yazının eleştirel okuma Dr. Benedikt Steuten özel teşekkürler. kitinazlarve orijinal eser Dr. Thorsten Langner tarafından yürütülmüştür. VG laboratuvar Bitki Bilimleri Mükemmellik (CEPLAS, DFG EXC 1028) ve BioSC ve Cluster tarafından desteklenen, KS laboratuvar BioSC tarafından desteklenmektedir. KB BioSC tarafından desteklenmektedir. Bioeconomy Bilim Merkezi (BioSC) bilimsel faaliyetleri maddi NRW Strategieprojekt BioSC (No 313 / 323-400-00213) çerçevesinde Yenilik, Bilim ve Araştırma Bakanlığı tarafından desteklendi. LF DFG Uluslararası Araştırma Eğitim Grubu 1525 iGRADplant bir doktora burs tarafından desteklenmektedir.

Silinti yapılan, 1. Üretim <ol><li> Ilgili bir 1 kb yukan kanadını (UF) ve alt kanadı (DF), her ve keskin kesme kısıtlama sahaları ile çevrili, uygun direnç kasedi içeren silinmesi yapısı (Şekil 1) ihtiva eden bir plasmid oluşturur. NOT: Herhangi bir klonlama stratejisi bu tür plazmidler 9 Golden Gate klonlama tavsiye (klonlama için referans 22) kullanılabilir. </li><li> Silme 9 inşa silme 1 ug DNA elde etmek için bir künt kesici kullanılarak plazmid gelen inşa tüketim. Enzim ortadan kaldırmak ve ticari reaktifler kullanılarak 22 örneğin tampon ve üreticinin talimatlarına uyun için silme yapı arındırın. NOT: vektör omurga dönüşüm karışımı kalabilir. </li></ol> Protoplast 2. Hazırlık NOT: e tüm zamanlarda steril koşullar tutunXperiment. Hücre duvarı plazma zarına moleküllerin erişimi sınırlayan güçlü bir koruyucu engeldir. Silme yapısını içeren DNA alımını sağlamak için, hücre çeperi, bir protoplasting reaksiyonunda bozundurucu enzimler, hücre duvarı ile kaldırılması gerekir. protoplast hazırlanmasında kritik adımlar ortamın 1) ozmotik stabilizasyon ve 2) protoplastlar mekanik stres kaçınarak. <ol><li> Mark 2 protoplast dondurmak ve -20 ° C&#39;de onları soğumasını yuvarlak dipli ml&#39;lik tüpler. arzu edilen genetik kökenli soyunun taze plakadan 3 ml YEPS-Light bir ön kültür başlatın. 28 ° C&#39;de 24 saat boyunca dönen bir tekerlek üzerinde inkübe edin. NOT: zorlanma solopathogenic gerilme SG200 10, yabanıl tip suşları gibi AB33 23, ya da çift mutantların nesil için herhangi bir mutant arka plan olarak test suşları olabilir. suşu istenilen direnç serbest olduğundan emin olun. </li><li> Bir şaşkın flas 50 ml YEPS-Light kültür seyreltink ve 200 rpm&#39;de 28 ° C&#39;de bir orbital çalkalayıcı üzerinde inkübe edin. NOT: katlama zaman vahşi tipli suşları için yaklaşık 2 saattir. Üç duplikasyonlar az bekleyin. </li><li> üstel faz kadar büyütün. (1.0 olarak kabul edilebilir olan 0.6) 600 nm&#39;de (OD600) arasında bir dalga boyunda ölçülen optik yoğunluk, yaklaşık 0.8 olduğundan emin olun. OD 1.0 600 1 U. 7 10 ila 2 x tekabül ml başına hücreler maydis. </li><li> Bir mikroskop altında kirlenme hücreleri kontrol edin. 40x büyütme kullanın. 5 dakika, 1.500 xg için tam 50 ml kültür hücreleri Pelet ve supernatant atın. 25 ml sodyum sitrat, sorbitol çözeltisi (SCS), santrifüj 5 dakika, 1.500 xg pelletini tekrar ve supernatant atın. Not: Bakteriyel kirlilikler, küçük ve çoğu zaman hareket eden hücreler olarak tespit edilebilir. Mantar kontaminasyonlar U. sigara şeklinde hücrelere göre farklı bir hücre şekil ya da boyutta göre tespit edilebilir maydis. </li><li> cen sırasındatrifugation protoplasting solüsyon hazırlanır (12.5 mg / ml, Trichoderma SCS enzimler, lize hücre pelet başına 3 ml hazırlanması, filtre 22 um&#39;lik bir filtreden steril, çözelti, uygun enzimatik aktivitesi için taze olmalıdır). SCS hücre duvarının kaldırılması üzerine protoplast delinmesine engel olmak için bir ozmotik dengeleyicidir. </li><li> çözelti protoplasting 2 ml pelletini. Oda sıcaklığında 5 ila 20 dakika süreyle inkübe ve hücrelerin 30 ila 40% yuvarlak veya iğne topuzlarında gibi (Şekil 2) kadar mikroskop altında kontrol edin. NOT: Bundan sonra buz üzerinde tüm adımları uygulayın ve dikkatle protoplast ele! </li><li> 10 ml soğuk (4 ° C) SCS yıkayın 3x, 5 dakika boyunca 1000 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Süpernatan atılır, 5 dakika boyunca 1000 x g&#39;de soğuk sorbitol TrisHCl, CaCl2 çözeltisi (STC) sıkma 10 ml pelletini. , 1 ml soğuk STC pelletini tekrar soğutulmuş tüplerde 100 ul alikotları olun. sonraki kullanıma kadar -80 ° C&#39;de alikot dondurun.</li></ol> U. 3. dönüştürülmesi maydis Not: U. dönüşümü maydis protoplastlar teknik olarak basit ve özel ekipman gerektirmez elektroporasyon ya biolistik transformasyon karşı olan polietilen glikol (PEG) aracılı dönüştürme yöntemi, dayanır. <ol><li> İki katmanlı seçme plakaları (transformasyon reaksiyon başına 2 levha) hazırlayın. buradaki alt kat, kat konsantrasyonda antibiyotik içerir. 400 ug / ml higromisin içeren RegLight pipetleyin 12 mi (ya da 300 ug / ml nourseothricin veya 4 ug / ml karboksin ya da 1 mg / ml G418), bir Petri kutusu içine. kabarcıkları kaçının. Not: Taban tabaka levhaları (aşağıya bakınız), 4 ° C de bir kaç gün saklanan ama dönüşümü sırasında taze üst tabaka hazırlamak olabilir. </li><li> buz üzerinde çözülme protoplastlar (1 tüp / transformasyon). 1 ul heparin (15 mg / ml) eklenir. 1 ug DNA (doğrusallaştırılmış yapı) ya da 10 ul H 2 Ekle </sub&gt; O (su kontrolü). Buz üzerinde 10 dakika süreyle inkübe edin. </li><li> Bu süre boyunca üst tabaka için RegLight taban plakası üzerine (60 ° C kaynama ve serin) RegLight sıvılaştırılmış 12 ml yayıldı. NOT: Bu katman antibiyotik içermez. </li><li> dönüşüm tüp (3. 2) 500 ul STC / PEG (polietilen glikol) ekleyin ve tersini tüp dikkatlice karıştırın. Buz üzerinde 15 dakika kuluçkalayın. </li><li> İki tabakalı RegLight plakaların ikisinin her dönüşüm reaksiyonu dağıtın. . Bir cam pipet ile dikkatlice ve yavaşça yayılır transformantlar koloniler olarak büyümeye kadar 5 ila 7 gün süreyle 28 ° C&#39;de dik inkübe edin. plaka başına yaklaşık 100-200 koloniler elde edin. NOT: Düşük sayılar ya çok fazla hücre duvarını içeren ve bu nedenle DNA&#39;yı alamaz ya da yeniden edemez &quot;kötü&quot; protoplastlar neden olabilir. Eski kendi kendini kopyalayan bir plazmid, antibiyotikler olmadan plakalar üzerine rejenerasyonu test ederek ikinci ile dönüştürme ile test edilebilir. </li> &lt;li&gt; / ml higromisin 200 ug uygun antibiyotiği içeren YEPS Işık tabak hazırlayın (ya da 150 ug / ml nourseothricin ya da 2 ug / ml karboksin veya 500 ug / ml G418, bu konsantrasyonlar alt plakalar için kullanılan bir eşit yarısı). Bu plakalar üzerinde en az 24 varsayılan transformant koloniler yeniden arındırmak. Tek tek koloniler elde edilmelidir. seçici olmayan medya üzerinde orijinal zorlanma dışarı Aynı zamanda çizgi at. Not: Plakalar 1-2 hafta boyunca 4 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol> Doğru Silme Olaylar 4. Doğrulama Not: mutasyonlar üç aşamalı bir prosedürde doğrulanır (Şekil 1). İlk olarak, genin vahşi tip kopyasını içeren adaylar PCR ile dışlanır. İkinci olarak, lokusuna direnç kasetinin entegre PCR ile doğrulanır. Üçüncü olarak, sadece arzu edilen lokusuna direnç kasetinin entegre Southern blot analizi ile doğrulanmıştır. Dikkatli gerilme doğrulama esse olduğununtial mutant fenotip gerçekten silinmesi ile ilişkili böylece. <ol><li> İlk Teşhis PCR 20 <ol><li> Geninde tasarım primerler eşleştirme 250-600 bp (Şekil 1) sahip bir ürün ile sonuçlanan silinir. Böyle küçük ürünler bir koloni PCR yükseltmek kolay ve standart jel elektroforezinde tespiti için yeterince uzun olan. </li><li> Her aday ve bir pozitif kontrol olarak, orijinal suşu için, 20 ul 0.02 M NaOH içinde bir kürdan ile tek bir koloni hücre malzemesinin biraz (bir toplu iğne başı miktarı) yeniden süspanse edin. 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. NOT: Taze koloniler kullanın. Plakalar 1 hafta yeniden çizgi daha eski ise yeni bir koloni elde etmek. </li><li> Hemen PCR için hücre süspansiyonu 1 ul kullanın. Standart bir PCR reaksiyonu ve elde edilen fragmanlar analiz eder. NOT: Bu örnekler saklanamaz. Not: bu şekilde Bu PCR vahşi tipli geninin varlığı için test negatif cand hızla belirlenmesini sağlarilgi gen yerini henüz hangi idates. Bu PCR reaksiyonunda bantlar elde klonlar atılır. Bu tür bir negatif klon yine ek bir negatif kontrol olarak birlikte gerçekleştirilmelidir. Bir PCR ürünü olmayan adaylar daha analiz edilmesi gerekir. diğer yarısı bir bant neden olmamalıdır ise zarar vermeden gen adaylarından yaklaşık olarak yarısı, vahşi tipli genini içermelidir. Bu,% 50 homolog bir rekombinasyon oranına karşılık gelir. </li></ol></li><li> İkinci teşhissel PCR <ol><li> Genomik DNA hazırlanması. Not: Genomik DNA (gDNA), iki farklı protokolü kullanarak hazırlanabilir. İlk fenol ve kloroform ve dolayısıyla, sadece ikinci de 4.2 4.2.1.6 açıklanan az deneyimli öğrenciler (tarafından ele alınabilir ise (4.2.1.5 için 4.2.1.1 anlatılmıştır) deneyimli araştırmacılar tarafından ele alınmalıdır gibi toksik reaktif içerir. 1.11). Her iki protokol güvenilir çalışıyoruz. Aşama 4.2.1.1 iki protoc için aynıdırols. <ol><li> her bir aday ile 5 mi YEPS Işık inoküle ve 28 ° C&#39;de 24 saat boyunca dönen bir tekerlek üzerinde inkübe edin. Bir CM plaka üzerinde kültürün 2 ul bırakın. Steril kültür tutun. NOT: Aşağıdaki standart protokolü (: toksik adımlar DİKKAT) &#39;dir. </li><li> 2 ml tüpler için 1 kepçe HCI yıkanmış cam boncuklar (~ 200 ul) yerleştirin. U. 2 ml ilave edilir maydis kültürü. 5 dakika boyunca 12.000 xg Spin. (Pelet, bu aşamada dondurulabilir) süpernatant atılır. (: 24: 1, 25) pelet 500 ul fenol / kloroform / izoamilalkol ekleyin. DİKKAT! PHENOL ZEHİRLİ IS! </li><li> 1000 rpm&#39;de bir Vibrax 500 ul Usti-lisis tampon 6 dakika 10 1. çalkalayın ekleyin. Hücre topağı tamamen yeniden süspanse olduğundan emin olun, ama gDNA ve kesme önlemek için sallayarak genişletilmiş kaçının. 15 dakika boyunca 12.000 xg&#39;de Spin. Yeni reaksiyon tüpüne sulu fazın 400 ul aktarın (interfaz dokunmayın). </li><li> 1 mi, 100% (v / v) etanol ekleyin. c gözlemlemek, mix tüp 3x haricindekilerikısa bir süre görünen DNA&#39;nın yüksek sesle. 5 dakika boyunca 12.000 xg&#39;de Spin. Süpernatantı ve 200 ul% 70 EtOH ile yıkayın. Bu aşamada pelletini etmeyin. </li><li> (Pelet tamamen kurumasını izin vermeyin) tamamen süpernatantı. 50 ul TE / RNAaz ari ekleyin. 10 dakika boyunca 50 ° C&#39;de 400 rpm&#39;de çalkalanarak gDNA&#39;sından eritin. % 0.8 agaroz jeli 20 gDNA 2 ul analiz edin. Not: Aşağıdaki adımlar, alternatif bir toksik-olmayan protokol içermektedir. </li></ol></li><li> Genomik DNA Alternatif Hazırlanması <ol><li> HCI 2 ml tüpler cam boncuk yıkanmış 1 kepçe (~ 200 ul) yerleştirin. U. 2 ml ilave edilir 5 dakika boyunca 12.000 xg&#39;de maydis kültür ve spin. (Granüller bu aşamada dondurulabilir) süpernatant atın. </li><li> pelet 500 ul liziz tamponu Usti 2 ekleyin. 1000 rpm&#39;de bir Vibrax ile 5 ila 15 dakika boyunca çalkalayın. Hücre topağı tamamen yeniden süspanse olduğundan emin olun. </li><li> 15 ila 20 dakika boyunca, 65 ° C&#39;de inkübe edin. beğenme kullanma2 ml tüpler barındırmak için tasarlanmış zemelerle kuluçka önemlidir. Daha sonra, 5 dakika buz üzerine yerleştirin. </li><li> 100 ul 8 M potasyum asetat, vorteks ekleyin ya da 8 ila 10 kez ters çevirin. Oda sıcaklığında 15 dakika için 12,000 xg dönerler. </li><li> Aktarım 500 yeni bir 1.5 ml&#39;lik tübe süpernatan ul 400 ul izopropanol ekleyin. Vortex veya invert 8 ila 10 kat. 15 dakika için 12,000 xg dönerler. Süpernatantı ve 500 ul% 70 EtOH ile yıkayın. 5 dakika boyunca 12.000 xg Spin. </li><li> tamamen süpernatant emmek! Sonuç olarak, artık sıvıyı ortadan kaldırmak için kısa bir sıkma (10 sn) ekleyin. 3 ila 5 dakika süreyle DNA pelet kurumasını bekleyin. 50 ul TE / RNAaz ekleyin ve 400 rpm hızda 10 dakika 15 için 50 ° C&#39;de inkübe edin. </li></ol></li><li> PCR <ol><li> Tasarım bunlardan biri (UF-f, RC-R, RC-f DF-R, Şekil 1) dış yan yüzleri dışında bağlanması ve direnç kaseti içinde bağlayıcı bir karşılık gelen iki primer çiftleri 9. </li><li> Her c gDNA 1:10 seyreltmesinin 1 ul kullanınandidate 2 PCR reaksiyonlarında şablon olarak yukarı ve aşağı doğru 9 doğru takılmasını teyit etti. </li><li> Her bir aday için standart PCR reaksiyonları kullanın ve parçaları 22 sonuçlanan analiz eder. NOT: Bu PCR doğru genomik direnç kasetinin eklenmesi için test edin. ürünler her iki taraf için elde edildiği takdirde, adayın doğru yerleştirilmesidir. Bununla birlikte, (alt yukan ya da) sadece bir tarafı teyit edilebilir da aday PCR reaksiyonları sadece tek bir kanat için başarısız olması durumunda, daha fazla analiz için birlikte gerçekleştirilmelidir. </li></ol></li></ol></li><li> Southern Blot Analizi 22 tarafından doğru Genomik Takma doğrulanması <ol><li> geninde veya açıkça dist yol açan direnç kaseti ya keser, inşa ve ek olarak / lokus dışında keser uygun bir enzim ile 15 mutant adayların gDNA ul (4.2.1) ve ilgili wild tip / progenitör gerginlik Digestinguishable desenler (Şekil 1) 8. NOT: sindirilmemiş DNA açıkça ayırdedilebilmektedir böylece, beklenen şeritleri hiçbiri, daha büyük olan 10 kb olmalıdır. </li><li> kaynak tarafı ve sondalar olarak aşağı kanadını kullanın. örnek PCR DIG etiketleme Kit veya benzeri bir standart yöntemi kullanmak için onları etiketlemek için. 1 etiketli problar karıştırın: 1 moleküler oranına ve Güney leke yürütmek. en az iki bağımsız doğru transformantları tutun. NOT: Vahşi tipli model orijinal zorlanma açıkça tespit olmalı ve doğru klonlar sadece beklenen bantları içermelidir. adayların sadece mevcut ek bantları yanlış lokusunda yapının diğer eklemeleri göstermektedir. Bu gibi klonlar atılmalıdır. İlk tanı PCR tanımlanan olumsuz aday yanlış entegre silme yapısının wild tip bantları ve (boyut olarak öngörülemeyen) bantlar içermelidir. </li></ol></li><li> gliserol stokları NOT: Gliserol stokları Strain collections&#39;da yıllardır klonlar muhafaza ederler. en azından iki bağımsız transformant, her mutant için tutulmalıdır. Bu aynı olmalıdır karşılaştırarak fenotipi sağlar. <ol><li> 500 ul NSY-gliserin-ortamı her kültür 28 ° C Karışım 500 ul 24 saat süre ile dönen bir tekerlek üzerinde YEPS-Light teyit mutant 5 ml kültür büyütün. Kültür ve orta iyice karıştırılır kadar Tüpü ters çevirin. ortam içinde gliserol, buz kristallerinin oluşmasını önler. </li><li> -80 ° C&#39;de dondurun. stok fonksiyonel olup olmadığını yeniden çizgi dondurulmuş kültürünün bir parçası test etmek. </li></ol></li></ol> 5. Mikroskobik fenotipler <ol><li> 28 ° C&#39;de 12 saat boyunca dönen bir tekerlek üzerinde YEPS-Işık vahşi tip ve mutant 5 ml kültür büyütün. </li><li> Ertesi gün, yaklaşık 0.1 OD 600 kültür sulandırarak 0.5 ve 0.7 arasında bir OD 600 kadar büyümek. 1.0 Nominal değerden uygun bir OD 600İlik yaklaşık 1 7 10 x 2 U. ml başına hücreler maydis. </li><li> mikroskobik hücre morfolojisi kontrol edin. NOT: Sağlıklı hücreler puro biçimli (Şekil 4, WT) görünür. Seslendirilmiş vakuoller veya filament oluşum hücreleri vurguladı olduğunu göstermektedir. Not: haberci soylarının Uygun tahlil bu aşamada gerçekleştirilebilir kullanıldığında beklenen mutant fenotipinin bağlı olarak, analiz, örneğin, adapte edilebilir. Hücre morfolojisi değişti istatistiksel analiz yapılmalıdır ise, örneğin, ortalama hücre uzunluğunu belirlemek için. </li></ol> 6. Enfeksiyon Deneyi NOT: fide enfeksiyon tahlil bu dergide 11 daha önce görüntülenmiştir edilmiştir. Bu Ya örneğin SG200 10 veya her iki mutasyonu taşıyan uyumlu geçme karışım eşleri, bir haploid, solopathogenic suş zemini kullanılarak gerçekleştirilebilir. <ol><li> başına en az 40 mısır fideleri büyütün16 saat, 200 μE / 22 ° C (gündüz / gece) 28 ° C&#39;lik bir ışık döngüsü 7 gün boyunca soyu. Bu 3-yaprak aşamalı ve 10-15 cm enfeksiyonun gün boyunda olmalıdır. </li><li> Enfeksiyondan iki gün önce, 28 ° C&#39;de 24 saat boyunca dönen bir tekerlek üzerinde, 5 ml YEPS ışıkta suşlarının kültür öncesi başlar. YEPS Işık 600 = 1.0 OD 50 ml bir ana kültür büyütün (hücre bölünmesi oranı = 2 ila 3 saat bölümler en az izin O / N yapılabilir). </li><li> 5 dakika boyunca 1.500 xg&#39;de 50 ml kültür hücreleri aşağı Spin ve süpernatant atın. Steril H 2 O ile yıkayın 3x OD 3,0 600 steril H 2 O hücreleri tekrar süspansiyon. Gerekirse, çiftleşme ortakları karıştırın. </li><li> küçük bir şırınga ile 7 gün eski mısır fidelerinin kök içine hücre süspansiyonları 500 ul - 250 enjekte edilir. Bir kontrol olarak steril H 2 O kullanın. aynı ışık ve ısı koşullarında, ek 7-14 gün boyunca enfekte fide tutun. Her bitki a fenotip PuanSağlıklı, kloroz, antosiyanin oluşumu, küçük tümörler, büyük tümörler, ölü bitki 10 şeklinizi ona göre. NOT: Puanlama gibi erken 7 gün olarak yapılır ve zamanla enfeksiyon takip 14 gün tekrar edilebilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Dean, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Top+10+fungal+pathogens+in+molecular+plant+pathology.">The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology.</a> Molecular Plant Pathology. 13, 414-430 (2012).</li><li>Vollmeister, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+development+of+the+plant+pathogen+Ustilago+maydis.">Fungal development of the plant pathogen Ustilago maydis.</a> Fems Microbiol Rev. 36, 59-77 (2012).</li><li>Banuett, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ustilago+maydis,+the+delightful+blight.">Ustilago maydis, the delightful blight.</a> Trends in Genetics. 8, 174-180 (1992).</li><li>Holloman, W. K., Schirawski, J., Holliday, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+homologous+recombination+system+of+Ustilago+maydis.">The homologous recombination system of Ustilago maydis.</a> Fungal Genetics and Biology. 45, S31-S39 (2008).</li><li>Feldbr&#252;gge, M., K&#228;mper, J., Steinberg, G., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mating+and+pathogenic+development+in+Ustilago+maydis.">Regulation of mating and pathogenic development in Ustilago maydis.</a> Current Opinion in Microbiology. 7, 666-672 (2004).</li><li>&#214;kmen, B., Doehlemann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inside+plant:+Biotrophic+strategies+to+modulate+host+immunity+and+metabolism.">Inside plant: Biotrophic strategies to modulate host immunity and metabolism.</a> Current Opinion in Plant Biology. 20, 19-25 (2014).</li><li>Brachmann, A., K&#246;nig, J., Julius, C., Feldbr&#252;gge, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reverse+genetic+approach+for+generating+gene+replacement+mutants+in+Ustilago+maydis.">A reverse genetic approach for generating gene replacement mutants in Ustilago maydis.</a> Molecular Genetics and Genomics. 272, 216-226 (2004).</li><li>K&#228;mper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PCR-based+system+for+highly+efficient+generation+of+gene+replacement+mutants+in+Ustilago+maydis.">A PCR-based system for highly efficient generation of gene replacement mutants in Ustilago maydis.</a> Molecular Genetics and Genomics. 271, 103-110 (2004).</li><li>Terfr&#252;chte, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+a+versatile+Golden+Gate+cloning+system+for+genetic+engineering+in+fungi.">Establishing a versatile Golden Gate cloning system for genetic engineering in fungi.</a> Fungal Genetics and Biology. 62, 1-10 (2014).</li><li>K&#228;mper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+from+the+genome+of+the+biotrophic+fungal+plant+pathogen+Ustilago+maydis.">Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis.</a> Nature. 444, 97-101 (2006).</li><li>Chavan, S., Smith, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rapid+and+Efficient+Method+for+Assessing+Pathogenicity+of+Ustilago+maydis+on+Maize+and+Teosinte+Lines.">A Rapid and Efficient Method for Assessing Pathogenicity of Ustilago maydis on Maize and Teosinte Lines.</a> Journal of Visualized Experiments. (83), e50712 (2014).</li><li>Khrunyk, Y., M&#252;nch, K., Schipper, K., Lupas, A. N., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+FLP-mediated+recombination+for+the+functional+analysis+of+an+effector+gene+family+in+the+biotrophic+smut+fungus+Ustilago+maydis.">The use of FLP-mediated recombination for the functional analysis of an effector gene family in the biotrophic smut fungus Ustilago maydis.</a> New Phytologist. 187, 957-968 (2010).</li><li>van Peer, A. F., de Bekker, C., Vinck, A., W&#246;sten, H. A. B., Lugones, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phleomycin+Increases+Transformation+Efficiency+and+Promotes+Single+Integrations+in+Schizophyllum+commune.">Phleomycin Increases Transformation Efficiency and Promotes Single Integrations in Schizophyllum commune.</a> Appl Environ Microb. 75, 1243-1247 (2009).</li><li>Sarkari, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+expression+of+single-chain+antibodies+in+Ustilago+maydis.">Improved expression of single-chain antibodies in Ustilago maydis.</a> Journal of Biotechnology. 191, 165-175 (2014).</li><li>Schirawski, J., Heinze, B., Wagenknecht, M., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mating+type+loci+of+Sporisorium+reilianum:+Novel+pattern+with+three+a+and+multiple+b+specificities.">Mating type loci of Sporisorium reilianum: Novel pattern with three a and multiple b specificities.</a> Eukaryotic Cell. 4, 1317-1327 (2005).</li><li>Cervantes-Chavez, J. A., Ali, S., Bakkeren, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+to+Environmental+Stresses,+Cell-wall+Integrity,+and+Virulence+Are+Orchestrated+Through+the+Calcineurin+Pathway+in+Ustilago+hordei.">Response to Environmental Stresses, Cell-wall Integrity, and Virulence Are Orchestrated Through the Calcineurin Pathway in Ustilago hordei.</a> Mol Plant Microbe In. 24, 219-232 (2011).</li><li>Yu, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+genetic+manipulation+protocol+for+Ustilago+esculenta.">An efficient genetic manipulation protocol for Ustilago esculenta.</a> FEMS Microbiology Letters. 362, (2015).</li><li>Ninomiya, Y., Suzuki, K., Ishii, C., Inoue, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+gene+replacements+in+Neurospora+strains+deficient+for+nonhomologous+end-joining.">Highly efficient gene replacements in Neurospora strains deficient for nonhomologous end-joining.</a> P Natl Acad Sci USA. 101, 12248-12253 (2004).</li><li>Colot, H. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+gene+knockout+procedure+for+Neurospora+reveals+functions+for+multiple+transcription+factors.">A high-throughput gene knockout procedure for Neurospora reveals functions for multiple transcription factors.</a> P Natl Acad Sci USA. 103, 10352-10357 (2006).</li><li>Langner, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitinases+Are+Essential+for+Cell+Separation+in+Ustilago+maydis.">Chitinases Are Essential for Cell Separation in Ustilago maydis.</a> Eukaryot Cell. 14, 846-857 (2015).</li><li>Langner, T., G&#246;hre, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+chitinases:+function,+regulation,+and+potential+roles+in+plant/pathogen+interactions.">Fungal chitinases: function, regulation, and potential roles in plant/pathogen interactions.</a> Current Genetics. , (2015).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloining: a laboratry manual. , (1989).</li><li>Brachmann, A., Weinzierl, G., K&#228;mper, J., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+in+the+bW/bE+regulatory+cascade+in+Ustilago+maydis.">Identification of genes in the bW/bE regulatory cascade in Ustilago maydis.</a> Molecular Microbiology. 42, 1047-1063 (2001).</li><li>Becht, P., Vollmeister, E., Feldbr&#252;gge, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+RNA-binding+proteins+implicated+in+pathogenic+development+of+Ustilago+maydis.">Role for RNA-binding proteins implicated in pathogenic development of Ustilago maydis.</a> Eukaryotic Cell. 4, 121-133 (2005).</li><li>Vollmeister, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+KH+domains+of+Khd4+recognize+AUACCC+and+are+essential+for+regulation+of+morphology+as+well+as+pathogenicity+in+Ustilago+maydis.">Tandem KH domains of Khd4 recognize AUACCC and are essential for regulation of morphology as well as pathogenicity in Ustilago maydis.</a> RNA. 15, 2206-2218 (2009).</li><li>Stock, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+unconventional+secretion+of+the+endochitinase+Cts1+to+export+heterologous+proteins+in+Ustilago+maydis.">Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis.</a> Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).</li><li>Baumann, S., Pohlmann, T., Jungbluth, M., Brachmann, A., Feldbr&#252;gge, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-3+and+dynein+mediate+microtubule-dependent+co-transport+of+mRNPs+and+endosomes.">Kinesin-3 and dynein mediate microtubule-dependent co-transport of mRNPs and endosomes.</a> Journal of Cell Science. 125, 2740-2752 (2012).</li><li>Pohlmann, T., Baumann, S., Haag, C., Albrecht, M., Feldbr&#252;gge, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FYVE+zinc+finger+domain+protein+specifically+links+mRNA+transport+to+endosome+trafficking.">A FYVE zinc finger domain protein specifically links mRNA transport to endosome trafficking.</a> eLife. 4, (2015).</li><li>Kronstad, J. W., Leong, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+two+Alleles+of+the+b-Locus+of+Ustilago.">Isolation of two Alleles of the b-Locus of Ustilago.</a> P Natl Acad Sci USA. 86, 978-982 (1989).</li><li>Koepke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA-binding+protein+Rrm4+is+essential+for+efficient+secretion+of+endochitinase+Cts1.">The RNA-binding protein Rrm4 is essential for efficient secretion of endochitinase Cts1.</a> Molecular &amp; cellular proteomics. 10, (2011).</li><li>Schuler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hxt1,+a+monosaccharide+transporter+and+sensor+required+for+virulence+of+the+maize+pathogen+Ustilago+maydis.">Hxt1, a monosaccharide transporter and sensor required for virulence of the maize pathogen Ustilago maydis.</a> New Phytologist 206. , 1086-1100 (2015).</li><li>Schuster, M., Schweizer, G., Reissmann, S., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+in+Ustilago+maydis+using+the+CRISPR-Cas+system.">Genome editing in Ustilago maydis using the CRISPR-Cas system.</a> Fungal Genetics and Biology. , (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bu protokol U ters genetik çalışmalar için silme mutantlar oluşturmak açıklamaktadır maydis. Başlangıç noktası bir önceki 7,9 optimize gen-faiz 1 başlangıç yukan ve durdurma kodonundan aşağı doğru kb olarak uygun bir direnç kaseti sekanslarını ihtiva eden kuşatıcı sekanslar içeren bir silme konstruktu olup . yapıları tek tek her gen için oluşturulan ve dikkatle geni silmeden önce dizi hatalar için doğrulanacak var. dış yan yüzleri komşu gen içine ulaşm...

Ustilago maydis yıllardır 1,2 yoğun çalışılmıştır bir fitopatojenik bir model mantardır. Bu iki morfoloji, bir maya gibi, patojenik olmayan aşamasında ve filamentli, enfeksiyöz bir şekilde 3 bulunmaktadır. Örneğin homolog rekombinasyon ve DNA tamir mekanizmaları gibi evrensel atılım bulgu, bu mantar 4 maya benzeri büyüme aşamasında yapılmıştır. Ayrıca, enfeksiyon için önemli bir enfeksiyon filament ve hastalık oluşturma faktörlerinin morfolojik anahtarı 5,6, iyi karakterize edilmiştir. Bu kurum mantar biyoloji ve virülans hakkında artan moleküler bilgi mükemmel bir genom açıklama 10 ve kullanılarak ters genetik kolaylığı, örneğin, bizim enstitüsünde iyi organize plazmid toplama (http tarafından desteklenen basit bir gen değiştirme stratejisi 7-9 dayanır : //www.mikrobiologie.hhu.de/ustilago-community.html). mısır s standartlaştırılmış, hızlı enfeksiyon deneylerieedlings patojenite detaylı çalışmalar 11 faktörleri tanır. U. genomu maydis yaklaşık 6.900 gen 10 içerir. onların işlevini incelemek için, onlar nedeniyle etkin bir homolog rekombinasyon sistemi tek başına veya birlikte silinebilir. Mükemmel homolog uçlarını ihtiva eden yaklaşık 1 kb&#39;lik yanında bulunan bölgeler% 50&#39;den daha büyük, homolog rekombinasyon oranları için idealdir, ama homolog olmayan uç ile daha önce 250 bp yapının 9 doğru entegrasyon bir dereceye kadar izin verir. Şu anda, beş farklı direnç kaseti, higromisin, karboksin, nourseothricin, G418 ve fleomisin karşı direnç aracılık hygR, cbxR, NATR, G418R ve phleoR, transformantların 7,9 seçmek için kullanılır. Buna ek olarak, higromisin direnci, heterolog bir FLP yeniden bağlayıcı 12 geçici ifade ile çıkarılabilir geri dönüşümlü bir kaset (STT-hygR) olarak geliştirilmiştir. Bu direnç kasetin ve böylece teori sınırsız genetik modifikasyon olarak kaldırılmasını sağlar. Fleomisin yeni kasetler ile, geri dönüşümlü hygR kaseti, özellikle phleoR kullanımı azalmaktadır, böylece 13 mutajen. Dörtlü mutantlar, böylece, diğer dört kasetleri kullanılarak üretilebilir, ancak beşli mutantlar için, FRT-hygR sistemi 14 önerilir. Bu genel gen silme stratejisi başarıyla gibi Sporisorium reilianum 15, U. gibi diğer karalamak mantarlara devredilmiştir hordei 16 veya A.B.D. esculenta 17 ve bu nedenle verimli bir homolog rekombinasyon sistemi ile henüz genetik dirençli organizmaların daha fazla uygulamalar için potansiyel sunmaktadır. yer alan genlerin silinmesi ile örneklendiği gibi Ayrıca, homolog yeniden birleştirmeye yoksun organizmaların genetik mühendisliği geliştirmek için modifiye edilebilir homolog olmayan-enD-katılmadan Neurospora crassa 18,19 yılında. Burada U. için yayınlanan gen silme stratejisini açıklamak adayların hızlı ve doğru doğrulama odaklanarak deneysel detaylı 7,9 Maydis&#39;in. Bir örnek olarak, mantar şitinaz Tek ve mutantların üretilmesinden oluşmaktadır ve birden fazla silme 20,21 suşları tasvir etmektedir. Onlar sert hücre duvarında kitin üzerinde hareket çünkü kitinazlarve ilginç örneklerdir. Hücre duvarı yeniden şekillenme hücre bölünmesi sırasında morfolojik değişiklikler için gerekli olan, ipliksi büyüme ve spor oluşumuna geçin. Dolayısıyla, silme mutantlar süresi boyunca fenotipleri beklenebilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1138">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Aminobenzoeic acid (Free Acid)</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">A-9878</td>
			<td style="width:485px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacto Agar&#160;</td>
			<td style="width:183px;">BD</td>
			<td style="width:124px;">214010</td>
			<td>alternatively use local supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacto Peptone</td>
			<td style="width:183px;">BD</td>
			<td style="width:124px;">211677</td>
			<td>alternatively use local supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacto Yeast Extract&#160;</td>
			<td style="width:183px;">BD</td>
			<td style="width:124px;">212750</td>
			<td>alternatively use local supplier</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">CaCl2*2H2O</td>
			<td style="width:183px;">Gr&#252;ssing GmbH</td>
			<td style="width:124px;">10234</td>
			<td>alternatively use local supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Ca-pantothenat (Hemi-Ca. salt)</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">P-2250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Carboxin&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">45371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Casamino acids&#160;</td>
			<td style="width:183px;">BD</td>
			<td style="width:124px;">223050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Cholinchlorid</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>C-1879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Citric acid</td>
			<td style="width:183px;">ChemSolute</td>
			<td style="width:124px;">24,321,000</td>
			<td>alternatively use local supplier</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">CuSO4*5H2O</td>
			<td style="width:183px;">Fluka</td>
			<td style="width:124px;">61240</td>
			<td>alternatively use local supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">D(+)Sucrose&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Roth</td>
			<td style="width:124px;">4621.1</td>
			<td>alternatively use local supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">DNA degr. free acid&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">D-3159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">EDTA</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">FeCl3*6H2O</td>
			<td style="width:183px;">Gr&#252;ssing GmbH</td>
			<td style="width:124px;">10288</td>
			<td>alternatively use local supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Geneticin (G418) disulfate salt</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">A1720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trichoderma lysing enzymes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L1412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Glucose</td>
			<td style="width:183px;">Caelo</td>
			<td style="width:124px;">2580</td>
			<td>alternatively use local supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Glycerin&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:124px;">G065015</td>
			<td>alternatively use local supplier</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">H3BO3</td>
			<td style="width:183px;">AppliChem</td>
			<td style="width:124px;">A2940</td>
			<td>Dangerous substance. Please check manufacturer&#39;s safety instructions.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heparin sodium salt</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">H3393-50KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hygromycin B-solution</td>
			<td style="width:183px;">Roth</td>
			<td style="width:124px;">1287.2</td>
			<td>Dangerous substance.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">KCl</td>
			<td style="width:183px;">VWR</td>
			<td style="width:124px;">26764298</td>
			<td>alternatively use local supplier</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:183px;">AppliChem</td>
			<td style="width:124px;">A3620</td>
			<td>alternatively use local supplier</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">MgSO4 waterfree</td>
			<td style="width:183px;">Merck</td>
			<td style="width:124px;">7487-88-9</td>
			<td>Water free is critical. Alternatively use local supplier</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">MnCl2*4H2O</td>
			<td style="width:183px;">AppliChem</td>
			<td style="width:124px;">A2087</td>
			<td>alternatively use local supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">myo-Inositol</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>I-5125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Na2-EDTA*2H2O</td>
			<td style="width:183px;">AppliChem</td>
			<td style="width:124px;">A2937</td>
			<td>alternatively use local supplier</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Na2MoO4*2H2O</td>
			<td style="width:183px;">Roth</td>
			<td style="width:124px;">0274.2</td>
			<td>alternatively use local supplier</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Na2SO4</td>
			<td style="width:183px;">Gr&#252;ssing GmbH</td>
			<td style="width:124px;">12174</td>
			<td>alternatively use local supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">NaCl</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:124px;">S316060</td>
			<td>alternatively use local supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">NaOH</td>
			<td style="width:183px;">ChemSolute</td>
			<td style="width:124px;">13,751,000</td>
			<td>alternatively use local supplier</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">NH4NO3</td>
			<td style="width:183px;">Roth</td>
			<td style="width:124px;">K299.1</td>
			<td>alternatively use local supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nicotinic acid (Free Acid)</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">N-4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nourseothricin dihydrogen sulfate&#160;&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Werner BioAgents</td>
			<td style="width:124px;">5,001,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Nutrient broth&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Difco</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td>local suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1) pH 6.7</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3803</td>
			<td>Dangerous substance. Please check manufacturer&#39;s safety instructions.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">polyethylene glycol (PEG)</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">P-3640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium acetate</td>
			<td style="width:183px;">AppliChem</td>
			<td>121479</td>
			<td>alternatively use local supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Pyridoxin (Monohydrochlorid)</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">P-9755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Riboflavin&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">R4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">RNaseA</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">R5503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">SDS</td>
			<td style="width:183px;">Roth</td>
			<td style="width:124px;">Cn30.3</td>
			<td>alternatively use local supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">small syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>300300</td>
			<td>alternatively use local supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sterile filter, 22 &#181;m</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-477</td>
			<td>alternatively use local supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Sorbitol</td>
			<td style="width:183px;">Roth</td>
			<td style="width:124px;">6213.1</td>
			<td>alternatively use local supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Thiamin-Hydrochloride</td>
			<td style="width:183px;">Serva</td>
			<td style="width:124px;">36020.02</td>
			<td>alternatively use local supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">tri-Na-Citrate</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:124px;">S332060</td>
			<td>alternatively use local supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Tris- (hydroxymethyl) aminomethane</td>
			<td>VWR</td>
			<td style="width:124px;">103156X</td>
			<td>alternatively use local supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Tris hydrochloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td style="width:124px;">9090.4</td>
			<td>alternatively use local supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Serva&#160;</td>
			<td style="width:124px;">37240</td>
			<td>alternatively use local supplier</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">ZnCl2</td>
			<td style="width:183px;">Fluka</td>
			<td style="width:124px;">96470</td>
			<td>alternatively use local supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Name</td>
			<td style="width:183px;">Company</td>
			<td style="width:124px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Composition of solutions/preparation of material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Composition of solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Carboxin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stock: 5 mg/ml in methanol, final concentration: 2 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CM plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.25 % (w/v) Casamino acids, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 1.0 % (v/v) Holliday vitamin solution, 6.25 % (v/v); Holliday salt solution, 0.05 % (w/v) DNA degr. free acid, 0.15 % (w/v) NH4NO3, 2.0 % (w/v) Bacto Agar; adjust to pH 7.0 using 5 M NaOH; after autoclaving add 1 % glucose&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Geneticin (G418)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stock: 50 mg/ml in H2O, final concentration: 500 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">HCl-washed glass beads (0,35-0,45 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cover glass beads with concentrated HCl (25 %, 7.8 M) and incubate for 60 min. Sway several times. Decant HCl (keep decanted liquid) and wash glass beads with 3 M HCl (keep decanted liquid). Wash glass beads several times with double distilled H2O until the pH is 7 (the liquid should not be yellow-green anymore). Aliquot the glass beads and dry them at 180 &#176;C. The decanted HCl has to be neutralized before disposal.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heparin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stock: 15 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Holliday salt solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>16.0 &#8240; (w/v) KH2PO4, 4.0 &#8240; (w/v) Na2SO4, 8.0 &#8240; (w/v) KCl, 1.32 &#8240; (w/v) CaCl2*2H2O, 8.0 &#8240; (v/v) trace elements, 2.0 &#8240; (w/v) MgSO4; sterile filtrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Holliday vitamin solution&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1&#8240; (w/v) Thiamin, 0.05&#8240; (w/v) Riboflavin, 0.05&#8240; (w/v) Pyridoxin, 0.2&#8240; (w/v) Ca-Pantothenat, (0.05&#8240; (w/v) Aminobenzoeic acid, 0.2&#8240; (w/v) Nicotinic acid, 0.2&#8240; (w/v) Cholinchlorid, 1.0&#8240; (w/v) myo-Inositol; may be stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hygromycin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stock: 50 mg/ml in PBS, final concentration: 200 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Nourseothricin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stock: 200 mg/ml in H2O, final concentration: 150 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NSY-glycerol-medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.8 % (w/v) Nutrient Broth, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 0.5 % (w/v) Sucrose,&#160; 80.0 % (v/v) 87% Glycerin (f.c. 69.6%)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RegLight</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.0% (w/v) Yeast Extract&#160; 0.4 % (w/v) Bacto Peptone, 0.4 % (w/v) Sucrose, 18.22 % (w/v) Sorbitol, 1.5 % (w/v) Agar</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SCS, pH 5.8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solution 1: 20 mM tri-Na-citrate, 1 M Sorbitol; colution 2: 20 mM Citric acid, 1 M Sorbitol, add solution 2 into solution 1 until pH 5.8 is reached; autoclave</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">STC, pH 8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 M Sorbitol, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM CaCl2; filter sterile</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">STC/PEG</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>40 % (v/v) PEG in STC-buffer&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">TE buffer, pH 8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.31 mM Tris-Base, 8.69 mM Tris-HCl, 10 mM Na2-EDTA*2H2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TE/RNase</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 &#181;g/ml RNaseA in TE buffer</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Trace elements</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.06&#8240; (w/v) H3BO3, 0.14&#8240; (w/v) MnCl*4H2O, 0.4 &#8240; (w/v) ZnCl2, 0.4 &#8240; (w/v) Na2MoO4*2H2O, 0.1 &#8240; (w/v) FeCl3*6H2O, 0.04&#8240; (w/v) CuSO4*5H2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trichoderma lysing enzymes solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>12.5 mg/ml SCS; filter sterile; prepare shortly before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris-HCl pH 7.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>806 mM Tris-HCl, 194 mM Tris-Base; check the pH and if necessary adjust with HCl; autoclave</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Usti-lysis buffer 1, pH 8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM NaCl, 1 % (w/v) SDS, 2 % (v/v) TritonX-100, 1 mM EDTA. Do not measure pH using pH meter.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Usti-lysis buffer 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>mix Usti lysis buffer 1 with 1 x TE in a 1:1 ratio</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">YEPS-Light medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.0% (w/v) Yeast Extract, 0.4% (w/v) Bacto Peptone, 0.4% (w/v) Sucrose, for plates: 1.5% (w/v) Bacto Agar</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic manipulation of the plant pathogen ustilago maydis to study fungal biology and plant microbe interactions

Gen silinmesi gen fonksiyonu analizi önemli bir rol oynar. hedefli bir şekilde genlerin bozmaya en etkin yöntemlerden biri, homolog rekombinasyon yoluyla bir seçilebilir marker ile bütün gen yerine geçer. Homolog rekombinasyon sırasında DNA değişimi, yüksek benzerliğe sahip sekanslar arasında yer alır. Bu nedenle, hedef gene komşu lineer genomik diziler spesifik olarak arzu edilen entegrasyon sitesine bir seçilebilir işaret doğrudan kullanılabilir. Silme yapısının kör uçlar hücrenin DNA onarım sistemleri aktive edebilir ve böylece homolog rekombinasyon yoluyla ya da homolog olmayan uca birleştirilmesi yoluyla yapının entegrasyonu teşvik. verimli homolog rekombinasyon ile organizmalar, başarılı gen silme oranı% 50&#39;den fazla, bu strateji değerli bir gen bozulması sistemi yapım ulaşabilir. Ustilago Maydis&#39;in rastık mantarı gibi verimli homolog Rekombinant gösteren bir ökaryotik bir model mikroorganizmadıriyon. Bunu yaklaşık 6.900 gen dışında, bir çok işlevsel silme mutantları yardımıyla karakterize edilmiştir, ve gen temel işlevi de gen değiştirme girişimleri Puan yetmezliği tekrarladı. floresan işaretleri veya tahmin etki mutasyonlar ile etiketleyerek gen işlevi sonraki karakterizasyonu da homolog rekombinasyon yoluyla DNA değişimine dayanır. Burada, biz U. sunuyoruz En basit örnek, gen silme işlemini kullanarak detaylı Maydis zorlanma nesil stratejisi.

U. kodlanmış dört chitinolytic genler için silinti yapılan, Maydis genom cts1 silinmesi için hygR kaseti kullanarak Golden Gate klonlama tarafından oluşturulan, NATR cts2 silinmesi için, cts3 silinmesi ve cts4 20 silinmesi için cbxR için G418R kaseti. Gen değiştirme stratejisinin genel bir bakış cts3 silinmesi (Şekil 1) ile tarif edilmektedir. Iki...

Watch this Scientific Journal Video about Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions at JoVE.com

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetik Ustilago Maydis&#39;in karalamak mantar işlemek için Biz sağlam bir gen değiştirme stratejisini açıklar. Bu protokol enfeksiyon fenotipleri araştırmak için silme mutantlarını üretmek açıklar. Bir floresan protein etiketi kodlayan bir sekansı ilave olarak, örneğin, arzu edilen herhangi bir şekilde, genleri değiştirme uzatılabilir.

Bitki patojeni olarak genetik manipülasyonu<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Mantar Biyoloji ve Bitki Mikrop Etkileşimleri Eğitim için

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

genetic-manipulation-plant-pathogen-ustilago-maydis-to-study-fungal

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

14.3K Görüntüleme.  Heinrich-Heine University Düsseldorf.  Genetik Ustilago Maydis'in karalamak mantar işlemek için Biz sağlam bir gen değiştirme stratejisini açıklar. Bu protokol enfeksiyon fenotipleri araştırmak için silme mutantlarını üretmek açıklar. Bir floresan protein etiketi kodlayan bir sekansı ilave olarak, örneğin, arzu edilen herhangi bir şekilde, genleri değiştirme uzatılabilir. 

Video: Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time PCR (RT-qPCR). It provides accurate, sensitive, reliable, and reproducible results. Several factors can affect the sensitivity and specificity of RT-qPCR. Residual genomic DNA (gDNA) contaminating RNA samples is one of them. In gene expression analysis, non-specific amplification due to gDNA contamination will overestimate the abundance of transcript levels and can affect the RT-qPCR results. Generally, gDNA is detected by qRT-PCR using primer pairs annealing to intergenic regions or an intron of the gene of interest. Unfortunately, intron/exon annotations are not yet known for all genes from vertebrate, bacteria, protist, fungi, plant, and invertebrate metazoan species.
Here we present a protocol for detection of gDNA contamination in RNA samples by using ribosomal DNA (rDNA)-based primers. The method is based on the unique features of rDNA: their multigene nature, highly conserved sequences, and high frequency in the genome. Also as a case study, a unique set of primers were designed based on the conserved region of ribosomal DNA (rDNA) in the Poaceae family. The universality of these primer pairs was tested by melt curve analysis and agarose gel electrophoresis. Although our method explains how rDNA-based primers can be applied for the gDNA contamination assay in the Poaceae family,&#160;it could be easily used to other prokaryote and eukaryote species

Here, we present a protocol for tracing genomic DNA (gDNA) contamination in RNA samples. The presented method utilizes primers specific for the internal transcribed spacer region (ITS) of ribosomal DNA (rDNA) genes. The method is suited for reliable and sensitive detection of DNA contamination in most eukaryotes and prokaryotes.

DNA kirlenme ribozomal DNA tabanlı RNA örneklerinde değerlendirilmesi

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Genetik

Purification of High Molecular Weight Genomic DNA from Powdery Mildew for Long-Read Sequencing

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics of these pathogens, in part due to a lack of well-developed genetic and genomic resources. These organisms have large, repetitive genomes, which have made genome sequencing and assembly prohibitively difficult. Here, we describe methods for the collection, extraction, purification and quality control assessment of high molecular weight genomic DNA from one powdery mildew species, Golovinomyces cichoracearum. The protocol described includes mechanical disruption of spores followed by an optimized phenol/chloroform genomic DNA extraction. A typical yield was 7 &#181;g DNA per 150 mg conidia. The genomic DNA that is isolated using this procedure is suitable for long-read sequencing (i.e., &#62; 48.5 kbp). Quality control measures to ensure the size, yield, and purity of the genomic DNA are also described in this method. Sequencing of the genomic DNA of the quality described here will allow for the assembly and comparison of multiple powdery mildew genomes, which in turn will lead to a better understanding and improved control of this agricultural pathogen.

Described here is a method for the extraction, purification, and quality control of genomic DNA from the obligate biotrophic fungal pathogen, powdery mildew, for use in long-read genome sequencing.

Uzun Okuma Dizi Yapmak İçin Küllemesi Yüksek Moleküler Ağırlık Genomik DNA saflaştırılması

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics ...

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the intestine the primary location for disease. The nematode intestine structurally and functionally mimics mammalian intestines and is transparent making it amenable to microscopic study of colonization. Here we show that pathogens can cause disease and death. We are able to identify microbial mutants that show altered virulence. Its conserved innate response to biotic stresses makes C. elegans an excellent system to probe facets of host innate immune interactions. We show that hosts with mutations in the dual oxidase gene cannot produce reactive oxygen species and are unable to resist microbial insult. We further demonstrate the versatility of the presented survival assay by showing that it can be used to study the effects of inhibitors of microbial growth. This assay may also be used to discover fungal virulence factors as targets for the development of novel antifungal agents, as well as provide an opportunity to further uncover host-microbe interactions. The design of this assay lends itself well to high throughput whole-genome screens, while the ability to cryo-preserve worms for future use makes it a cost-effective and attractive whole animal model to study.

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

Here, we present the nematode Caenorhabditis elegans as a versatile host model to study microbial interaction.

Nematot Caenorhabditis Elegans - konak-mikrop etkileşimleri çalışmaya çok yönlü Vivo içinde manken

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with a number of challenges including sample preservation quality, degraded DNA, and destructive sampling of rare specimens. In order to more effectively use herbarium material in large sequencing projects, a dependable and scalable method of DNA isolation and library preparation is needed. This paper demonstrates a robust, beginning-to-end protocol for DNA isolation and high-throughput library construction from herbarium specimens that does not require modification for individual samples. This protocol is tailored for low quality dried plant material and takes advantage of existing methods by optimizing tissue grinding, modifying library size selection, and introducing an optional reamplification step for low yield libraries. Reamplification of low yield DNA libraries can rescue samples derived from irreplaceable and potentially valuable herbarium specimens, negating the need for additional destructive sampling and without introducing discernible sequencing bias for common phylogenetic applications. The protocol has been tested on hundreds of grass species, but is expected to be adaptable for use in other plant lineages after verification. This protocol can be limited by extremely degraded DNA, where fragments do not exist in the desired size range, and by secondary metabolites present in some plant material that inhibit clean DNA isolation. Overall, this protocol introduces a fast and comprehensive method that allows for DNA isolation and library preparation of 24 samples in less than 13 h, with only 8 h of active hands-on time with minimal modifications.

This article demonstrates a detailed protocol for DNA isolation and high-throughput sequencing library construction from herbarium material including rescue of exceptionally poor-quality DNA.

Sağlam DNA izolasyon ve yüksek işlem hacmi sıralama kitaplığı inşaat sulak numuneler için

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to abiotic stresses and diseases. As the plant microbiome can be highly complex, low-cost, high-throughput methods such as amplicon-based sequencing of the 16S rRNA gene are often preferred for characterizing its microbial composition and diversity. However, the selection of appropriate methodology when conducting such experiments is critical for reducing biases that can make analysis and comparisons between samples and studies difficult. This protocol describes in detail a standardized methodology for the collection and extraction of DNA from soil, rhizosphere, and root samples. Additionally, we highlight a well-established 16S rRNA amplicon sequencing pipeline that allows for the exploration of the composition of bacterial communities in these samples, and can easily be adapted for other marker genes. This pipeline has been validated for a variety of plant species, including sorghum, maize, wheat, strawberry, and agave, and can help overcome issues associated with the contamination from plant organelles.

Here, we describe a protocol to obtain amplicon sequence data of soil, rhizosphere, and root endosphere microbiomes. This information can be used to investigate the composition and diversity of plant-associated microbial communities, and is suitable for the use with a wide range of plant species.

Kök Microbiome keşfetmek: toprak, rizosferde ve kök Endosphere bakteriyel topluluk verileri ayıklama

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Maintaining Biological Cultures and Measuring Gene Expression in Aphis nerii: A Non-model System for Plant-insect Interactions

Aphids are excellent experimental models for a variety of biological questions ranging from the evolution of symbioses and the development of polyphenisms to questions surrounding insect's interactions with their host plants. Genomic resources are available for several aphid species, and with advances in the next-generation sequencing, transcriptomic studies are being extended to non-model organisms that lack genomes. Furthermore, aphid cultures can be collected from the field and reared in the laboratory for the use in organismal and molecular experiments to bridge the gap between ecological and genetic studies. Last, many aphids can be maintained in the laboratory on their preferred host plants in perpetual, parthenogenic life cycles allowing for comparisons of asexually reproducing genotypes. Aphis nerii, the milkweed-oleander aphid, provides one such model to study insect interactions with toxic plants using both organismal and molecular experiments. Methods for the generation and maintenance of the plant and aphid cultures in the greenhouse and laboratory, DNA and RNA extractions, microsatellite analysis, de novo transcriptome assembly and annotation, transcriptome differential expression analysis, and qPCR verification of differentially expressed genes are outlined and discussed here.

Maintaining Biological Cultures and Measuring Gene Expression in Aphis nerii: A Non-model System for Plant-insect Interactions

The aphid Aphis nerii colonizes on highly-defended plants in the dogbane family (Apocyanaceae) and provides numerous opportunities to study plant-insect interactions. Here, we present a series of protocols for the maintenance of plant and aphid cultures, and the generation and analysis of molecular and -omic data for A. nerii.

Biyolojik kültür ve gen ifadesinde ölçme Aphis neriiBakımı: bitki böcek etkileşimleri için bir sigara-model sistemi

Aphids are excellent experimental models for a variety of biological questions ranging from the evolution of symbioses and the development of polyphenisms ...

Plant Growth and Agrobacterium-mediated Floral-dip Transformation of the Extremophyte Schrenkiella parvula

Schrenkiella parvula is an extremophyte adapted to various abiotic stresses, including multiple ion toxicity stresses. Despite high-quality genomic resources available to study how plants adapt to environmental stresses, its value as a functional genomics model and tool has been limited by the lack of a feasible transformation system. In this protocol, we report how to generate stable transgenic S. parvula lines using an Agrobacterium-mediated floral-dip method. We modified the transformation protocol used for A. thaliana to account for unique traits of S. parvula, such as an indeterminate flowering habit and a high epicuticular wax content on leaves. Briefly, S. parvula seeds were stratified at 4 &#176;C for five days before planting. Plants were grown at a photoperiod of a 14 h light and 10 h dark and a 130 &#181;mol m-2s-1 light intensity, at 22 &#176;C to 24 &#176;C. Eight to nine week-old plants with multiple inflorescences were selected for transformation. These inflorescences were dipped in an infiltration solution of Agrobacterium tumefaciens GV3101 carrying the pMP90RK plasmid. We performed two rounds of flower dipping with an interval of three to four weeks to increase the transformation efficiency. The T1 seeds were collected and dried for four weeks in a container with desiccants before germination to screen for candidate transformed lines. Resistance to BASTA was used to screen T1 plants. We sprayed the BASTA solution three times with an interval of three days starting at two week-old plants to reduce false positives. A BASTA drop test was performed on surviving individual plants to identify true positive transformants. The transformation efficiency was 0.033%, yielding 3&#8211;4 transgenic plants per 10,000 T1 seeds propagated.

Plant Growth and Agrobacterium-mediated Floral-dip Transformation of the Extremophyte Schrenkiella parvula

Agrobacterium-mediated transformation using a floral-dip method can be successfully employed to create stable transgenic lines of the extremophyte model Schrenkiella parvula. We present a protocol modified from that for Arabidopsis thaliana, considering different growth habits and physiological characteristics of the extremophyte.

Bitki büyüme ve Floral daldırma dönüşümün Agrobacterium aracılı Extremophyte Schrenkiella parvula

Schrenkiella parvula is an extremophyte adapted to various abiotic stresses, including multiple ion toxicity stresses. Despite high-quality genomic ...

Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

Inspired by Homer&#180;s Trojan horse myth, we engineered the maize pathogen Ustilago maydis to deliver secreted proteins into the maize apoplast permitting in vivo phenotypic analysis. This method does not rely on maize transformation but exploits microbial genetics and secretory capabilities of pathogens. Herein, it allows inspection of in vivo delivered secreted proteins with high spatiotemporal resolution at different kinds of infection sites and tissues. The Trojan horse strategy can be utilized to transiently complement maize loss-of-function phenotypes, to functionally characterize protein domains, to analyze off-target protein effects, or to study onside protein overdosage, making it a powerful tool for protein studies in the maize crop system. This work contains a precise protocol on how to generate a Trojan horse strain followed by standardized infection protocols to apply this method to three different maize tissue types.

Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

This work describes the cloning of an Ustilago maydis Trojan horse strain for the in situ delivery of secreted maize proteins into three different types of maize tissues.

Ustilago maydis bir Truva atı olarak In Situ teslim, Mısır proteinler için kullanma.

Inspired by Homer&#180;s Trojan horse myth, we engineered the maize pathogen Ustilago maydis to deliver secreted proteins into the maize apoplast ...

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing in C. albicans requires Cas9, guide RNA, and repair template. A plasmid expressing a yeast codon optimized Cas9 (CaCas9) has been generated. Guide sequences directly upstream from a PAM site (NGG) are cloned into the Cas9 expression vector. A repair template is then made by primer extension in vitro. Cotransformation of the repair template and vector into C. albicans leads to genome editing. Depending on the repair template used, the investigator can introduce nucleotide changes, insertions, or deletions. As C. albicans is a diploid, mutations are made in both alleles of a gene, provided that the A and B alleles do not harbor SNPs that interfere with guide targeting or repair template incorporation. Multimember gene families can be edited in parallel if suitable conserved sequences exist in all family members. The C. albicans CRISPR system described is flanked by FRT sites and encodes flippase. Upon induction of flippase, the antibiotic marker (CaCas9) and guide RNA are removed from the genome. This allows the investigator to perform subsequent edits to the genome. C. albicans CRISPR is a powerful fungal genetic engineering tool, and minor alterations to the described protocols permit the modification of other fungal species including C. glabrata, N. castellii, and S. cerevisiae.

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

Efficient genome engineering of Candida albicans is critical to understanding the pathogenesis and development of therapeutics. Here, we described a protocol to quickly and accurately edit the C. albicans genome using CRISPR. The protocol allows investigators to introduce a wide variety of genetic modifications including point mutations, insertions, and deletions.

Candida albicans insan mantar patojen genom düzenleme CRISPR-aracılı

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing ...

A Bioinformatics Pipeline to Accurately and Efficiently Analyze the MicroRNA Transcriptomes in Plants

MicroRNAs (miRNAs) are 20- to 24-nucleotide (nt) endogenous small RNAs (sRNAs) extensively existing in plants and animals that play potent roles in regulating gene expression at the post-transcriptional level. Sequencing sRNA libraries by Next Generation Sequencing (NGS) methods has been widely employed to identify and analyze miRNA transcriptomes in the last decade, resulting in a rapid increase of miRNA discovery. However, two major challenges arise in plant miRNA annotation due to increasing depth of sequenced sRNA libraries as well as the size and complexity of plant genomes. First, many other types of sRNAs, in particular, short interfering RNAs (siRNAs) from sRNA libraries, are erroneously annotated as miRNAs by many computational tools. Second, it becomes an extremely time-consuming process for analyzing miRNA transcriptomes in plant species with large and complex genomes. To overcome these challenges, we recently upgraded miRDeep-P (a popular tool for miRNA transcriptome analyses) to miRDeep-P2 (miRDP2 for short) by employing a new filtering strategy, overhauling the scoring algorithm and incorporating newly updated plant miRNA annotation criteria. We tested miRDP2 against sequenced sRNA populations in five representative plants with increasing genomic complexity, including Arabidopsis, rice, tomato, maize and wheat. The results indicate that miRDP2 processed these tasks with very high efficiency. In addition, miRDP2 outperformed other prediction tools regarding sensitivity and accuracy. Taken together, our results demonstrate miRDP2 as a fast and accurate tool for analyzing plant miRNA transcriptomes, therefore a useful tool in helping the community better annotate miRNAs in plants.

A bioinformatics pipeline, namely miRDeep-P2 (miRDP2 for short), with updated plant miRNA criteria and an overhauled algorithm, could accurately and efficiently analyze microRNA transcriptomes in plants, especially for species with complex and large genomes.

Bitkilerdeki MikroRNA Transkripsiyonlarını Doğru ve Verimli Bir Şekilde Analiz Eden Bir Biyoinformatik Boru Hattı

MicroRNAs (miRNAs) are 20- to 24-nucleotide (nt) endogenous small RNAs (sRNAs) extensively existing in plants and animals that play potent roles in ...