This work was supported by a Grant-in-Aid for Scientific Research by the Japanese Society for the Promotion of Science (15K08060).

1. DNA ekstraksiyonu Not: jel elektroforez ve LC / ESI-MS gibi DNA ekstraksiyonu ve PCR sonrası sınavları için ayrı bir oda kullanın. tampon 1 (ihtiva guanidin hidroklorid) ve DNA ekstraksiyon kiti protokolüne göre, yıkama tamponu 2 (guanidin hidroklorid içeren olan) yıkama etanol ekleyin. Balık örnekleri Japonya&#39;da balık toptancılar ve perakende pazarlar elde edilmiştir. <ol><li> 0.5 ml ya da 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde balık doku 30-50 mg yerleştirin. (Fin ve cilt için hariç), bir mikro-spatula kullanılarak doku Squash. Not: fin durumunda, ıslatılması için 0.5 ml&#39;lik bir tüp kullanın. </li><li> liziz tamponu 180 ul ve kısaca proteinaz K ve vorteks 40 ul ekle. 2 saat veya gece boyunca bir blok ısıtıcı üzerinde 56 ° C&#39;de inkübe edin. kısaca inkübasyon sırasında her 15 dakikada bir vorteks ile karıştırın. Not: Tam lizis gerekli değildir. </li><li> 13.000 x g&#39;de 5 dakika boyunca santrifüje. Santrifüj işleminden sonra, eğer küçük amoyağ unt karaciğer gibi bir yağlı örnek durumunda yüzey üzerinde var, atın. yeni bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüp süpernatant aktarın. </li><li> guanidin hidroklorür içeren kaotropik tampon 200 ul ekleyin ve vorteks karıştırın. Yine vorteks etanol (% 99.5) ve karışımı 200 ul ekle. </li><li> 2 ml&#39;lik bir toplama tüpü içinde yerleştirilmiş spin kolon içine karışımı aktarın. 13.000 x g&#39;de 1 dakika boyunca santrifüj. flow-through atın. Dikkat: Guanidin çamaşır suyu ile son derece reaktif bileşikler oluşturabilir çünkü atık çamaşır suyu katmayın. </li><li> 13.000 x g&#39;de 1 dakika için yıkama tamponu 1 (ihtiva guanidin hidroklorür) ve santrifüj 500 ul ekle. akışını ve toplama tüpü atın. </li><li> kiti ile sağlanan yeni 2 ml toplama tüpü spin kolon yerleştirin. 20.000 x g&#39;de 3 dakika boyunca yıkama tamponu 2 ile santrifüj 500 ul ekle. Flow-through ve toplama tüpü atın. Yeni spin kolon aktarın1.5 ml mikrosantrifüj tüp. </li><li> Pipet spin kolon membranın merkezi elüsyon tamponu 200 ul. 1 dakika sonra, 6000 x g, 1 dakika süre ile santrifüjlenir. </li><li> Pipet 50 tek kullanımlık bir UV küvete eluat ul 220-300 nm&#39;de, sıyırma sıvısının UV spektrumu ve bir spektrofotometre kullanılarak 260 nm&#39;de absorbans ölçümü. </li><li> 260 nm&#39;de zirve ile DNA&#39;nın UV spektrumu edin. basit bir denklem kullanılarak yaklaşık DNA konsantrasyonu hesaplamak &quot;DNA konsantrasyonu (ng / ml) 260 nm x 50 absorbans =&quot;. Not: puffer kanatlarına elde Tipik DNA konsantrasyonu 63 ± 30 ng / | il (n = 20) &#39;dir. </li><li> DNA konsantrasyonu daha yüksek 10 ng / | il ise, / ml, 5 ng Tris-EDTA (TE) tampon çözeltisi (pH 8) ile birlikte DNA örnekleri seyreltin. </li><li> -20 ° C&#39;de örnek Mağaza ya da PCR büyütmesi (bölüm 2) geçin. </li></ol> 2. PCR <ol><li> Her extr için 25 ul PCR kurmakDNA örneği, pozitif kontrol kirlenmesini önlemek için temiz bir bankta Tablo 1 ve 2&#39;ye uygun olan buz üzerinde ve negatif kontrol (DNA yerine örnek ultrapurified su) (TE tamponu pH 8.0 içinde, hedef dizisine sahip olan oligonükleotid sentezlenmiş 0.2 um) vermiştir. Not: Kolay kullanım için, şablon DNA olmadan tüm reaktifleri içeren kokteyl yeterli miktarda yapmak ve dağıtmak. PCR ürününün 3 &#39;A çıkıntılar eklenmesini önlemek için DNA polimeraz olan redaksiyon aktivitesini kullanın. </li><li> Tablo 3&#39;te gösterilen döngü programı kullanılarak, bir termal döngü PCR yürütmek. </li></ol> 3. Enzimatik Sindirim <ol><li> PCR çözeltisi 100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitol ve 500 mM NaCl içeren çözeltinin 2 ul ekle. </li><li> her biri, sınır enzimi 1 ul (DRA I ve Msp I) ekleyin ve yavaşça karıştırın. th 37 ° C sıcaklıkta 30 dakika boyunca inkübe edinErmal cycler. </li><li> Msp I tarafından üretilen yapışkan ucunu doldurur diğer DNA polimeraz, aktive etmek için 72 ° C&#39;de 5 dakika süreyle inkübe </li><li> İsteğe bağlı: 15 3.33 (ağırlıkça%) bir çapraz bağ oranı (% C, bisakrilamid yüzdesi) ve poliakrilamid jel konsantrasyonu (% T) ile poliakrilamid jel elektroforez ile reaksiyon çözeltisinin, her 2.5 ul analiz (% ağırlık / hacim) 38. floresan DNA leke kullanılarak jel Leke ve kehribar ekranını kullanarak bir mavi ışık transilluminator&#39;de çift iplikli DNA gözlemleyin. </li><li> Analitik sütun hasara sebep olabilir, tıkanmayı önlemek için 0.2-0.5 um santrifüj filtre cihazı ile, reaksiyon çözeltisi filtre. </li><li> analize kadar -20 ° C&#39;de, bir şevli polipropilen şişe ve saklamak için filtrat aktarın. </li></ol> 4. LC / ESI-MS analizi <ol><li> HFIP 67.2 g (yaklaşık 42 mL) ve bir 1 L şişe içinde TEA, 1.52 gr (yaklaşık 2.0 mi) tartılır. ultrapurified su (LC / MS gra 955 ml ilave edilirReaktifler tamamen eriyene kadar de) ilave edin ve manyetik bir karıştırıcı kullanılarak. çözeltisinin bir bölümü almak ve pH kontrol (7.85 ve 7.95 arasında, ideal pH = 7.9) bir pH metre kullanılarak. Not: metal iyonları ile kirlenmesini önlemek için şişeye kısım iade etmeyin. pH değildir 7.9 ise, pH&#39;ı ayarlamak ve yeniden pH ölçmek için HFIP veya çay küçük bir miktar ilave edin. </li><li> buharlaşmasını önlemek için (ev kullanımı için) doğrudan soğutma taşınabilir buzdolabı kullanarak şişe soğutma sıvı kromatograf A hattına şişe bağlayın. B hattına metanol ile dolu bir şişe bağlayın </li><li> koruma sütunu ve sıvı kromatografı analitik kolon (2.0 x 50 mm, mezogözeneklere size = 30 nm) bağlayın. Sütunları dengelemek için ilk mobil faz (% 95 A ve% 5 B) akmaya başlar. </li><li> Kalibran 39 olarak 0.5 mg / ml sodyum trifloroasetat (pH 3.5) hazırlayın. <ol><li> Trifluoroasetik ac 50 mg (yaklaşık 34 ul) tartılırBir beher id. </li><li> ultrapurified 30 mL su ilave edin ve bir pH ölçer yardımıyla, 10 mM sodyum hidroksit ile pH 3.5&#39;e titre edilir. </li><li> ultrapurified su ile 50 ml&#39;ye kadar doldurun. 50 ml asetonitril (LC / MS grade) ilave et ve karıştır. </li><li> çalışma çözeltisinin bir kısmını almak ve oda sıcaklığında saklayın. 4 ° C&#39;da, çözelti geri kalanını saklayın. </li></ol></li><li> aşağıdaki gibi C-tuzak azot basıncını azaltın. Not: Son Fourier, bozulmamış protein analizi için uygun olan kütle spektrometre, dönüşümü basıncını kontrol etmek için kontrol yazılımı. <ol><li> kütle spektrometresi sol üst kapağını çıkarın. C-tuzak valf sol ön planda köşesinde yer almaktadır. </li><li> kontrol yazılımı alet durum penceresinde yüksek vakum basınç değerini kontrol edin. Not: değer tipik olarak, 3 x 10 -8 bar. </li><li> Kilidi açmak ve yüksek vakum basın azaltmak amacıyla çok yavaş Düğmeyi saat yönünün tersine çevirmek için düğmeyi çekin1/3 (tipik olarak 1 x 10 -8 bar) ure. belirtilen basınç gecikmeli bir şekilde yavaş yavaş değişmelidir. Alçak basınç hakkında uyarı mesajını görmezden. kilitlemek için düğmeyi itin. </li><li> güvenliği için üst kapağı geri yükleyin. </li></ol></li><li> Sodyum trifloroasetat 39 kullanılarak kütle spektrometresi ayarlayın. Not: Günlük kitle kalibrasyon bu protokol ile değiştirilebilir, ancak üretici tarafından önerilen önerilen kalibrasyon Bu kalibrasyon öncesinde tamamlanmış olması gerekir. <ol><li> aşağıdaki gibi tarama parametreleri ve ayar yazılımı enstrüman kontrol kutusu ısıtmalı ESI kaynak parametrelerini ayarlayın: Tarama tipi tam MS; tarama aralığı m / z 500-4,000; parçalanma (in-kaynak çarpışma kaynaklı ayrılma (CID) gerilim 60 eV, polarite negatif, kılıf gaz akış hızı 5;; aux gaz akış hızı 0; süpürme gazı otomatik kazanç kontrolü (AGC) 1 x 10 6, maksimum enjekte süresi 50 msn hedef hızı 0 akış, gerilimi sprey 3 kV kılcal sıcaklık 320 ° C; S lens radyofrekans (RF) seviyesi 100; Isıtıcı sıcaklığı 30 ° C. <ol><li> Negatif iyon girişi listesi m / z 792,85908, 1064,80870, 1336,75832, 1608,70794, 1880,65755, 2152,60717, 2424,55679, 2696,50640, 2968,45602, 3376,38045 olarak izlenecek. </li></ol></li><li> kütle spektrometresi (pozisyon B) arayüzüne yakın ısıtılmış ESI probu hareket ettirin. prob ve bir boru ile bir şırınga bağlayın. </li><li> Gömülü şırınga pompası kullanılarak 10 ul / dk&#39;lık bir akış hızında, sürekli kalibrant infüze. Özelleştirilmiş kalibrasyon tablosunda sadece 6 alt kitle iyonları (m / z 792,85908-2152,60717) kontrol edin. <ol><li> sinyallerin yoğunluğu stabilize edildikten sonra kalibrasyon ile devam edin. Kalibrasyon sonra, sadece altı yüksek kütle iyonları (m / z 1.880,65755-3376,38045) kontrol ve kalibrasyon ile devam edin. başarısızlığı önlemek için bir kerede tüm iyonları kullanılarak kalibre kaçının. </li></ol></li></ol></li><li> ÖDENEK probu taşı0.4 ml / dk (pozisyon D) bir akış hızı için te konumu nötr bir metal boru ile sıvı kromatografı bağlanabilir. </li><li> aşağıdaki gibi ayar yazılımı enstrüman kontrol kutusu ısıtmalı ESI kaynak parametrelerini ayarlayın: kılıf gaz akış hızı 50; aux gaz akış hızı 15; gaz akış hızı 1 süpürme; gerilimi 2.5 kV sprey; kılcal sıcaklığı 350 ° C; S-lens RF seviyesi 100; Isıtıcı sıcaklığı 350 ° C&#39;dir. </li><li> enstrümantal ayar penceresinde kütle spektrometresi ayarlayın edinimi parametreleri aşağıdaki gibi: yöntem süresi 8 dakika; vana, kütle spektrometresi 3,5-6 dakika, 0-3,5 ve atık 6-8 dk aktarma; 6 dk çalışma zamanı 3.5; negatif polarite; Kaynak CID geriliminin 15.0 eV olarak; microscans 3; Nominal çözünürlük gücü (m / z 200) 140000; AGC hedef 1 x 10 6; Maksimum iyon süresi 50 msn; taramaları 1 sayısı; tarama aralığı m / z 700-3,500; spektrum veri türü profili. </li><li> sıvı kromatografı Set parametreleri aşağıdaki gibi: kolon fırını sıcaklığı 20 ° C; sample tepsi sıcaklığı 10 ° C; gradyan programı 0-0.5 dakika% 5 B, 0.5-1 dakika% 5-30 B, 1-3,5 dakika% 30-40 B, 3.5-5 dakika 40-98% B, 5-6 dk% 98 B, 6- 6.05 dakika 98-5% B, 6,05-8 dakika% 5 B; oranı 0.4 ml / dk akış. </li><li> Boşaltma şişeleri dipleri dokunarak kabarcıklar. Numune raf örnek şişeleri ayarlayın ve analiz başlatmak için otomatik numune alıcı kullanarak bir örnek 1.0 ul enjekte edilir. </li><li> tarayıcı yazılımı ile ham veri dosyaları açmak ve tüm satın almalar başarıyla pozitif ve negatif kontroller de dahil olmak üzere, bitmiş olduğunu onaylayın. Not: Genellikle, iki ya da üç adet tepe noktası 4-5,5 dakikalık bir alıkonma zamanında, toplam iyon akımı kromatogramda görülmektedir olur pufferfish DNA, başarılı bir şekilde yükseltilir ve hazmedildiginde. </li></ol> 5. Dekonvolüsyon ve Yorumlama <ol><li> Dekonvolüsyonun yazılımını başlatın. &quot;(Izotopik çözüldü) oto özü&quot; Select deneme türü. </li><li> Aşağıdaki parametreleri kullanarak bir yöntem düzenleyin: çıktı kütle M; S / N threshold3, göreceli bolluk eşiği 0; negatif yük evet; Geçerli kromatogram (XIC) iyon çıkarılan hesaplamak evet; m / z aralığı 700-3,500; Taşıyıcı H + şarj; tespit edilen ücret 3 minimum sayıda; izotop oranı nükleotid; uygun faktör% 80; kalan eşiği% 0; evet çakışmalar düşünün; aralığı 3-50 ücret; Minimum yoğunluğu 1 &#39;dir; beklenen yoğunluk hatası 3. <ol><li> yeni bir yöntem olarak kaydet ve onu seçin. </li></ol></li><li> Ham veri dosyaları mevcut dizini seçin. analiz edilecek ham veri dosyaları seçin ve düğmesine tıklayın &#39;Sıraya Ekle&#39;. </li><li> dekonvulasyon başlatmak için &#39;Run Queue&#39; sekmesinde &#39;Çalıştır&#39; düğmesine tıklayın. </li><li> Sıra tamamlandıktan sonra, bir satır seçin ve Dekonvolüsyonun sonuçlarını elde etmek için üst başlık olarak &#39;Aç Sonuç tıklayın. </li><li> Tablo 4 kullanılarak 4-5,5 dakikalık bir retansiyon zamanında zirvelerinden elde edilen Monoizotopik kitlelerden sonuçları yorumlama. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

DNA elde etmek için, kan ve doku DNA elde etmek için bir ticari kit küçük değişiklikler (proteinaz K miktarına ve lizis çözeltisinin santrifüj) ile üreticinin protokolüne uygun olarak kullanılır. Bununla birlikte, herhangi bir ekstraksiyon kiti sürece hücresel DNA, PCR için uygun geri kazanım ve saflıkta elde edilebilir olarak kullanılabilir. Bu yöntem kas, fin, karaciğer, yumurtalık ve cilt 37 kullanılarak test edilmiştir. Fin için, dondurulmuş, kurutulmuş kaynatıldı ve pişmiş pufferfish örnekleri başarılı 37 test edildi proteinaz K Fresh ile hızlı bir lizis geniş bir yüzey alanına, özellikle uygundur. PCR primer seti (Tablo 1) puffer için tasarlanmış ve puffer mitokondrial 16S ribozomal RNA geni güçlendirir edilir. Yükseltmek için hedef DNA 114-115 bp&#39;lik (cinsi Takifugu) ve 86 bp&#39;lik (cinsi Lagocephalus) (Tablo 5). yöntem, developme kolaylaştırmaknt hedef sekansları olan sentez oligonükleotitler yerine özgün pufferfish numuneleri toplamak ve referans olarak kullanılmıştır. primer seti amacı yanıt olarak başka bir primer dizisi ile ikame edilmiş olabilir, bununla birlikte, enzimatik sindirimden sonra nihai DNA uzunluğu başarılı dekonvolüsyon için gerekli olan kütle spektrumu kalitesini koruma açısından nt az 100 olmalıdır. Buna ek olarak, C-tuzak azot basıncı hedef oligonükleotid uzun yaklaşık 75 nt uzun olduğunda azalır ve kütle spektrum kalitesi başarılı Dekonvolüsyonun için yetersiz olmalıdır. Bu tür sınırlamalar protokolü bölümünde tarif edildiği gibi başka bir kasa içinde Cı-trap valf ayarlı olması gerekir, gösterge yazılım son gelişmeler ile kontrol edilebilir. Numune hazırlama için olduğu gibi, deterjan içermeyen reaktiflerin kullanılması uygun pik şekli, yeterli bir tepe şiddetine ve sabit tutma süresi 31 açısından daha sonra LC için önemlidir. 21,24-33, bir C18 ters-faz parçacık silika kolon 23,40,41 ve bir hidrofobik etkileşim kromatografisi (HILIC) sütunu 42 LC kullanılmıştır / oligonükleotidlerin ESI-MS analizi. Bunlar arasında, kılcal monolit sütun ayırma kapasitesi açısından diğerlerinden üstün olduğunu, ancak, geçmiş çalışmalarda kullanılan kılcal monolit sütun in-house yaptı ve enstrümantasyon gerektiren düşük akış hızı (2 ul / dak), işletilmiştir mikro LC adanmış. Kolay işlemini kolaylaştırmak için, ticari olarak temin edilebilen sütun daha yüksek akış oranları (100-400 ul / dakika) uzun oligonükleotitlerin ayrılması için değerlendirildi. DNA dubleksleri (26, 37 ve 53 bp) üç çift yukarıda belirtilen sütunları kullanılarak ayrıldı, ancak, C18-bağlı partikül silika kolonu ve PS-DVB monolit sütun çevrim süreleri sırasıyla 65 ve 70 dk idi , C oysa <sub&gt; 18-bağlı silika monolit sütun 8 dakika (Şekil 1). Dikkate hızlı analiz alarak, C18-bağlı silika monolit sütun sınırlı ayırma kapasitesine rağmen bizim amaçlarımız için seçildi; Bununla birlikte, geliştirilmiş ayırma gerekli olduğunda, kalan iki sütun kullanılabilir. Teorik olarak, bir monolit kolonu durumunda, hiçbir geçiş hacmidir ve mobil faz, böylece etkili bir ayırma 27 etkinleştirme tutarlı yol uzunluğuna korurken katı faz gözenekleri boyunca akmaya zorlanabilir olacaktır. Bu tür işlemler, büyük moleküller yavaş difüzyonu gibi, böyle bir oligonükleotidin özellikle biomacromolecules analizinde, ortaya olacaktır. Bir monolit sütun pratik yararları bir tane arka basınç, bir parçacık halinde silika kolonu 27 daha düşük olmasıdır. yüksek akış hızı (400 ul / dak) ve düşük kolon sıcaklığı (20 ° C), maksimum geri basınç rağmenSistem MPa 37 12.5 idi. Bu, uzun bir oligonükleotidin hızlı analizi için bir C18-bağlı silika monolit sütunun avantajı ilk örnek bu olmuştur. Yüksek akış hızı sayesinde, ara yüzeyde mikro LC tam bir bağlantı için özel bir alet gerekli değildir. Bunun yerine, bir ısıtılmış ESI prob, DNA dubleks ayırmak, daha sonra tarif edildiği gibi DNA iyonizasyonu yardımcı olmak için gereklidir. İyon çifti kromatografisi yaygın oligonükleotid MS uyumlu ayrılması için kullanılır. Bununla birlikte, bir iyon çifti reajanı genellikle ESI işlemi ile karışır ve ESI-MS duyarlılığını azaltır. Bu nedenle, HFIP sık oligonükleotidin hassasiyetini artırmak için mobil faz için kullanılır. Bununla birlikte, HFIP (kaynama noktası 59 ° C) metanol (kaynama noktası 65 ° C) ve bu nedenle, çözgen ve bu kayıp pH artar ve iyon çifti ayıracı ayrışmasını teşvik (örneğin, çay) önce, ara yüzeyde hızlı buharlaşanoligonükleotidden. Mevcut buluş, 350 ° C &#39;de sıcak azot gazı ile eluatın nebulizes ısıtılmış ESI sonda kullandığı için, bu etki aşırı önem olabilir. Çünkü eser metal iyonları 33, adükt oluşumunun bir azalma genotipleme analizi için, bunun yerine HFIP TEA tampon maddesi, Erb ve Oberacher cyclohexyldimethylammonium asetat (pH 8.4 CycHDMAA) önerilir. Yazarlar CycHDMAA kendisini metal ilave maddesinin oluşumunun bastırılması çıkarılabilir. Literatürde rağmen, önemli bir adükt oluşumu, bu yöntemde gözlenmemiştir. Buna ek olarak, HFIP TEA-metanol sistemi kayda değer faydası HFIP TEA-metanol sistemi ile elde edilen tepe alanı T. 86 bp&#39;lik bir amplikon analiz ederken CycHDMAA asetonitril sistemi elde edilenden 17 kat daha fazla olmasıdır poecilonotus (veriler gösterilmemiştir). HFIP TEA-metanol sisteminin bir dezavantajı, CycHDMAA asetonitril sistemine artan maliyet göredir. monoizotopik kütle hesaplanması çok yüklü iyonların izotopik tepe ayrılmasını gerektirir. Bu nedenle, çözünürlük, bu analiz için kritik önem taşır. gerekli çözünürlük gücü analitin baz çifti uzunluğuna bağlıdır, ancak bin onlarca bir çözünürlük gücüne sahip olan geleneksel TOF analiz, kısa oligonükleotidlerin analizi için sınırlanabilir. Tablo 4&#39;te gösterilen teorik monoizotopik kütleler analitlerin karşılık gelen baz bileşimlerinin hesaplandı. Seçenek olarak ise, Muddiman ve ark. Doğru kütle 43 baz bileşimin hesaplanması için bir yazılım uygulaması geliştirilmiştir. Benzer bir program otomatik ESI-MS sisteminde 16-18 entegre edildi. ölçülü monoizotopik kütle her zaman özel bir baz bileşimi o karşılık gelmez, çünkü bu algoritmaların kullanımı, bu yöntemin sağlamlığını artırabilirkaçınılmaz ölçüm hatasından kaynaklanan 3 ppm kitle tolerans kanat. Ne yazık ki, biz bu çalışmada bu yazılım ürünleri elde edemezler. Bu yöntem temel bileşimi üzerine kurulmuştur ve özellikle de puffer için tasarlanmış bir işlem ile ilgili değildir, bu monoizotopik kütle bazlı türler belirlenmesi puffer farklılaşması için değil, aynı zamanda diğer DNA polimorfizmlerinin tespiti için de uygun olabilir. DNA polimorfizmi tespit edilmesi için de, özel bir ESI-MS sistemi, patojenlerin 15,17,18,20,30 tespiti gibi tanısal kullanım için uygun olabilir, tam otomatik ve kullanımı kolaydır. Bunun aksine, mevcut metot, bir araştırma kullanımları için uygun olan, bu nedenle ortak araştırma aletleri ve cihaz ve, ile mümkündür. ESI-MS önce bu tip bir tekli nükleotid polimorfizm 13,28,32, kısa tandem tekrarı 26 insan DNA polimorfizmi uygulanmıştır, Ve mitokondriyal DNA 16,19 ANALİZİ. Mikro RNA da kılcal LC / ESI-MS 44 ile analiz edildi. Bu yayınlanmış başvurular da mevcut yöntem ile gerçekleştirilebilir. Buna ek olarak, bu yöntem, düşük sıcaklık ayrılmasına bağlı antibiyotik etkileşim ve ribozomal RNA 45&#39;e oligonükleotid ve düşük molekül ağırlıklı bileşikler arasındaki etkileşiminin izlenmesi için de uygun olabilir. Bu gibi durumlarda, oligonükleotitlerin ve düşük molekül ağırlıklı bileşikler LC / ESI-MS kullanılarak bir avantaj olduğu, aynı zamanda tespit edilmelidir. Aletler örneğin Sanger sekanslama ve gerçek zamanlı PCR gibi geleneksel tekniklerle olarak paralel bir analiz gerçekleştirmek için uygun olmayan bir sınırlama yoktur. Ek olarak, mevcut yöntem, yalnızca baz bileşim ve aynı molekül içinde bir baz ikame ayırt edilemez tanımlar. Ancak, burada açıklanan MS tabanlı DNA analizi hâlâ dönemde hak olabilirjel elektroforezi ve gerçek zamanlı PCR gibi boya bazlı teknikler DNA bağlama ile karşılaştırıldığında doğruluğu s.

Kütle spektrometrisi (MS) iyonizasyon 1,2 için kullanılan nükleik asit, matris destekli lazer çıkarma / iyonlaşma (MALDI) ile elektrosprey iyonizasyon (ESI) arasında hızlı ve güvenli bir tanımlama için kabul edilen bir teknolojidir. MALDI tekniği genellikle bir süre-of-flight (TOF) analiz ile birleştirilir; Ancak, MALDI-TOF MS uygulaması kısa oligonükleotidler ile sınırlıdır (~ 25 nükleotid (nt)) sonraki parçalanma, adükt oluşumu ve düşük iyonlaşma verimliliği 1,2 sayesinde. Bunun aksine, ESI uzun oligonükleotidler (&gt; 100 nt) için geçerlidir, ancak birden çok yük durumları ([M-NH] n-) biomacromolecules aynı anda üretilir ve bu nedenle de bir analit kütlesi üst aşabilir yüklü iyonlar spektrometre m / z aralığı sınırı. Bu karşılık gelen kütle içine kıvrık spektrumları yorumlanması, yani bir şarj durumu serisinin dönüşümünü gerektirirDekonvolüsyonun yoluyla. Küçük molekül kütlesi ölçümü, monoizotopik kütle zirve, yani söz konusu olduğunda, her bir elemanın, sadece en yaygın izotop ihtiva eden bir molekül kütlesi en bol ve 3 doğal görülmektedir. Molekül ağırlığı arttıkça, daha yüksek, m / z ve monoizotopik tepe izotopik dağıtım değişimleri taban gürültü 3-5 kararmaktadır. Monoizotopik pik artık kDa 3, 10 daha büyük kitleler için tespit sonra, ortalama moleküler ağırlıklı monoizotopik kütle 5 yerine ölçülmesi için kullanılır. Bu gibi durumlarda, tek tek zirvelerin her biri 1 Da tarafından ayrıldığı izotopik dağılımı sadece gözlemlenebilir zaman TOF, Fourier Kingdon&#39;un tutarak analiz 6 değiştirilmiş dönüşüm ya da bir Fourier dönüşümü iyon siklotron rezonans gibi yüksek çözünürlüklü kütle analizörü analiz analizi için kullanılır. Ancak, en bol zirve sometimes ortalama moleküler kütlesi 5 ile tutarlı değildir. Bu sorunlar doğru analitin belirlenmesi için zorluk yol açabilir. Kararlı izotopların doğal bolluk içinde değişim ve ortalama molekül kütlesi belirlenmesinde zorluklar göz önüne alındığında, Monoizotopik kitle ölçüm biyomoleküllerin 3,4 kitle karakterizasyonu için idealdir. Pratikte, monoizotopik pik uygulanıp olup olmadığını, monoizotopik kütle model analit 4,7-10 hesaplanan teorik bir gözlenen izotopik dağılım modelini karşılaştırarak tahmin edilebilir. Uydurma algoritması 8 şimdi sahipli yazılım içine dahil edilmiştir. ESI-MS bağlamında, bir DNA çift yönlü, saflaştırma ve tuzsuzlaştırma ayrışma nedeniyle iyon bastırılması ve adükt oluşumu 2,10-14 için iyonizasyon başarısızlığını önlemek için doğrudan ölçümü için gereklidir. Bu prosedürler troubl olanesome Ancak tam otomatik analitik sistemler patojenlerin 15-20 tespiti için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), numune hazırlama ve ESI-MS ile ilgili ticari olarak geliştirilmiştir. Başka bir yaklaşım ayrılması için sıvı kromatografisi (LC) sunuyor. LC eşlik eden maddelerden analitlerin bir on-line olarak ayrılmasına sunar ve 21,22 İyonizasyon öncesinde laboratuarda örnek hazırlama gerektirmez. Bununla birlikte, MS-uyumlu bir mobil faz kullanılarak nükleik asit ayrılması bu tür nükleotidlerin polianyonik doğası nedeniyle ilaç, peptidler ve proteinler gibi pek çok başka bileşikler için daha zordur. LC / ESI-MS en başarılı örnekler, ters fazlı LC iyon çifti kullanılmasını içerir. 1,1,1,3,3,3-heksafluoro-2-propanol, hareketli aşamada (HFIP) -triethylamine (TEA) -metanol ilk Apffel ve arkadaşları tarafından önerilmiştir. Ayırma ve kısa oligonükleotitler 23 tespit edilmesi için. differentiatio LC / ESI-MS genotipleme Uygulamapatojen türleri, tek nükleotid polimorfizm ve kısa tandem tekrarı n uzun oligonükleotitler 1,21,24-33 ayırabilen bir kılcal polimer yekpare kolonu kullanılarak rapor edilmiştir. Japonya ve Amerika Birleşik Devletleri&#39;nde, ciddi gıda zehirlenmesi hatalı tanımlama ve puffer uygunsuz hazırlanması nedeniyle oluştu ve bu puffer dağıtım ve hazırlık kesinlikle gıda güvenliği mevzuatı 34,35 tarafından kontrol edilir gerçeğine rağmen. Ayrıca, pufferfish ekstresi kullanarak kasıtlı cinayet Japonya&#39;da 36 meydana geldi. Bu nedenle, pufferfish türlerin farklılaşması kamu sağlığı ve adli soruşturma açıdan hem de gereklidir. Takifugu rubripes puffer diğer türlü çok daha pahalı olduğu için, ayrıca, bir farklılaşma kabiliyeti de gıda dolandırıcılık araştırmaların kapsamında gereklidir. Burada, m belirlemek için detaylı bir yöntemters-fazlı silika yekpare kolon ve yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi kullanılarak LC / ESI-MS ile bir PCR ürününün onoisotopic kütlesi tarif edilmektedir. Özellikle, bu yaklaşım MS kullanılarak hayvan türlerinin farklılaşması için ilk örnektir PCR restriksiyon parça uzunluk polimorfizm (RFLP) ile 37 kullanımına dayanmaktadır toksik pufferfish türlerinin farklılaşmasını izin vermek için geliştirilmiştir.

<table><tbody><tr><td>DNeasy Blood &amp;amp; Tissue Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td>DNA extraction kit</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Qiagen</td><td>19131</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (99.5+ vol%)</td><td>Wako</td><td>054-07225</td><td>For dilution of wash buffers</td></tr><tr><td>TE buffer (pH 8.0)</td><td>Wako</td><td>310-90023</td><td>For dilution of DNA sample</td></tr><tr><td>PCR primer</td><td>Fasmac</td><td>NA</td><td>Purified with reverse-phase cartridge column by the supplier</td></tr><tr><td>Template DNA</td><td>Eurofins Genomics</td><td>NA</td><td>Purified by HPLC by the supplier</td></tr><tr><td>Ultrapurified water</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Generated with a Milli-Q Direct water purification system (Merck Millipore), used for sample preparation</td></tr><tr><td>Detergent Free 5x Phusion HF Buffer</td><td>Thermo Fisher</td><td>F-520L</td><td>Use instead of the provided buffer of DNA polymerase</td></tr><tr><td>Pfu-X DNA polymerase</td><td>Jena Bioscience</td><td>PCR-207S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix (20 mM each)</td><td>Jena Bioscience</td><td>NA</td><td>Supplied with the DNA polymerase</td></tr><tr><td>10&amp;times; Universal buffer M</td><td>Takara Bio</td><td>NA</td><td>Containing 100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 10 mM dithiothreitol and 500 mM NaCl</td></tr><tr><td>Dra I</td><td>Thermo Fisher</td><td>FD0224</td><td>Restriction enzyme</td></tr><tr><td>Msp I</td><td>Thermo Fisher</td><td>FD0544</td><td>Restriction enzyme</td></tr><tr><td>1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP)</td><td>Fluka</td><td>42060-50ML</td><td>Eluent additive for LC-MS grade.</td></tr><tr><td>Triethylamine (TEA)</td><td>Fluka</td><td>65897-50ML</td><td>Eluent additive for LC-MS grade.</td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508</td><td>For preparation of calibrant.</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide (1.0 M)</td><td>Fluka</td><td>72082</td><td>Dilute to 10 mM with ultrapurified water and use for titration of trifluoroacetic acid.</td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Fluka</td><td>34967</td><td>For preparation of calibrant, LC/MS grade.</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Kanto</td><td>25185-76</td><td>For mobile phase, LC/MS grade.</td></tr><tr><td>Water</td><td>Thermo Fisher</td><td>W6-1</td><td>For mobile phase, LC/MS grade.</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tube (0.5 ml)</td><td>Eppendorf</td><td>0030123301</td><td>PCR clean grade</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tube (1.5 ml)</td><td>Eppendorf</td><td>0030123328</td><td>PCR clean grade</td></tr><tr><td>UVette</td><td>Eppendorf</td><td>0030106300</td><td>Disposable UV cuvette.</td></tr><tr><td>Gel Green</td><td>Biotium</td><td>41004</td><td>Fluorescent DNA stain</td></tr><tr><td>Cosmospin filter G (0.2 &amp;mu;m)</td><td>Nakalai Tesque</td><td>06549-44</td><td>Made of hydrophilic polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane. Any centrifugal filter unit (pore size, 0.2&amp;ndash;0.5 &amp;mu;m) made of hydrophilic PTFE or another low-binding membrane is applicable.</td></tr><tr><td>300 &amp;mu;l PP screw vial</td><td>American Chromatography Supplies</td><td>V0309P-1232</td><td></td></tr><tr><td>Preassembled screw cap and septa</td><td>Finneran</td><td>5395-09R</td><td></td></tr><tr><td>Monobis C18 analytical column (2.0&amp;times;50 mm, mesopore size = 30 nm)</td><td>Kyoto Monotech</td><td>2050H30ODS</td><td>Outside Japan, available for purchase from GL Sciences via its distributors. (http://www.glsciences.com/distributors/)</td></tr><tr><td>Monobis C18 guard column</td><td>Kyoto Monotech</td><td>GCSET-ODS3210</td><td>Holder included.</td></tr><tr><td>Cadenza CW-C18 (3.0&amp;times;250 mm)</td><td>Imtakt</td><td>CW036</td><td>C&lt;sub&gt;18&lt;/sub&gt;-bonded particulate silica column</td></tr><tr><td>ProSwift RP-4H (1.0&amp;times;250 mm)</td><td>Thermo Fisher</td><td>066640</td><td>Poly(styrene-divinylbenzene) monolith column</td></tr><tr><td>Themo Mixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382 000.023</td><td>For digestion of fish tissues.</td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Shimadzu</td><td>UV-3150</td><td>Quantification of DNA concentration.</td></tr><tr><td>Thermal cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>T100</td><td></td></tr><tr><td>Portable refrigerator</td><td>Twinbird</td><td>D-CUBE</td><td>For aqueous mobile phase to avoid evaporation of HFIP. This can be replaced by an ice box.</td></tr><tr><td>Ultimate 3000 liquid chromatograph</td><td>Thermo Fisher</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive mass spectrometer</td><td>Thermo Fisher</td><td>NA</td><td>Fourier transform mass spectrometer equipped with the modified Kingdon trap analyzer.</td></tr><tr><td>Protein deconvolution 3.0</td><td>Thermo Fisher</td><td>NA</td><td>Use version 3.0 or higher having an isotopic patter model of nucleotide.</td></tr></tbody></table>

improved polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism genotyping of toxic pufferfish by liquid chromatography/mass spectrometry

bir polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) -restriction parça uzunluk polimorfizm (RFLP), sıvı kromatografisi / elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometrisi (LC / ESI-MS) ile, toksik pufferfish türleri genotipleme için yöntemin geliştirilmiş bir versiyonu açıklanmıştır. DNA izolasyonu bir silis membran bazlı DNA ekstraksiyon kiti kullanılarak gerçekleştirilir. Bir deterjan içermeyen PCR tamponu kullanılarak PCR amplifikasyonu sonra restriksiyon enzimleri Reaksiyon çözeltisi arıtılması olmaksızın çözeltiye ilave edilir. Ters-faz silis yekpare kolonu ve bir Fourier değiştirilmiş Kingdon&#39;un tutarak analiz sahip olan yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi, sırasıyla, ayırma ve saptama için kullanılır dönüşümü. 400 mM 1,1,1,3,3,3-heksafluoro-2-propanol &#39;den ibaret hareketli faz, 15 mM trietilamin (pH 7.9) ve metanol, 0.4 ml / dk&#39;lık bir akış oranında verilmektedir. LC / ESI-MS analizi için devir süresi sütun dengeleme dahil 8 dakikadır. Bir izotop dağıtım modeli o sahip Dekonvolüsyonun yazılımoligonükleotidin f kütle spektrumu karşılık gelen monoizotopik kütle hesaplamak için kullanılır. Oligonükleotidler (aralık 26-79 nükleotid) analizi için, kitle doğruluk oldu 0.62 ± 0.74 ppm (n = 280) ve mükemmel doğruluk ve hassasiyet bir kilit kütle standardı kullanılmadan 180 saat boyunca devam etti.

Üç ticari olarak temin edilebilen sütun 100-400 ul / dakika akış hızlarında, uzun oligonükleotitlerin ayrılması için değerlendirildi. Geniş gözenekli oktadesil karbon zinciri (C18) n-bağlı parçacık silika kolon (a) ticari olarak temin edilebilen poli (stiren-divinilbenzen) (PS-DVB) yekpare kolonu (b) ve bir C18-bağlı silika monolit kolonu ( c)) (Şekil 1 karşılaştırıldı. DNA duplekslerine (26, 37 ve 53 bp) üç çift tüm sütunları kullanılarak ayrıldı ve C18-bağlı silika monolit sütunu daha sonraki çalışmalarda kullanılmıştır. T. kas özü Bir DNA analizi için Örnek sonuç rubripes Şekil 2 &#39;de gösterilmiştir. izotopik çözüldü zirveleri, Şekil 2a&#39;da gösterildiği gibi, başarılı bir şekilde monoizotopik kütle hesaplamak için gereklidir. Teorik ve ölçümT. edili- monoizotopik kütle rubripes Şekil 2B&#39;de gösterilmiştir. endonükleazlar ile sindirim saflaştırılmadan hemen PCR amplifikasyonundan sonra yapıldığından, Msp I endonükleaz tarafından oluşturulan 3&#39;-yapışkan ucu Kalan DNA polimerazı ile doldurulur. Sentetik DNA şablonları türetilen amplikonların analizine göre, kütle hassasiyeti -2.48 den 2.40 ppm (ortalama 0.62 ± 0.74 ppm, n = 280) arasında değişmektedir. Bu nedenle, 3 ppm&#39;lik bir kütle tolerans türleri (Tablo 4) ayırt etmek için kullanıldı. Tabloyu kullanarak, marketler ve mağazalar alınan pufferfish örneklerinin tamamı düzgün spesifik türlerin 37 olarak ayırt edildi. T. sentetik DNA şablonundan elde edilen numunenin periyodik analizine göre Chrysops, analitlerin tüm Monoizotopik kütleleri başarıyla de le için ± 3 ppm içinde belirlenmiştirherhangi bir kitle kalibrasyon olmadan ast 180 saat (Şekil 3). Bu kütle kalibrasyonu haftalık olarak gerekli olduğu anlamına gelir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54402/54402fig1.jpg" /> Şekil 1: T. sentezlenen DNA şablonundan elde edilen PCR-RFLP ürününün toplam iyon akımı kromatogramları PARDALIS bir C18-bağlı parçacık halindeki silis kolonu (a, 3 x 250 mm, parçacık büyüklüğü 3 um), bir poli (stiren-divinilbenzen) kullanılarak (PS-DVB) yekpare kolonu (B, 1.0 x 250 mm) ve bir C 18 n-bağlı monolit silika kolon (Cı, bu yöntem,) (a) için şartlar:. akış hızı, 0.2 ml / dakika; metanol oranı, 0-2 dakika% 5, 2-5 dakika% 5% 25, ​​5-20 dakika% 25 -40%, 20-35 dakika% 40 -98,% 35-50 dakika% 98, 50- 51 dk% 98% -5, 51-65 dakika% 5. Koşulları (b):oranı 0.1 ml / dk; metanol oranı, 0-2 dakika% 5, 2-5 dakika% 5% 25, ​​5-35 dakika% 25 -40%, 35-40 dakika% 40 -98,% 40-55 dakika% 98, 55- 56 dk% 98% -5, 56-70 dakika% 5. Her iki sütun için sıcaklığı 20 ° C idi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54402/54402fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54402/54402fig2.jpg" /> Şekil 2: T. ham kas analiz etmek için Temsilcisi sonuçlar rubripes. (a) Tipik toplam iyon akımı kromatogramlar ve kütle spektrumu. (B) T. sentezlenen DNA örneğinin elde edilen PCR-RFLP ürünlerinin teorik ve ölçülen Monoizotopik kitleler rubripes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54402/54402fig2large.jpg" target="_blank">Büyük görmek için buraya tıklayınız</a>Bu rakamın r sürümü. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54402/54402fig3.jpg" /> Şekil 3:. T. sentetik DNA elde edilen Stabilite testi Sindirilmiş amplikonlarının Chrysops her 10 saat analiz edilmiştir. Kütle kalibrasyon testi sırasında yapılmadı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54402/54402fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> isim </td><td> Sıra </td></tr><tr><td> lago86F </td><td> 5&#39;-CCATGTGGAATGAAAACACC-3&#39; </td></tr><tr><td> taki114F </td><td> 5&#39;-AAAAACAAGAGCCACAGCTCTAA-3&#39; </td></tr><tr><td> fugu86-114R </td><td> 5&#39;-CCCTAGGGTAACTCGGTTCG-3&#39; </td></tr></tbody></table>Tablo 1: PCR primerleri. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> PCR reajan </td><td> Cilt kullanılan </td><td> Nihai konsantrasyon </td></tr><tr><td> Ultrapurified su </td><td> 15.75 ul </td><td></td></tr><tr><td> Deterjan içermeyen 5x Tampon </td><td> 5,0 ul </td><td> 1x </td></tr><tr><td> dNTP karışımı (10 mM) </td><td> 0.5 ul </td><td> 0.2 mM </td></tr><tr><td> Primer karışımı (TE tamponu pH 8.0 içinde 10 uM lago86F, taki114F ve fugu86-114R her) </td><td> 1.0 ul </td><td> 0.4 uM her </td></tr><tr><td> DNA polimeraz (2.5 birim / ul), </td><td> 0,25 ul </td><td> 0.1 ünite / ul </td></tr><tr><td> TE tamponu pH Şablon DNA, 8.0 (5,0-10 ng / ekstre örnek uL, pozitif kontrol olarak, sentetik DNA 0.2 uM) </td><td> 2.5 ul </td><td> 0.5-1.0 ng / ekstre DNA ul, sentetik DNA için 20 nM </td></tr><tr><td></td><td> Toplam: 25 ul </td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 2: 25 ul ölçek PCR bileşenleri. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> devir </td><td> Şart </td><td> işlev </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 95 ° C&#39;de 2 dakika </td><td> ilk denatürasyon </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 95 ° C&#39;de 30 saniyelik </td><td> denatürasyonu </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 56 ° C&#39;de 30 saniyelik </td><td> tavlama </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 72 ° C&#39;de 30 saniyelik </td><td> Uzama </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 2-4 (toplam 30 kez) tekrarlayın </td><td></td></tr><tr><td> 6 </td><td> 72 ° C&#39;de 7 dakika </td><td> nihai uzama </td></tr><tr><td> 7 </td><td> Numunenin çıkarılana kadar 12 ° C&#39;de tutun </td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 3: PCR programı. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"> 4,0-5,5 dakika tutma süresi zirve sayı </td><td colspan="2"> aralığında bir üçüncü zirvenin monoizotopik kütle (dA) </td><td colspan="2"> aralığında, ikinci tepe monoizotopik kütle (dA) </td><td rowspan="2"> pufferfish türler </td></tr><tr><td> küçük şerit </td><td> büyük iplik </td><td> küçük şerit </td><td> büyük iplik </td></tr><tr><td rowspan="5"> 2 </td><td rowspan="5"> → </td><td rowspan="5"> → </td><td> 15890,707-15890,803 </td><td> 16177,531-16177,629 </td><td> L. inermis </td></tr><tr><td> 15921,702-15921,797 </td><td> 16146,537-16146,634 </td><td> L. gloveri </td></tr><tr><td> 15930,713-15930,809 </td><td> 16137,525-16137,622 </td><td> L. lunaris </td></tr><tr><td> 15937,697-15937,792 </td><td> 16131,537-16131,634 </td><td> L. wheeleri </td></tr><tr><td> 24173,034-24173,179 </td><td> 24566,905-24567,053 </td><td> T. Chrysops </td></tr><tr><td rowspan="6"> 3 </td><td rowspan="2"> 16295,706-16295,804 </td><td rowspan="2"> 16467,610-16467,709 </td><td> 11341,851-11341,919 </td><td> 11466,875-11466,944 </td><td> T. pardalis T. snyderi T. ocellatus T. xanthopterus T. stictonotus </td></tr><tr><td> 11654,908-11654,978 </td><td> 11770,920-11770,991 </td><td> T. niphobles </td></tr><tr><td> 16296,701-16296,799 </td><td> 16468,605-16468,704 </td><td> → </td><td> → </td><td> T. rubripes </td></tr><tr><td> 16311,701-16311,799 </td><td> 16452,610-16452,709 </td><td> → </td><td> → </td><td> T. poecilonotus T. exascurus </td></tr><tr><td> 16320,713-16320,811 </td><td> 16443,599-16443,697 </td><td> → </td><td> → </td><td> T. porphyreus T. obscurus </td></tr><tr><td> 16599,751-16599,851 </td><td> 16780,667-16780,767 </td><td> → </td><td> → </td><td> T. vermicularis </td></tr></tbody></table> Tablo 4: LC / ESI-MS türetilmiş Monoizotopik kitlelerden puffer Farklılaşma. <img alt="tablo 5" src="/files/ftp_upload/54402/54402tbl5.jpg" /> Tablo 5: Amplifiye DNA sekansı: (a) sırası ile aynıdır.Bu Tablo 4&#39;te açıklandığı gibi diğer balon balıkları türlerinin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54402/54402tbl5large.jpg" target="_blank">Bu tablonun büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry at JoVE.

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

sıvı kromatografisi / kütle spektrometresi ile pufferfish türleri genotipleme için geliştirilmiş bir polimeraz zincir reaksiyonu restriksiyon parça uzunluk polimorfizm yöntemi tarif edilmektedir. Ters-faz silis yekpare kolonu sindirilmiş amplıkonları ayırmak için kullanılır. Bu yöntem, baz bileşimi tanımlamak için yararlıdır oligonükleotidlerin Monoizotopik kitleleri aydınlatmak olabilir.

Sıvı Kromatografi / Kütle Spektrometresi zehirlidir pufferfish Geliştirilmiş Polimeraz Zincir Reaksiyonu-kısıtlama Parça Uzunluk Polimorfizmi Genotiplemesi

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

improved-polymerase-chain-reaction-restriction-fragment-length

Research

JoVE Journal

Genetics

11.1K Görüntüleme.  National Research Institute of Police Science.  sıvı kromatografisi / kütle spektrometresi ile pufferfish türleri genotipleme için geliştirilmiş bir polimeraz zincir reaksiyonu restriksiyon parça uzunluk polimorfizm yöntemi tarif edilmektedir. Ters-faz silis yekpare kolonu sindirilmiş amplıkonları ayırmak için kullanılır. Bu yöntem, baz bileşimi tanımlamak için yararlıdır oligonükleotidlerin Monoizotopik kitleleri aydınlatmak olabilir. 

Video: Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

Laboratory Estimation of Net Trophic Transfer Efficiencies of PCB Congeners to Lake Trout (Salvelinus namaycush) from Its Prey

A technique for laboratory estimation of net trophic transfer efficiency (&#947;) of polychlorinated biphenyl (PCB) congeners to piscivorous fish from their prey is described herein. During a 135-day laboratory experiment, we fed bloater (Coregonus hoyi) that had been caught in Lake Michigan to lake trout (Salvelinus namaycush) kept in eight laboratory tanks. Bloater is a natural prey for lake trout. In four of the tanks, a relatively high flow rate was used to ensure relatively high activity by the lake trout, whereas a low flow rate was used in the other four tanks, allowing for low lake trout activity. On a tank-by-tank basis, the amount of food eaten by the lake trout on each day of the experiment was recorded. Each lake trout was weighed at the start and end of the experiment. Four to nine lake trout from each of the eight tanks were sacrificed at the start of the experiment, and all 10 lake trout remaining in each of the tanks were euthanized at the end of the experiment. We determined concentrations of 75 PCB congeners in the lake trout at the start of the experiment, in the lake trout at the end of the experiment, and in bloaters fed to the lake trout during the experiment. Based on these measurements, &#947; was calculated for each of 75 PCB congeners in each of the eight tanks. Mean &#947; was calculated for each of the 75 PCB congeners for both active and inactive lake trout. Because the experiment was replicated in eight tanks, the standard error about mean &#947; could be estimated. Results from this type of experiment are useful in risk assessment models to predict future risk to humans and wildlife eating contaminated fish under various scenarios of environmental contamination.

Laboratory Estimation of Net Trophic Transfer Efficiencies of PCB Congeners to Lake Trout Salvelinus namaycush from Its Prey

A technique for laboratory estimation of net trophic transfer efficiency of polychlorinated biphenyl (PCB) congeners to piscivorous fish from their prey is presented. To maximize applicability of the laboratory results to the field, the piscivorous fish should be fed prey fish that are typically eaten in the field.

Göl Alabalık PCB kongenerinin Net Trofik Transferi Etkinliklerinin Laboratuvarı Tahmini (<em&gt; Salvelinus namaycush</em&gt;) Onun Prey dan

A technique for laboratory estimation of net trophic transfer efficiency (&#947;) of polychlorinated biphenyl (PCB) congeners to piscivorous fish from ...

Çevre

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) coupled to tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) and isobaric labeling multiplexing capacity. Here, we introduce a deep-proteomics profiling protocol that combines 10-plex tandem mass tag (TMT) labeling with an extensive LC/LC-MS/MS platform, and post-MS computational interference correction to accurately quantitate whole proteomes. This protocol includes the following main steps: protein extraction and digestion, TMT labeling, 2-dimensional (2D) LC, high-resolution mass spectrometry, and computational data processing. Quality control steps are included for troubleshooting and evaluating experimental variation. More than 10,000 proteins in mammalian samples can be confidently quantitated with this protocol. This protocol can also be applied to the quantitation of post translational modifications with minor changes. This multiplexed, robust method provides a powerful tool for proteomic analysis in a variety of complex samples, including cell culture, animal tissues, and human clinical specimens.

We present a protocol to accurately quantitate proteins with isobaric labelling, extensive fractionation, bioinformatics tools, and quality control steps in combination with liquid chromatography interfaced to a high-resolution mass spectrometer.

Derin Proteom izobarik etiketleme, kapsamlı sıvı Kromatografi, kütle spektrometresi ve yazılım destekli miktar tarafından profil oluşturma

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Biyokimya

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short generation time, are easy to handle, display a high reproductive rate, low cost, and are easily amenable to genetic manipulations by microinjection of DNA in embryos. Recent advances in gene editing tools are enabling precise introduction of mutations and transgenes in zebrafish. Disease modeling in zebrafish often leads to larval phenotypes and early death which can be challenging to interpret if genotypes are unknown. This early identification of genotypes is also needed in experiments requiring sample pooling, such as in gene expression or mass spectrometry studies. However, extensive genotypic screening is limited by traditional methods, which in most labs are performed only on adult zebrafish or in postmortem larvae. We addressed this problem by adapting a method for the isolation of PCR-ready genomic DNA from live zebrafish larvae that can be achieved as early as 72 h post-fertilization (hpf). This time and cost-effective technique, improved from a previously published genotyping protocol, allows the identification of genotypes from microscopic fin biopsies. The fins quickly regenerate as the larvae develop. Researchers are then able to select and raise the desired genotypes to adulthood by utilizing this high-throughput PCR-based genotyping procedure.

Zebrafish have been used as reliable genetic model organisms in biomedical research, especially with the advent of gene-editing technologies. When larval phenotypes are expected, DNA extraction and genotype identification can be challenging. Here, we describe an efficient genotyping procedure for zebrafish larvae, by tail clipping, as early as 72-h post-fertilization.

Yüksek işlem hacmi DNA ekstraksiyon ve 3dpf zebra balığı larva Fin kırpma tarafından Genotipleme

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

Genetik

Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis

Yersinia ruckeri is an important pathogen of farmed salmonids worldwide, but simple tools suitable for epizootiological investigations (infection tracing, etc.) of this bacterium have been lacking. A Multi-Locus Variable-number tandem-repeat Analysis (MLVA) assay was therefore developed as an easily accessible and unambiguous tool for high-resolution genotyping of recovered isolates. For the MLVA assay presented here, DNA is extracted from cultured Y. ruckeri samples by boiling bacterial cells in water, followed by use of supernatant as template for PCR. Primer-pairs targeting ten Variable-number tandem-repeat (VNTR) loci, interspersed throughout the Y. ruckeri genome, are distributed equally amongst two five-plex PCR reactions running under identical cycling conditions. Forward primers are labelled with either of three fluorescent dyes. Following amplicon confirmation by gel electrophoresis, PCR products are diluted and subjected to capillary electrophoresis. From the resulting electropherogram profiles, peaks representing each of the VNTR loci are size-called and employed for calculating VNTR repeat counts in silico. Resulting ten-digit MLVA profiles are then&#160;used to generate Minimum spanning trees enabling epizootiological evaluation by cluster analysis. The highly portable output data, in the form of numerical MLVA profiles, can rapidly be compared across labs and placed in a spatiotemporal context. The entire procedure from cultured colony to epizootiological evaluation may be completed for up to 48 Y. ruckeri isolates within a single working day.

Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis

The Multi-Locus Variable-number tandem-repeat Analysis (MLVA) assay presented here enables inexpensive, robust and portable high-resolution genotyping of the fish-pathogenic bacterium Yersinia ruckeri. Starting from pure cultures, the assay employs multiplex PCR and capillary electrophoresis to produce ten-loci MLVA profiles for downstream applications.

Multiplex PCR ve kapiller Elektroforez tarafından çok-Locus değişken-sayı tandem-balık tekrar Analizi-patojen Bakterium Yersinia ruckeri

Yersinia ruckeri is an important pathogen of farmed salmonids worldwide, but simple tools suitable for epizootiological investigations (infection tracing, ...

Identifying Per- and Polyfluorinated Chemical Species with a Combined Targeted and Non-Targeted-Screening High-Resolution Mass Spectrometry Workflow

Historical and emerging per- and polyfluoroalkyl substances (PFASs) have garnered significant interest from the public and government agencies from the local to federal levels. The continuing evolution of PFAS chemistries presents a challenge to the environmental monitoring, where ongoing development of targeted methods necessarily lags the discovery of new chemical compounds. There is a need, therefore, to have forward-looking methodologies that can detect emerging and unexpected compounds, monitor these species over time, and resolve details of their chemical structure to enable future work in human health. To this end, non-targeted analysis by high-resolution mass spectrometry offers a broad base detection approach that can be combined with almost any sample preparation scheme and provides significant capabilities for compound identification after detection. Herein, we describe a solid-phase extraction (SPE) based sample concentration method tuned for shorter chain and more hydrophilic PFAS chemistries, such as per fluorinated ether acids and sulfonates, and describe analysis of samples prepared in this fashion in both targeted and non-targeted modes. Targeted methods provide superior quantification when reference standards are available but are intrinsically limited to expected compounds when performing analysis. In contrast, a non-targeted approach can identify the presence of unexpected compounds and provide some information about their chemical structure. Information about chemical features can be used to correlate compounds across sample locations and track abundance and occurrence over time.

Here, we present a protocol for the sequential targeted quantification and non-targeted analysis of fluorinated compounds in water by mass spectrometry. This methodology provides quantitative levels of known fluorochemical compounds and identifies unknown chemicals in related samples with semi-quantitative estimates of their abundance.

Ücret belirlenmesi- ve Polyfluorinated kimyasal türler ile kombine hedef ve hedef tarama olmayan yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi iş akışı

Historical and emerging per- and polyfluoroalkyl substances (PFASs) have garnered significant interest from the public and government agencies from the ...

Development and Testing of Species-specific Quantitative PCR Assays for Environmental DNA Applications

New, non-invasive methods for detecting and monitoring species presence are being developed to aid in fisheries and wildlife conservation management. The use of environmental DNA (eDNA) samples for detecting macrobiota is one such group of methods that is rapidly becoming popular and being implemented in national management programs. Here we focus on the development of species-specific targeted assays for probe-based quantitative PCR (qPCR) applications. Using probe-based qPCR offers greater specificity than is possible with primers alone. Furthermore, the ability to quantify the amount of DNA in a sample can be useful in our understanding of the ecology of eDNA and the interpretation of eDNA detection patterns in the field. Careful consideration is needed in the development and testing of these assays to ensure the sensitivity and specificity of detecting the target species from an environmental sample. In this protocol we will delineate the steps needed to design and test probe-based assays for the detection of a target species; including creation of sequence databases, assay design, assay selection and optimization, testing assay performance, and field validation. Following these steps will help achieve an efficient, sensitive, and specific assay that can be used with confidence. We demonstrate this process with our assay designed for populations of the mucket (Actinonaias ligamentina), a freshwater mussel species found in the Clinch River, USA.

Environmental DNA assays require rigorous design, testing, optimization and validation before the collection of field data can begin. Here, we present a protocol to take users through each step of designing a species-specific, probe-based qPCR assay for the detection and quantification of a target species DNA from environmental samples.

ÇevreSEL DNA Uygulamaları için Türlere Özgü Nicel PCR Testlerinin Geliştirilmesi ve Testi

New, non-invasive methods for detecting and monitoring species presence are being developed to aid in fisheries and wildlife conservation management. The ...

DNA-based Fish Species Identification Protocol

We have developed a fast, simple, and accurate DNA-based screening method to identify the fish species present in fresh and processed seafood samples. This versatile method employs PCR amplification of genomic DNA extracted from fish samples, followed by restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis to generate fragment patterns that can be resolved on the Agilent 2100 Bioanalyzer and matched to the correct species using RFLP pattern matching software.
The fish identification method uses a simple, reliable, spin column- based protocol to isolate DNA from fish samples. The samples are treated with proteinase K to release the nucleic acids into solution. DNA is then isolated by suspending the sample in binding buffer and loading onto a micro- spin cup containing a silica- based fiber matrix. The nucleic acids in the sample bind to the fiber matrix. The immobilized nucleic acids are washed to remove contaminants, and total DNA is recovered in a final volume of 100 &mu;l. The isolated DNA is ready for PCR amplification with the provided primers that bind to sequences found in all fish genomes. The PCR products are then digested with three different restriction enzymes and resolved on the Agilent 2100 Bioanalyzer. The fragment lengths produced in the digestion reactions can be used to determine the species of fish from which the DNA sample was prepared, using the RFLP pattern matching software containing a database of experimentally- derived RFLP patterns from commercially relevant fish species.

This publication describes how to use the Agilent Fish Species Identification System to identify the species of a fish by extracting DNA and performing PCR and RFLP analysis.

DNA tabanlı Balık Türleri Tanımlama Protokolü

We have developed a fast, simple, and accurate DNA-based screening method to identify the fish species present in fresh and processed seafood samples. ...

Biyoloji

<meta charset="utf8"></head><body>Fentanil Analoglarını Taramak için LC ve TIMS-TOF MS/MS'nin Ortogonalliğinin Toplanması

Fentanyl Analog Screening using LC-TIMS-TOF MS/MS

The use of fentanyl and the emergence of fentanyl analogs over recent decades has become an increasing concern to the community at large. Fentanyl and its analogs are the major contributors to fatal and nonfatal overdoses in the United States. Most recent cases of fentanyl-related overdose are linked to illicitly manufactured fentanyl and its associated extreme potency. In the present work, we describe a high-throughput analytical protocol for the screening of fentanyl analogs. The use of complementary liquid chromatography, trapped ion mobility spectrometry, and tandem mass spectrometry allow for the separation and assignment of hundreds of fentanyl analogs from a single sample in a single scan. The described approach takes advantage of the recent development of data-dependent acquisition and data-independent acquisition using parallel accumulation in the mobility trap followed by sequential fragmentation using collision-induced dissociation. The fentanyl analogs are confidently assigned based on their retention time, mobility, and MS fragmentation pattern.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: Fentanil analoglarını güvenle ayırt etmek ve karakterize etmek için etkili bir metodoloji

A method for the screening of fentanyl analogs based on their retention time, mobility, and mass spectrometry fragmentation pattern.

LC-TIMS-TOF MS/MS kullanılarak Fentanil Analog Tarama

The use of fentanyl and the emergence of fentanyl analogs over recent decades has become an increasing concern to the community at large. Fentanyl and its ...

Sıvı Kromatografi / Kütle Spektrometresi zehirlidir pufferfish Geliştirilmiş Polimeraz Zincir Reaksiyonu-kısıtlama Parça Uzunluk Polimorfizmi Genotiplemesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Göl Alabalık PCB kongenerinin Net Trofik Transferi Etkinliklerinin Laboratuvarı Tahmini (

Derin Proteom izobarik etiketleme, kapsamlı sıvı Kromatografi, kütle spektrometresi ve yazılım destekli miktar tarafından profil oluşturma

Yüksek işlem hacmi DNA ekstraksiyon ve 3dpf zebra balığı larva Fin kırpma tarafından Genotipleme

Multiplex PCR ve kapiller Elektroforez tarafından çok-Locus değişken-sayı tandem-balık tekrar Analizi-patojen Bakterium Yersinia ruckeri

Ücret belirlenmesi- ve Polyfluorinated kimyasal türler ile kombine hedef ve hedef tarama olmayan yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi iş akışı

ÇevreSEL DNA Uygulamaları için Türlere Özgü Nicel PCR Testlerinin Geliştirilmesi ve Testi

DNA tabanlı Balık Türleri Tanımlama Protokolü

LC-TIMS-TOF MS/MS kullanılarak Fentanil Analog Tarama

LC-TIMS-TOF MS/MS kullanılarak Fentanil Analog Tarama

LC-TIMS-TOF MS/MS kullanılarak Fentanil Analog Tarama