Agilent Stratagene Ürünler Bölümü <ul><li> Harini Ravi </li><li> Natalia Novorodovskaya </li><li> Sağlam Basehore </li><li> Jeff Braman </li><li> Rachel Formosa </li><li> Ronda Allen </li><li> Rajesh Bagga </li><li> Derek Salonu </li><li> Sarah Jandle </li><li> Danielle Huffman </li></ul> Agilent Laboratuvarları <ul><li> Robert Kincaid </li><li> Mary McBride </li></ul> Agilent Avrupa <ul><li> Nigel Skinner </li><li> Jürgen Schneider </li><li> Stephen Mueller </li><li> Martin Kratzmeier </li></ul> Chipping BRI <ul><li> Steve Garrett </li></ul>

1: DNA Ekstraksiyon Balık Örnekleri hazırlayın <ol><li> Test edilecek her balık örnek için tek bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpe 10 mg ve 1 g (çiğ ya da pişmiş) arasında ağırlığında balık dokusunun bir parçası koyun. Aşağıdaki resimde örnek büyüklüğüne göre bir çiğ balık örneği ağırlığını tahmin etmek için bir kılavuz olarak kullanın. <img src="/files/ftp_upload/1871/1871fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Balık Örneklerinin Kitle Tahminleri Örneklem Büyüklüğü geçerli. </li><li> 65 Pre-sıcak Proteinaz K Sindirim Tampon ° C&#39;de bir inkübatör veya su banyosunda 5 dakika. </li><li> Proteinaz K Proteinaz K Sindirim Tampon ve Proteinaz K örnek başına 20 ul 200 ul birleştirerek bir çalışma çözeltisi hazırlayın. Not: Her kullanımdan önce Proteinaz K taze bir çalışma çözeltisi hazırlayın. </li><li> 220 balık örnek her 1.5 ml tüp Proteinaz K çözüm ul ekleyin. Tüpler 65 ° C&#39;de bir inkübatör veya su banyosunda 10 dakika. </li><li> Pelet herhangi bir sindirilmemiş dokuların xg 14.000 3 5 dakika için bir mikrosantrifüj tüpler Spin. </li><li> 1.5 ml taze bir tüpe her süpernatant 150 ul aktarın. Sindirilmemiş, tüp ya da tüpün üst kısmında görülebilir herhangi bir yağlı madde alt herhangi bir malzeme transferi kaçının. Süpernatant Bu borular örnekleri hangi genomik DNA çıkartılacaktır. </li></ol> 2: Genomik DNA ayıklayın <ol><li> Steril bir konteyner (polipropilen tüp ya da cam şişe),% 90 sulfolane 320 ul ve Nükleik Asit Bağlama Buffer numune başına 170 ul birleştirerek sulfolane ve Nükleik Asit Cilt Tampon çalışan bir solüsyon hazırlanır. Bu karışımı bir sonraki 4 hafta içinde incelemek için planladığınız gibi birçok örnekleri işlemek için yeterli miktarda hazırlamak isteyebilirsiniz. Bu karışım, oda sıcaklığında 30 gün kadar saklanabilir . Depolama sırasında karışımı ışığa maruz bırakmaktan kaçının. </li><li> Her balık örnek sulfolane / Ciltleme Tampon karışımı (Yukarıda 1. adımda hazırlanan) 490 ul ekleyin. Vortex veya pipetlemeyin homojenize kadar art arda örnek. Bu karışımı Ayrıca her numunenin toplam hacmi 640 ul getirecektir. </li><li> Her numune, 2 ml priz tüp içinde oturan (sağlanan) ve spin fincan üstüne tüpün kapağı ek bileşenini bir DNA Cilt Spin Kupası aktarın. </li><li> Spin fincan matris üzerine DNA yüklemek için 1 dakika 14.000 xg&#39;de için mikrosantrifüj örnekleri Spin. </li><li> Çıkarın ve korumak spin bardak ve filtratlar atın. Her bir örnek için, priz tüp spin bardak yerine, daha sonra 500 1x Yüksek Tuz Yıkama Tamponu ul ekleyin ve tüp kap. </li><li> 1 dakika 14.000 xg&#39;de mikrosantrifüj örnekleri Spin. </li><li> Çıkarın ve korumak spin bardak ve filtratlar atın. Her bir örnek için, priz tüp spin bardak yerine, daha sonra% 80 etanol 500 ul eklemek ve tüp kap. </li><li> 1 dakika 14.000 xg&#39;de mikrosantrifüj örnekleri Spin. </li><li> 500 ul% 80 etanol ile toplam 3 yıkama için adım 7 ve 8 iki kez daha tekrarlayın. </li><li> % 80 etanol içinde üçüncü bir yıkamadan sonra, kaldırmak ve spin bardak korumak ve filtratlar atın . Priz tüpler spin bardak değiştirin ve kuru fiber matris 14.000 xg&#39;de 2 dakika boyunca mikrosantrifüj döndürün. </li><li> 1.5-m1 toplama tüpleri spin bardak aktarın. 100 ul Elüsyon Tampon her spin fincan fincan içinde doğrudan fiber matris üzerine ekleyin. Toplama tüplerin kapakları spin bardak üzerine çekin ve 1 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> 1 dakika boyunca maksimum hızda bir mikrosantrifüj örnekleri Spin. </li><li> Saflaştırılmış DNA mikrosantrifüj tüp Elüsyon Tampon. Spin fincan atın ve tüpler kap. DNA, bir ay kadar 4 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. Uzun süreli depolama için, DNA saklamak 20 ° C veya 80 ° C. </li><li> İsterseniz, bir spektrofotometre, DNA örneklerinin konsantrasyonu ölçmek. </li></ol> Genomik DNA ekstraksiyonu protokolü genellikle 5 ng / ul 500 ng / ml arasında değişen bir konsantrasyon ile örnek verir. PCR-RFLP protokolü DNA örnekleri ile 0.05 ng / ul ng / ml 2000 yılına kadar her yerde değişen kuyulardan çalışır. 3: PCR Reaksiyonlar ayarlayın <ol><li> DNA stoku 8 ul steril, DNaz-su 32 ul ile birleştirerek bir pozitif kontrol somon DNA 50 ng / ul seyreltme hazırlayın. Karıştırmak için Vortex. Seyreltilmiş numune 4 ° C &#39;de ileride kullanmak üzere saklanabilir. </li><li> Sırasına göre aşağıdaki tabloda bileşenleri birleştirerek reaksiyonlar hazırlayın. Belirtilen miktarlar kadar ölçekleme tarafından aynı anda çalıştırmak olacaktır PCR reaksiyonları için tek bir reaktif karışımı hazırlayıntablosu. Test DNA örnekleri yanı sıra, pozitif bir kontrol reaksiyonu ve herhangi bir şablon kontrol reaksiyon içerir. Yinelenen PCR reaksiyonları her test DNA örneği için hazırlanması tavsiye edilir. Tüm reaksiyon artı bir reaksiyon hacim fazlalığı için yeterli reaktif karışımı hazırlayın. 5 test DNA örnekleri varsa test reaksiyonlarının çiftleri dahil Örneğin, 8 reaksiyon (5 test reaksiyonlarının, 1 pozitif kontrol, 1 no-şablon kontrolü, ve 1 fazla) veya 13 reaksiyonlar için yeterli reaktif karışımı hazırlamak (10 yinelenen test reaksiyonlar, 1 pozitif kontrol, 1 no-şablon kontrolü ve 1 fazla). PCR Reaktif Karışımı <table border="1"><tbody><tr><td> Bileşen </td><td> Volume 1 Reaksiyon </td><td> Cilt 5 Reaksiyonlar </td></tr><tr><td> dH 2 O, steril </td><td> 9 ul </td><td> 45 ul </td></tr><tr><td> 2x PCR Master Mix </td><td> 12.5 ul </td><td> 62.5 ul </td></tr><tr><td> Primer Mix </td><td> 2.5 ul </td><td> 12.5 ul </td></tr><tr><td> Toplam hacim </td><td> 24 ul </td><td> 120 ul </td></tr></tbody></table></li><li> Vorteks reaktif karışımı, daha sonra her bir ince duvarlı PCR reaksiyon tüpü 24 ul dağıtmak. </li><li> 1 ul sulandırılmış pozitif kontrol DNA pozitif kontrol reaksiyon tüpüne ekleyin. Test örneği tüplere, test DNA örneği 1 ul ekleyin. No-şablon kontrol reaksiyon için, DNA yerine 1 ul DNaz ücretsiz su ekleyin. Çapraz bulaşmayı önlemek için, her DNA örneği için taze bir pipetlemeyin ucu kullanın. Örnek ekledikten sonra, tüpün içeriğini hızlı bir şekilde yukarı ve aşağı pipetleme reaksiyon karışımı. </li><li> Tüpler kısaca karıştırılır ve santrifüjlenir reaksiyon tüpleri, vorteks tüpleri Cap. </li></ol> 4: PCR Protokolü çalıştırın <ol><li> Termal cycler reaksiyonlar yerleştirin ve aşağıda gösterilen PCR programı çalıştırın. PCR Bisiklete binme Protokolü <table border="1"><tbody><tr><td> Bölüm </td><td> Çevrimleri sayısı </td><td> Sıcaklık </td><td> Süre </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 95 ° C </td><td> 5 dakika </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 40 </td><td> 95 ° C 50 ° C 72 ° C </td><td> 30 saniye 30 saniye 30 saniye </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 1 </td><td> 72 ° C </td><td> 7 dakika </td></tr></tbody></table></li></ol> 5: Enzimler Kısıtlama Digest PCR Ürünler <ol><li> Etiket 0.5 ml tüp ya da kısıtlama sindirmek reaksiyonlar için kullanılmak üzere 0.2 ml şerit tüpler. DdeI, HaeIII ve NlaIII: Her PCR reaksiyon üç farklı restriksiyon enzimleri ile sindirilir. Bu nedenle, her PCR reaksiyonu, PCR örnek adı ve restriksiyon enzimi adı ile üç ayrı tüpler etiketi. </li><li> Amacıyla aşağıdaki parçaları birleştirerek DdeI sindirimler için reaktif karışımı hazırlayın. Katları kullanarak her bir bileşenin tüm DdeI sindirim reaksiyonları (artı en az bir reaksiyon hacmi fazla) için tek bir reaktif karışımı hazırlayın. PCR işlemi tamamlandıktan sonra, PCR reaksiyonları, RFLP (RFLP) analizi için restriksiyon enzimleri ile tedavi edilir. DdeI Sindirim Reaktif Karışımı <table border="1"><tbody><tr><td> Bileşen </td><td> Hacim </td></tr><tr><td> dH 2 O, steril </td><td> 1.5 ul </td></tr><tr><td> 10x DdeI Tampon </td><td> 0.5 ul </td></tr><tr><td> 10x DdeI enzim </td><td> 0.5 ul </td></tr></tbody></table></li><li> Vortex reaktif karışımı, daha sonra bireysel reaksiyon tüpleri DdeI için etiketli 2.5 ul dağıtmak. </li><li> Amacıyla aşağıdaki parçaları birleştirerek HaeIII sindirimler için reaktif karışımı hazırlayın. Katları kullanarak her bir bileşenin tüm HaeIII sindirim reaksiyonları (artı en az bir reaksiyon hacmi fazla) için tek bir reaktif karışımı hazırlayın. HaeIII Sindirim Reaktif Karışımı <table border="1"><tbody><tr><td> Bileşen </td><td> Hacim </td></tr><tr><td> dH 2 O, steril </td><td> 1.5 ul </td></tr><tr><td> 10x HaeIII Tampon </td><td> 0.5 ul </td></tr><tr><td> 10x HaeIII enzim </td><td> 0.5 ul </td></tr></tbody></table></li><li> Vortex reaktif karışımı, daha sonra bireysel reaksiyon tüpleri HaeIII için etiketli 2.5 ul dağıtmak. </li><li> Reaktif karışımı hazırlayın.Amacıyla aşağıdaki parçaları birleştirerek NlaIII sindirimler her bileşen katları kullanarak tüm NlaIII sindirim reaksiyonları (artı en az bir reaksiyon hacmi fazla) için tek bir reaktif karışımı hazırlayın. NlaIII Sindirim Reaktif Karışımı <table border="1"><tbody><tr><td> Bileşen </td><td> Hacim </td></tr><tr><td> dH 2 O, steril </td><td> 1.5 ul </td></tr><tr><td> 10x NlaIII Tampon </td><td> 0.5 ul </td></tr><tr><td> 10x NlaIII enzim </td><td> 0.5 ul </td></tr></tbody></table></li><li> Vortex reaktif karışımı, daha sonra bireysel reaksiyon tüpleri NlaIII için etiketli 2.5 ul dağıtmak. </li><li> Her sindirim tepki için, etiketli tüpler için uygun PCR ürününün 2.5 ul ekleyin. Tüm test PCR reaksiyonlarının yanı sıra pozitif kontrol reaksiyon üç restriksiyon enzimleri ile sindirilir gerekir. </li><li> Vorteks sindirim reaksiyonları ve ardından kısa bir süre tüpler santrifüj. </li><li> 37 ° C&#39;de 2 saat boyunca tüm sindirim reaksiyonları inkübe edin. Bu inkübasyon termal cycler yapılabilir. İsterseniz, reaksiyonlar 37 ° C gece bırakılabilir. </li><li> 65 ° C&#39;de 15 dakika süreyle reaksiyonlar aktarın. Bu adım, termal cycler yapılabilir. </li><li> Her reaksiyon ve vorteks 60 mM EDTA (kit ile birlikte verilen) 1 ul ekleyin. </li></ol> 6: kısıtlama sindirmek desen analiz <ol><li> Jel boya karışımı hazırlayın, DNA çip çip emişli istasyonu yer ve DNA çip üzerine karışımı yük. </li><li> Pipetleyin 5 merdiven sembolü olan ve her birinin içine çip üzerinde 12 örnek kuyuların işaretlenmiş içine DNA marker ul. DNA göstergesi yeşil kapaklı bir tüp içerisinde DNA 1000 Reaktif Kiti içinde sağlanır . </li><li> Iyi bir merdiven sembolü ile işaretlenmiş içine DNA merdiveni pipetleyin 1 ul. DNA merdiveni, sarı-kapaklı bir tüp içerisinde DNA 1000 Reaktif Kiti sağlanmaktadır. </li><li> DNA örneklerinin her biri için, aşağıdaki şekilde yönergelere göre çip üzerinde 12 örnek kuyulardan biri haline her bir kısıtlama sindirimi reaksiyon pipetlemeyin 1 ul. Bu yaklaşımı kullanarak, kuyular 1-3, pozitif kontrol örneği için 3 sindirim reaksiyonlar için, kuyular 4-6 test örneği 2 3 sindirim reaksiyonlar için test örneği 1, 7-9 kuyuları için 3 sindirim reaksiyonlar için, ve test örneği, sindirim sırasında üretilen parçası uzunlukları belirlemek için Agilent 2100 Bioanalyzer üzerinde kısıtlama sindirimi reaksiyonlar 3.Analyze 3 sindirim reaksiyonlar için kuyular 10-12. Agilent DNA 1000 Kit Rehberi Bioanalyzer laboratuar yongaları çalıştırmak için tam talimatlar vardır. Kısa bir protokol rahatınız için aşağıda verilmiştir. <img src="/files/ftp_upload/1871/1871fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. Çip üzerinde Örnekleri Örgütü. Kullanılmayan kuyu içine az 4 DNA örnekleri, su pipetlemeyin 1 ul varsa. 4 DNA örnekleri daha fazla varsa, birden fazla çip çalıştırmanız gerekecektir. Her çip üzerinde pozitif kontrol örneği çalıştırmak için gerekli olduğunu unutmayın. </li><li> 2400 devirde 60 saniye IKA vorteks karıştırıcı ve vorteks adaptör çip yatay yerleştirin. </li><li> Agilent 2100 Bioanalyzer içine çip takın ve çip çalıştırmak başlatmak. Aracı kapsamında gelen ham sinyalleri görüntülenir. Vadede bittikten sonra, zirveleri tepe ayarları bulmak algoritma kullanarak tüm örnekler için tanımlanır. Algoritma, gerçek bir zirve algılamak için başarısız oldu düşünüyorsanız, algoritma pik tanımlamanıza olanak sağlar bir değer Yükseklik Eşik set düşürebilir . </li><li> Testi bağlamda gidin ve Chip Özet sekmesini seçin. Örnek Adı alanında, aşağıdaki şekilde gösterildiği gibi, çip üzerinde tüm 12 kuyu için bir örnek adı girin. <img src="/files/ftp_upload/1871/1871fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. Chip Özet Tab Adı Entry örnek. </li></ol> 7: RFLP Maçlar kullanarak test örneği türlerin tanımlanması Agilent yazılımı uygulama RFLP Decoder sindirim reaksiyonlarda üretilen parçası uzunlukları dayalı test DNA örnekleri için balık türlerini tanımlamak için kullanılır. Pozitif Kontrol Kısıtlama Enzim Beklenen Ürün Boyutu (bp) DdeI 117 Tablo 7 Beklenen DNA Fragment Boyutları , 332, 340 HaeIII 40, 105, 333 NlaIII 459 talimatları burada sağlanan RFLP Maçlar varsayılan analiz ayarları kullanabilirsiniz. Yazılım işletim ve ekran yorumlama hakkında ayrıntılı bilgi için yazılım yardım sistemi bakın. <ol><li> RFLP Decoder programı başlatın. </li><li> Dosya&gt; Aç&gt; Dosya XAD tıklayın. Aç iletişim kutusu will açmak. </li><li> Restriksiyon sindirimi reaksiyonlar dahil DNA çip için XAD dosyayı seçin. Aç seçeneğini tıklatın. Çip üzerinde yüklenen örnekleri listeleyen bir iletişim kutusu açılacaktır. </li><li> Bir DNA örneği karşılık gelen üç sindirim reaksiyonlar seçin ve açılan Enzim sütununun altında menüleri kullanarak her bir örnek için uygun bir restriksiyon enzimi belirtin. Aşağıdaki şekilde, Enzim sütun, DNA Sample 1 doldurulacak olmuştur. <img src="/files/ftp_upload/1871/1871fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4. Her Sample Kısıtlama Enzim belirtme. </li><li> Düşük marker &quot;% min pik yüksekliği etiketli alanında, varsayılan değeri% 10.0. Gerekirse, kaçırılan küçük doruklarına tanımlamak için bu değer indirdi ya da non-spesifik gürültü kaynaklanan doruklarına atmak için kaldırdı olabilir Elektroferogram. min pik yüksekliği değeri için herhangi bir ayarlama yaptıktan sonra Yeniden Entegre tıklayın. <img src="/files/ftp_upload/1871/1871fig5.jpg" alt="Şekil 5" /> Şekil 5. Asgari tepe yüksekliği atama. </li><li> Kireç iletişim kutusunun altındaki tıklayın. Bioanalyzer vadede elde edilen parça uzunluk verileri yazılım alanları doldurmak. </li><li> Ekranın sol üst köşesindeki skor açılan listesinde, veri analizi için uygun bir algoritma seçin . Analiz edilen balık numunesi tek bir balık türü oluşuyorsa puanı açılan listesinde Zar (Nei Li) seçin. Karışım seçin örnekleri türlerinin bir karışımı oluşabilir. Ekranın alt kısmında tablo etiketli kombine skoru her üç sindirim reaksiyonlar sonuçlarına göre en iyi türlerin eşleşen listeler. Türün adının yanı sıra ortak adı (aşağıya bakın) tabloda yer almaktadır. Mükemmel maçları (1 puan ile) yeşil vurgulanır. Sarı vurgulanır eşleşir yakın olarak kabul edilir. Bu türler için FishBase web sayfası getirmek için bir tür adı üzerine çift tıklatın. <img src="/files/ftp_upload/1871/1871fig6.jpg" alt="Şekil 6" /> Şekil 6. Türlerin tanımlanması Sindirim dayanarak. </li><li> Ekranın üst kısmında alt kesim ve maç tolerans alanları, en iyi türlerin maçın skorunu geliştirmek için varsayılan ayarları. Düşük kesme değeri alanında belirlenen uzunluğundan daha kısa olan herhangi bir parçaları atmak için kullanılır . Maç tolerans değeri bir parçası uzunluğu dikkate alınması gereken bir maç tahmin parçası ne kadar yakın olmalıdır belirler. </li><li> Bu aynı yonga üzerinde alındı, geri kalan DNA örnekleri için 4 ile 8 arasındaki adımları tekrarlayın. </li></ol> 8: Temsilcilik Sonuçları: 4 farklı balık türlerinin kısıtlama sindirimi örnekleri ile bir Bioanlyzer jel bir görüntü aşağıdaki şekilde gösterilmiştir. Pozitif DNA örneği için beklenen sonuçlar aşağıdaki tabloda özetlenmiştir. <img src="/files/ftp_upload/1871/1871fig7.jpg" alt="Şekil 7" /> Şekil 7. Kısıtlama sindirmek reaksiyon örnekleri Bioanalyzer jel görüntüsü. Her jel şeritli bu tepki olarak kullanılan restriksiyon enzimi ile etiketlenir. Somon Pozitif Kontrol Beklenen DNA Fragment Boyutları <img src="/files/ftp_upload/1871/1871fig8.jpg" alt="Şekil 8" /> Şekil 8. Somon Pozitif Kontrol Beklenen DNA Fragment Boyutları.

<ol>
	<li>Dooley, J. J., Sage, H. D., Brown, H. M., Garrett, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+fish+species+identification+by+use+of+lab-on-a-chip+technology.">Improved fish species identification by use of lab-on-a-chip technology.</a> Food Control. 16 (7), 601-607 (2004).</li><li>Dooley, J. J., Sage, H. D., Clarke, M. -. A. L., Brown, H. M., Garrett, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fish+species+Identification+Using+PCR-RFLP+Analysis+and+Lab-on-a-Chip+Capillary+Electrophoresis:+Application+to+Detect+White+Fish+Species+in+Food+Products+and+an+Interlaboratory+Study.">Fish species Identification Using PCR-RFLP Analysis and Lab-on-a-Chip Capillary Electrophoresis: Application to Detect White Fish Species in Food Products and an Interlaboratory Study.</a> J. Agric. Food Chem. 53, 3348-3357 (2005).</li><li>Dooley, J., Garrett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+PCR-RFLP+Profiles+for+Fish+Species+Using+the+Agilent+2100+Bioanalyzer.">Determination of PCR-RFLP Profiles for Fish Species Using the Agilent 2100 Bioanalyzer.</a> Agilent Technologies Application Note. , (2005).</li><li>Dooley, J. J., Clarke, M. L., Sage, H. D., Brown, H. M., Garrett, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+chip-based+capillary+electrophoresis+system+to+enable+simple+PCR-RFLP+identification+of+fish+species.">Application of a chip-based capillary electrophoresis system to enable simple PCR-RFLP identification of fish species.</a> FSA Final Report Q01069. , (2004).</li></ol>

Yazarlar, bu yazıda kullanılan reaktifler ve aletleri üreten Agilent Technologies tarafından istihdam edilmektedir.

Biz deniz ürünleri balık türlerinin belirlenmesi için DNA tabanlı, basit, hızlı ve doğru bir tarama yöntemi göstermektedir. Bu güçlü yöntem az bir iş günü içinde tekrarlanabilir ve kesin sonuçlar sağlar ve aerodinamik protokolleri ve basit kurulum nedeniyle ticari test tesislerinde uygulanabilir. Deneysel olarak elde edilen balık türleri profilleri genişletilebilir bir veritabanı ile RFLP Dekoder yazılımı kullanılarak analiz nesnel veri üretimi ile karakterizedir. Rutin uygulanması ile, bu test yöntemi, deniz ürünleri mislabeling önlemek ve hükümet düzenlemelerine uyum için uygun doğru kayıtlarının tutulması yardımcı potansiyeline sahiptir.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Agilent 2100 Bioanalyzer (with chip priming station and IKA vortex mixer)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent</td>
<td>G2939AA</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Agilent 2100 Bioanalyzer laptop &amp; Expert Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent</td>
<td>G2953CA</td>
<td>G2950CA - desktop PC &amp; Expert Software</td>
</tr>
<tr>
<td>Agilent Bioanalyzer DNA 1000 Reagent Kit (part #5067-1504)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent</td>
<td>5067-1504</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Thermal Cycler</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various</td>
<td>Various</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PCR Strip Tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent</td>
<td>401428</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PCR Strip Caps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent</td>
<td>401425</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>96-Well Working Rack</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent</td>
<td>410094</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fish Species Identification System DNA Isolation Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent</td>
<td>Contact</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fish Species Identification System PCR-RFLP Reagent Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent</td>
<td>Contact</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RFLP Matcher Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent</td>
<td>Contact</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100% ethanol, 200 proof (USP grade or equivalent)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various</td>
<td>Various</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sterile, nuclease-free water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various</td>
<td>Various</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pipettors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various</td>
<td>Various</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Incubator or water bath set to 65&deg;C</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various</td>
<td>Various</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sterile glass bottle or polypropylene tube (e.g. 14-ml BD Falcon polypropylene)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various</td>
<td>Various</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>round-bottom tubes or 50-ml BD Falcon polypropylene conical tubes)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various</td>
<td>Various</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vortex mixer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various</td>
<td>Various</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microcentrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various</td>
<td>Various</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microcentrifuge tubes 1.5ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various</td>
<td>Various</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tube rack 1.5ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various</td>
<td>Various</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pipette Tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various</td>
<td>Various</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

dna-based fish species identification protocol

Biz, taze ve işlenmiş deniz ürünleri örnekleri mevcut balık türleri belirlemek için DNA tabanlı, hızlı, basit ve doğru bir tarama yöntemi geliştirdik. Bu çok yönlü bir yöntem Agilent 2100 Bioanalyzer giderilmiş ve RFLP desen eşleştirme yazılımı kullanarak doğru türe uygun olabilir parçasının kalıplarını üretmek için RFLP (RFLP) analizi takip balık numunelerinde çıkarılan genomik DNA, PCR kullanmaktadır. Balık tanımlama yöntemi balık örneklerinden DNA izole etmek için basit, güvenilir, spin kolon tabanlı protokol kullanır. Örnekleri çözüm içine nükleik asitlerin serbest proteinaz K ile tedavi edilir. Sonra bağlayıcı tampon örnek askıya alınması ve silika bazlı bir fiber matris içeren bir mikro-spin fincan üzerine yükleme DNA izole edilmiştir. Fiber matris örnek bağlama nükleik asitler. Immobilize nükleik asitler kirleri çıkarmak için yıkanır ve toplam nihai hacmi 100 ul DNA kurtarılır. İzole edilen DNA, tüm balıklar genomlarındaki bulundu dizileri bağlamak sağlanan primerleri ile PCR için hazır. PCR ürünleri daha sonra üç farklı restriksiyon enzimleri ile sindirilir ve Agilent 2100 Bioanalyzer çözümlenir. Sindirim reaksiyonlarda üretilen parçası uzunlukları ticari ilgili balık türlerinin deneysel olarak elde edilen RFLP desenler içeren bir veritabanı yazılımı ile eşleşen RFLP desen kullanarak, DNA örneği hazırlanan balık türlerini belirlemek için kullanılabilir.

Watch this Scientific Journal Video about DNA-based Fish Species Identification Protocol at JoVE.com

DNA-based Fish Species Identification Protocol

Bu yayın Agilent Balık Türleri Tanımlama Sistemi, DNA ayıklanması ve, PCR ve RFLP analizi yapan bir balık türü tanımlamak için nasıl kullanılacağı açıklanmıştır.

DNA tabanlı Balık Türleri Tanımlama Protokolü

We have developed a fast, simple, and accurate DNA-based screening method to identify the fish species present in fresh and processed seafood samples. ...

dna-based-fish-species-identification-protocol

Research

JoVE Journal

Biology

29.3K Görüntüleme.  Agilent Technologies. Bu yayın Agilent Balık Türleri Tanımlama Sistemi, DNA ayıklanması ve, PCR ve RFLP analizi yapan bir balık türü tanımlamak için nasıl kullanılacağı açıklanmıştır.

Video: DNA-based Fish Species Identification Protocol

Neutrophil Isolation Protocol

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory immune response. Due to their key role in inflammation, neutrophil functions such as locomotion, cytokine production, phagocytosis, and tumor cell combat are extensively studied. To characterize the specific functions of neutrophils, a clean, fast, and reliable method of separating them from other blood cells is desirable for in vitro studies, especially since neutrophils are short-lived and should be used within 2-4 hours of collection. Here, we demonstrate a standard density gradient separation method to isolate human neutrophils from whole blood using commercially available separation media that is a mixture of sodium metrizoate and Dextran 500. The procedure consists of layering whole blood over the density gradient medium, centrifugation, separation of neutrophil layer, and lysis of residual erythrocytes. Cells are then washed, counted, and resuspended in buffer to desired concentration. When performed correctly, this method has been shown to yield samples of >95% neutrophils with >95% viability.

Neutrophils are among the first cells to arrive on the site of inflammatory immune response, and their functions and mechanisms have been studied extensively in vitro. We demonstrate a standard density gradient separation method to isolate human neutrophils from whole blood using commercially available separation media.

Nötrofil İzolasyon Protokolü

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory ...

Biyoloji

Non-radioactive in situ Hybridization Protocol Applicable for Norway Spruce and a Range of Plant Species

The high-throughput expression analysis technologies available today give scientists an overflow of expression profiles but their resolution in terms of tissue specific expression is limited because of problems in dissecting individual tissues. Expression data needs to be confirmed and complemented with expression patterns using e.g. in situ hybridization, a technique used to localize cell specific mRNA expression. The in situ hybridization method is laborious, time-consuming and often requires extensive optimization depending on species and tissue. In situ experiments are relatively more difficult to perform in woody species such as the conifer Norway spruce (Picea abies). Here we present a modified DIG in situ hybridization protocol, which is fast and applicable on a wide range of plant species including P. abies. With just a few adjustments, including altered RNase treatment and proteinase K concentration, we could use the protocol to study tissue specific expression of homologous genes in male reproductive organs of one gymnosperm and two angiosperm species; P. abies, Arabidopsis thaliana and Brassica napus. The protocol worked equally well for the species and genes studied. AtAP3 and BnAP3 were observed in second and third whorl floral organs in A. thaliana and B. napus and DAL13 in microsporophylls of male cones from P. abies. For P. abies the proteinase K concentration, used to permeablize the tissues, had to be increased to 3 g/ml instead of 1 g/ml, possibly due to more compact tissues and higher levels of phenolics and polysaccharides. For all species the RNase treatment was removed due to reduced signal strength without a corresponding increase in specificity. By comparing tissue specific expression patterns of homologous genes from both flowering plants and a coniferous tree we demonstrate that the DIG in situ protocol presented here, with only minute adjustments, can be applied to a wide range of plant species. Hence, the protocol avoids both extensive species specific optimization and the laborious use of radioactively labeled probes in favor of DIG labeled probes. We have chosen to illustrate the technically demanding steps of the protocol in our film.
Anna Karlgren and Jenny Carlsson contributed equally to this study.
Corresponding authors: Anna Karlgren at Anna.Karlgren@ebc.uu.se and Jens F. Sundstr&#246;m at Jens.Sundstrom@vbsg.slu.se

Non-radioactive in situ Hybridization Protocol Applicable for Norway Spruce and a Range of Plant Species

We describe a modified DIG in situ hybridization protocol, which is fast and applicable on a wide range of plant species including Norway spruce. With just a few adjustments, including altered RNase treatment and proteinase K concentration, the protocol may be used in studies of different tissues and species.

Radyoaktif olmayan In situ Hibridizasyon Norveç Ladin Uygulanacak Protokol ve Bitki Türlerinin Aralığı

The high-throughput expression analysis technologies available today give scientists an overflow of expression profiles but their resolution in terms of ...

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

Floresan In situ İnsan Sperm hibridizasyon (FISH) Protokolü

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using noninvasive sampling techniques to investigate population genetics and demography of wild populations1. This approach has proven to be especially useful when dealing with rare or elusive species2. While a number of these methods have been developed to sample hair, feces and other biological material from carnivores and medium-sized mammals, they have largely remained untested in elusive small mammals. In this video, we present a novel, inexpensive and noninvasive hair snare targeted at an elusive small mammal, the American pika (Ochotona princeps). We describe the general set-up of the hair snare, which consists of strips of packing tape arranged in a web-like fashion and placed along travelling routes in the pikas&#x2019; habitat. We illustrate the efficiency of the snare at collecting a large quantity of hair that can then be collected and brought back to the lab. We then demonstrate the use of the DNA IQ system (Promega) to isolate DNA and showcase the utility of this method to amplify commonly used molecular markers including nuclear microsatellites, amplified fragment length polymorphisms (AFLPs), mitochondrial sequences (800bp) as well as a molecular sexing marker. Overall, we demonstrate the utility of this novel noninvasive hair snare as a sampling technique for wildlife population biologists. We anticipate that this approach will be applicable to a variety of small mammals, opening up areas of investigation within natural populations, while minimizing impact to study organisms.

We present a noninvasive sampling approach to efficiently collect hair samples from elusive small mammals, as shown for the American pika. We demonstrate the utility of this method by extracting DNA from sampled hair and amplifying several types of molecular markers commonly used in studies of wildlife ecology and conservation.

Elusive Küçük Memeliler Yüksek Kalite DNA Edinme Noninvaziv Saç Örnekleme Tekniği

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

Dayanarak protein-protein etkileşimleri ve kimliği için bir protokol<sup&gt; 15</sup&gt; K Metabolik Etiketleme, immünopresipitasyon, Kantitatif Kütle Spektrometrisi ve Affinity Modülasyon

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases Alzheimer's disease (A&beta;, tau), Parkinson's Disease (&alpha;-synuclein), Huntington's disease (polyglutamine, huntingtin), and others. Protein aggregation is thought to occur due to disturbed proteostasis, i.e. the imbalance between the arising and degradation of misfolded proteins. Of note, the same proteins are found aggregated in sporadic forms of these diseases that are mutant in rare variants of familial forms.
Schizophrenia is a chronic progressive brain condition that in many cases goes along with a permanent and irreversible cognitive deficit. In a candidate gene approach, we investigated whether Disrupted-in-schizophrenia 1 (DISC1), a gene cloned in a Scottish family with linkage to chronic mental disease1, 2, could be found as insoluble aggregates in the brain of sporadic cases of schizophrenia3. Using the SMRI CC, we identified in approximately 20 % of cases with CMD but not normal controls or patients with neurodegenerative diseases sarkosyl-insoluble DISC1 immunoreactivity after biochemical fractionation. Subsequent studies in vitro revealed that the aggregation propensity of DISC1 was influenced by disease-associated polymorphism S704C4, and that DISC1 aggresomes generated in vitro were cell-invasive5, similar to what had been shown for A&beta;6, tau7-9, &alpha;-synuclein10, polyglutamine11, or SOD1 aggregates12. These findings prompted us to propose that at least a subset of cases with CMD, those with aggregated DISC1 might be protein conformational disorders.
 Here we describe how we generate DISC1 aggresomes in mammalian cells, purify them on a sucrose gradient and use them for cell-invasiveness studies. Similarly, we describe how we generate an exclusively multimeric C-terminal DISC1 fragment, label and purify it for cell invasiveness studies. Using the recombinant multimers of DISC1 we achieve similar cell invasiveness as for a similarly labeled synthetic &alpha;-synuclein fragment. We also show that this fragment is taken up in vivo when stereotactically injected into the brain of recipient animals.

The generation, purification and cell invasion of intracellular, cytoplasmic full length DISC1 protein aggresomes from cell cultures and of a labeled, multimeric recombinant DISC1 protein fragment in E. coli are described. Cell invasiveness is shown for recipient cells in cell culture and for neurons in vivo after stereotactical brain inoculation.

Hücre-invaziv DISC1 Protein Türlerinin Üretimi, Saflaştırılması, ve Karakterizasyonu

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases ...

Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate bacterial strains and detect genetic mutations that confer resistance to anti-microbial agents. The advantages of pyrosequencing for microbiology applications include rapid and reliable high-throughput screening and accurate identification of microbes and microbial genome mutations. Pyrosequencing involves sequencing of DNA by synthesizing the complementary strand a single base at a time, while determining the specific nucleotide being incorporated during the synthesis reaction. The reaction occurs on immobilized single stranded template DNA where the four deoxyribonucleotides (dNTP) are added sequentially and the unincorporated dNTPs are enzymatically degraded before addition of the next dNTP to the synthesis reaction. Detection of the specific base incorporated into the template is monitored by generation of chemiluminescent signals. The order of dNTPs that produce the chemiluminescent signals determines the DNA sequence of the template. The real-time sequencing capability of pyrosequencing technology enables rapid microbial identification in a single assay. In addition, the pyrosequencing instrument, can analyze the full genetic diversity of anti-microbial drug resistance, including typing of SNPs, point mutations, insertions, and deletions, as well as quantification of multiple gene copies that may occur in some anti-microbial resistance patterns.

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate bacterial strains, and detect genetic mutations that confer resistance to anti-microbial agents. In this video, the procedure for microbial amplicon generation, amplicon pyrosequencing, and DNA sequence analysis will be demonstrated.

Mikrobiyal Tanımlama ve Karakterizasyonu için Pyrosequencing

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

3D DNA FISH has become a major tool for analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations of the technique have been published. In this article we describe a protocol which has been optimized for robustness, reproducibility, and ease of use. Brightly fluorescent directly labeled probes are generated by nick-translation with amino-allyldUTP followed by chemical coupling of the dye. 3D DNA FISH is performed using a freeze-thaw step for cell permeabilization and a heating step for simultaneous denaturation of probe and nuclear DNA. The protocol is applicable to a range of cell types and a variety of probes (BACs, plasmids, fosmids, or Whole Chromosome Paints) and allows for high-throughput automated imaging. With this method we routinely investigate nuclear localization of up to three chromosomal regions.

We describe a robust and versatile protocol for analyzing nuclear architecture by 3D DNA FISH using directly labeled fluorescent probes.

Doğrudan Etiketli Problar kullanarak Sağlam 3D DNA BALIK

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to the histological and morphological development of vertebrate embryos. In particular, the use of chimeric embryos has established the importance of neural crest in directing the species-specific morphology of the craniofacial complex. The method described herein utilizes two avian species, duck and quail, with remarkably different craniofacial morphology. This method greatly facilitates the investigation of molecular and cellular regulation of species-specific pattern in the craniofacial complex.&#160;Experiments in quail and duck chimeric embryos have already revealed neural crest-mediated tissue interactions and cell-autonomous behaviors that regulate species-specific pattern in the craniofacial skeleton, musculature, and integument. The great diversity of neural crest derivatives suggests significant potential for future applications of the quail-duck chimeric system to understanding vertebrate development, disease, and evolution.

This article describes a method to generate chimeric embryos that are&#160;designed to test the species-specific contributions of neural crest and/or other tissues to craniofacial development.

Bıldırcın-ördek Chimeras kullanma Kraniyofasiyal Kalkınma için Türlere özgü Katılımlar değerlendirilmesi

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to ...

Fish Sperm Assessment Using Software and Cooling Devices

For gamete quality evaluation, there are innovative, rapid, and quantitative techniques that can provide useful data for aquaculture. Computerized systems for sperm analysis were developed to measure several parameters and one of the most commonly measured is the sperm motility.
Initially, this computer technology was designed for mammalian species, although it can also be used for fish sperm analysis. Fish have specific features that can affect sperm assessment such as a short motility time after activation and, in some cases, adaptation to lower temperatures. Thus, it is necessary to modify both software and hardware components to make motility analysis more efficient for fish sperm analysis. For mammalian sperm, the heating plate is used to maintain optimal temperatures of spermatozoa. However, for some fish species, it is advantageous to use a lower temperature to prolong the duration of motility, since the sperm remain active for less than 2 min. Therefore, cooling devices are necessary to refrigerate samples at constant temperature over the time of analysis, including on the optical microscope. This protocol describes the analysis of fish sperm motility using software for sperm analysis and new cooling devices to optimize the results.

The present protocol describes a procedure of fish sperm assessment using computer-assisted sperm analysis and cooling devices. The software gives a rapid, accurate and quantitative analysis of fish sperm quality based on spermatozoa motility, which can be a useful tool in aquaculture to improve reproduction success.

Yazılımı kullanarak ve soğutma aygıtlarının balık Sperm değerlendirmesi

For gamete quality evaluation, there are innovative, rapid, and quantitative techniques that can provide useful data for aquaculture. Computerized systems ...