Name: an acute retinal model for evaluating blood retinal barrier breach and potential drugs for treatment
Uploaded: 2016-09-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment at JoVE.com

Bringhurst Meats (Berlin, NJ) is acknowledged for their genuine help in providing the swine eyeballs.

Tüm protokoller geçerli nereye Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi politikalarına uygun yürütülmüştür. 1. Hazırlık <ol><li> % 75 ile sabitleme ortamı hazırlamak Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM),% 25 Hanks dengeli tuz çözeltisi (HBSS). kullanılana kadar -20 ° C&#39;de, iyi kısım ve mağaza karıştırın. </li><li> Fosfat tamponlu tuz (PBS) hazırlanması ve otoklavda sterilize edilir. Oda sıcaklığında çözüm saklayın. Deney (oyuk başına 5 mi) daha önce 37 ° C&#39;ye kadar PBS ısıtın. </li><li> % 10,% 20 ve PBS içinde% 30 sukroz hazırlayın. ayrı sterilizasyon için ayrı 0.22 mikron filtre üzerinden tüm çözümleri filtre. 4 ° C&#39;de çözüm kaydedin. </li><li> 90 mM&#39;lik bir konsantrasyona kadar PBS içinde histamin stok çözelti hazırlayın. 0.22 uM filtre üzerinde filtre edilerek çözelti sterilize edin. Kısım ve -80 ° C&#39;da, çözelti kaydedin. Birden fazla donma-ve-çözülme döngüleri kaçının. </li><li> deneyden önce PBS içinde taze% 4 paraformaldehid (PFA) yapın. Buz üzerine yerleştirin. Dikkat: Davlumbaz PFA tutun ve uygun koruyucu ekipman giyin. </li><li> stabilizasyon orta (retinanın başına 20 ml) çözülme. 100 U / ml bir son konsantrasyona kadar Penisilin-Streptomisin ekleyin. Deney öncesi bir inkübatörde 37 ° C&#39;ye kadar ortam (retinanın başına 15 mi) sıcak bölümü. buz üzerinde orta kalanı bırakın. </li><li> buz üzerinde HBSS (retinanın başına 10 ml) koyun. </li></ol> 2. Retina Organotipik Kültür <ol><li> Bir doku kültürü kaputu örnekleri aktarın. lensin etrafında keserek Göz yuvası açın. Bir fırça yardımıyla hafifçe retina üzerine çekerek olmadan vitreus mizah kaldırın. Yavaşça optik diski ortaya çıkarmak için bir fırça ile kesilmiş kenarından retina ayırın. optik bir ustura ile sinir ve retina serbest ağır. </li><li> Petri kabı içine retina aktarın ve dikkatle soğuk HBSS kullanarak bir kez retina durulayın. i üzerinde HBSS örnek yerleştirince. Adım 2.1 ve bu adımı tekrarlayarak gerektiği kadar retina parçalara ayır. </li><li> simetrik bir jilet ile ikiye retina kesti. Yavaşça sabitleme ortamının 3 ml 6 yuvalı bir plaka örnekleri transferi ile sabitleştirilir. % 5 CO2 içeren bir atmosfer ile bir inkübatör içinde 37 ° C&#39;de 30 dakika boyunca dengede izin verin. </li><li> Adım 2.3 de inkübasyon sırasında aşağıdaki reaktifler hazırlayın: sıcak ortamda istenen konsantrasyona (450 uM) histamin stok solüsyonu sulandırınız. 250 ng / ml &#39;lik bir nihai konsantrasyona kadar bir ortamda (argon altında saklanan) LXA4 çözülür. Not: LXA4 etkisini ölçerken, diğer yarısı LXA4 ile histamin kullanılır ise, tek bir retina yarısı tek başına histamin kullanılır. </li><li> dikkatli bir şekilde sabitleme ortamı aspire ve her bir (oyuk başına 3 mi) hazırlanan orta ekleyin. % 5 CO2 içeren bir atmosfer ile bir kuluçka makinesi içinde, 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> durulamabir zamanlar sıcak, steril PBS örnekler. </li></ol> 3. immün için Örnekleri hazırlayın <ol><li> plakalardan aspire PBS. % 4 PFA (oyuk başına 3 mi) ilave edilir ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir. </li><li> Çabuk PFA aspire. bir zamanlar PBS kullanarak örnekleri durulayın. % 10 sakaroza örnekleri (oyuk başına 5 mi) aktarın ve 4 ° C&#39;de 2 saat ila 4 inkübe edilir. </li><li> % 30 sukroz (oyuk başına 5 mi) örnekleri aktarın ve 4 ° C&#39;de gece boyunca inkübe edilir. Çalışma donma orta yapmak için% 20 sukroz, iki parça ticari dondurma orta bir bölümünü karıştırın. kabarcıklar kaybolur hava kadar 4 ° C gecede veya daha uzun bırakın. </li><li> Çalışma dondurma ortamı örnekleri aktarın ve oda sıcaklığında 5 dakika için dengeleme sağlar. dikdörtgenler içine her retina (5 mm kabaca 3 mm) Trim. </li><li> Dikkatle silindirik bir kap (yaklaşık 1 cm çapında x 2 cm yükseklik) dev içerdiği çalışan dondurma ortama örnekleri aktarmakAlüminyum folyodan ised. retina dilimleri ve sıvı nitrojen içinde bunları dondurmak (Kesit üzerine retinanın bir kesitini sağlamaya yönelik) dik olduğundan emin olun. kullanılana kadar -80 ° C &#39;de bloklar kaydedin. </li><li> Bölüm her 14 mikron kalınlığında dilimler halinde bir kriyostat blok ve cam slaytlar bölümleri monte edin. kullanılana kadar -80 ° C &#39;de slaytlar saklayın. </li></ol> 4. immün <ol><li> bir kez% 5 sakaroz fosfat tamponu (SPB, PBS içinde% 5 sukroz, pH 7.4) ile bölümleri yıkayın. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca (% 10 normal keçi serumu ve% 0.5 Triton X-100 ile% 5 SPB) blokaj tamponunda bölümleri inkübe edilerek spesifik olmayan bağlanma yerlerini bloke. </li><li> Uygun primer antikor ile (slaytlar üzerinde) bölümleri inkübe (1&#39;de seyreltilmiş GFAP ya MAP2&#39;nin: 500 bloklama tamponu içinde) 1 saat boyunca. çözüm aspire. % 5 SPB içinde üç kez yıkayın. endojen IgG boyama için, bu adımı atlayın. </li><li> İlgili secon ile bölümleri inkübe1 saat: dary antikorlar (bloke edici tampon içinde 800 Cyanine3 / FITC konjüge edilmiş eşek anti-fare / anti-tavşan IgG, 1 seyreltilmiş). </li><li> iyice% 5 SPB üç kez bölümleri yıkayın. orta montaj DAPI içeren ve lamelleri ile kaplama onları monte edilerek mikroskopi için örnekler hazırlayın. </li><li> Gruplar arasında, vb kalma süresi, lazer yoğunluğu, kazanç değeri olarak aynı parametreleri altında 20X merceğinden bir lazer konfokal mikroskop, yakalama görüntüleri kullanma. 488/525 nm olarak 561/785 nm olarak (Cyanine3 algılamak için) kırmızı kanal için, 408/447 nm olarak (DAPI tespit etmek) ve yeşil kanal için (FITC algılamak için) mavi kanal için uyarma / emisyon dalga boylarını ayarlamak . </li></ol> 5. Görüntü Analizi <ol><li> Aşağıdaki kriterlere 12&#39;ye göre sızdıran kan damarlarının yüzdesini ölçmek: sayısında bölümün düzlemi içinde endotel hücre çekirdekleri ile sadece kan damarları dahil; o ag gösterirse bir kan damarı sızan düşününkabı çevreleyen immün radient. </li><li> ifade seviyesini belirlemek için, ilgi alanları seçmek ve görüntü analizi yazılımı kullanılarak ortalama gri değeri ölçmek. </li><li> sürecin genişliğini ölçmek için, süreçler (örneğin dış çekirdek katmanı, onl) farklı olan bölümün bir alanı seçin. Sonra bu süreçler görünür ve sürekli olan bir optik alanı seçin. Mikroskobik ayarına göre ölçek çıtayı süreci boyunca bir çizgi çizin ve ölçümü yapmak. </li><li> sürecin devamlılığını analiz etmek için, ilgi seçkin bölgeleri, komşuluk varyans ile her pikseli değiştirerek Görüntüdeki kenarları artırır varyans denilen filtre uygulamak, otomatik olarak, kontrast ve parlaklık ayarı satırları saymak tarafından sayımı normale Konum. </li><li> İki kuyruklu Student t-testi kullanılarak istatistiksel anlamlara hesaplayın. * P &lt;0.05; ** P &lt;0.01; *** P &lt;0.001. Plot Mean olarak sonuç SEM ±. </li></ol>

<ol>
	<li>Cunha-Vaz, J., Bernardes, R., Lobo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-retinal+barrier.">Blood-retinal barrier.</a> J Ophthalmol. 21, 3 (2011).</li><li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-neural+barrier:+intercellular+communication+at+glio-vascular+interface.">Blood-neural barrier: intercellular communication at glio-vascular interface.</a> J Biochem Molec Biol. 39, 339-345 (2006).</li><li>Kumagai, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+transport+in+brain+and+retina:+implications+in+the+management+and+complications+of+diabetes.">Glucose transport in brain and retina: implications in the management and complications of diabetes.</a> Diabetes Metab Res Rev. 15, 261-273 (1999).</li><li>Runkle, E. A., Antonetti, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-retinal+barrier:+structure+and+functional+significance.">The blood-retinal barrier: structure and functional significance.</a> Methods Molec Biol. 686, 133-148 (2011).</li><li>Takata, K., Hirano, H., Kasahara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+of+glucose+across+the+blood-tissue+barriers.">Transport of glucose across the blood-tissue barriers.</a> Int Rev Cytol. 172, 1-53 (1997).</li><li>Goncalves, A., Ambrosio, A. F., Fernandes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+claudins+in+blood-tissue+barriers+under+physiological+and+pathological+states.">Regulation of claudins in blood-tissue barriers under physiological and pathological states.</a> Tissue Barriers. 1, 24782 (2013).</li><li>Patton, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+image+analysis:+concepts,+applications+and+potential.">Retinal image analysis: concepts, applications and potential.</a> Prog Ret Eye Res. 25, 99-127 (2006).</li><li>Di Marco, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+dysfunction+in+the+pathogenesis+of+Alzheimer's+disease--A+review+of+endothelium-mediated+mechanisms+and+ensuing+vicious+circles.">Vascular dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer's disease--A review of endothelium-mediated mechanisms and ensuing vicious circles.</a> Neurobiol Dis. 82, 593-606 (2015).</li><li>Nagele, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-reactive+autoantibodies+prevalent+in+human+sera+increase+intraneuronal+amyloid-beta(1-42)+deposition.">Brain-reactive autoantibodies prevalent in human sera increase intraneuronal amyloid-beta(1-42) deposition.</a> J Alzheimer's Dis: JAD. 25, 605-622 (2011).</li><li>Goldwaser, E., Acharya, N., Nagele, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrovascular+and+blood-brain+barrier+compromise:+A+mechanistic+link+between+vascular+disease+and+Alzheimer's+disease+subtypes+of+neurocognitive+disorders.">Cerebrovascular and blood-brain barrier compromise: A mechanistic link between vascular disease and Alzheimer's disease subtypes of neurocognitive disorders.</a> J Parkinsons Dis Alzheimer's Dis. 2, 10 (2015).</li><li>Horton, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+three-photon+microscopy+of+subcortical+structures+within+an+intact+mouse+brain.">In vivo three-photon microscopy of subcortical structures within an intact mouse brain.</a> Nat Photonics. 7, (2013).</li><li>Sedeyn, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histamine+Induces+Alzheimer's+Disease-Like+Blood+Brain+Barrier+Breach+and+Local+Cellular+Responses+in+Mouse+Brain+Organotypic+Cultures.">Histamine Induces Alzheimer's Disease-Like Blood Brain Barrier Breach and Local Cellular Responses in Mouse Brain Organotypic Cultures.</a> Biomed Res Int. 2015, 937148 (2015).</li><li>Avdeef, A., Deli, M. A., Neuhaus, W., Di, L., Kerns, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Blood-Brain Barrier in Drug Discovery: Optimizing Brain Exposure of CNS Drugs and Minimizing Brain Side Effects for Peripheral Drugs. , 188 (2014).</li><li>Eigenmann, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+four+immortalized+human+brain+capillary+endothelial+cell+lines,+hCMEC/D3,+hBMEC,+TY10,+and+BB19,+and+optimization+of+culture+conditions,+for+an+in+vitro+blood-brain+barrier+model+for+drug+permeability+studies.">Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies.</a> Fluids Barriers CNS. 10, 33 (2013).</li><li>Takeshita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+blood-brain+barrier+model+combining+shear+stress+and+endothelial+cell/astrocyte+co-culture.">An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture.</a> J Neurosci Methods. 232, 165-172 (2014).</li><li>Alberghina, M., Lupo, G., Anfuso, C. D., Moro, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitate+transport+through+the+blood-retina+and+blood-brain+barrier+of+rat+visual+system+during+aging.">Palmitate transport through the blood-retina and blood-brain barrier of rat visual system during aging.</a> Neurosci Lett. 150, 17-20 (1993).</li><li>Hosoya, K., Yamamoto, A., Akanuma, S., Tachikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipophilicity+and+transporter+influence+on+blood-retinal+barrier+permeability:+a+comparison+with+blood-brain+barrier+permeability.">Lipophilicity and transporter influence on blood-retinal barrier permeability: a comparison with blood-brain barrier permeability.</a> Pharm Res. 27, 2715-2724 (2010).</li><li>Minamizono, A., Tomi, M., Hosoya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+dehydroascorbic+acid+transport+across+the+rat+blood-retinal+and+-brain+barriers+in+experimental+diabetes.">Inhibition of dehydroascorbic acid transport across the rat blood-retinal and -brain barriers in experimental diabetes.</a> Biol Pharm Bull. 29, 2148-2150 (2006).</li><li>Serlin, Y., Levy, J., Shalev, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+pathology+and+blood-brain+barrier+disruption+in+cognitive+and+psychiatric+complications+of+type+2+diabetes+mellitus.">Vascular pathology and blood-brain barrier disruption in cognitive and psychiatric complications of type 2 diabetes mellitus.</a> Cardiovasc Psychiatry Neurol. 2011, 609202 (2011).</li><li>Kolb, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+the+retina+works+-+Much+of+the+construction+of+an+image+takes+place+in+the+retina+itself+through+the+use+of+specialized+neural+circuits.">How the retina works - Much of the construction of an image takes place in the retina itself through the use of specialized neural circuits.</a> Am Sci. 91, 28-35 (2003).</li><li>Ikram, M. K., Cheung, C. Y., Wong, T. Y., Chen, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pathology+as+biomarker+for+cognitive+impairment+and+Alzheimer's+disease.">Retinal pathology as biomarker for cognitive impairment and Alzheimer's disease.</a> J Neurol Neurosurgery Psychiatry. 83, 917-922 (2012).</li><li>Tan, Z., Ge, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-beta,+the+retina,+and+mouse+models+of+Alzheimer+disease.">Amyloid-beta, the retina, and mouse models of Alzheimer disease.</a> Am J Pathol. 176, 2055 (2010).</li><li>Serhan, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-resolving+lipid+mediators+are+leads+for+resolution+physiology.">Pro-resolving lipid mediators are leads for resolution physiology.</a> Nature. 510, 92-101 (2014).</li><li>Bucolo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+topical+indomethacin,+bromfenac+and+nepafenac+on+lipopolysaccharide-induced+ocular+inflammation.">Effects of topical indomethacin, bromfenac and nepafenac on lipopolysaccharide-induced ocular inflammation.</a> J Pharm Pharmacol. 66, 954-960 (2014).</li><li>Edelman, J. L., Lutz, D., Castro, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corticosteroids+inhibit+VEGF-induced+vascular+leakage+in+a+rabbit+model+of+blood-retinal+and+blood-aqueous+barrier+breakdown.">Corticosteroids inhibit VEGF-induced vascular leakage in a rabbit model of blood-retinal and blood-aqueous barrier breakdown.</a> Exp Eye Res. 80, 249-258 (2005).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

In this report, we present a powerful ex vivo acute retinal model of BRB dysfunction using the swine retina. This model system does not require special instruments and can be easily adapted under most laboratory settings. However, to obtain a successful result, several steps require close attention. After obtaining the eyeballs from the source, they must be kept at 4 &#176;C or on ice and processed as soon as possible. When the effect of a treatment is being analyzed, two halves of the same retina must be used -...

Artan miktarda kanıt vücut kan retina bariyerinin (BRB) 1-5 ve kan beyin bariyeri (KBB) 6,7 olan benzerliği varlığını destekler. BBB Uzlaşma sıkıca böyle deliryum 10 olarak nedensel ya da Alzheimer hastalığı (AH) gibi kronik nörodejeneratif hastalıklar tanısal belirteç olarak 8,9 ve akut koşulları ile bağlantılı olmuştur. potansiyel ilaç hedefleri için bu patolojilerin ve keşifler içine mekanistik anlayışlar genellikle beynin sınırlı erişilebilirlik ve ağ karışıklık tarafından engellenmektedir. Bu, in vivo görüntüleme 11, beyin Organotipik kültürü 12, birincil hücre kültürleri 13,14 ve ko-kültür sistemleri 15 gibi alternatifler oluşturulmuştur. Ancak bu modellerin çoğu hücreleri tanımlamak için özel araçlar, uzun deneysel dönemleri veya birden fazla belirteçler gerektirir. Fonksiyonel ve yapısal BBB ile BRB arasındaki benzerlikler yanı sıra dy arasında bir korelasyoniki sfunctions 16-19 iddia edilmiştir. Buna ek olarak, daha kolay erişim, iyi tanımlanmış hücre tipleri ve tabakalı yapı beyne bir pencere olarak iyi karakterize edilmiş retina izin vermiştir. BBB ve BRB yapısal ve işlevsel kimlikler detaylı karşılaştırılması gerekmektedir. Bununla birlikte, retina hastalıkları, özellikle de BRB ihlali da sıkı bir şekilde diyabet 18-19 ve AD 21,22 dahil olmak üzere çeşitli hastalıkların ilerlemesinin ile ilişkilendirilmiştir. Bu durumda, bir BRB disfonksiyon sistemi mekanizmasını tanımlamak için değil, aynı zamanda, potansiyel ilaç taranması için sadece kurmak ilgi çekicidir. Bu raporda, basit bir akut retinal kültürünü kullanarak bir protokol sağlayan BRB disfonksiyonu gelişti ve sunulmuştur. Artmış BBB geçirgenliği ve AD-benzeri patolojik değişiklikler histamin, bir pro-inflamatuar arabulucu 12 ile inkübe bir beyin Organotipik kültürü kurulmuştur. Bu nedenle, sunulan sistemde, histamin İçi olduBRB disfonksiyonu ikna etmek için ex vivo retina kültürüne ied. Böyle Mus musculus ve Bos Boğa gibi çeşitli türlerden gelen retinaları, test edilmiştir. Nedeniyle ticari kullanılabilirliği ve insan dokusuna benzediği için, taze domuz gözbebekleri burada bildirilen veri sağlamak için kullanılmıştır. Histamin ve / veya diğer ilaçlar ile inkübe edildikten sonra, retinalar immünoglobülin G (IgG), kan ana bileşenden biri olarak bir kaç protein 12 için immün değerlendirme için işleme alınmıştır; Glial fibriller asidik protein (GFAP), glial aktivasyon için iyi bilinen bir işaretleyici; ve mikrotübül-ilişkili protein 2 (MAP2), mikrotübül montaj için gerekli bir nörona özgü sitoskeletal proteini. Bundan başka, retinanın tabakalı yapı gibi genişliği ve süreklilik değişiklikler olarak Müller hücrelerinin ve gangliyon hücreleri proseslerinin ayrıntılı bir analizini sağlar. Böylece birkaç ek parametreler sonuçlarını değerlendirmek için kullanılabilirBRB ihlali erken bir aşamada ve aynı zamanda potansiyel tedavilerin ters etkilerini değerlendirmek için. kan damarlarının sızıntı (KZ), glial hücrelerin aktivasyonu ve nöronal hücrelerin hasar tepki: Bu protokol, ekranlı ilaçların potansiyel ters etkileri üç açıdan değerlendirilir. Çeşitli ölçümü yöntemleri, örneğin, ifade seviyesi immün bir süreç ve bir donanım filtresi tarafından gösterilen nöronal süreçlerin sürekliliği genişliği ölçüm yoğunluğu ile gösterilen, kullanılmaktadır. Daha iyi yöntemi göstermek için ve sonuçları yorumlamaya yardımcı olmak için, Lipoksin A4 (LXA4), endojen inflamatuar hasarına yanıt ve endotel disfonksiyonu 23 hafifletici sentezlenen bir bileşik, gösteri amaçlı seçilmiştir.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>14170-112</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>J.T.Baker</td><td>4072-05</td><td></td></tr><tr><td>Histamine&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H7125-1G</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Freezing Media&amp;nbsp;</td><td>Triangle Biomedical Sciences</td><td>TFM-5</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum&amp;nbsp;</td><td>Rockland</td><td>D104-00-0050</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>GFAP Antibody</td><td>Millipore</td><td>AB5804</td><td></td></tr><tr><td>MAP2 Antibody</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB3418</td><td></td></tr><tr><td>FITC conjugated Donkey anti-rabbit IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.</td><td>711-095-152</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 conjugated Donkey anti-mouse IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.</td><td>715-165-150</td><td></td></tr><tr><td>mounting medium containing DAPI</td><td>Vector Laboratories, Inc.</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Laser Confocal Microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti microscope</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td>1.45s</td><td></td></tr></tbody></table>

an acute retinal model for evaluating blood retinal barrier breach and potential drugs for treatment

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An inflammatory factor, histamine, is demonstrated to compromise vessel integrity in the cultured retina through positive staining of IgG outside of the blood vessels. The effects of histamine itself and those of candidate drugs for potential treatments, such as lipoxin A4, are assessed using three parameters: blood vessel leakage via IgG immunostaining, activation of M&#252;ller cells via GFAP staining and change in neuronal dendrites through staining for MAP2. Furthermore, the layered organization of the retina allows a detailed analysis of the processes of M&#252;ller and ganglion cells, such as changes in width and continuity. While the data presented is with swine retinal culture, the system is applicable to multiple species. Thus, the model provides a reliable tool to investigate the early effects of compromised retinal vessel integrity on different cell types and also to evaluate potential drug candidates for treatment.

Biz histamin tarafından uyarılan BRB ihlal karşı koruyabilecek potansiyel tedaviler değerlendirmek için düşük maliyetli, zaman verimli ve kolay kullanımlı bir sistem sunuyoruz. IgG kontrol retina (Şekil 1A) damarlar içinde kısıtlı, ancak modelin başarıyla kuruldu doğrulayan histamin maruz (Şekil 1B) üzerine kan damarlarının, dışarı sızdırıyor. LXA4 sunulan sistemde...

Watch this Scientific Journal Video about An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment at JoVE.com

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

Düşük maliyetli, kullanımı kolay ve güçlü bir sistem histamin tarafından uyarılan kan retina bariyer ihlali iyileştirecek potansiyel tedaviler değerlendirmek için kurulmuştur. Kan damarı sızıntı, Müller hücre aktivasyonu ve nöron sürekliliği bir potansiyel ilaç, Lipoksin A4 hasarı yanıtını ve ters değerlendirmek için kullanılır.

Tedavi Kan Retina Bariyer ihlali ve Potansiyel İlaçlar değerlendirilmesi için bir Akut Retina Modeli

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

an-acute-retinal-model-for-evaluating-blood-retinal-barrier-breach

Research

JoVE Journal

Medicine

7.1K Görüntüleme.  Rowan University.  Düşük maliyetli, kullanımı kolay ve güçlü bir sistem histamin tarafından uyarılan kan retina bariyer ihlali iyileştirecek potansiyel tedaviler değerlendirmek için kurulmuştur. Kan damarı sızıntı, Müller hücre aktivasyonu ve nöron sürekliliği bir potansiyel ilaç, Lipoksin A4 hasarı yanıtını ve ters değerlendirmek için kullanılır. 

Video: An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium (hfRPE) cultures with morphological, physiological and genetic characteristics of native human RPE. These hfRPE cell cultures exhibit heavy pigmentation, and electron microscopy show extensive apical membrane microvilli. The junctional complexes were identified with immunofluorescence labeling of various tight junction proteins. Epithelial polarity and function of these easily reproducible primary cultures closely resemble previously studied mammalian models of native RPE, including human. These results were extended by the development of therapeutic interventions in several animal models of human eye disease. We have focused on strategies for the removal of abnormal fluid accumulation in the retina or subretinal space. The extracellular subretinal space separates the photoreceptor outer segments and the apical membrane of the RPE and is critical for maintenance of retinal attachments and a whole host of RPE/retina interactions.

We provide a reproducible method for culturing confluent monolayers of human fetal retinal pigment epithelial cells (hfRPE) cells that exhibit morphology, physiology, polarity, and protein and gene expression patterns of adult native tissue. This work has been extended to an animal model of several eye diseases.

Retina Pigment Epitel Fizyoloji ve Patofizyoloji Çalışma Deneysel Modeller

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium ...

Nörobilim

Rat Model of Blood-brain Barrier Disruption to Allow Targeted Neurovascular Therapeutics

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain barrier1. The barrier selectively excludes molecules from crossing between the blood and the brain based upon their size and charge. This function can impede the delivery of therapeutics for neurological disorders. A number of chemotherapeutic drugs, for example, will not effectively cross the blood-brain barrier to reach tumor cells2. Thus, improving the delivery of drugs across the blood-brain barrier is an area of interest.
The most prevalent methods for enhancing the delivery of drugs to the brain are direct cerebral infusion and blood-brain barrier disruption3. Direct intracerebral infusion guarantees that therapies reach the brain; however, this method has a limited ability to disperse the drug4. Blood-brain barrier disruption (BBBD) allows drugs to flow directly from the circulatory system into the brain and thus more effectively reach dispersed tumor cells. Three methods of barrier disruption include osmotic barrier disruption, pharmacological barrier disruption, and focused ultrasound with microbubbles. Osmotic disruption, pioneered by Neuwelt, uses a hypertonic solution of 25% mannitol that dehydrates the cells of the blood-brain barrier causing them to shrink and disrupt their tight junctions. Barrier disruption can also be accomplished pharmacologically with vasoactive compounds such as histamine5 and bradykinin6. This method, however, is selective primarily for the brain-tumor barrier7. Additionally, RMP-7, an analog of the peptide bradykinin, was found to be inferior when compared head-to-head with osmotic BBBD with 25% mannitol8. Another method, focused ultrasound (FUS) in conjunction with microbubble ultrasound contrast agents, has also been shown to reversibly open the blood-brain barrier9. In comparison to FUS, though, 25% mannitol has a longer history of safety in human patients that makes it a proven tool for translational research10-12.
In order to accomplish BBBD, mannitol must be delivered at a high rate directly into the brain's arterial circulation. In humans, an endovascular catheter is guided to the brain where rapid, direct flow can be accomplished. This protocol models human BBBD as closely as possible. Following a cut-down to the bifurcation of the common carotid artery, a catheter is inserted retrograde into the ECA and used to deliver mannitol directly into the internal carotid artery (ICA) circulation. Propofol and N2O anesthesia are used for their ability to maximize the effectiveness of barrier disruption13. If executed properly, this procedure has the ability to safely, effectively, and reversibly open the blood-brain barrier and improve the delivery of drugs that do not ordinarily reach the brain 8,13,14.

Blood-brain barrier disruption aids the delivery of certain drugs to the brain. Mannitol delivered intra-arterially shrinks cells surrounding blood vessels in order to physically disrupt the barrier.

Kan-beyin bariyer bozulması arasında Rat Modeli Nörovasküler Therapeutics Hedefli izin ver için

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain ...

Tıp

Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes (ILM), and in conjunction with astrocytes, pericytes and endothelial cells they establish the blood-retinal barrier (BRB). BRB limits material transport between the bloodstream and the retina while the ILM acts as a basement membrane that defines histologically the border between the retina and the vitreous cavity. Labeling M&#252;ller cells is particularly relevant to study the physical state of the retinal barriers, as these cells are an integral part of the BRB and ILM. Both BRB and ILM are frequently altered in retinal disease and are responsible for disease symptoms.
There are several well-established methods to study the integrity of the BRB, such as the Evans blue assay or fluorescein angiography. However these methods do not provide information on the extent of BRB permeability to larger molecules, in nanometer range. Furthermore, they do not provide information on the state of other retinal barriers such as the ILM. To study BRB permeability alongside retinal ILM, we used an AAV based method that provides information on permeability of BRB to larger molecules while indicating the state of the ILM and extracellular matrix proteins in disease states. Two AAV variants are useful for such study: AAV5 and ShH10. AAV5&#160;has a natural tropism for photoreceptors but it cannot get across to the outer retina when administered into the vitreous when the ILM is intact (i.e., in wild-type retinas). ShH10 has a strong tropism towards glial cells and will selectively label M&#252;ller glia in both healthy and diseased retinas. ShH10 provides more efficient gene delivery in retinas where ILM is compromised. These viral tools coupled with immunohistochemistry and blood-DNA analysis shed light onto the state of retinal barriers in disease.

To investigate the blood-retinal barrier permeability and the inner limiting membrane integrity in animal models of retinal disease, we used several adeno-associated virus (AAV) variants as tools to label retinal neurons and glia. Virus mediated reporter gene expression is then used as an indicator of retinal barrier permeability.

Aracı Olarak Adeno-ilişkili virüs kullanarak Hastalığında Retina Engelleri Eğitim için

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes ...

Xenopus'ta Hücresel Onarım Stratejilerini Araştırmak için Retina Dejenerasyonu Oluşturma

Generating Retinal Injury Models in Xenopus Tadpoles

Retinal neurodegenerative diseases are the leading causes of blindness. Among numerous therapeutic strategies being explored, stimulating self-repair recently emerged as particularly appealing. A cellular source of interest for retinal repair is the M&#252;ller glial cell, which harbors stem cell potential and an extraordinary regenerative capacity in anamniotes. This potential is, however, very limited in mammals. Studying the molecular mechanisms underlying retinal regeneration in animal models with regenerative capabilities should provide insights into how to unlock the latent ability of mammalian M&#252;ller cells to regenerate the retina. This is a key step for the development of therapeutic strategies in regenerative medicine. To this aim, we developed several retinal injury paradigms in Xenopus: a mechanical retinal injury, a transgenic line allowing for nitroreductase-mediated photoreceptor conditional ablation, a retinitis pigmentosa model based on CRISPR/Cas9-mediated rhodopsin knockout, and a cytotoxic model driven by intraocular CoCl2 injections. Highlighting their advantages and disadvantages, we describe here this series of protocols that generate various degenerative conditions and allow the study of retinal regeneration in Xenopus.

Yazar Spotlight: Xenopus Kurbağasında Retinal Yenilenme Mekanizmalarını Keşfetmek 

We have developed several protocols to induce retinal damage or retinal degeneration in Xenopus laevis tadpoles. These models offer the possibility of studying retinal regeneration mechanisms.

Xenopus Kurbağa Yavrularında Retina Yaralanma Modellerinin Oluşturulması

Retinal neurodegenerative diseases are the leading causes of blindness. Among numerous therapeutic strategies being explored, stimulating self-repair ...

Gelişim Biyolojisi

A Mouse Model of Retinal Ischemia-Reperfusion Injury Through Elevation of Intraocular Pressure

Retinal ischemia-reperfusion (I/R) is a pathophysiological process contributing to cellular damage in multiple ocular conditions, including glaucoma, diabetic retinopathy, and retinal vascular occlusions. Rodent models of I/R injury are providing significant insights into mechanisms and treatment strategies for human I/R injury, especially with regard to neurodegenerative damage in the retinal neurovascular unit. Presented here is a protocol for inducing retinal I/R injury in mice through elevation of intraocular pressure (IOP). In this protocol, the ocular anterior chamber is cannulated with a needle, through which flows the drip of an elevated saline reservoir. Using this drip to raise IOP above systolic arterial blood pressure, a practitioner temporarily halts inner retinal blood flow (ischemia). When circulation is reinstated (reperfusion) by removal of the cannula, severe cellular damage ensues, resulting ultimately in retinal neurodegeneration. Recent studies demonstrate inflammation, vascular permeability, and capillary degeneration as additional elements of this model. Compared to alternative retinal I/R methodologies, such as retinal arterial ligation, retinal I/R injury by elevated IOP offers advantages in its&#160;anatomical specificity, experimental tractability, and technical accessibility, presenting itself as a valuable tool for examining neuronal pathogenesis and therapy in the retinal neurovascular unit.

This article describes a procedure for inducing retinal ischemia-reperfusion injury by elevated intraocular pressure in mice. Retinal ischemia-reperfusion injury by elevated intraocular pressure serves to model human pathologies characterized by compromised oxygen and nutrient delivery in the retina, enabling researchers to examine potential cellular mechanisms and treatments for human diseases of the retinal neurovascular unit.

Göz İçi Basıncı Yükselmesi ile Retina İskemi-Reperfüzyon Hasarı Fare Modeli

Retinal ischemia-reperfusion (I/R) is a pathophysiological process contributing to cellular damage in multiple ocular conditions, including glaucoma, ...

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To properly leverage this greater translatability, there is a need to devise reproducible methods of drawing quantitative data from these images. Optical coherence tomography (OCT) imaging can resolve retinal histology at micrometer resolution and reveal functional differences in vascular blood flow. Here, we delineate noninvasive vascular readouts that we use to characterize pathological damage post vascular insult in an optimized mouse model of retinal vein occlusion (RVO). These readouts include live imaging analysis of retinal morphology, disorganization of retinal inner layers (DRIL) measure of capillary ischemia, and fluorescein angiography measures of retinal edema and vascular density. These techniques correspond directly to those used to examine patients with retinal disease in the clinic. Standardizing these methods enables direct and reproducible comparison of animal models with clinical phenotypes of ophthalmic disease, increasing the translational power of vascular injury models.

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

Here, we present three data analysis protocols for fluorescein angiography (FA) and optical coherence tomography (OCT) images in the study of Retinal Vein Occlusion (RVO).

İn vivo Tekrarlanabilirliği Artırmak için Fare Retinasında Vasküler Yaralanma Okumaları

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To ...

Retinal Pathophysiological Evaluation in a Rat Model

A posterior segment eye disease like diabetic retinopathy alters the physiology of the retina. Diabetic retinopathy is characterized by a retinal detachment, breakdown of the blood-retinal barrier (BRB), and retinal angiogenesis. An in vivo rat model is a valuable experimental tool to examine the changes in the structure and function of the retina. We propose three different experimental techniques in the rat model to identify morphological changes of retinal cells, retinal vasculature, and compromised BRB. Retinal histology is used to study the morphology of various retinal cells. Also, quantitative measurement is performed by retinal cell count and thickness measurement of different retinal layers. A BRB breakdown assay is used to determine the leakage of extraocular proteins from the plasma to vitreous tissue due to the breakdown of BRB. Fluorescence angiography is used to study angiogenesis and leakage of blood vessels by visualizing retinal vasculature using FITC-dextran dye.

Diabetic retinopathy is one of the leading causes of blindness. Histology, blood-retinal barrier breakdown assay, and fluorescence angiography are valuable techniques to understand the pathophysiology of the retina, which could further enhance the efficient drug screening against diabetic retinopathy.

Sıçan Modelinde Retinal Patofizyolojik Değerlendirme

A posterior segment eye disease like diabetic retinopathy alters the physiology of the retina. Diabetic retinopathy is characterized by a retinal ...

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

Dysfunction of the blood-retinal barrier (BRB) contributes to the pathophysiology of several vascular eye diseases, often resulting in retinal edema and subsequent vision loss. The inner blood-retinal barrier (iBRB) is mainly composed of retinal vascular endothelium with low permeability under physiological conditions. This feature of low permeability is tightly regulated and maintained by low rates of paracellular transport between adjacent retinal microvascular endothelial cells, as well as transcellular transport (transcytosis) through them. The assessment of retinal transcellular barrier permeability may provide fundamental insights into iBRB integrity in health and disease. In this study, we describe an endothelial cell (EC) transcytosis assay, as an in vitro model for evaluating iBRB permeability, using human retinal microvascular endothelial cells (HRMECs). This assay assesses the ability of HRMECs to transport transferrin and horseradish peroxidase (HRP) in receptor- and caveolae-mediated transcellular transport processes, respectively. Fully confluent HRMECs cultured on porous membrane were incubated with fluorescent-tagged transferrin (clathrin-dependent transcytosis) or HRP (caveolae-mediated transcytosis) to measure the levels of transferrin or HRP transferred to the bottom chamber, indicative of transcytosis levels across the EC monolayer. Wnt signaling, a known pathway regulating iBRB, was modulated to demonstrate the caveolae-mediated HRP-based transcytosis assay method. The EC transcytosis assay described here may provide a useful tool for investigating the molecular regulators of EC permeability and iBRB integrity in vascular pathologies and for screening drug delivery systems.

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

This protocol illustrates an in vitro endothelial cell transcytosis assay as a model to evaluate inner blood-retinal barrier permeability by measuring the ability of human retinal microvascular endothelial cells to transport horseradish peroxidase across cells in caveolae-mediated transcellular transport processes.

İç Kan-Retinal Bariyer Geçirgenliğini Değerlendirmek için In Vitro Model Olarak Endotel Hücre Transsitozu Testi

Dysfunction of the blood-retinal barrier (BRB) contributes to the pathophysiology of several vascular eye diseases, often resulting in retinal edema and ...

Tedavi Kan Retina Bariyer ihlali ve Potansiyel İlaçlar değerlendirilmesi için bir Akut Retina Modeli

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Retina Pigment Epitel Fizyoloji ve Patofizyoloji Çalışma Deneysel Modeller

Kan-beyin bariyer bozulması arasında Rat Modeli Nörovasküler Therapeutics Hedefli izin ver için

Aracı Olarak Adeno-ilişkili virüs kullanarak Hastalığında Retina Engelleri Eğitim için

Xenopus Kurbağa Yavrularında Retina Yaralanma Modellerinin Oluşturulması

Xenopus Kurbağa Yavrularında Retina Yaralanma Modellerinin Oluşturulması

Xenopus Kurbağa Yavrularında Retina Yaralanma Modellerinin Oluşturulması

Göz İçi Basıncı Yükselmesi ile Retina İskemi-Reperfüzyon Hasarı Fare Modeli

İn vivo Tekrarlanabilirliği Artırmak için Fare Retinasında Vasküler Yaralanma Okumaları

Sıçan Modelinde Retinal Patofizyolojik Değerlendirme

İç Kan-Retinal Bariyer Geçirgenliğini Değerlendirmek için In Vitro Model Olarak Endotel Hücre Transsitozu Testi