The authors thank Dr. M. Matrosovich for providing the parent MDCK and MDCK-SIAT1 cell lines and Roche Pharmaceuticals for supplying the oseltamivir carboxylate.We also appreciate Dr. Anne Weston for valuable suggestions on the manuscript. This study was dependent upon the valued collaboration of the WHO National Influenza Centres and the WHO CCs within the WHO GISRS, who provided the influenza viruses used. This work was funded by the Medical Research Council through Programme U117512723.

NOT: Aşağıdaki protokol için biyogüvenlik düzeyi (BSL) potansiyel pandemik influenza virüs mevsimsel grip virüsleri ve BSL 3+ BSL 2 &#39;dir. Viral titrasyon, kontrol (VC) viral konsantrasyona karar vermek için bir nötralizasyon deneyi önceden gereklidir. 1. Virüs titrasyonu NOT: (1) viral seyreltme satırların veya sütunların (Şekil 1) ya birlikte düzenlenebilir: virüslerin sayısı ve çiftleri sayısına bağlı olarak, bir kuyu plaka aşağıdaki esneklikleri ile kurulabilir. Her virüs ayrı bir satır / sütun işgal etmelidir. (2) viral seyreltme artış esnektir, ancak sol üst köşedeki en yüksek viral konsantrasyona ile başlamalıdır. (3) çiftleri sayısında herhangi bir sınırlama yoktur. NOT: Madin Darby köpek böbrek (MDCK) ve MDCK-SIAT1 (SIAT) hücreleri nazikçe M. Matrosovich, Marburg, Ger tarafından sağlanmıştır10 çok. SIAT hücreleri kararlı bir şekilde insan CMP-N-acetylneuraminate ile transfekte MDCK hücreleri: sialik asit (SA) geliştirilmiş ekspresyon için olan B-galaktosid α-2,6-sialil-transferazı geni α2-6Gal terminasyonlu oligosakaritler. <ol><li> Kısım yeterli MDCK hücreleri veya MDCK SIAT hücreler 8 96 oyuklu plakalara (200 | al / ul). Izdiham ulaşmak için 2 ya da 3 gün boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de inkübe hücreleri. % 10 ısıyla inaktive edilmiş cenin dana serumu (FCS) ve antibiyotik (100 U / ml penisilin ve / ml streptomisin, 100 ug) ile desteklenmiş DMEM içerisinde hücrelerin yayar. % 5 CO2 ve 1 mg / ml G418 sülfat ile 37 ° C &#39;de SIAT hücreleri inkübe edin. NOT: seyreltme faktörü deneyim ve kullanılan hücre hattı bağlıdır. Hücre tek tabaka birleştirilebilmeli gerekir (yani, hiçbir hücre duvarı ya da MDCK hücreleri ve MDCK-SIAT1 hücreleri için sıkıca paketlenmiş düzeni görebilir anahat) virüs aşılama sırasında. dilüsyonları örnekleri dayalıMDCK veya MDCK SIAT1 hücrelerinin konfluent şişe alt kültür Tablo 1 &#39;de verilmiştir. </li><li> oyuk başına virüs büyüme ortamında (BYM) 200 ul hücreleri 3 kez yıkayın. 30 dakika boyunca% 70 EtOH ile çok katlı levha yıkayıcı sterilize ve yıkamadan önce steril fosfat-tamponlu tuzlu su (PBS) ya da VGM durulayınız. </li><li> VGM aspire ve hemen her kuyuya VGM 50 ul ekleyin. </li><li> (Test virüs ve çiftleri sayısına bağlı olarak, ya da daha az) 6 steril tüplere her birine VGM 900 ul ekleyin. Her bir seyreltme ile uçlarının değiştirilmesi, seyreltik seri birinci tüp içine virüsün 100 ul pipet karıştırın ve. her bir virüs için tekrar titre edilmesi. NOT: Bu 10 -6 10 -1 virüs dilüsyonları verecektir. </li><li> En yüksek dilüsyon başlayarak her bir virüs, seyreltme 50 ul ekle 9 çoğaltılmış oyuklara (Şekil 1 &#39;de Sütun 9 ve 10) ile (Şekil 1&#39; de 1 x 10 -5),6-çukurlu plaka. </li><li> Virüs hücreleri enfekte izin 2-3 saat boyunca 37 ° C&#39;de plaka koyun. NOT: 2 ila 3 saat inkübasyon inokulum virüsler tek tabaka ulaşmak için yeterli zamana sahip olmasını sağlamak için gereklidir. </li><li> kaplamayı hazırlayın (10 ml / plaka) NOT: Kaplama 2x DMEM, Tripsin (2 ug / ml nihai konsantrasyon), 20, 1 mg / ml stok ul, ve selüloz, pamuk linterleri, 5 ml (Malzeme Listesi bakınız), 5 ml oluşur. </li><li> inokulum çıkarın. </li><li> bindirme (her bir kuyunun 200 ul) ekleyin. Bozulmamış, 37 ° C&#39;de gece boyunca inkübe edilir. NOT: Virüs tomurcuklanan sonra yaklaşık 4 saat gerçekleşir, bu nedenle plaka bu saatten sonra rahatsız değil önemlidir. </li><li> Kuyulardan kaplamayı aspire. </li><li> PBS A buz soğukluğunda% 4 paraformaldehid ekleyin (200 ul / oyuk). 30 dakika ya da 20 dakika süre ile, oda sıcaklığında, 4 ° C&#39;de yerleştirin. Not: PBS 10 hareket doğal pH fosfat tamponlu serum fizyolojikF NaCl, KCl 0.25 g, Na 2 HPO 4 1.437 gr KH 2 PO 4 0.25 g, ve distile su 1 L (Malzeme listesine bakınız). NOT: Solunduğunda ve yutulduğunda yanıklara neden olabilir zaman Paraformaldehyde zararlıdır. Orada Kanserojen etki sınırlı kanıt da, ve cilt temasından sonra hassasiyete neden olabilir. </li><li> paraformaldehit aspire ve PBS A ile iki kez plakaları yıkaması (200 ul / oyuk). </li><li> ileride kullanım için 4 ° C&#39;de, PBS A plakaları mağaza ya da aşağıdaki adımlarla devam et. </li><li> permeabilizasyon tamponu ekleyin (100 ul / oyuk). 30 dakika için oda sıcaklığında bırakın. </li><li> PBS A ile iki kez plaka yıkaması (200 ul / oyuk). </li><li> oyuk başına: (ELISA tamponu 1.000 1) birinci antikor, 50 ul, influenza A karşı fare mAb ekleyin. çalkalanarak 1 saat (ya da 4 ° C sıcaklıkta gece), oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Yıkama tamponu (% 0.05 Tween 80, PBS, A, hacim / hacim olarak) p 100 ul 3 kez yıkayıniyi er. Yıkamalar arasında 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Alternatif olarak, kuyu başına 300 ul kullanarak inkübasyon olmadan o 3 kere yıkayın. </li><li> ikinci antikor, 50 ul ekle • Keçi anti-fare IgG (H + L) HRP konjügatı (1: ELISA tamponu 1000) ile sabitleştirilir. çalkalanarak 1 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Adım 1.17 açıklandığı gibi o 3 kere yıkayın. </li><li> alt-tabakanın (50 ul / oyuk) ilave edin. 30 dakika süre ile ya da mavi bir renk gelişimi görülene kadar oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Yıkamalar arasında 2 -3 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe, reaksiyonu durdurmak oyuk başına damıtılmış su, 200 ul iki kez plakayı yıkayın için. </li><li> Plaka Hava kurutun ve karanlık bir yerde (örneğin, alüminyum folyoya sarın) saklayın. </li></ol> 2. Titrasyon miktar tayini <ol><li> Şekil 2a&#39;da gösterildiği gibi, düz yataklı bir tarayıcının tarama alanında iyi olarak plaka koyun. L-şekil pozisyon limiti kullanoptimum ve tekrarlanabilir görüntüleme konumunu sağlamak. Not: Bu, bir tarama görüntü iki gözlü plakalara mümkündür. </li><li> bir görüntüyü taramak. NOT: Ayarlar Tablo 2&#39;de gösterilmiştir. </li><li> Gerekli virüs konsantrasyonu (Şekil 3) hesaplamak için &quot;well plate Reader&quot; yazılımını çalıştırın. <ol><li> Bir resim yüklemek için &quot;Load görüntü&quot; butonuna tıklayın. Örnekleme eşiğini ayarlamak için &quot;Küresel Eşik&quot; sekmesinin histogram kırmızı çubuk kaydırın. görüntü üzerindeki etkisini incelemek için &quot;Güncelle&quot; düğmesine tıklayın. </li><li> &quot;Hesapla Nötralizasyon / Titrasyon&quot; kutusunu işaretleyin. ICP ölçmek için &quot;Örnekleme&quot; düğmesine tıklayın. istendiğinde örnekleme sonuçlarını kaydetmek için &quot;Kaydet&quot; düğmesine tıklayın. NOT: &quot;Hesapla Nötralizasyon / Titrasyon&quot; kutusu işaretli ise örnekleme sürecinin ardından, &quot;Nötralizasyon &amp; Titrasyon Hesaplama&quot; olarak adlandırılan yeni bir pencere otomatik olarak belirir. </li><li>Yük veya giriş iyi plaka tanımlama haritası. &quot;: Optimal Virüs Nüfus (%) Titrasyon&quot; in eşiğine (örneğin,% 30) belirtiniz. titrasyon sonuçları hesaplamak için &quot;Titrasyon Süreci&quot; sekmesini seçin. titrasyon sonuçlarını kontrol edin. titrasyon sonuçlarını kaydetmek için &quot;Kaydet &amp; Kapat&quot; düğmesine tıklayın. NOT: Yazılımın ilgili daha ayrıntılı talimatlar için Ek S1 bakın. ısmarlama yazılımının bir kopyası istek üzerine mevcuttur. NOT: Genellikle, her bir kuyunun 11 içinde% 50 (20-85%) toplam hücre ICP etrafında plak azaltma tahlil getirileri için en iyi virüs seyreltme. </li></ol></li></ol> 3. Virüs Nötralizasyon Not: nötralizasyon tayini için gereken levha sayısını hesaplayın. Her plaka bir virüs ve antiserumlar bir dizi barındırabilir. Not: antiserumlar sayısı ve çiftleri sayısına bağlı olarak, bir yuvalı plaka th ayarlanabilirE, aşağıdaki esneklikleri: (1) serum seyreltisi, ya arka arkaya ya da bir sütun (Şekil 4) boyunca ayarlanabilmektedir. Her serum ayrı bir satır veya sütun işgal gerekir. (2) serum seyreltme artış esnektir, ama bir plakanın sol üst köşesinde en yüksek serum konsantrasyonu ile başlamalıdır. (3) çiftleri sayısı antiserumlar sayısını dengeler. Daha çiftleri deneysel varyasyonları düzeltmek için yardımcı olabilir. (4) VC sayısı ve hücre kontrolü (CC) çoğaltır esnek, ama onlar da ayrı satır veya sütun olmalıdır sayısı. VC çiftleri sayısının antiserumlar önemli ölçüde daha yüksek olduğunu tahmin edilmektedir. <ol><li> önceden 1.1-1.3, 2 ya da 3 gün adım olarak, hücre tekli tabakası hazırlayın. </li><li> plakanın her oyuğuna VGM 50 ul ekle. </li><li> sırasıyla, VC ve CC Sütunlar 11 ve 12 kullanın. Colum ilk satırında (A) ila 1:20 reseptör imha edici enzim (RDE) ile tedavi edilen, serum 50 ul alikotları eklemens 1-10. Not: her bir virüs, ve serum kombinasyonu için, deney iki kopya halinde gerçekleştirilir, bu nedenle bir levha, örneğin, bir virüs, beş antisera karşı test içerebilir. </li><li> Satır H. 50 ul (Şekil 4&#39;te Sütunlar 1-10) H Satır Satır A 50 ul aktarılması ve atarak seri seyreltiler 2 kat gerçekleştirin </li><li> CC kolonu (Şekil 4&#39;te Sütun 12) her bir kuyu için seyreltici 50 ul ekle. </li><li> CC sütun hariç plakanın her oyuğuna virüsün 50 ul ekle (sütun 1-11, Şekil 4&#39;te satır H.). </li><li> 2-3 saat boyunca 37 ° C &#39;de inkübe edin. inokulum çıkarın. her kuyuya kaplamayı (200 ul) ekleyin. Bozulmamış, 37 ° C&#39;de gece boyunca inkübe. Fix ve virüs titrasyon (1.11-1.22 adımlar) gibi plakaları leke. </li></ol> 4. Nötralizasyon Niceleme <ol><li> Figu gösterildiği gibi, düz yataklı bir tarayıcının tarama alanında iyi olarak plakasını2a yeniden. optimum ve tekrarlanabilir görüntüleme konumunu sağlamak için L-şekil pozisyon limiti kullanın. Not: Bu, bir tarama görüntü iki gözlü plakalara mümkündür. </li><li> aşama 2.2 &#39;de tarif edildiği gibi, levha tarama. </li><li> Gerekli viral titreleri (Şekil 3, adım 2.3) hesaplamak için &quot;well plate Reader&quot; yazılımını çalıştırın. <ol><li> Bir resim yüklemek için &quot;Load görüntü&quot; butonuna tıklayın. Örnekleme eşiğini ayarlamak için &quot;Küresel Eşik&quot; kırmızı çubuğu kaydırın. etkisini incelemek için &quot;Güncelle&quot; düğmesine tıklayın. </li><li> &quot;Hesapla Nötralizasyon / Titrasyon&quot; kutusunu işaretleyin. ICP ölçmek için &quot;Örnekleme&quot; düğmesine tıklayın. istendiğinde örnekleme sonuçlarını kaydetmek için &quot;Kaydet&quot; düğmesine tıklayın. NOT: &quot;Hesapla Nötralizasyon / Titrasyon&quot; kutusu işaretli ise örnekleme sürecinin ardından, &quot;Nötralizasyon &amp; Titrasyon Hesaplama&quot; olarak adlandırılan yeni bir pencere otomatik olarak belirir. </li><li> İyi p yükü veya girişGeç haritası. Barajı (örneğin,% 50) işaret eder &quot;Nötralizasyon. Enfeksiyon azaltılmıştır (%)&quot; </li><li> titreleri hesaplamak için &quot;Nötralizasyon Süreci&quot; seçeneğini seçin. titreleri kontrol edin ve nötralizasyon sonuçlarını kaydetmek için &quot;Kaydet &amp; Kapat&quot; düğmesine tıklayın. Not: Nötralizasyon VC karşı önceden belirlenmiş bir ICP azalma (örneğin,% 50 ya da% 80 gibi) (Şekil 4&#39;te Sütun 11 ortalaması) ile en yüksek serum seyreltisi karşılığı olarak rapor edilir. % 50 ICP azalma Temsilcisi Sonuçlar kullanılmıştır. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Walker, D. L., Horsfall, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+identity+in+neutralizing+and+hemagglutination-inhibiting+antibodies+against+influenza+viruses.">Lack of identity in neutralizing and hemagglutination-inhibiting antibodies against influenza viruses.</a> J Exp Med. 91, 65-86 (1950).</li><li>Medeiros, R., Escriou, N., Naffakh, N., Manuguerra, J. C., van der Werf, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemagglutinin+residues+of+recent+human+A(H3N2)+influenza+viruses+that+contribute+to+the+inability+to+agglutinate+chicken+erythrocytes.">Hemagglutinin residues of recent human A(H3N2) influenza viruses that contribute to the inability to agglutinate chicken erythrocytes.</a> Virology. 289, 74-85 (2001).</li><li>Lin, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuraminidase+receptor+binding+variants+of+human+influenza+A(H3N2)+viruses+resulting+from+substitution+of+aspartic+acid+151+in+the+catalytic+site:+a+role+in+virus+attachment.">Neuraminidase receptor binding variants of human influenza A(H3N2) viruses resulting from substitution of aspartic acid 151 in the catalytic site: a role in virus attachment.</a> J Virol. 84, 6769-6781 (2010).</li><li>Harmon, M. W., Rota, P. A., Walls, H. H., Kendal, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+response+in+humans+to+influenza+virus+type+B+host-cell-derived+variants+after+vaccination+with+standard+(egg-derived)+vaccine+or+natural+infection.">Antibody response in humans to influenza virus type B host-cell-derived variants after vaccination with standard (egg-derived) vaccine or natural infection.</a> J Clin Microbiol. 26, 333-337 (1988).</li><li>Rowe, T., Abernathy, R. A., Hu-Primmer, J., Thompson, W. W., Lu, X., Lim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+antibody+to+avian+influenza+A+(H5N1)+virus+in+human+serum+by+using+a+combination+of+serologic+assays.">Detection of antibody to avian influenza A (H5N1) virus in human serum by using a combination of serologic assays.</a> J Clin Microbiol.37. 37, 937-943 (1999).</li><li>Okuno, Y., Tanaka, K., Baba, K., Maeda, A., Kunita, N., Ueda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+focus+reduction+neutralization+test+of+influenza+A+and+B+viruses+in+microtiter+system.">Rapid focus reduction neutralization test of influenza A and B viruses in microtiter system.</a> J Clin Microbiol. 28, 1308-1313 (1990).</li><li>Bachmann, M. F., Ecabert, B., Kopf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus:+a+novel+method+to+assess+viral+and+neutralizing+antibody+titers+in+vitro.">Influenza virus: a novel method to assess viral and neutralizing antibody titers in vitro.</a> J Immunol Methods. 225, 105-111 (1999).</li><li>Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+low-viscosity+overlay+medium+for+viral+plaque+assays.">New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays.</a> Virol J. 3, 63-70 (2006).</li><li>Comley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+content+screening+-+Emerging+importance+of+novel+reagents/probes+and+pathway+analysis.">High content screening - Emerging importance of novel reagents/probes and pathway analysis.</a> Drug Discovery World Summer 2005. , 31-53 (2005).</li><li>Matrosovich, M., Matrosovich, T., Carr, J., Roberts, N. A., Klenk, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+alpha-2,+6-sialyltransferase+in+MDCK+cells+increases+influenza+virus+sensitivity+to+neuraminidase+inhibitors.">Overexpression of the alpha-2, 6-sialyltransferase in MDCK cells increases influenza virus sensitivity to neuraminidase inhibitors.</a> J. Virol. 77, 8418-8425 (2003).</li><li>Sullivan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+virus+plaque+quantitation+using+a+flatbed+scanner.">High throughput virus plaque quantitation using a flatbed scanner.</a> J Virol Methods. 179, 81-89 (2012).</li><li>Lin, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+micro-neutralization+assay+and+its+application+in+antigenic+characterization+of+influenza+viruses.">Optimization of a micro-neutralization assay and its application in antigenic characterization of influenza viruses.</a> Influenza Other Respir Viruses. 9, 331-340 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bu çalışmada, biz virüsler arasındaki gerçek antijenik ilişkileri ölçmek için bir görüntüleme bazlı MN deneyi nitelendirdi. diğer plak azaltma deneyleri ile karşılaştırıldığında, yöntem enfektif nüfusun tam kapsama sağlanması tüm kuyunun ICP ölçüm vurgulayan. plak oluşumunun bağımsızlığı da çoğunlukla görünmez küçük plaklar oluşturabilir ya da sadece tek hücreli enfeksiyonu yönetebilir virüslere karşı testinin uygulanmasını genişletmektedir. Bu nedenle, tahlil daha fazla virüs ve HI daha antikorların daha geniş etkilerini inceleyen yeteneğine sahiptir ve daha kapsamlı antijenik benzerlik ya da virüsler 12 arasındaki farklılıkları yansıtmak için yardımcı olur. Örneğin, oseltamivir karboksilat dahil edildiğinde, MN tahlil az daha doğru antijenik farklılıkları yansıtan, bağlayıcı NA-bağımlı etkilenir. Testin geliştirilmesi sırasında, büyük çabalar deney tutarlılık, hız ve algılama geliştirmek için yapılmıştırduyarlılık, bir masaüstü tarayıcı ile yüksek verimlilik olarak quantitated titrasyon, görüntüleme yoluyla giriş virüsleri kontrol ederek de dahil olmak üzere, ve kullanıcı dostu bir veri işleme platformu uygulanması. Sonuçlar genellikle ile tutarlı ve HI olanlar doğruladı. Özellikle, sonuçlar aynı zamanda belirli A (H1N1) pdm09 virüslerin HA1 içinde G155E ikamesi olarak kültür-seçilmiş veya sporadik değişikliklerin neden olduğu son tip A ve B aşı virüslerinin antijenik sürüklenme varyantları arasında antijenik farklılıklar yanı sıra antijenik değişiklikler, ortaya 12. protokol büyük ölçüde görüntüleme sinyali gelişmiş güçlü enfeksiyon verdi hücre hatları seçimi ile virüs türü veya alt türü eşleşti. Deneysel varyasyon test antiserumlar sayısı ile dengeli çiftleri tasarımı ile düzeltti. Belirsizlikler de ağırlıklı görüntüleme cihazı etkilenir görüntü kalitesi, gelebilir. İyi bir renk flatbed tarayıcı signi olabilirficantly görüntü kontrastı artırmak ve gürültüyü azaltmak. virüsler hala benzer bir durumunu korumak ise nötralizasyon giriş virüs miktarı kantitatif ilgili titrasyon peşin tespit edilmelidir. Nötralizasyon sırasında bir enfeksiyona antiserum yanıt referans virüsü (VC) ve arka plan seviyesinin (CC) arasındaki farkın karşı normalize. VC ve CC hassas ölçümler bir nötralizasyon deneyinde için gereklidir. Daha çiftleri (sekiz çiftleri Temsilcisi Sonuçlar kullanılmıştır) tavsiye edilir. Son olarak, yazılım anlamak bir denemenin başarısı için hayati önem taşımaktadır. Yazılım iki yıldan fazla DSÖ İnfluenza Merkezi, İngiltere&#39;de rutin virüs karakterizasyonu için test edilmiştir. Çeşitli durumlarla başa çıkmak için ayrıntılı talimatlar Ek S1 sağlanır. Bu MN deney örnekleri bir dahili kapak uygulamalar için uygundurremely büyük görüş alanı ama sadece orta görüntüleme çözünürlüğü gerektirir. düşük maliyetli ve basit kurulum en viroloji laboratuvarlarında sistem hazır olun. Aynı numunenin ölçümleri varyasyon yaklaşık tarama sırasında 11 kişiye belirsizliği tanımlayan en az% 3 olmuştur. Bu tekrarlanabilirlik birçok viral çalışmalarında yeterli olduğu ve daha çok taramaları görüntü ortalama azaltılabilir. Sonuç olarak, bu çalışma rutin antijenik çalışmada kullanılabilir ve özellikle, insan influenza aşıları dahil virüslerin iki yılda bir seçimi için, influenza virüs şu anda dolaşan detaylı analizler HI verileri desteklemek için sağlam bir MN deneyi gösterir.

Mikro-nötrleştirme (MN) tahlilleri nötralize edici antikor miktarının belirlenmesi için ve antiviral etkinlikleri viroloji kullanılır. Hemaglutinasyon engellenmesinin bir alternatif olarak (HI) deneyleri, MN deneyleri HI yorumlanması 1,2,3 sonuçları karmaşıklaştırabilir reseptör bağlanma influenza virüsleri içinde afinite değişiklikler, etkilenmiş antijenik olmayan etkileri üstesinden gelebilir. Yakın zamana kadar, en çok MN deneyleri sitopatik etkiler (CPE) veya enzim bağlı immünosorbent deneyleri (ELISA) 4,5 dayandırılmıştır. Odak ve plak azalmasına dayalı MN deneyleri 1990 6,7,8 geliştirilmiştir. Plak redüksiyon deneyleri enfektiviteyi ölçmek için görünür plaket sayma güveniyor. Ancak, görsel sayıları sadece plakların çoğunluğu küçük ve birçok güncel dolaşan virüs görünmez olsa, insan gözü tarafından çözülebilir olan büyük plaklar kapsamaktadır. Bu eksik kapsama i lider, sınav arasında ve deneyler arasında önemli varyasyon neden olabilirncomparable sonuçlanır. Bazı virüsler tek hücre ya da çok küçük plaklar başarısız enfeksiyon gösterdiğinizde yöntemi kullanmak da mümkün değildir. fakir sayım çözünürlük, bir görüntüleme tabanlı protokol girişi ile geliştirilebilir. Teknoloji, optik mikroskop ve yüksek verimlilik gelişmeler ile iyi plaka okuyucu enfekte hücreleri 9 saymak doğru araç sağlayabilir. trans-aydınlatmalı mikroskobu altında belirli bir belirteç ile etiketlenmiş enfekte olmuş hücreler alt-hücresel çözünürlükte absorpsiyon veya floresan Buna karşılık görüntülenebilir. Bir numune, bir bilgisayar ekranı üzerinde analiz edilebilir. Ne yazık ki, görüş alanı içinde sınırlama, yüzden fazla kiremitli görüntüleri tek bir kuyu kapağı için gereklidir. 96 çukurlu bir plaka analiz yaklaşık on bin görüntülerin görüntüleme ve işlem gerektirir. Bu zahmetli bir proses zaman alıcı ve pahalıdır ve elde edilen çözünürlük Cinslerviral enfeksiyonların rutin karakterizasyonu için gereksiz l. sınırlı bir bütçe ile laboratuvarlar bir masaüstü tarayıcı etrafında inşa yaklaşım maliyetli, yüksek hacimli bir alternatif sunuyor bulabilirsiniz. Bu yazıda, virüs büyük bir sayıda antijenik karakterizasyonu için ve nicel olarak, antiviral aktiviteleri ve nötralizasyon antikorları ölçmek için uygun olan bir gelişmiş diştaşı azaltma MN deneyi tarif eder. Deney çeşitli avantajları vardır: ilk olarak, ne olursa olsun, plak boyutu, hücresel seviyede virüs enfeksiyonları ölçebilir bir görüntüleme bazlı deneyidir. iyi içinde toplam enfekte hücre popülasyonu (ICP) Sayma büyük ölçüde mümkün düşük enfeksiyon ile virüsleri karakterize etmek için yapım, algılama hassasiyetini artırır. İkinci olarak, daha kesin bir niceliksel titrasyonu, giriş virüsünün miktarını belirlemek için nötrleştirme öncesi ilave edilir. Kantitatif giriş virüsü anlamlı değişkenden azaltırFarklı deneyler arasındaki laboratuarlarında arasındaki sonuçlar daha karşılaştırılabilir hale getirir. Üçüncüsü, nötralizasyon titreleri, görüntüleri analiz hızlı kantitatif yapma ve kullanıcı dostu doğrudan belirlenebilir. Son olarak, protokol gerekli çözünürlük ve doğruluk ile düşük maliyetli ve yüksek verimli bir alternatif sunuyor. kantitatif bir flatbed tarayıcıya ve ücretsiz veri işleme yazılımı dayanmaktadır. Tüm kurulum küçük bir ayak izi vardır ve çoğu laboratuvarlarda konuşlandırılabilir. Bu çalışmada sunulan protokol virüs titrasyon, titrasyon kantitatif, virüs nötralizasyon ve nötralizasyon kantitatif olmak üzere dört ana adımlardan oluşur. Virüs titrasyonu girişi virüs miktarı nötrleştirme kullanılacak belirleyen bir preparat denemedir. Bir titrasyon sırasında viral konsantrasyonları bir dizi 96 oyuklu bir plaka içerisinde, hücre mono tabakaları uygulanır. Enfekte hücreler daha sonra bölüm 2. Viral Dilu olarak nicelendirilir% 20-% 85 üretir tion ICP da karşılık gelen nötralizasyon giriş virüs olarak uygulanır bölüm 3. nötralizasyon protokolü titreleri bölüm yukarıdaki protokoller Temsilcisi Sonuçlar sunulmuştur ardından 4. Deneyleri kullanılarak ölçülür. Tahlil gibi A (H1N1) pdm09, A (H3N2) ve B virüsleri gibi güncel dolaşan influenza virüsleri, çoğu ile son iki yılda iyice test edilmiştir. İnfluenza virüsü karakterizasyonu sonuçları 2016 yılında Güney Yarımküre ve 2016-2017 yılında Kuzey Yarımküre&#39;de kullanılmak üzere influenza aşılarının önerileri verdi DSÖ istişare toplantısı için raporlara dahil edilmiştir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1115">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:177px;">VGM</td>
			<td style="width:172px;">Sigma</td>
			<td style="width:383px;">D6429, P0781</td>
			<td style="width:383px;">500 ml DMEM+5 ml Pen/Strepb</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:177px;">PBS A</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:383px;"></td>
			<td style="width:383px;">Nature pH Phosphate-buffered saline: NaCl -10 gm, KCl - 0.25 gm, Na2HPO4 - 1.437 gm, KH2PO4 &#8211; 0.25 .gm, and Dist. Water &#8211; 1 L.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:177px;">Avicell</td>
			<td style="width:172px;">FMC</td>
			<td style="width:383px;">RC-581F</td>
			<td style="width:383px;">2.4g in 100ml distilled water dissolved by agitation on a magnetic stirrer for 1 hr. Sterilize by autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:177px;">2XDMEM</td>
			<td style="width:172px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:383px;">21935-028</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:177px;">Trypsin</td>
			<td style="width:172px;">Sigma</td>
			<td style="width:383px;">T1426</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:177px;">Overlay (10ml/plate):</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:383px;"></td>
			<td style="width:383px;">5ml 2X DMEM, Trypsin 2&#956;g/ml final conccentration,Avicell&#160; - 5ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:177px;">Triton X- 100e</td>
			<td style="width:172px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:383px;">T8787</td>
			<td style="width:383px;">Permeabilisation buffer: 0.2% in PBS A (v/v)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:177px;">Tween 80</td>
			<td style="width:172px;">Sigma</td>
			<td style="width:383px;">P5188</td>
			<td style="width:383px;">&#160;Wash Buffer: 0.05% Tween &#8211; 80 in PBS A (v/v)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:177px;">Horse serum</td>
			<td style="width:172px;">PAA Labs Ltd</td>
			<td style="width:383px;">B15-021</td>
			<td style="width:383px;">ELISA Buffer: 10%&#160; in PBS A (v/v) + 0.1% Tween 80</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:177px;">Mouse MAb against influenza type A</td>
			<td style="width:172px;">Biorad</td>
			<td style="width:383px;">MCA 400</td>
			<td style="width:383px;">1st Antibody: 1:1000 in ELISA Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:177px;">Goat anti-mouse IgG (H+L) HRP conjugate</td>
			<td style="width:172px;">Biorad</td>
			<td style="width:383px;">172-1011</td>
			<td style="width:383px;">2nd Antibody: 1:1000 in ELISA Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:177px;">True Blu peroxidase substrate</td>
			<td style="width:172px;">KPL&#160;</td>
			<td style="width:383px;">50-78-02</td>
			<td style="width:383px;">Substrate:&#160; True blue +0.03% H2O2g (1:1000 of 30% solution)</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:177px;">96-well flat-bottom microtitre plates</td>
			<td style="width:172px;">Costar&#160;</td>
			<td style="width:383px;">3596</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:177px;">8 channel multiwall-plate washer and manifold</td>
			<td style="width:172px;">Sigma</td>
			<td style="width:383px;">M2656</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="104">
			<td height="104" style="height:104px;width:177px;">Perfection Plate Scanner</td>
			<td style="width:172px;">Epson</td>
			<td style="width:383px;">V750 Pro</td>
			<td style="width:383px;"><a href="http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134&amp;infoType=Downloads.">The imaging software can be downloaded freely from http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134&#38;infoType=Downloads.</a></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:177px;">Software operational environment: LabVIEW</td>
			<td style="width:172px;">National Instruments Corporation</td>
			<td style="width:383px;">Window based with NI Vision builder</td>
			<td style="width:383px;">Version: LabVIEW2012 or above</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of a quantitative micro-neutralization assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.

Yukarıdaki prosedürlerin ardından, son antijenik karakterizasyon deneyleri bazı sonuçlarını sunmak. titrasyon kurulumu her seyreltme için çift çiftleri ile, sekiz giriş virüsleri incelemek için tasarlanmıştır. Viral seyreltileri virüsler arasında varyasyonlar kapsayacak -6 1.0 x -1 10 x 1.0 ila 1.0 test edilmiştir. Test virüsleri A / Kamerun / 15V-3538/2015 dahil olmak üzere H3N2 alt tipi, olduğumuzu A / Vladivostok / / 2015 36 A / Moskova / A / Tomsk / 5/2015 / A / Moskova / 101/2015 103 / 2015, A / Moskova / / 2015 100 A / Moskova / / 2015 133 ve A / Bratislava / 437/2015. Titrasyon sonuçları Şekil 5&#39;te gösterilmiştir. Şekil 5d, virüs seyreltme artarak KİPler azalmasını göstermektedir. Eğrileri bir kuyunun 12 dahilindeki tüm hücrelerde enfeksiyonları vermiştir aynı virüslerin KİPler karşı normalize edildi (ICP doygunluk olarak tanımlanır). ICP hi ile doygunluk ulaşmak olmadıysale en yüksek virüs yoğunluğu, ilgili kopyalardan ICP ortalama yerine kullanılmıştır (A / Moskova / / 2015 103 Şekil 5d). ICP doygunluk% 30 üretilen virüs seyreltmeleri nötralizasyon (Tablo 3), giriş virüsünün seyreltme seçilmiştir. Nötralizasyon her tabakta çift çiftleri ile beş antiserumlar karşı bir giriş virüs amaçlanmıştır. gösterilen referans virüsü H3N2 A / Stockholm / 63/2015. Beş antiserumlar olan A / HK 4801/14 Yumurta F12 / 15, A / HK 7295/14 MDCK F02 / 15, A / Güney Afrika R2665 / 15 SIAT F50 / 15, A / İsviçre 9715923/13 SIAT NIBF F18 / 15, ve A / Hollandalı 525/14 SIAT F23 / 15. Nötralizasyon sonuçları Şekil 6&#39;da gösterilmiştir. Şekil 6d serum seyreltme artması ile enfeksiyon ilerlemesini gösterir. Dikey eksende normalize pozitif nüfus ortalama ICP karşı gelen antiserumlar yanıtı KİPler oranını temsilReferans virüsünün 12. enfekte olmamış hücre kontrolleri arka plan ICP normalleşme sırasında çıkarıldı. Nötralizasyon titreleri% 50 ICP azalma (Tablo 4) karşılık gelen antiserumu seyreltileri reciprocals olarak belirlenmiştir. Doğrusal interpolasyon iki komşu serum dilüsyon arasında düşen titreleri tahmin etmek için kullanılmıştır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig1.jpg" /> Şekil 1: Bir virüs titrasyonu deneyde iyi bir plaka ortamında örneği. Test virüsleri ayrı satır (H A) atanır. Kolonlar, farklı viral seyreltilerde (12 1) için tasarlanmıştır. Iki sütun, her viral seyreltme için kopya olarak kullanıldı. Ölçek çubuğu = 10 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Şekil 2: Örnek tarama sisteminin Şemalar. (A) düz yataklı tarayıcı görüntüleme konumunda bir 96 oyuklu plaka (arasında basılmıştır Elsevier BV kuruluşunun izni) ile 11 referans, ve (b) &#39;de gösterilen L-şekil pozisyon limiti boyutları (a). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54897/54897fig3.jpg" /> Şekil 3: &quot;well plate Reader&quot; kantitatif yazılımı Masaüstü diyagramı. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> </p&gt; <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54897/54897fig4.jpg" /> Şekil 4: bir nötrleştirme deneyde iyi bir plaka ortamında örneği. Her bir serumdan çiftleri (10 1) ile iki sütun atanır. Sıralar farklı serum seyreltmeleri (H&#39;ye kadar) için tasarlanmıştır. virüs kontrolü sekiz çiftleri (H11 için A11) ile, Sütun 11 alır. hücre kontrolü sekiz çiftleri (H12 A12) ile, Sütun 12 olduğunu. Ölçek çubuğu = 10 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54897/54897fig5.jpg" /> Şekil 5: bir titrasyon deneyinin sonuçları. (A) iyi plaka kurulum, (b) iyi plaka Taranan görüntüyü, (c) çizimRenk kodlu, niceliksel, virüs ile enfekte olmuş hücre popülasyonu ve virüs seyreltmeleri karşı (d) normalize virüs ile enfekte olmuş hücre popülasyonlarının. % 30 ICP eşik değeri olarak kullanılmıştır. (D) hata çubukları örnek duplications (± 1 SD) standart sapmalar (SD) vardır. (B) ve (c) &#39;de Ölçek çubukları 10 mm =. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/54897/54897fig6.jpg" /> Şekil 6: Bir nötralizasyon deneyi sonuçları. (A) Her bir plaka ortamında, (b) de plaka görüntü hesaplanır, virüs ile enfekte olmuş bir hücre popülasyonu (C) Çizim ve serum seyreltme karşı (d) normalize virüsü ile enfekte olmuş hücre popülasyonu taranır. giriş virus (VC) A / Stockholm / 63/2015. % 50 ICP titrelerini hesaplamak için kullanıldı. (D) hata çubukları örnek duplications (± 1 SD) standart sapmalar (SD) vardır. (B) ve (c) &#39;de Ölçek çubukları 10 mm =. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Ek S1: <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/Supplementary_S1.pdf" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3"> Tipik seyreltme </td></tr><tr><td></td><td> MDCK hücreleri </td><td> MDCK hücreleri, SIAT1 </td></tr><tr><td> 2 gün </td><td> 1: 5 (1 + 4) </td><td> 1:10 oranında (1 + 9) </td></tr><tr><td> 3 gün </td&gt; <td> 1:10 oranında (1 + 9) </td><td> 1:20 (1 + 19) </td></tr><tr><td colspan="3"> Ml başına hücre sayısı tipik </td></tr><tr><td></td><td> MDCK hücreleri </td><td> MDCK hücreleri, SIAT1 </td></tr><tr><td> 2 gün </td><td> 2 x 10 5 </td><td> 1 x 10 5 </td></tr><tr><td> 3 gün </td><td> 1 x 10 5 </td><td> 5 x 10 4 </td></tr></tbody></table> Tablo 1: MDCK veya MDCK-SIAT1 hücrelerinin Birleşik kaplardan bir altkültür üzerinde tipik dilüsyonları. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> kip </td><td> profesyonel Mod </td></tr><tr><td> Belge Türü </td><td> Film (Film Alan Rehberi) </td></tr><tr><td> Otomatik Poz Türü </td><td> Fotoğraf </td></tr><tr><td> Benyaş Tipi </td><td> 24-bit Renkli </td></tr><tr><td> çözüm </td><td> 1200 dpi </td></tr><tr><td> Kaydedilen görüntü Biçimi </td><td> TIFF </td></tr></tbody></table> Tablo 2: bir masaüstü tarayıcı Tipik kurulum. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> sıra </td><td> Virüs </td><td> Tavsiye edilen seyreltme </td></tr><tr><td> bir </td><td> A / Cameron / 15V-3538/2016 </td><td> 1.0 x 10 -2 </td></tr><tr><td> B </td><td> A / Vladivostok / 36/2015 </td><td> 1.0 x 10 -3 </td></tr><tr><td> C </td><td> A / Moskova / 103/2015 </td><td> 1.1 x 10 -1 </td></tr><tr><td> D </td><td> A / Tomsk / 5/2015 </td><td> 5.9 x 10 -1 </td></tr><tr><td> E </td><td> A / Moskova / 101/2015 </td><td> 8.3 x 10 -1 </td></tr><tr><td> F </td><td> A / Moskova / 100/2015 </td><td> 1.4 x 10 -2 </td></tr><tr><td> G </td><td> A / Moskova / 133/2015 </td><td> 1.3 x 10 -2 </td></tr><tr><td> H </td><td> A / Bratislava / 437/2015 </td><td> 1.3 x 10 -4 </td></tr></tbody></table> Tablo 3:% 30 ICP nüfusu hesaplanan Viral dilüsyonlar. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> sütun </td><td> antiserumlar </td><td> Önerilen titre </td></tr><tr><td> 1-2 </td><td> A / HK4801 / 2014 </td><td> 110 </td></tr><tr><td> 3-4 </td><td> A / HK7295 / 2014 </td><td> 213,3 </td></tr><tr><td&gt; 5-6 </td><td> A / Güney Afrika / R2665 / 2015 </td><td> 2155,8 </td></tr><tr><td> 7 - 8 </td><td> A / İsviçre / 9715293/2013 </td><td> 89.4 </td></tr><tr><td> 9 - 10 </td><td> A / Hollanda / 525/2014 </td><td> 78.6 </td></tr></tbody></table> Tablo 4: A / Stockholm% 50 ICP / antiserumlar karşı 63/2015 titreleri.

Watch this Scientific Journal Video about Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay at JoVE.com

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

Bu çalışma, bir açıklar görüntüleme bazlı mikro-nötralizasyon deneyi virüsler arasında antijenik ilişkileri analiz etmek. protokol düz yataklı tarayıcı kullanır ve titrasyon, titrasyon kantitatif, nötralizasyon ve nötralizasyon kantitatif olmak üzere dört adım vardır. Tahlil akımı dolaşan grip A (H1N1) pdm09, A (H3N2) ve B virüsleri ile iyi çalışır.

Bir Kantitatif Mikro-nötralizasyon Testi optimizasyonu

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

optimization-of-a-quantitative-micro-neutralization-assay

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

20.9K Görüntüleme.  The Francis Crick Institute.  Bu çalışma, bir açıklar görüntüleme bazlı mikro-nötralizasyon deneyi virüsler arasında antijenik ilişkileri analiz etmek. protokol düz yataklı tarayıcı kullanır ve titrasyon, titrasyon kantitatif, nötralizasyon ve nötralizasyon kantitatif olmak üzere dört adım vardır. Tahlil akımı dolaşan grip A (H1N1) pdm09, A (H3N2) ve B virüsleri ile iyi çalışır. 

Video: Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

Microtiter Dish Biofilm Formation Assay

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings. In fact, life in a biofilm probably represents the predominate mode of growth for microbes in most environments. Mature biofilms have a few distinct characteristics. Biofilm microbes are typically surrounded by an extracellular matrix that provides structure and protection to the community. Microbes growing in a biofilm also have a characteristic architecture generally comprised of macrocolonies (containing thousands of cells) surrounded by fluid-filled channels. Biofilm-grown microbes are also notorious for their resistance to a range of antimicrobial agents including clinically relevant antibiotics.
The microtiter dish assay is an important tool for the study of the early stages in biofilm formation, and has been applied primarily for the study of bacterial biofilms, although this assay has also been used to study fungal biofilm formation. Because this assay uses static, batch-growth conditions, it does not allow for the formation of the mature biofilms typically associated with flow cell systems. However, the assay has been effective at identifying many factors required for initiation of biofilm formation (i.e, flagella, pili, adhesins, enzymes involved in cyclic-di-GMP binding and metabolism) and well as genes involved in extracellular polysaccharide production. Furthermore, published work indicates that biofilms grown in microtiter dishes do develop some properties of mature biofilms, such a antibiotic tolerance and resistance to immune system effectors.
This simple microtiter dish assay allows for the formation of a biofilm on the wall and/or bottom of a microtiter dish. The high throughput nature of the assay makes it useful for genetic screens, as well as testing biofilm formation by multiple strains under various growth conditions. Variants of this assay have been used to assess early biofilm formation for a wide variety of microbes, including but not limited to, pseudomonads, Vibrio cholerae, Escherichia coli, staphylocci, enterococci, mycobacteria and fungi.
In the protocol described here, we will focus on the use of this assay to study biofilm formation by the model organism Pseudomonas aeruginosa. In this assay, the extent of biofilm formation is measured using the dye crystal violet (CV). However, a number of other colorimetric and metabolic stains have been reported for the quantification of biofilm formation using the microtiter plate assay. The ease, low cost and flexibility of the microtiter plate assay has made it a critical tool for the study of biofilms.

The assay describes a rapid means to measure early biofilm formation in bacteria and fungi. This method uses a microtiter plate as the substratum for microbial biofilm formation, and the biofilm is visualized using crystal violet strain. The assay provides either a qualitative or quantitative assay for early biofilm formation.

Microtiter Bulaşık Biyofilm Oluşumu Testi

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings.  In fact, life in a biofilm ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. Thus, in vivo imaging of malaria parasites during pre-erythrocytic stages have revealed the active entrance of parasites into skin lymph nodes 3, the complete development of the parasite in the skin 4, and the formation of a hepatocyte-derived merosome to assure migration and release of merozoites into the blood stream 5. Moreover, the development of individual parasites in erythrocytes has been recently documented using 4D imaging and challenged our current view on protein export in malaria 6. Thus, intravital imaging has radically changed our view on key events in Plasmodium development. Unfortunately, studies of the dynamic passage of malaria parasites through the spleen, a major lymphoid organ exquisitely adapted to clear infected red blood cells are lacking due to technical constraints.
Using the murine model of malaria Plasmodium yoelii in Balb/c mice, we have implemented intravital imaging of the spleen and reported a differential remodeling of it and adherence of parasitized red blood cells (pRBCs) to barrier cells of fibroblastic origin in the red pulp during infection with the non-lethal parasite line P.yoelii 17X as opposed to infections with the P.yoelii 17XL lethal parasite line 7. To reach these conclusions, a specific methodology using ImageJ free software was developed to enable characterization of the fast three-dimensional movement of single-pRBCs. Results obtained with this protocol allow determining velocity, directionality and residence time of parasites in the spleen, all parameters addressing adherence in vivo. In addition, we report the methodology for blood flow quantification using intravital microscopy and the use of different colouring agents to gain insight into the complex microcirculatory structure of the spleen. 
Ethics statement
All the animal studies were performed at the animal facilities of University of Barcelona in accordance with guidelines and protocols approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the University of Barcelona CEEA-UB (Protocol No DMAH: 5429). Female Balb/c mice of 6-8 weeks of age were obtained from Charles River Laboratories.

We show the method for performing intravital microscopy of the spleen using GFP transgenic malaria parasites and the quantification of parasite mobility and blood flow within this organ.

Dalak intravital Mikroskopi: Parazit Mobilite ve Kan Akımının Kantitatif Analiz

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular organisms towards a source of nutrients or away from unsuitable conditions, as well as in multicellular organisms for tissue development, immune surveillance and wound healing, just to mention a few roles1,2,3. Deregulation of this process can lead to serious neurological, cardiovascular and immunological diseases, as well as exacerbated tumor formation and spread4,5. Molecularly, actin polymerization and receptor recycling have been shown to play important roles in creating cellular extensions (lamellipodia), that drive the forward movement of the cell6,7,8. However, many biological questions about cell migration remain unanswered.
The central role for cellular motility in human health and disease underlines the importance of understanding the specific mechanisms involved in this process and makes accurate methods for evaluating cell motility particularly important. Microscopes are usually used to visualize the movement of cells. However, cells move rather slowly, making the quantitative measurement of cell migration a resource-consuming process requiring expensive cameras and software to create quantitative time-lapsed movies of motile cells. Therefore, the ability to perform a quantitative measurement of cell migration that is cost-effective, non-laborious, and that utilizes common laboratory equipment is a great need for many researchers.
The phagokinetic track motility assay utilizes the ability of a moving cell to clear gold particles from its path to create a measurable track on a colloidal gold-coated glass coverslip9,10. With the use of freely available software, multiple tracks can be evaluated for each treatment to accomplish statistical requirements. The assay can be utilized to assess motility of many cell types, such as cancer cells11,12, fibroblasts9, neutrophils13, skeletal muscle cells14, keratinocytes15, trophoblasts16, endothelial cells17, and monocytes10,18-22. The protocol involves the creation of slides coated with gold nanoparticles (Au&deg;) that are generated by a reduction of chloroauric acid (Au3+) by sodium citrate. This method was developed by Turkevich et al. in 195123 and then improved in the 1970s by Frens et al.24,25. As a result of this chemical reduction step, gold particles (10-20 nm in diameter) precipitate from the reaction mixture and can be applied to glass coverslips, which are then ready for use in cellular migration analyses9,26,27.
In general, the phagokinetic track motility assay is a quick, quantitative and easy measure of cellular motility. In addition, it can be utilized as a simple high-throughput assay, for use with cell types that are not amenable to time-lapsed imaging, as well as other uses depending on the needs of the researcher. Together, the ability to quantitatively measure cellular motility of multiple cell types without the need for expensive microscopes and software, along with the use of common laboratory equipment and chemicals, make the phagokinetic track motility assay a solid choice for scientists with an interest in understanding cellular motility.

The phagokinetic motility track assay is a method used to assess the movement of cells. Specifically, the assay measures chemokinesis (random cell motility) over time in a quantitative manner. The assay takes advantage of the ability of cells to create a measurable track of their movement on colloidal gold-coated coverslips.

Phagokinetic Parça Motilite Testi sayesinde Hücre Göç Kantitatif Değerlendirilmesi

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

A complex interaction between the immune response and host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in particular, is known to occur as a response to infection in mammals 1 and has also recently been described in Drosophila melanogaster2. It is generally accepted that sleep is beneficial to the host during an infection and that it is important for the maintenance of a robust immune system3,4. However, experimental evidence that supports this hypothesis is limited4, and the function of excess sleep during an immune response remains unclear. We have used a multidisciplinary approach to address this complex problem, and have conducted studies in the simple genetic model system, the fruitfly Drosophila melanogaster. We use a standard assay for measuring locomotor behavior and sleep in flies, and demonstrate how this assay is used to measure behavior in flies infected with a pathogenic strain of bacteria. This assay is also useful for monitoring the duration of survival in individual flies during an infection. Additional measures of immune function include the ability of flies to clear an infection and the activation of NF&kappa;B, a key transcription factor that is central to the innate immune response in Drosophila. Both survival outcome and bacterial clearance during infection together are indicators of resistance and tolerance to infection. Resistance refers to the ability of flies to clear an infection, while tolerance is defined as the ability of the host to limit damage from an infection and thereby survive despite high levels of pathogen within the system5. Real-time monitoring of NF&kappa;B activity during infection provides insight into a molecular mechanism of survival during infection. The use of Drosophila in these straightforward assays facilitates the genetic and molecular analyses of sleep and the immune response and how these two complex systems are reciprocally influenced.

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

To understand a link between the immune response and behavior, we describe a method to measure locomotor behavior in Drosophila during bacterial infection as well as the ability of flies to mount an immune response by monitoring survival, bacterial load, and real-time activity of a key regulator of innate immunity, NF&kappa;B.

İmmün Yanıt ve Uyku içinde kantitatif ölçümü<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

T Hücreleri İçin Kantitatif Yüksek throughput Tek hücreli Sitotoksisite Testi

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Neuroinflammation is a complex innate immune response vital to the healthy function of the central nervous system (CNS). Under normal conditions, an intricate network of inducers, detectors, and activators rapidly responds to neuron damage, infection or other immune infractions. This inflammation of immune cells is intimately associated with the pathology of neurodegenerative disorders, such as Parkinson&#39;s disease (PD), Alzheimer&#39;s disease and ALS. Under compromised disease states, chronic inflammation, intended to minimize neuron damage, may lead to an over-excitation of the immune cells, ultimately resulting in the exacerbation of disease progression. For example, loss of dopaminergic neurons in the midbrain, a hallmark of PD, is accelerated by the excessive activation of the inflammatory response. Though the cause of PD is largely unknown, exposure to environmental toxins has been implicated in the onset of sporadic cases. The herbicide paraquat, for example, has been shown to induce Parkinsonian-like pathology in several animal models, including Drosophila melanogaster. Here, we have used the conserved innate immune response in Drosophila to develop an assay capable of detecting varying levels of nitric oxide, a cell-signaling molecule critical to the activation of the inflammatory response cascade and targeted neuron death. Using paraquat-induced neuronal damage, we assess the impact of these immune insults on neuroinflammatory stimulation through the use of a novel, quantitative assay. Whole brains are fully extracted from flies either exposed to neurotoxins or of genotypes that elevate susceptibility to neurodegeneration then incubated in cell-culture media. Then, using the principles of the Griess reagent reaction, we are able to detect minor changes in the secretion of nitric oxide into cell-culture media, essentially creating a primary live-tissue model in a simple procedure. The utility of this model is amplified by the robust genetic and molecular complexity of Drosophila melanogaster, and this assay can be modified to be applicable to other Drosophila tissues or even other small, whole-organism inflammation models.

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Levels of the inflammatory cell-signaling molecule nitric oxide (NO) are commonly assayed using Griess reagent. In this protocol, we have created a modified Griess assay utilizing live Drosophila brain tissue in order to detect the secretion of NO in a simple, quantifiable and highly repeatable method.

Neuroinflammation is a complex innate immune response vital to the healthy function of the central nervous system (CNS). Under normal conditions, an ...

Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. During infection of the urinary bladder, polymorphonuclear leukocytes (PMN; neutrophils) migrate from the bloodstream and traverse the bladder epithelium. Failure to resolve infection in the absence of a neutrophilic response demonstrates the importance of PMN in bladder defense. To facilitate colonization of the bladder epithelium, uropathogenic Escherichia coli (UPEC), the causative agent of the majority of urinary tract infections (UTIs), dampen the acute inflammatory response using a variety of partially defined mechanisms. To further investigate the interplay between host and bacterial pathogen, we developed an in vitro model of this aspect of the innate immune response to UPEC. In the transuroepithelial neutrophil migration assay, a variation on the Boyden chamber, cultured bladder epithelial cells are grown to confluence on the underside of a permeable support. PMN are isolated from human venous blood and are applied to the basolateral side of the bladder epithelial cell layers. PMN migration representing the physiologically relevant basolateral-to-apical direction in response to bacterial infection or chemoattractant molecules is enumerated using a hemocytometer. This model can be used to investigate interactions between UPEC and eukaryotic cells as well as to interrogate the molecular requirements for the traversal of bladder epithelia by PMN. The transuroepithelial neutrophil migration model will further our understanding of the initial inflammatory response to UPEC in the bladder.

We developed an in vitro model that mimics an important component of the acute inflammatory response during infection of the bladder with uropathogenic Escherichia coli. The transuroepithelial neutrophil migration assay enables quantitative assessment of human neutrophil migration across bladder epithelia, cultured on permeable supports, in response to bacterial infection or chemoattractant substances.

Bir kültür Mesane EPİTELİ karşısında İnsan Nötrofil Göç Kantitatif Değerlendirilmesi

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

Yüksek verim Kantitatif Gerçek zamanlı RT-PCR Testi Türleri I ve III İnterferon Alttipleriyle İfadesi Profilleri belirlenmesi için

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

Nitel ve Nicel Saptanması için Tahliller ve Protein Antimikrobiyal karakterizasyonu

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Visualization of the Charcoal Agar Resazurin Assay for Semi-quantitative, Medium-throughput Enumeration of Mycobacteria

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the etiological agent of TB, is refractory to rapid and lasting chemotherapy due to the presence of bacilli exhibiting phenotypic drug resistance. The charcoal agar resazurin assay (CARA) was developed as a tool to characterize active molecules discovered by high-throughput screening campaigns against replicating and non-replicating M. tuberculosis. Inclusion of activated charcoal in bacteriologic agar medium helps mitigate the impact of compound carry-over, and eliminates the requirement to pre-dilute cells prior to spotting on CARA microplates. After a 7-10 day incubation period at 37 &#176;C, the reduction of resazurin by mycobacterial microcolonies growing on the surface of CARA microplate wells permits semi-quantitative assessment of bacterial numbers via fluorometry. The CARA detects approximately a 2-3 log10 difference in bacterial numbers and predicts a minimal bactericidal concentration leading to &#8805;99% bacterial kill (MBC&#8805;99). The CARA helps determine whether a molecule is active on bacilli that are replicating, non-replicating, or both. Pilot experiments using the CARA facilitate the identification of which concentration of test agent and time of compound exposure require further evaluation by colony forming unit (CFU) assays. In addition, the CARA can predict if replicating actives are bactericidal or bacteriostatic.

The charcoal agar resazurin assay (CARA) is a semi-quantitative, medium-throughput method to assess activity of test agents against mycobacteria that are replicating, non-replicating, or both. The CARA permits rapid evaluation of time- and concentration-dependent activity and identifies parameters to pursue by colony forming unit (CFU) assays.

Mikobakteriler Yarı kantitatif, Orta hacimli Sayımı İçin Kömür Agar Resazurin Testi görselleştirme

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the ...