu gösterdi fenotip olarak kanıtlanmıştır (Şekil 3B). <img src="/files/ftp_upload/3010/3010fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 CHO hücreler monoklonal antikor üretimi için imalat hücre hatlarının geliştirilmesi. A) floresan etiketli anti-insan IgG ile ilk transfekte hücre havuzu Yüzey boyama. B) 96-kuyu plakasına yüksek floresan (PE Yüksek) ve düşük floresan (PE düşük) ile hücre popülasyonunun sıralama. C) koloni BelgelenmesiCloneSelect Imager ™ günden oluşumunu 0 günlük 13 Mesaj tohumlama. D) ELISA yöntemi ile Tarama klonlar. <img src="/files/ftp_upload/3010/3010fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. Yüzey ilişkili antikor düzeyi hücre antikor verimliliği ile ilişkilidir. Yüksek ve düşük floresan boyama Klonlar hücre hatları geliştirilen ve beslenen toplu kültür değerlendirildi. Volumetrik titresi ve özel verimlilik her nüfusunun üst 2 klonlar arasında karşılaştırıldı. <img src="/files/ftp_upload/3010/3010fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3 daha yüksek genetik homojenlik ve klon kararlılık gösterirler sıralama FACS oluşturulur Klonlar. A) Antikor üretimi istikrar ~ 80 hücre çiftlenmeler kültür geçecek süre için toplu kültür. Δ, klon hücreleri, az 1000 / 2000 hücreleri hücre / kuyu ve 500 hücre / kuyu numaralı seribaşı sınırlayıcı seyreltme yoluyla oluşturulmuştur. <img src="/files/ftp_upload/3010/3010triangle.jpg" alt="Siyah üçgen" /> , Klon 1 hücre / kuyu FACS aracılığıyla oluşturulmuştur. B) CHO hücre kromozom Transgen entegrasyon sitesini Floresan in situ hibridizasyon ile tanımlanır.

<ol>
	<li>Hung, F., Deng, L., Ravnikar, P., Condon, R., Li, B., Do, L., Saha, D., Tsao, Y. S., Merchant, A., Liu, Z., Shi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+stability+and+antibody+production+in+CHO+cells:+improvement+through+gene+optimization.">mRNA stability and antibody production in CHO cells: improvement through gene optimization.</a> Biotechnol. J. 5, 393-401 (2010).</li><li>Brezinsky, S. C., Chiang, G. G., Szilvasi, A., Mohan, S., Shapiro, R. I., MacLean, A., Sisk, W., Thill, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+enriching+populations+of+transfected+CHO+cells+for+cells+of+higher+specific+productivity.">A simple method for enriching populations of transfected CHO cells for cells of higher specific productivity.</a> J. Immunol. Methods. 277, 141-155 (2003).</li><li>Kromenaker, S. J., Srienc, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+producer+hybridoma+cell+lines+after+cell+sorting:+a+case+study.">Stability of producer hybridoma cell lines after cell sorting: a case study.</a> Biotechnol. Prog. 10, 299-307 (1994).</li><li>Marder, P., Maciak, R. S., Fouts, R. L., Baker, R. S., Starling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+cloning+of+hybridoma+cells+for+enhanced+immunoglobulin+production+using+flow+cytometric+cell+sorting+and+automated+laser+nephelometry.">Selective cloning of hybridoma cells for enhanced immunoglobulin production using flow cytometric cell sorting and automated laser nephelometry.</a> Cytometry. 11, 498-505 (1990).</li><li>Henegariu, O., Heerema, N., Wright, L. L., Bray-Ward, P., Ward, D. C., Vance, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvements+in+cytogenetic+slide+preparation:+controlled+chromosome+spreading+chemical+aging+and+gradual+denaturing.">Improvements in cytogenetic slide preparation: controlled chromosome spreading chemical aging and gradual denaturing.</a> Cytomery. 43, 101-109 (2001).</li><li>Meng, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grenn+fluorescent+protein+(GFP)+as+a+second+selectable+marker+for+selection+of+high+producing+clones+from+transfected+CHO+cells.">Grenn fluorescent protein (GFP) as a second selectable marker for selection of high producing clones from transfected CHO cells.</a> Gene. 242, 201-207 (2000).</li><li>DeMaria, C. T., Cairns, V., Schwarz, C., Zhang, J., Guerin, M., Zuena, E., Estes, S., Karey, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+clone+selection+for+recombinant+CHO+cells+using+a+FACS-based+high-throughput+screen.">Accelerated clone selection for recombinant CHO cells using a FACS-based high-throughput screen.</a> Biotechnol. Prog. 23, 465-472 (2007).</li><li>Weaver, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel+microdrop+technology+for+rapid+isolation+of+rare+an+high+producer+cells.">Gel microdrop technology for rapid isolation of rare an high producer cells.</a> Nat. Med. 3, 583-585 (1997).</li></ol>

Bu makalenin yazarları, memeli hücre hatları protein terapötikler büyük ölçekli üretim için bu yöntemi kullanan çalışanlar, Merck &amp; Co, Inc.

Klonalite ve klon istikrarı sağlarken, son derece verimli klonlar izolasyonu sağlar ve ortalama bir otomatik üretim hücre hattı geliştirme platformu sundu. FACSAria ™ hücre sıralama takip yüzey antikoru boyanma nişan yüksek antikor verimlilik ile tek klonlar elde etmek için bir anahtardır. Sonuçları ve diğer raporlar 2-4 hücre yüzeyinde geçici olarak görüntülenen antikor düzeyi hücre verimlilik ile ilişkili olduğunu düşündürmektedir. Böylece, floresein-konjuge antikor biyolojik membran ilişkili ürünü tanıması ve yüksek üreticilerin izolasyon yardım etmek için kullanılabilir. Alternatif olarak, FACS 6-8 muhabiri genler ve jel microdrop teknoloji Koekspresyon yüksek üreten klonların seçimi kolaylaştırmak için kullanılır olmuştur. FACS üzerinden yüksek üreten klonlar izole yanı sıra, diğer teknolojiler, aynı hedefe ulaşmak için evrildi. Bunlar, son derece verimli klonları tanımlamak ve, yüksek kapasiteli bir floresan antikor algılama sistemi kullanarak üretim hücre hatları tarama gerçekleştirmek Genetix ClonePix FL Teknolojileri ve StemCell ClonaCell EasyPick platformu istenmeyen hücrelerin ortadan kaldırmak için microspere antikor algılama sistemleri ve lazer tarama teknolojisi kullanır Kafes Bioscience CellSpot teknoloji . Biz, kullanım kolaylığı, verimliliği ve klonalite seçicilik birleştirir çünkü yüzey ilişkili antikor düzeyi dayalı FACS klonlama yöntemi uygulamak için seçti. Istihdam Tecan Özgürlük EVO ® sıvı taşıma sistemi, yüksek verim klonlar için çok daha büyük bir hücre havuzu seçmek için fırsat sağlayan tarama hacmi, önemli ölçüde arttı. HTRF, BioForte Sekizli, HPLC, vb gibi tahlil için enstrümantasyon, yüksek üreticilerin seçilmesi ve düşük üreticileri tarama mümkün olan tüm yollarla. CloneSelect Imager ™ ile klon oluşumu takip ederek, sayısallaştırılmış hücre hattı geçmişi ile klonalite kanıtlamak için gerekli belgeleri oluşturulur. Klonalite genetik kromozom üzerinde tek transgen entegrasyon sitesi karakterize daha teyit edilir. Genellikle klonalite sağlamak için alınan bir subcloning adım, elenecektir. Bu hücre hattı gelişmesi için 4-8 hafta zaman kazandıracak. Özetle, yüksek verimli otomatik platform tarafından oluşturulan kalite hücre hatları, yüksek verimlilik, üretim istikrar ve büyük ölçekli üretim ve akım düzenleyici gereksinimleri için talebi karşılamak gerekir belgelenen hücre hattı geçmişi gösterdi.

<table border="1"><tbody><tr><td> Isim </td><td> Şirket </td></tr><tr><td> BD FACS Aria ™ Hücre Sıralayıcısı </td><td> Bioscience BD </td></tr><tr><td> CloneSelect ™ Imager </td><td> Genetix </td></tr><tr><td> Tecan Özgürlük EVO ® sıvı taşıma sistemi </td><td> Tecan Grup </td></tr></tbody></table>

a high-throughput automated platform for the development of manufacturing cell lines for protein therapeutics

Hızlı büyüyen biyofarmasötik endüstrisi, ilaç temini için artan ihtiyacı karşılamak için, yüksek verimli ve güvenilir üretim sistemlerinin hızlı gelişmesi talep eder. Nesil üretim hücre hatları geleneksel emek-yoğun, düşük verimlilik ve insan hataları açık manuel işlemleri yer vardır. Biz burada, protein terapötikler üretimi için üretim hücre hatlarının geliştirilmesi için entegre bir yüksek verimlilik ve otomatik bir platform raporu. BD FACS Aria kombinasyonu ™ Hücre Sıralayıcısı CloneSelect ™ Imager ve Tecan Özgürlük EVO ® sıvı taşıma sistemi, yüksek verimlilik ve daha verimli bir hücre hattı geliştirme süreci sağladı. Bu operasyonda, üretim konak hücreleri ilk kez bir seçim aracı ile tedavi takip ilgi 1 gen taşıyan bir ifade vektör ile transfekte. Stably transfekte hücreler daha sonra floresan-etiketli anti-insan IgG ile boyanmış, ve flow sitometri analizi 2-4 sonradan tabidir. Son derece üretken hücrelerin floresan yoğunluğuna göre seçilir ve tek hücreli bir BD FACSAria ™ sıralayarak izole edilir. Tek hücre aşamasından Colony oluşumu mikroskopik olarak tespit edildi ve bir dizi zaman-tur dijital görüntüler, hücre hattı tarihinin belgelere CloneSelect ™ Imager ile alınır. Tek klonlar oluşturduktan sonra, bu klonları bir Tecan Özgürlük EVO yapılan ELISA ile verimlilik ® sıvı taşıma sistemi için tarandı. Yaklaşık 2,000 - 10,000 klonlar, mevcut sistem kurulumu ile çalışma döngüsü başına gösterildi. Bu entegre yaklaşım, terapötik monoklonal antikor (mAb) yanı sıra füzyon proteini üretimi için yüksek üreten Çin hamsteri over (CHO) hücre hatları oluşturmak için kullanılır olmuştur. Tespit probları farklı türde yardımı ile diğer protein terapötikler geliştirilmesi için, yöntem ya da diğer üretim ana bilgisayar sistemleri uygulanabilir. Geleneksel el yordamı ile karşılaştırıldığında, bu otomatik bir platform önemli ölçüde kapasite artışı sağlanmıştır klonalite, elektronik dokümantasyon ile hücre hattı geçmişi izlenebilirlik ve operatör hatası çok azalır fırsat avantajları gösterdi.

Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics at JoVE.com

A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics

Protein terapötikler üretmek için hücre hattı geliştirme, üretim, yüksek verimlilik, otomatik bir platform açıklanmıştır. Uygulama, BD FACS Aria Hücre Sıralayıcısı CloneSelect Imager ve Tecan Özgürlük EVO sıvı taşıma sistemi, gelişmiş hücre hattı kalite ve yüksek tekrarlanabilirlik hücre hattı geliştirme işleme kapasitesi önemli ölçüde artış göstermiştir.

Protein Therapeutics İmalat Hücre Hatları Kalkınma Yüksek throughput Otomatik Platformu

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing ...

a-high-throughput-automated-platform-for-development-manufacturing

Research

JoVE Journal

Medicine

22.1K Görüntüleme.  Merck & Co., Inc. Protein terapötikler üretmek için hücre hattı geliştirme, üretim, yüksek verimlilik, otomatik bir platform açıklanmıştır. Uygulama, BD FACS Aria Hücre Sıralayıcısı CloneSelect Imager ve Tecan Özgürlük EVO sıvı taşıma sistemi, gelişmiş hücre hattı kalite ve yüksek tekrarlanabilirlik hücre hattı geliştirme işleme kapasitesi önemli ölçüde artış göstermiştir.

Video: A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics

Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular degeneration, photoreceptor degeneration, cataract, glaucoma, retinoblastoma, and diabetic retinopathy have been recapitulated in transgenic mice.1-5 Most transgenic and knockout mice have been generated by laboratories to study non-ophthalmic diseases, but genetic conservation between organ systems suggests that many of the same genes may also play a role in ocular development and disease. Hence, these mice represent an important resource for discovering new genotype-phenotype correlations in the eye. Because these mice are scattered across the globe, it is difficult to acquire, maintain, and phenotype them in an efficient, cost-effective manner. Thus, most high-throughput ophthalmic phenotyping screens are restricted to a few locations that require on-site, ophthalmic expertise to examine eyes in live mice. 6-9 An alternative approach developed by our laboratory is a method for remote tissue-acquisition that can be used in large or small-scale surveys of transgenic mouse eyes. Standardized procedures for video-based surgical skill transfer, tissue fixation, and shipping allow any lab to collect whole eyes from mutant animals and send them for molecular and morphological phenotyping. In this video article, we present techniques to enucleate and transfer both unfixed and perfusion fixed mouse eyes for remote phenotyping analyses.

The dissection technique illustrates enucleation of the mouse eye for tissue fixation to perform phenotyping in high-throughput screens.

Uzaktan Yüksek throughput fenotipleme için Fare Göz Enükleasyon

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

Tıp

The Use of Cystometry in Small Rodents: A Study of Bladder Chemosensation

The lower urinary tract (LUT) functions as a dynamic reservoir that is able to store urine and to efficiently expel it at a convenient time. While storing urine, however, the bladder is exposed for prolonged periods to waste products. By acting as a tight barrier, the epithelial lining of the LUT, the urothelium, avoids re-absorption of harmful substances. Moreover, noxious chemicals stimulate the bladder's nociceptive innervation and initiate voiding contractions that expel the bladder's contents. Interestingly, the bladder's sensitivity to noxious chemicals has been used successfully in clinical practice, by intravesically infusing the TRPV1 agonist capsaicin to treat neurogenic bladder overactivity1. This underscores the advantage of viewing the bladder as a chemosensory organ and prompts for further clinical research. However, ethical issues severely limit the possibilities to perform, in human subjects, the invasive measurements that are necessary to unravel the molecular bases of LUT clinical pharmacology. A way to overcome this limitation is the use of several animal models2. Here we describe the implementation of cystometry in mice and rats, a technique that allows measuring the intravesical pressure in conditions of controlled bladder perfusion.
	After laparotomy, a catheter is implanted in the bladder dome and tunneled subcutaneously to the interscapular region. Then the bladder can be filled at a controlled rate, while the urethra is left free for micturition. During the repetitive cycles of filling and voiding, intravesical pressure can be measured via the implanted catheter. As such, the pressure changes can be quantified and analyzed. Moreover, simultaneous measurement of the voided volume allows distinguishing voiding contractions from non-voiding contractions3.
	Importantly, due to the differences in micturition control between rodents and humans, cystometric measurements in these animals have only limited translational value4. Nevertheless, they are quite instrumental in the study of bladder pathophysiology and pharmacology in experimental pre-clinical settings. Recent research using this technique has revealed the key role of novel molecular players in the mechano- and chemo-sensory properties of the bladder.

Cystometry is an efficient technique to measure bladder function of small animals in vivo. The bladder is continuously infused at rates controlled through an intravesical catheter, whereas the urethra is left free for micturition. This allows for repetitive filling and emptying of the bladder, while intravesical pressure and voided volume are recorded.

Küçük Kemirgenler sistometri ve Kullanımı: Mesane Chemosensation Çalışması

	The lower urinary tract (LUT) functions as a  dynamic reservoir that is able to store urine and to efficiently expel it at a  convenient time. While ...

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

İnsan Nöroendokrin Tümör Terapi Çalışmaları Üç Boyutlu Model İnsan nöroendokrin tümör hücre hatlarında

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

Intranasal Administration of CNS Therapeutics to Awake Mice

Intranasal administration is a method of delivering therapeutic agents to the central nervous system (CNS). It is non-invasive and allows large molecules that do not cross the blood-brain barrier access to the CNS. Drugs are directly targeted to the CNS with intranasal delivery, reducing systemic exposure and thus unwanted systemic side effects1. Delivery from the nose to the CNS occurs within minutes along both the olfactory and trigeminal neural pathways via an extracellular route and does not require drug to bind to any receptor or axonal transport2. Intranasal delivery is a widely publicized method and is currently being used in human clinical trials3.
Intranasal delivery of drugs in animal models allows for initial evaluation of pharmacokinetic distribution and efficacy. With mice, it is possible to administer drugs to awake (non-anesthetized) animals on a regular basis using a specialized intranasal grip. Awake delivery is beneficial because it allows for long-term chronic dosing without anesthesia, it takes less time than with anesthesia, and can be learned and done by many people so that teams of technicians can dose large numbers of mice in short periods. Efficacy of therapeutics administered intranasally in this way to mice has been demonstrated in a number of studies including insulin in diabetic mouse models 4-6 and deferoxamine in Alzheimer's mouse models. 7,8
The intranasal grip for mice can be learned, but is not easy and requires practice, skill, and a precise grip to effectively deliver drug to the brain and avoid drainage to the lung and stomach. Mice are restrained by hand using a modified scruff in the non-dominant hand with the neck held parallel to the floor, while drug is delivered with a pipettor using the dominant hand. It usually takes 3-4 weeks of acclimating to handling before mice can be held with this grip without a stress response. We have prepared this JoVE video to make this intranasal delivery technique more accessible.

A method to intranasally administer drugs to awake mice for the purpose of targeting the brain is described. This method allows for repeat dosing over long periods using intranasal administration of drug without anesthesia, and nose-to-brain delivery with minimal systemic exposure.

Uyanık Fare CNS Therapeutics İntranazal İdaresi

Intranasal administration is a method of delivering  therapeutic agents to the central nervous system (CNS). It is  non-invasive and allows large ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases in children and adults. These antibodies have been used to guide diagnosis and treatment. Cell-based assays have improved the detection of antibodies in patient serum. They are based on the surface expression of brain antigens on eukaryotic cells, which are then incubated with diluted patient sera followed by fluorochrome-conjugated secondary antibodies. After washing, secondary antibody binding is then analyzed by flow cytometry. Our group has developed a high-throughput flow cytometry live cell-based assay to reliably detect antibodies against specific neurotransmitter receptors. This flow cytometry method is straight forward, quantitative, efficient, and the use of a high-throughput sampler system allows for large patient cohorts to be easily assayed in a short space of time. Additionally, this cell-based assay can be easily adapted to detect antibodies to many different antigenic targets, both from the central nervous system and periphery. Discovering additional novel antibody biomarkers will enable prompt and accurate diagnosis and improve treatment of immune-mediated disorders.

Over the recent years, live cell-based assays have been used successfully to detect antibodies against surface and conformational antigens. Here, we describe a method using high-throughput flow cytometry enabling the analysis of large cohorts of patients. Detection of novel antibodies will improve diagnosis and treatment of immune-mediated disorders.

İnsan Serum içinde N-metil-D-aspartat reseptör ya da dopamin-2 reseptör antikorları algılamak üzere yüksek verimli Flow Cytometry hücre bazlı bir deneyde

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics

The molecular analysis of established cancer cell lines has been the mainstay of cancer research for the past several decades. Cell culture provides both direct and rapid analysis of therapeutic sensitivity and resistance. However, recent evidence suggests that therapeutic response is not exclusive to the inherent molecular composition of cancer cells but rather is greatly influenced by the tumor cell microenvironment, a feature that cannot be recapitulated by traditional culturing methods. Even implementation of tumor xenografts, though providing a wealth of information on drug delivery/efficacy, cannot capture the tumor cell/microenvironment crosstalk (i.e., soluble factors) that occurs within human tumors and greatly impacts tumor response. To this extent, we have developed an ex vivo (fresh tissue sectioning) technique which allows for the direct assessment of treatment response for preclinical and clinical therapeutics development. This technique maintains tissue integrity and cellular architecture within the tumor cell/microenvironment context throughout treatment response providing a more precise means to assess drug efficacy.

Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics

Established cancer cell lines and xenografts have been the mainstay of cancer research for the past several decades. However, recent evidence suggests that therapeutic response is greatly influenced by the tumor cell microenvironment. Therefore, we have developed an ex vivo analysis of primary tumor specimens for drug development purposes.

İlköğretim Tümörleri ve / veya klinik öncesi için İlişkili Metastazlarının ve Tedavi Klinik Geliştirme Ex Vivo Tedavisi Tepki

The molecular analysis of established cancer cell lines has been the mainstay of cancer research for the past several decades. Cell culture provides both ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to develop strategies for treating a variety of diseases. The purpose of this study was to develop and characterize MSCs as cellular vehicles engineered for delivery of therapeutic factors as part of a neuroprotective strategy for rescuing the damaged or diseased nervous system. In this study we used mouse MSCs that were genetically modified using lentiviral vectors, which encoded brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), together with green fluorescent protein (GFP). 
Before proceeding with in vivo transplant studies it was important to characterize the engineered cells to determine whether or not the genetic modification altered aspects of normal cell behavior. Different culture substrates were examined for their ability to support cell adhesion, proliferation, survival, and cell migration of the four subpopulations of engineered MSCs. High content screening (HCS) was conducted and image analysis performed. 
Substrates examined included: poly-L-lysine, fibronectin, collagen type I, laminin, entactin-collagen IV-laminin (ECL). Ki67 immunolabeling was used to investigate cell proliferation and Propidium Iodide staining was used to investigate cell viability. Time-lapse imaging was conducted using a transmitted light/environmental chamber system on the high content screening system.
Our results demonstrated that the different subpopulations of the genetically modified MSCs displayed similar behaviors that were in general comparable to that of the original, non-modified MSCs. The influence of different culture substrates on cell growth and cell migration was not dramatically different between groups comparing the different MSC subtypes, as well as culture substrates. 
This study provides an experimental strategy to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

Nöroprotektif Stratejileri Tedavi Faktörleri teslimi için tasarlandı Erişkin Kök Hücre Yüksek Verimli Karakterizasyonu

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected from skin or muscle biopsy tissue available during the patient&#8217;s diagnostic workup. In this protocol, we describe a technique for live cell isolation from small amounts of muscle or skin tissue for primary cell culture. Additionally, we provide a technique for the immortalization of myogenic cell lines and fibroblast cell lines from primary cells. Once cell lines are immortalized, substantial expansion of patient-derived cells can be achieved. Immortalized cells are amenable to many downstream applications, including drug screening and in vitro correction of the genetic mutation. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

This protocol describes techniques for live cell isolation and primary culture of myogenic and fibroblast cell lines from muscle or skin tissue. A technique for the immortalization of these cell lines is also described. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

Hastalık Modelleme için kas biyopsisi Hasta türetilmiş Hücre Hatları İzolasyonu ve Ölümsüzleştirme

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be important in the development of future novel therapies. Often&#160;potential new biomarkers do not make it&#160;into the clinic&#160;due to limitations&#160;in their development and&#160;high costs.&#160;However,&#160;targeted proteomics using Multiple Reaction Monitoring Liquid Chromatography-tandem/Mass Spectrometry (MRM LC-MS/MS), specifically using triple quadrupole mass spectrometers, is one method that can be used to rapidly evaluate and validate biomarkers&#160;for clinical translation into diagnostic laboratories. Traditionally, this platform has been used extensively for measurement of small molecules&#160;in clinical laboratories, but it is the potential to analyze proteins, that makes it an attractive alternative to ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)-based methods. We describe here how targeted proteomics can be used to measure multiplexed markers of dementia, including the detection and quantitation of the known risk factor apolipoprotein E isoform 4 (ApoE4).
In order to make the assay suitable for translation, it is designed to be rapid, simple, highly specific and cost effective. To achieve this, every step in the development of the assay must be optimized for the individual proteins and tissues they are analyzed in. This method describes a typical workflow including various tips and tricks to developing a targeted proteomics MRM LC-MS/MS for translation.
The method development is optimized using custom synthesized versions of tryptic quantotypic peptides, which calibrate&#160;the MS for detection and then spiked into CSF to determine correct identification of the endogenous peptide in the chromatographic separation prior to analysis in the MS. To achieve absolute quantitation, stable isotope-labeled internal standard versions of the peptides with short amino acid sequence tags and containing a trypsin cleavage site, are included in the assay.

We describe a high-throughput, multiplex, and targeted proteomic cerebrospinal fluid (CSF) assay developed with potential for clinical translation. The test can quantitate potential markers and risk factors for neurodegeneration, such as the apolipoprotein E variants (E2, E3 and E4), and measure their allelic expression.

Bir Yüksek Verimli, Çoklanmış ve Hedefli Proteomik BOS Deneyi nörodejeneratif Biyomarkerleri ve Apolipoprotein E İzoformları Durum belirlememize

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...

High-Throughput Analysis of Optical Mapping Data Using ElectroMap

Optical mapping is an established technique for high spatio-temporal resolution study of cardiac electrophysiology in multi-cellular preparations. Here we present, in a step-by-step guide, the use of ElectroMap for analysis, quantification, and mapping of high-resolution voltage and calcium datasets acquired by optical mapping. ElectroMap analysis options cover a wide variety of key electrophysiological parameters, and the graphical user interface allows straightforward modification of pre-processing and parameter definitions, making ElectroMap applicable to a wide range of experimental models. We show how built-in pacing frequency detection and signal segmentation allows high-throughput analysis of entire experimental recordings, acute responses, and single beat-to-beat variability. Additionally, ElectroMap incorporates automated multi-beat averaging to improve signal quality of noisy datasets, and here we demonstrate how this feature can help elucidate electrophysiological changes that might otherwise go undetected when using single beat analysis. Custom modules are included within the software for detailed investigation of conduction, single file analysis, and alternans, as demonstrated here. This software platform can be used to enable and accelerate the processing, analysis, and mapping of complex cardiac electrophysiology.

This protocol describes the setup and use of ElectroMap, a MATLAB-based open-source software platform for analysis of cardiac optical mapping data. ElectroMap provides a versatile high-throughput tool for analysis of optical mapping voltage and calcium datasets across a wide range of cardiac experimental models.

Elektromap kullanarak optik haritalama verilerinin yüksek verim Analizi

Optical mapping is an established technique for high spatio-temporal resolution study of cardiac electrophysiology in multi-cellular preparations. Here we ...