Bu çalışmanın bir parçası NIH hibe R01 A1064826-01 U19 AI062627-01, NO1-HHSN26600500032C (SM için) desteklenir. Biz yazının eleştiri, tartışma ve teknik yardım için Tina Heil bizim laboratuar üyelere teşekkür etmek isterim. Biz David Bina, Milwaukee Sağlığı Anabilim Dalı Laboratuvarı virüs kültürü ve PCR için teşekkür etmek istiyorum.

<ol>
	<li>Hirst, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+agglutination+of+red+cells+by+allantoic+fluid+of+chick+embryos+infected+with+influenza+virus.">The agglutination of red cells by allantoic fluid of chick embryos infected with influenza virus.</a> Science. 94, 22-23 (1941).</li><li>Jonsson, N., Gullberg, M., Lindberg, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+polymerase+chain+reaction+as+a+rapid+and+efficient+alternative+to+estimation+of+picornavirus+titers+by+tissue+culture+infectious+dose+50%+or+plaque+forming+units.">Real-time polymerase chain reaction as a rapid and efficient alternative to estimation of picornavirus titers by tissue culture infectious dose 50% or plaque forming units.</a> Microbiol. Immunol. 53, 149-154 (2009).</li><li>Kalter, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemagglutinating+Behavior+of+Mouse+and+Egg-adapted+Type+A+(PR8)+Influenza+Virus.">Hemagglutinating Behavior of Mouse and Egg-adapted Type A (PR8) Influenza Virus.</a> Science. 110, 184-184 (1949).</li><li>Dulbecco, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Plaques+in+Monolayer+Tissue+Cultures+by+Single+Particles+of+an+Animal+Virus.">Production of Plaques in Monolayer Tissue Cultures by Single Particles of an Animal Virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 38, 747-752 (1952).</li><li>Deyde, V. M., Nguyen, T., Bright, R. A., Balish, A., Shu, B., Lindstrom, S., Klimov, A. I., Gubareva, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+molecular+markers+of+antiviral+resistance+in+influenza+A+(H5N1)+viruses+using+a+pyrosequencing+method.">Detection of molecular markers of antiviral resistance in influenza A (H5N1) viruses using a pyrosequencing method.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 53, 1039-1047 (2009).</li><li>Jonsson, N., Gullberg, M., Lindberg, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+polymerase+chain+reaction+as+a+rapid+and+efficient+alternative+to+estimation+of+picornavirus+titers+by+tissue+culture+infectious+dose+50%+or+plaque+forming+units.">Real-time polymerase chain reaction as a rapid and efficient alternative to estimation of picornavirus titers by tissue culture infectious dose 50% or plaque forming units.</a> Microbiol. Immunol. 53, 149-154 (2009).</li><li>Rahman, M., Kieke, B. A., Vandermause, M. F., Mitchell, P. D., Greenlee, R. T., Belongia, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+Directigen+flu+A+B+enzyme+immunoassay+and+direct+fluorescent+assay+for+detection+of+influenza+infection+during+the+2004-2005+season.">Performance of Directigen flu A+B enzyme immunoassay and direct fluorescent assay for detection of influenza infection during the 2004-2005 season.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 58, 413-418 (2007).</li><li>Landry, M. L., Ferguson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suboptimal+detection+of+influenza+virus+in+adults+by+the+Directigen+Flu+A+B+enzyme+immunoassay+and+correlation+of+results+with+the+number+of+antigen-positive+cells+detected+by+cytospin+immunofluorescence.">Suboptimal detection of influenza virus in adults by the Directigen Flu A+B enzyme immunoassay and correlation of results with the number of antigen-positive cells detected by cytospin immunofluorescence.</a> J. Clin. Microbiol. 41, 3407-3409 (2003).</li><li>Herrmann, B., Larsson, C., Zweygberg, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+and+typing+of+influenza+viruses+A+and+B+by+a+nested+reverse+transcription-PCR:+comparison+to+virus+isolation+and+antigen+detection+by+immunofluorescence+and+optical+immunoassay+(FLU+OIA).">Simultaneous detection and typing of influenza viruses A and B by a nested reverse transcription-PCR: comparison to virus isolation and antigen detection by immunofluorescence and optical immunoassay (FLU OIA).</a> J. Clin. Microbiol. 39, 134-138 (2001).</li><li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints.">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> Am. J. Epidemiol. 27, 493-497 (1938).</li><li>Doerr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins:+into+the+infrared.">Fluorescent proteins: into the infrared.</a> Nat. Meth. 6, 482-483 (2009).</li><li>Shu, B., Wu, K. H., Emery, S., Villanueva, J., Johnson, R., Guthrie, E., Berman, L., Warnes, C., Barnes, N., Klimov, A., Lindstrom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+performance+of+the+CDC+real-time+reverse+transcriptase+PCR+swine+flu+panel+for+detection+of+2009+A+(H1N1)+pandemic+influenza+virus.">Design and performance of the CDC real-time reverse transcriptase PCR swine flu panel for detection of 2009 A (H1N1) pandemic influenza virus.</a> J. Clin. Microbiol. 49, 2614-2619 (2011).</li></ol>

Biz ifşa şey var.

Güneydoğu Asya&#39;da kuş gribi ve domuz gribi salgını küresel bir korku son salgın patlak kamu sağlığı ve güvenliği için çok büyük endişeleri empoze. Eleştirel odak noktası mevcut ve yeni influenza virüs suşları için aşılar üretmek ithaf edilmiştir. Hassas algılama ve doğru viral titresinde hesaplamalar için hızlı, yüksek verimli teknolojilerin mevcudiyeti muazzam tedavi artıracaktır. Virüs titresi hesaplamak için kullanılan en sık kullanılan teknikler, plak oluşumu ve grip hemaglütinasyon testleri içerir. Plak oluşturan deneyi ilk bakteriyofaj titreleri tahmin etmek için geliştirilen ve hayvan viral titreler 4 hesaplamak için Renato Dulbecco tarafından kabul edilmiştir. ,, Bu assay gerçekleştirdiğinizde etmek için&gt;,, 6-well plakaları in,,, influenza hisse senedi ya da hayvansal numuneler:, bu tür BAL akışkan gibi of 10-fold seyreltiler hazırlanır uygulanır ve 0,1 ml &#39;&gt; alikotları,,, MDCK hücreleri of monolayer hızda aktarılması gibi son derece önemli özellikler inoküle edilmiş uygulanır. Virüs reklam takip MDCK hücreleri üzerine adsorbe izin verilirbir besin ortamında ve agaroz olduğunu belirtmektedir. İnkübasyon sırasında, orijinal enfekte olmuş hücrelerde sadece komşu hücrelere yayılan viral döl bırakın. : Sitopatojenik bir efekti:,, influenza viral bir enfeksiyon of,, bir teşekkür plaketi olarak adlandırılan, enfekte olmuş hücreleri of, bir dairesel bir bir bir dilimini oldu üretir. Her plak muhtemelen virüs çoğaltma tarafından tek bir virüs parçacık tek bir hücrenin enfeksiyonu sonrası oluşur. Canlı hücreler ve plaklar arasındaki kontrastı kristal viyole gibi boyalarla artabilir. Bu testin önemli bir dezavantajı, tekrarlanabilirlik ve deneyler içinde büyük farklılıklar olmaması. ,,, Influenza viral bir titresinde belirlemek etmek kullanılan Başka bir assay,,, bir hemaglüsinasyon assay konumundadır. ,,, Influenza virüs of yüzey on The hemagglutinin bir protein şimdiki, verimli bir şekilde,,,,, memeli ve avian bir, kırmızı kan hücreleri 1 on N-asetilnöraminik ait, asit-ihtiva eden proteinleri etmek de de bağlar. ,,,,: Influenza virus: ve da aglütinasyon, eritrositlerde tarihleri ​​arasında Bu, bir etkileşim,,, bir lattice of arama formunu, in agglutination etmek yol açar. The Lagglutinasyon evel test örneklerinde influenza virüsü titresi tahmin etmek için kullanılır. Eritrosit agglutination assay, Malzemenin, bir için, da bilinir bir virüs of titrasyon belirlemek etmek,, yalnızca olarak kullanılan edilir ve,, strain tanımlama amaçlarla için kullanılan uygulanmaz değil edebilirsiniz.. Bu deneyde canlı ve ölü virüsler arasında ayrım yapmaz bu yana, viral titreleri kesin bir hesaplama elde etmek zordur. Gribal enfeksiyonlar Mevcut klinik tanı, serolojik testler, polimeraz zincir reaksiyonu, doğrudan numune immünfloresans ve hücre kültürü 1,6 dayanmaktadır. Burada açıklanan yeni bir yöntem, aynı zamanda klinik ve laboratuvar tanı potansiyeline sahiptir. Grip algılama kitleri Directigen FLU-A,, nükleoprotein 7 gibi viral antijen tespit etmek için (BD Biosciences, San Jose, CA) ve BinaxNow (Binax, Inc, Scarborough, ME) kullanımı immunakromatogrfi tahlil. , Virüs tespiti, bu kitleri kullanılarak 15 dakika içinde elde edilebilir, ancak tüm olumsuz örnekleri daha s olmasıDiğer: hücre kültürü: İçerikler üzerine yöntemini kullanıcısı tarafından creened. Çeşitli çalışmalar da enfeksiyon hafif veya 8 düşük olduğunu, özellikle bu kitler düşük hassasiyet, bildirdin. Geliştirilen yöntemde, sürekli olarak virüs gibi düşük olarak 100 PFU algılar. Bu,, bulaşmasına hafif bir konumundadır hatta, ne zaman bizim tekniktir,,, klinik numuneleri in H1N1 bir virüs saptamada in yararlı bir, konumundadır, da anlaşılacağı. ,, Ya da nazofarengeal bir aspirat, numuneler doğrudan doğruya olarak analiz edildi, ya da,,,, virüs çarpma ve müteakip analizler 9, için yatkındır hücreleri of, bir monolayer üzerine inoküle edilmiş edildi nerede,, viral bir antijenleri algılamak kullanıcılar etmek A floresans-tabanlı bir yöntemini, bildirdin, edilmiştir. Bununla birlikte,, bu yöntemlerden,,, tanısal amaçlarla için sınırlıdır ve, virüs titresinde hesaplamalar için uygun bir değil şunlardır? Uygulanır. , Q-PCR ile,,,, viral bir RNA, of varlığında tanımlamak etmek yardımcı olur ve,, canlı bir virüsler of enfektivite tahmin ediyoruz değil bulunmamış. Bu testler karşılaştırıldığında, IR boya bazlı analiz sistemi, klinik ve laboratuvar örnekleri algılama ve viral titre numaralandırma, yardımcı olacaktır. Grip salgını durumunda, bukısa bir süre içinde binlerce örnek teşhis etmek önemlidir. 384-plaka ve IR tarayıcı dayalı Bizim yöntemi, bu nedenle diğer direkt floresan yöntemlerine göre daha fazla avantaj sunan bir süre (&gt; 2.000 örnekleri) 6 plakaları tarayabilir. Binlerce klinik örneklerin hızlı işlem Fizibilite testi zaman ve maliyet test değişkenliği, süresini azaltabilir. ,, Bir M2-belirli bir bir antikor of kullanımını,,,,,, H ve N proteinleri in strain farklılıkları of bağımsız bir olmanın of avantajı, sunmaktadır. M2 proteini nispeten insanlara bulaşmasını en influenza suşlarına korunur. Dolaşan lekeler için özel antikorlar sistemi ile kombine edilmesi durumunda bir virüs titresi ölçmek ve zorlanma tespit edebilir. Ancak,, M2 Amantadin benzeri ilaçlar için bir hedef olduğundan, mutantlar, burada kullanılan, mAb için bağlayıcı bir site değişebilir ortaya çıkabilir. Bu, bu ilaçlarla tedavi edilen bireylerde bu sistem için potansiyel bir sınırlama ifade eder. Çokludeneyleri,,,, test örnekleri içinde influenza titreleri numaralandırılamadı kullanıcılar etmek kullanılır uygulanır. Virüs titresi,% 50 doku kültürü enfeksiyöz dozu (TCID 50) ve yumurta allantoik sıvı tabanlı testleri hesaplamak için yaygın olarak 1,10 kullanılmaktadır. Ancak, birden fazla gün gereksinimleri bu yöntemler daha az güvenilir olun. Dahası,, bu yöntemlerden, in,,,,,, plaklarla of numarasını in% 50 oranında değişikliği on dayanır hesaplamalar,, teorik bir, ancak doğru bir değil viral bir titrasyonlarını sağlamak. Plak testleri oluşturan 96 saat içinde yapılabilir, ancak tekrarlanabilirliği eksikliği, viral titre hesaplamalarda önemli bir husustur. Burada anlatılan bu tekniği birkaç belirgin avantajları vardır. İlk olarak, tutarlı sonuçlar ile yüksek oranda tekrarlanabilir bir tekniktir. İkincisi, viral titre hesaplamaları tanımlanmış standart eğrileri karşılaştırılarak floresan yoğunluklarına basit miktar dayanmaktadır. Üçüncü olarak,,, iki ya da daha fazla çok birincil antikorlar,,, verilen, bir numune in birden çok serotiplerinin tanılamanıza kullanıcılar etmek kullanılan uygulanmaz edebilirsiniz. Ayrıca, IR boya-konjuge antikorların damlaark otoflöresansının değerlendirilmesi ve hücre imajlama 11, için kullanılan&gt; edilmiştir&gt; adres. Varlığı yüksek kuantum verimli endojen florofor nedeniyle yüksek hücresel otofloresans UV veya görsel radyasyon (300-600 nM&#39;den) sonuçları. Bunlar,,,, aromatik bir amino asitler, lipo-pigmentleri, pyridinic. Nükleotidlerle (NADPH.), Elastin, kollajen ve flavin koenzimlerinin şunlardır. Hücreleri of Bu, intrinsik bir bir mülkiyet,,, spesifik proteinlerin of, probes bir ekspresyonu quantify etmek gibi dolu sunucular, it zor bir,, radyasyon of, bu kaynaklardan yararlanmak olan etmek hale getirir. Kontrast yılında,, yakınındaki-IR boyalar,,, heyecanlandırabilir ve 670-1000 nm tarihleri ​​arasında yayarlar. Birçok konağın hücresel moleküllerin ve poliaromatik hidrokarbonlar bu dalga boyunda heyecanlandırmak ve düşük ışık saçılması nedeniyle, son derece düşük eşiğe yaymaz. Dahası,,, arka plan ve belirli bir bir algılama tarihleri ​​arasında window,,, büyük ölçüde,,,, yakınındaki-IR florofor gruplarının, of, bir, yüksek bir soyu tükenme katsayısı, etmek nedeniyle artırıldı edilir. , Üstün sinyal-gürültü oranı, Fotostabilite viral titreleri nicelleştirmesinde son derece uygundur. Microfl of kullanınuidic odaları robotik kontroller aracılığıyla tarama işlemi otomatik olacak ve kullanım kolaylığı ile bize son derece bulaşıcı bir klinik test etmek için izin verebilir. Böylece, bu yöntemlerin yakın IR boyaların kullanımı doku örneklerinde viral titreleri numaralandırmak için ideal ve son derece güvenilir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Sığır serum albümin </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11750 </td><td></td></tr><tr><td> PR8 virüs </td><td></td><td></td><td> Dr Thomas M Moran itibaren </td></tr><tr><td> Keçi anti-fare IRDye @ 800 </td><td> LI-COR biyoloji </td><td> 926-32210 </td><td> 1:200 oranında seyreltildiğinde </td></tr><tr><td> LI-COR Odyssey IR tarayıcı </td><td> LI-COR-biyoloji </td><td> 9201-01 </td><td></td></tr><tr><td> 384-kuyu düz alt plaka </td><td> Nalge Nunc uluslararası </td><td> 164730 </td><td></td></tr><tr><td> 96-kuyu düz alt plaka </td><td> Nalge Nunc uluslararası </td><td> 165305 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM besiyeri ortamında </td><td> Invitrogen </td><td> 11965126 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI medyumu </td><td> Invitrogen </td><td> 11875135 </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum bikarbonat </td><td> Invitrogen </td><td> 25080 </td><td></td></tr><tr><td> L-glutamin 100x </td><td> Invitrogen </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> Trypson-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> R001100 </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum Piruvat </td><td> Invitrogen </td><td> 11360070 </td><td></td></tr><tr><td> Anti--, M-2 antikor </td><td></td><td></td><td> Dr Thomas M Moran itibaren </td></tr><tr><td> Anti--NP mAb </td><td> CDC </td><td> V2S2208 </td><td> Bir MTA ile elde </td></tr></tbody></table>

high-throughput detection method for influenza virus

Grip virüsü Dünyanın birçok yerlerinde her yıl morbidite ve mortalitesi yüksek derecede neden olan bir solunum yolu patojen. Bu nedenle, kesin tanı klinik örneklerden çok büyük sayıda bulaşmasını gerginlik ve hızlı yüksek verimlilik tarama pandemik enfeksiyonların yayılmasını kontrol etmek için her şeyden önemlidir. Gribal enfeksiyonlar Mevcut klinik tanı, serolojik testler, polimeraz zincir reaksiyonu, doğrudan numune immünfloresans ve hücre kültürü 1,2 dayanmaktadır. Burada, canlı grip virüsleri tespit etmek için kullanılan yeni bir teşhis tekniği geliştirme sunduk. Biz MDCK hücreleri kullanarak 4 Bu tekniğin etkinliğini test etmek için fare-uyarlanmış insan A/PR/8/34, (PR8, H1N1) virüsü 3 kullanılır. MDCK hücreleri (yanı 10, 4 ya da 5 - başı gecelik x 10 3) Mayıs,, 96 aşağıdakilerle in kültürlenen edildi - ya da,, PR8. Ve viral proteinler sentezlenir ile birlikte bulaşmışsa 384-well bir plakaları,,,,, bir IR bir dye-konjuge edilmiş sec tarafından, anti--M2 izledi kullanarak algıladı &#39;de edildisekonder antikor. , M2 5 ve - hemagglutinin 1,,,,, pek çok farklı bir tanısal deneyleri in kullanılan iki adet major işaretleyici proteinleri şunlardır. Istihdam IR-boya-konjuge sekonder antikorlar, diğer floresan boyalar ile ilişkili otofloresans en aza indirir. , Anti--M2 antikor of kullanımını,,, bize,, viral bir nicelik of, bir doğrudan bir bir bir metrik gibi antijen-belirli bir bir bir floresans bir yoğunluğunu kullanmak etmek, izin verilen. Floresan yoğunluğu numaralandırmak için, biz LI-COR Odyssey tabanlı IR tarayıcı kullanılır. Bu sistem florofor tespit ve arka plan gürültüsü onları ayırt etmek için iki kanal lazer tabanlı IR tespitlerde kullanır. Birinci kanal, 680 nm dalga boyunda heyecanlandıran ve arka plan ölçmek yardımcı olmak üzere 700 nm dalga boyunda yayar. Ikinci kanal 780 nm florofor heyecanlı bir şekilde algılar ve 800 nm dalga boyunda yayar. IR tarayıcı, PR8-enfekte MDCK hücrelerin viral titre-bağımlı parlak floresan Tarama belirtti. 10 2 -10 5 PFU itibaren virüs titresi floresans şiddetinin pozitif bir korelasyon con olabilirsistently gözlenmiştir. 10 2 -10 3 PFU PR8 viral titreler yakın-IR boyalar yüksek hassasiyet göstermiştir Minimal fakat fark pozitifliği ile tutarlı görülmektedir. Sinyal-gürültü oranı mock-enfekte veya izotip antikor tedavi MDCK hücreleri karşılaştırarak tespit edilmiştir. 96 floresan yoğunluklarına kullanarak veya 384-plaka biçimleri, standart titrasyon eğrileri inşa edilmiştir. Bu hesaplamalarda, ilk değişken İkinci değişken floresan yoğunluğu ise viral titre. Bu nedenle,, polinom viral titreleri ve floresan yoğunluklarına arasında ilişkiyi belirlemek için bir eğri-fit oluşturmak için üstel dağılım kullanılır. Topluca, IR boya bazlı protein algılama sistemi viral suşlar bulaşmasını teşhis ve hassas bulaşmasını patojenlerin titresi numaralandırmak yardımcı olabileceği sonucuna varıldı.

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Detection Method for Influenza Virus at JoVE.com

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Bu yöntem, yüksek hassasiyet enfekte olmuş fareler bronkoalveoler lavaj (BAL) sıvısında H1N1 tespiti için Kızılötesi boya temelli görüntüleme sisteminin kullanımı açıklanmaktadır. Bu metodoloji, bir 96 veya plaka 384-iyi, test malzemesi &lt;10 ul hacmi gerektirir ve birden fazla patojenlerin eşzamanlı tarama için bir potansiyele sahiptir.

Gribi için yüksek verimlilik Tespit Yöntemi

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

high-throughput-detection-method-for-influenza-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

26.0K Görüntüleme.  Blood Research Institute. Bu yöntem, yüksek hassasiyet enfekte olmuş fareler bronkoalveoler lavaj (BAL) sıvısında H1N1 tespiti için Kızılötesi boya temelli görüntüleme sisteminin kullanımı açıklanmaktadır. Bu metodoloji, bir 96 veya plaka 384-iyi, test malzemesi 

Video: High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

Plazmid DNA Rekombinant Grip Virüsü Üretimi

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

Yılları arasında sinerjistik Araştırma Bioluminescent Görüntüleme kullanma Streptococcus pneumoniae Bebek Fare ve İnfluenza A Virüsü

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

ampliPHOX Colorimetric Detection on a DNA Microarray for Influenza

DNA microarrays have emerged as a powerful tool for pathogen detection.1-5 For instance, many examples of the ability to type and subtype influenza virus have been demonstrated.6-11 The identification and subtyping of influenza on DNA microarrays has applications in both public health and the clinic for early detection, rapid intervention, and minimizing the impact of an influenza pandemic. Traditional fluorescence is currently the most commonly used microarray detection method. However, as microarray technology progresses towards clinical use,1 replacing expensive instrumentation with low cost detection technology exhibiting similar performance characteristics to fluorescence will make microarray assays more attractive and cost-effective.
The ampliPHOX colorimetric detection technology is intended for research applications, and has a limit of detection within one order of magnitude of traditional fluorescence11, with a main advantage being an approximate ten-fold lower instrument cost compared to the confocal microarray scanners required for fluorescence microarray detection. Another advantage is the compact size of the instrument which allows for portability and flexibility, unlike traditional fluorescence instruments. Because the polymerization technology is not as inherently linear as fluorescence detection, however, it is best suited for lower density microarray applications in which a yes/no answer for the presence of a certain sequence is desired, such as for pathogen detection arrays. Currently the maximum spot density compatible with ampliPHOX detection is &tilde;1800 spots/array. Because of the spot density limitations, higher density microarrays are not suitable for ampliPHOX detection.
Here, we present ampliPHOX colorimetric detection technology as a method of signal amplification on a low density microarray developed for the detection and characterization of influenza viruses (FluChip). Although this protocol uses the FluChip (a DNA microarray) as one specific application of ampliPHOX detection, any microarray incorporating biotinylated target can be labeled and detected in a similar manner. The microarray design and biotinylation of the target to be captured are the responsibility of the user. Once the biotinylated target has been captured on the array, ampliPHOX detection can be performed by first tagging the array with a streptavidin-label conjugate (ampliTAG). Upon light exposure using the ampliPHOX Reader instrument, polymerization of a monomer solution (ampliPHY) occurs only in regions containing ampliTAG-labeled targets. The polymer formed can be subsequently stained with a non-toxic solution to improve visual contrast, followed by imaging and analysis using a simple software package (ampliVIEW). The entire FluChip assay from un-extracted sample to result can be performed in about 6 hours, and the ampliPHOX detection steps described above can be completed in about 30 min.

ampliPHOX colorimetric detection technology is presented as an inexpensive alternative to fluorescence detection for microarrays. Based on photopolymerization, ampliPHOX produces solid polymer spots visible to the naked eye in just a few minutes. Results are then imaged and automatically interpreted with a simple yet powerful software package.

Grip için DNA Mikroarray ampliPHOX Kolorimetrik Algılama

DNA microarrays have emerged as a powerful tool for pathogen detection.1-5  For instance, many examples of the ability to type and subtype influenza virus ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

Embriyone Tavuk Yumurta Grip Virüsü Yayılım

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and new strains are continually emerging. Swine are able to be infected by diverse lineages of influenza A virus making them important hosts for the emergence and maintenance of novel influenza A virus strains. Sampling pigs in diverse settings such as commercial swine farms, agricultural fairs, and live animal markets is important to provide a comprehensive view of currently circulating IAV strains. The current gold-standard ante-mortem sampling technique (i.e. collection of nasal swabs) is labor intensive because it requires physical restraint of the pigs. Nasal wipes involve rubbing a piece of fabric across the snout of the pig with minimal to no restraint of the animal. The nasal wipe procedure is simple to perform and does not require personnel with professional veterinary or animal handling training. While slightly less sensitive than nasal swabs, virus detection and isolation rates are adequate to make nasal wipes a viable alternative for sampling individual pigs when low stress sampling methods are required. The proceeding protocol outlines the steps needed to collect a viable nasal wipe from an individual pig.

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

Domuz influenza A virüs Algılama ve İzolasyonu için Burun Mendil

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

Gradient Santrifüj tarafından İnfluenza A Virüsü Kapsidlerin Vitro Demontaj içinde

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of combining reactions together. We designed and evaluated a panel based on this principle to rapidly identify the presence of common disease agents in dogs and horses with acute respiratory illness. This manuscript describes a nanoscale diagnostic PCR workflow for sample preparation, amplification, and analysis of target pathogen sequences, focusing on procedures that are different from microliter scale reactions. In the respiratory panel presented, 18 assays were each set up in triplicate, accommodating up to 48 samples per plate. A universal extraction and pre-amplification workflow was optimized for high-throughput sample preparation to accommodate multiple matrices and DNA and RNA based pathogens. Representative data are presented for one RNA target (influenza A matrix) and one DNA target (equine herpesvirus 1). The ability to quickly and accurately test for a comprehensive, syndrome-based group of pathogens is a valuable tool for improving efficiency and ergonomics of diagnostic testing and for acute respiratory disease diagnosis and management.

High-throughput testing of DNA and RNA based pathogens by nanoscale PCR is described using a syndromic canine and equine respiratory PCR panel.

Nano PCR ile Hayvan Örnekler Solunum Patojenler yüksek verimlilik Algılama

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone considering direct medical and hospitalization expenses and work absenteeism2. Animal models are crucial in Influenza A virus (IAV) studies to evaluate viral pathogenesis, host-pathogen interactions, immune responses, and the efficacy of current and/or novel vaccine approaches as well as antivirals. Mice are an advantageous small animal model because their immune system is evolutionarily similar to that found in humans, they are available from commercial vendors as genetically identical subjects, there are multiple strains that can be exploited to evaluate the genetic basis of infections, and they are relatively inexpensive and easy to manipulate. To recapitulate IAV infection in humans via the airways, mice are first anesthetized prior to intranasal inoculation with infectious IAVs under proper biosafety containment. After infection, the pathogenesis of IAVs is determined by monitoring daily the morbidity (body weight loss) and mortality (survival) rate. In addition, viral pathogenesis can also be evaluated by assessing virus replication in the upper (nasal mucosa) or lower (lungs) respiratory tract of infected mice. Humoral responses upon IAV infection can be rapidly evaluated by non-invasive bleeding and secondary antibody detection assays aimed at detecting the presence of total or neutralizing antibodies. Here, we describe the common methods used to infect mice intranasally (i.n) with IAV and evaluate pathogenesis, humoral immune responses and protection efficacy.

Influenza A viruses (IAVs) are important human respiratory pathogens. To understand the pathogenicity of IAVs and to perform preclinical testing of novel vaccine approaches, animal models mimicking human physiology are required. Here, we describe techniques to evaluate IAV pathogenesis, humoral responses and vaccine efficacy using a mouse model of infection.

Grip A virüs enfeksiyonu bir fare modeli çalışmalarda

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface glycoproteins of the virus. The generation of escape variants is a powerful method in elucidating how viruses escape immune detection and in identifying critical residues required for antibody binding. Here, we describe a protocol on how to generate influenza A virus escape variants by utilizing human or murine monoclonal antibodies (mAbs) directed against the viral hemagglutinin (HA). With the use of our technique, we previously characterized critical residues required for the binding of antibodies targeting either the head or stalk of the novel avian H7N9 HA. The protocol can be easily adapted for other virus systems. Analyses of escape variants are important for modeling antigenic drift, determining single nucleotide polymorphisms (SNPs) conferring resistance and virus fitness, and in the designing of vaccines and/or therapeutics.

We describe a method by which we identify critical residues required for the binding of human or murine monoclonal antibodies that target the viral hemagglutinin of influenza A viruses. The protocol can be adapted to other virus surface glycoproteins and their corresponding neutralizing antibodies.

Grip virüsü monoklonal antikorları nötralize kaçış türevleri üretimi

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for the rapid bedside inactivation of the Ebola virus during blood sampling for safe nucleic acid (NA) tests by adding a commercial lysis/binding buffer directly into the vacuum blood collection tubes. Using this bedside inactivation approach, we have developed a safe, rapid, and simplified bedside NA extraction method for the subsequent detection of a virus in lysis/binding buffer-inactivated whole blood. The NA extraction is directly performed in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. 
After the blood is collected into the lysis/binding buffer, the contents are mixed by flipping the tube by hand, and the mixture is incubated for 20 min at room temperature. Magnetic glass particles (MGPs) are added to the tube, and the contents are mixed by flipping the collection tube by hand. The MGPs are then collected on the side of the blood collection tube using a magnetic holder or a magnet and a rubber band. The MGPs are washed three times, and after the addition of elution buffer directly into the collection tube, the NAs are ready for NA tests, such as qPCR or isothermal loop amplification (LAMP), without the removal of the MGPs from the reaction. The NA extraction method is not dependent on any laboratory facilities and can easily be used anywhere (e.g., in field hospitals and hospital isolation wards). When this NA extraction method is combined with LAMP and a portable instrument, a diagnosis can be obtained within 40 min of the blood collection.

Here, we present a protocol for the rapid virus nucleic acid extraction from the virus-inactivated whole blood. The extraction is performed directly in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. The method is not dependent on laboratory facilities and can be used anywhere (e.g., in field hospitals).

Tam kan örneklerinde virüs tespiti için hızlı, güvenli ve basit el ile başucu nükleik asit çıkarma

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...