Biz Lab üyeleri Jeffrey Adijanto Tina Banzon Rong Li Qin Wan, Congxiao Zhang Jing Zhao, Connie Zhi, Awais Ziya, Natalia Strunnikova bu hücre kültürleri karakterize yardım için teşekkür ederim. Jing Zhao, Connie Zhi, ve Tina Banzon hücre kültürleri büyük stoklar korunmasında yardım ettikleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Sağlık İntramural Araştırma Programı Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından da desteklenmiştir.

1. İnsan Fetal Doku Bütün insan dokusu ile ilgili araştırma, Helsinki Bildirgesi ve NIH kurumsal inceleme kurulu ilkelerini izler. Fetal gözleri buz üzerinde dolu tüpler (ABR tarafından sağlanan) içeren RPMI-1640 medya yerleştirilir rastgele donörler, gebeliğin 16 ila 22 hafta, bağımsız bir pezevengi, Gelişmiş Bioscience Kaynakları (ABR, Alameda, CA) tarafından elde edilen ve bir gecede öncelikli teslimat hizmeti tarafından teslim edilir. Dokular enükleasyon sonra 48 saat kadar canlı kalır. 2. Hücre Kültürü Orta MEM-alfa modifiye orta% 5 (Sigma-Aldrich) hazırlamak için temel aracı olarak kullanılan ve RPE hücrelerinin kültür (RPE orta, aşağıda Tablo 1) için% 15 serum içeren medya. <table border="1"><tbody><tr><td> Isim </td><td> Sigma </td><td> Gibco </td><td> Miktar </td><td> Depolama </td></tr><tr><td> MEM, alfa değişiklik </td><td> M-4526 </td><td></td><td> 500 mL </td><td> +4 ° C </td></tr><tr><td> N1 takviyesi </td><td> N-6530 </td><td></td><td> 5 ml </td><td> +4 ° C </td></tr><tr><td> Penisilin-streptomisin </td><td></td><td> 15140-148 </td><td> 5 ml </td><td> -20 ° C </td></tr><tr><td> GlutaMax - I </td><td></td><td> 35050 </td><td> 5 ml </td><td> -20 ° C </td></tr><tr><td> Sigara esansiyel amino asitleri </td><td> M-7145 </td><td></td><td> 5 ml </td><td> +4 ° C </td></tr><tr><td> THT * </td><td></td><td></td><td></td><td> -80 ° C </td></tr><tr><td> Boğa </td><td> T-0625 </td><td></td><td> 125 mg </td><td></td></tr><tr><td> Hidrokortizon </td><td> H-0396 10 </td><td></td><td> 10 mikrogram </td><td></td></tr><tr><td> Triiodo-thyronin </td><td> T-5516 </td><td></td><td> 0,0065 mg </td><td></td></tr><tr><td> Fetal sığır serumu ** </td><td></td><td></td><td> % 5 veya% 15 </td><td> -80 ° C </td></tr></tbody></table> Tablo 1. 500 ml Orta hazırlanması için İnsan Fetal RPE Orta Bileşenleri * THT orta yapmadan önce 1 1.5 ml PBS taurin hidrokortizon triiodo-thyronin eriterek yapılır. Birden fazla alikotları -80 yapılır ve saklanır ° C kültür kültür ortamı hazırlanması basitleştirmek için. ** Fetal sığır serumu, Sigma-Aldrich veya Gibco elde değildir. Medya hazırlanmasında kullanılan fetal sığır serumu Atlanta Biyolojik (Norcross, GA) elde edilir. Her şişe serum kullanmadan önce (56 ° C 1hr) inaktive ısı. Aynı lottan serum hücre kültürü tutarlılık büyük miktarda sağlamak için ortam hazırlanması için kullanılması kadar satın alınan ve -20 ° C&#39;de saklanır. % 20 FBS içeren farklı birçok medya birkaç hafta iyi plakaları - veya 12 - 24 hfRPE hücreleri belirli bir toplu seyrek numaralı seribaşı hücreleri yetiştirilmektedir. En klasik RPE morfolojisi (arnavut kaldırımı) ile en hızlı büyüyen melanated hücreleri, hücre kültürü için kullanılabilecek uygun bir serum çok göstermektedir. Hücre kültürü ortamı da içerir: N1 takviyesi (Sigma-Aldrich) 1:100 mL / ml, GlutaMax / penisilin-streptomisin 1:100 ml / ml (Gibco) ve esansiyel olmayan amino asit çözeltisi (Sigma-Aldrich) 1:100 mL / ml. Buna ek olarak, hidrokortizon (20 mg / L), taurin (250 mg / L) ve triiodo-thyronin (0,013 mg / L) (THT) 1:500 bir nihai konsantrasyonu PBS içinde eriterek, bu üç bileşenin önceden hazırlanan (ml / ml). THT, Alikot 80 saklanır ° C kadar RPE orta eklendi. 3. Hücre Kültürü Alındıktan sağlam küreler antibiyotik antimikotik çözüm durulanır (10X seyreltilir. Kedi hayır 15.240-096; Invitrogen) artı gentamisin (1 mg / ml) 3 ila 5 dakika (aşağıda Şekil 1). <img src="/files/ftp_upload/2032/2032fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Inkübasyon antibiyotik HBSS veya PBS gibi orta iki kez durulanır sonra. Bir anda göz dünya Sylgard-184 (TEFE) ile kaplı 10 cm Petri kabı aktarılır ve 27G iğne ile güvence altına alınmıştır. K seçik SidePort bıçak kullanma (Alcon) sklerasına siliyer cisim (ön yüzey göz ekvator mesafenin 1 / 3) altında bir kesi ile yapılır. Bu kesi ön göz kısmının çıkarılması için dairesel kesim başlatmak için kullanılır. Bu kesim, bir bıçak tırtıllı (FST) ile bir tungsten-karbür kaplı kavisli iris makası kullanılarak yapılır. Gözün ön kısmının kaldırılması için önce, bir kesim r koparmasını önlemek için vitreus ile yapılırarka kutbunda RPE etina. 5% 40-60 dakika süreyle serum içeren orta gözün ön kısmı çıkarıldıktan sonra, arka kutupta dispase-I çözeltisi (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN. 2 U / ml, kedi hayır 04942086001) ile inkübe edilir 37 ° C-% 5 CO 2. Dispase tedaviden sonra, posterior direkleri silikon dolgu (Sylgard 184, Dow Corning, Midland, MI) Petri kapları bir HBSS aktarılır ve kadran veya dokuların yeterince düzleştirmek için büyük parçalar halinde disseke. Daha sonra retinanın forseps ile yavaşça kaldırılır. Tek hücreli RPE katmanları sayfaları sıyrılır ve soğuk tripsin-EDTA (Gibco, # 25.200-056) çözümü doğrudan toplanmıştır. RPE toplandıktan sonra, tripsin-EDTA doku tüpler 37 mühürlü ve 10-15 dakika su banyosunda aktarılır ° C Inkübasyon 10 dakika sonra, küçük kümeler halinde RPE ayrı tüpler şiddetle sarsıldı. Mesafeyi tam değilse, tüpler 5 dakika su banyosu içine yerleştirilmiştir. Tripsin-EDTA inkübasyondan sonra, tüpler mümkün un çözünmüş karışık hücre kümeleri için denetlenmektedir. Herhangi bir gözlenen kümeleri ince uçlu cam Pasteur pipeti kullanarak kaldırılır. Aşağı iplik (4 dakika için 1.4 klinik santrifüj rpm) sonra, hfRPE hücrelerin% 15 RPE medyada yeniden askıya alınır ve daha sonra (örneğin primaria şişeler içine koyun: kedi hayır 08-772-45; Fisher Scientific, Pittsburgh, PA. .) Bu orta,% 5 serum içeren RPE orta ile 1 gün sonra değiştirilir ve 2 ila 3 günde bir sonraki değişiklikler yapılmıştır. 3 ila 4 hafta sonra, hücreler belirsiz ve düzgün pigmentli oldu. Corning Costar Daha sonra% 15 serum içeren RPE hücre kültür ortamı yeniden askıya alınmış ve ortalama 150 200K hücreleri (transwell açık hücre kültürü ekler üzerine numaralı seribaşı, 10 ila 15 dakika boyunca% 0.25 &#39;lik tripsin-EDTA tripsinize. kedi hayır 07-200-161 Fisher Scientific): 12 mm çap ekler, 0.4-um gözenekleri, polyester membranlar (örneğin kullanarak Corning, NY). Tohumlama önce, kuyulardan insan ekstrasellüler matriks (ortalama iyi 150 mcL HBSS 10 mikrogram, kedi hayır 354.237, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) ile kaplandı ve 2 saat boyunca başlık UV ışık ile tedavi. Bazı durumlarda, trypsinization prosedürü ilk trypsinization sonra ayırmak vermedi hücreleri toplamak için, ikinci kez tekrarlandı. Aynı protokolü (ECM ile kaplama hariç), matara, hücre P1 nüfus oluşturmak için kültür hücreleri kullanıldı. Bu hücreler ≥ 200 Ω • cm 2 olmak üzere toplam doku direnci vardı ve düzgün pigmentli deneylerde kullanıldı. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2032/2032fig1full.jpg">Daha büyük bir şekil 1 için buraya tıklayınız</a> . 4. Adım Adım Prosedürleri <ol><li> Birden fazla çözümleri (4 kuyu ihtiyaç duyulan her gözün) ile 12-plaka hazırlayın: <ol class="lalpha"><li> 1 / göz - 10x antibiyotik antimikotik çözüm eklemek </li><li> PBS / HBSS durulama için bir çözüm eklemek - 2 kuyuları / göz </li><li> dispase çözüm - 1 / göz </li></ol></li><li> Petri kabı 5 fiksasyon iğneler açma ve HBSS ile doldurma diseksiyon hazırlayın </li><li> Paketinden çıkarın gözleri ve 3-5 dakika (adım 1 hazırlanan) antibiyotik antimikotik çözüm içine yerleştirin </li><li> Iki kuyu (adım 1 hazırlanan) PBS / HBSS ile yıkayınız, daha sonra çanak diseksiyon aktarabilirsiniz. </li><li> Trim aşırı kas ve göz çevresindeki bağ dokuları </li><li> Güvenli 27G iğneler (silikon taban aşağı pin) gözleri korneanın yukarı bakacak şekilde hizalayarak çanak diseksiyon kullanma. </li><li> Dairesel kesme başlayacak SidePort bıçak kullanarak, kornea altında kesi yapmak </li><li> Kullanarak iris makası, göz etrafında vitreus üzerinden kesilmiş ve gözün ön kısmını kaldırın sonra aynı makas kullanarak kesin. Not: 3 ile 8 adımda göz küresinin herhangi bir aşırı mekanik basınç önlemek. </li><li> (Adım 1 hazırlanan) dispase çözüm Transfer açık göz </li><li> 37, 40-60 dakika süreyle göz fincan inkübe ° C ile% 5 CO 2 </li><li> Taze bir çanak diseksiyon HBSS çözüm değiştirin. </li><li> Dispase çözüm diseksiyon çanak göz aktarın. </li><li> Konum Petri kabındaki göz (göz küresinin fincan yukarı bakacak şekilde) ve iki 27G iğne ile güvenli. </li><li> Yavaşça kaldırın ve kısmen ayrılmış retina retina makas kullanarak optik sinir uzak retina kesti. Retinanın atın. </li><li> Iris makası kullanarak, optik sinir doğru göz çevreden bir kesi yapmak. </li><li> Tüm beş 27G iğneler kullanarak güzel gergin göz yapma RPE düzleştirmek. </li><li> Retina makas kullanarak optik sinir bağlılık RPE ayıran optik sinir etrafında dairesel kesim olun. Not: 13-17 adımları düşük büyütme ya da stereo mikroskop olmadan yapılabilir </li><li> 250x büyütme stereomikroskopta ayarlayın.veya daha fazla ve iris makas tarafından yapılan kesim birlikte optik sinir yakın RPE sayfasının kenarına bulmak. </li><li> Koroidal doku tabakası ayrı RPE-Bruch membran iki forseps kullanma. Kenarı boyunca RPE ve koroid bağlantı zayıf olduğu alanı bulmak için birkaç girişim gerekebilir. </li><li> Yeri RPE yaprak soğuk tripsin-EDTA çözeltisi içine 15 ml tüp </li><li> 37 RPE 10-15mins tripsin-EDTA su banyosu içine dokuları ile, şapka ve transfer borular toplandıktan sonra ° C </li><li> 10 dakika inkübasyondan sonra, şiddetle, küçük kümeler halinde RPE ayırmak için 15 ml tüpler sallayın. Mesafeyi tam değilse, başka bir 5 dakika su banyosunda geri tüpler içine yerleştirin. </li><li> Mümkün un çözünmüş karışık hücre kümeleri için tüpleri kontrol edin. Herhangi bir gözlenen kümeleri ince uçlu cam Pasteur pipeti kullanarak çıkarılmalıdır. </li><li> (4 dakika için 1.4 klinik santrifüj rpm) hfRPE hücreleri aşağı Spin,% 15 RPE medya (9 ml toplam) süpernatant kaldırmak ve yeniden askıya hücreleri </li><li> Primaria şişeler 2 mL taze% 15 RPE medya, ertesi gün (37 ° C,% 5 CO 2) kadar kuvöz içine balon içine 3 ml hücre süspansiyonu koyun </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar Fonksiyonel doğrulama hfRPE hücre kültürü Daha önceki deneylerde, plazma membran transport proteinleri ifade, kutuplaşma ve işlevini belirlemek ve uygulanabilir özellikleri ayarlanan bir doğrulama sağlamak birikmiş olarak RPE fonksiyonu 1-11 Bu özellikler düzenleyen özel sinyalizasyon yollar tanımlamak için bu primer kültürlerinde var her hücre nesil. Transepitelyal sıvı taşıma ve paracellular yolun bütünlüğünü belirleyen proteinleri tespit deneyler aşağıda özetlenmiştir. Bu in vitro deneylerde retina yeniden yatıştırıldı 6 bir hayvan modelinde onaylanmıştır . <img src="/files/ftp_upload/2032/2032fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. HfRPE hücreleri CFTR Yerelleştirme Sol üst paneli: CFTR hfRPE hücrelerin membran zenginleştirilmiş özler kullanılarak tespit edildi. M, moleküler ağırlık belirteci; şeritli 1, Merkezi alt panelde büyük olgun (bant C) ve immatür (A ve B grupları): CFTR immünofloresan lokalizasyonu (yeşil etiket) Top sağ panelde gösteren z düzlemi boyunca büyük kesit görünümü. z-ekseni üzerinden maksimum yoğunluk projeksiyon. ZO-1 (kırmızı olarak işaretlenmiş) RPE apikal ve bazolateral tarafı tasvir sıkı bir bağlantı belirteci olarak hizmet vermektedir. DAPI (mavi), bazal membran bulunan çekirdeklerin yakın etiketler. ZO-1 CFTR kırmızı etiket örtüşmektedir yeşil floresan bu yana, sarı / turuncu olarak görünür. <img src="/files/ftp_upload/2032/2032fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. HfRPE içinde IFNγ indüklenen fizyolojik değişiklikler A: bazal banyo IFNγ Ayrıca, ilköğretim, kültürlü hfRPE hücrelerin tek tabaka üzerinde transepitelyal sıvı taşımacılığı (J v) artmış J v üst izlemesi zaman fonksiyonu ve net sıvı olarak çizilir . emme (bazal banyo için apikal) pozitif değerler ile gösterilir; transepitelyal potansiyeli (TEP) ve total doku direnci (R T) alt izleri zamanın bir fonksiyonu olarak çizilir. B: bazal banyo CFTRinh-172 (5 mcM) eklenmesi IFNγ uyarılmış J v artması engellenir. Aşağıda hayvan modeli deneyler vitro bulgular hfRPE doğrulayan bir örnektir. Bu deneyde, yapay olarak oluşturulmuş retina dekolmanı (Şekil 4 A, B) dış göz yüzeyine IFNg eklenmesinden sonra önemli ölçüde azalmıştır. Bu etki kısmen tarafından bloke edilebilir: (1) Ayrıca cAMP bloker (Şekil 4D), (2) JAK + cAMP blokerler eklenmesinden sonra tamamen engellendi. Aşağıdaki resimlere Ekim tarayıcı kullanılarak elde edilir. <img src="/files/ftp_upload/2032/2032fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4, in vivo retina dekolmanı deneylerde in vivo deneylerde bu prosedürleri daha önce ayrıntılı 6 tarif edilmiştir . Bu deneylerde, retina dekolmanları subretinal boşluk (SRS), tek başına ya JAK-STAT ve PKA yolak inhibitörleri kombinasyonu ile modifiye PBS çözüm 0,5-3 mcL enjeksiyon yoluyla sıçan göz yaratıldı. Her deneyde, retina dekolmanı oluşturulmasından sonra, 40-70 dk bir başlangıç ​​kontrolü süre vardı. Bu süre zarfında, bleb hacminin değişim oranı bleb istikrar sigorta ölçüldü. Optik koherens tomografi görüntüleme (Uygulamalı Fizik Enstitüsü, Rusya Bilimler Akademisi, Nizhniy Novgorod, Rusya) SRS ses düzeyini değiştirmek zaman ders ölçmek için kullanılmıştır. Re-eki vol zaman kursuume değişiklik Optik Koherens Tomografi (OCT) ile ölçüldü. Dekolmanı boyutlarda bir değişim göstermektedir (A, B, oklar, ve D) 40-70 dakika süreyle ön yüzeyine IFNγ Ayrıca aşağıdaki 4 farklı deneyler (AD soldaki paneller) OCT görüntüleri. Paneller A ve IFNγ kontrol oranı JV arttığını B gösterisi (≈ 2 ul • 2 • saat -1) sırasıyla 14 ve 12 ul • cm 2 saat-1 cm. Kaynaklı emme oranları önemli ölçüde JAK-STAT yolu ve PKA inhibitörleri (C ve D), IFNγ ilavesinden sonra 0.2 ve 7.9 azaldı ul • cm 2 • saat-1, sırasıyla. Oklar, kesikli çizgi içine alan, (başlangıç ​​hacim) ile karşılaştırıldığında bleb sınırını gösterir. Figürün sağ tarafı: t = 0 dekolmanı mekansal kapsamı ve çeşitli deneyler Ölçülen JV oranları üst panelde özeti; orta panel film ( <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2032/Bleb%205.wmv">buraya tıklayın</a> ); alt panel-3D B. mavi Pseudocolor özetlenebilir deney bölümleri gösterir . INFγ ek 40 dakika sonra. Vizyon Araştırma ve Oftalmoloji bildirimde Derneği ile uyumlu Tüm hayvan deneyleri yapılmıştır. Protokolü Ulusal Sağlık Enstitüleri Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı.

<ol>
	<li>Bharti, K., Miller, S. S., Arnheiter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+paradigm:+Retinal+pigment+epithelium+cells+generated+from+embryonic+stem+cells+or+induced+pluripotent+cells.">The new paradigm: Retinal pigment epithelium cells generated from embryonic stem cells or induced pluripotent cells.</a> Pigment Cell &#38; Melanoma Research. , .</li><li>Strunnikova, N. V., Maminishkis, A., Barb, J. J., Wang, F., Zhi, C., Sergeev, Y., Chen, W., Edwards, A. O., Stambolian, D., Abecasis, G., Swaroop, A., Munson, P. J., Miller, S. S., S, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+and+molecular+signature+of+human+retinal+pigment+epithelium.">Transcriptome analysis and molecular signature of human retinal pigment epithelium.</a> Hum Mol Genet. 19 (12), 2468-2486 (2010).</li><li>Miller, S. S., Maminishkis, A., Li, R., Adijanto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+184:+Phototransduction:+RPE+transport+Retina+Phototransduction:+RPE+transport.">Chapter 184: Phototransduction: RPE transport Retina Phototransduction: RPE transport.</a> Encyclopedia of the Eye. , 2540-2540 (2010).</li><li>Bryant, D. M., Mostov, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+cells+to+organs:+Building+polarized+tissue.">From cells to organs: Building polarized tissue.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (11), 887-901 (2008).</li><li>Maminishkis, A., Chen, S., Jalickee, S., Banzon, T., Shi, G., Wang, F. E., Ehalt, T., Hammer, J. A., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confluent+monolayers+of+cultured+human+fetal+retinal+pigment+epithelium+exhibit+morphology+and+physiology+of+native+tissue.">Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 3612-3624 (2006).</li><li>Shi, G., Maminishkis, A., Banzon, T., Jalickee, S., Li, R., Hammer, J., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+chemokine+gradients+by+the+retinal+pigment+epithelium.">Control of chemokine gradients by the retinal pigment epithelium.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 4620-4630 (2008).</li><li>Economopoulou, M., Hammer, J., Wang, F. E., Fariss, R., Maminishkis, A., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+localization,+and+function+of+junctional+adhesion+molecule-C+(JAM-C)+in+human+retinal+pigment+epithelium.">Expression, localization, and function of junctional adhesion molecule-C (JAM-C) in human retinal pigment epithelium.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (3), 1454-1463 (2008).</li><li>Li, R., Maminishkis, A., Banzon, T., Wan, Q., Jalickee, S., Chen, S., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFN{gamma}+Regulates+Retinal+Pigment+Epithelial+Fluid+Transport.">IFN{gamma} Regulates Retinal Pigment Epithelial Fluid Transport.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 297, C1452-C1465 (2009).</li><li>Li, R., Maminishkis, A., Wang, F. E., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDGF-C+and+-D+induced+proliferation/migration+of+human+RPE+is+abolished+by+inflammatory+cytokines.">PDGF-C and -D induced proliferation/migration of human RPE is abolished by inflammatory cytokines.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, 5722-5732 (2007).</li><li>Maminishkis, A., Jalickee, S., Blaug, S. A., Rymer, J., Yerxa, B. R., Peterson, W. M., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P2Y(2)+receptor+agonist+INS37217+stimulates+RPE+fluid+transport+in+vitro+and+retinal+reattachment+in+rat.">The P2Y(2) receptor agonist INS37217 stimulates RPE fluid transport in vitro and retinal reattachment in rat.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 43, 3555-3566 (2002).</li><li>Wang, F. E., Zhang, C., Maminishkis, A., Dong, L., Zhi, C., Li, R., Zhao, J., Majerciak, V., Gaur, A. B., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-204/211+alters+epithelial+physiology.">MicroRNA-204/211 alters epithelial physiology.</a> FASEB J. 24, (2010).</li><li>Adijanto, J., Banzon, T., Jalickee, S., Wang, N. S., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CO2-induced+ion+and+fluid+transport+in+human+retinal+pigment+epithelium.">CO2-induced ion and fluid transport in human retinal pigment epithelium.</a> J Gen Physiol. 133, 603-622 (2009).</li><li>Li, R., Maminishkis, A., Zahn, G., Vossmeyer, D., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+alpha5beta1+mediates+attachment,+migration,+and+proliferation+in+human+retinal+pigment+epithelium:+relevance+for+proliferative+retinal+disease.">Integrin alpha5beta1 mediates attachment, migration, and proliferation in human retinal pigment epithelium: relevance for proliferative retinal disease.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 5988-5996 (2009).</li><li>Peterson, W. M., Meggyesy, C., Yu, K., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+ATP+activates+calcium+signaling,+ion,+and+fluid+transport+in+retinal+pigment+epithelium.">Extracellular ATP activates calcium signaling, ion, and fluid transport in retinal pigment epithelium.</a> J Neurosci. 17, 2324-2337 (1997).</li><li>Voloboueva, L. A., Liu, J., Suh, J. H., Ames, B. N., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R)-alpha-lipoic+acid+protects+retinal+pigment+epithelial+cells+from+oxidative+damage.">R)-alpha-lipoic acid protects retinal pigment epithelial cells from oxidative damage.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46, 4302-4310 (2005).</li></ol>

Mevcut deneylerde, göz başına elde edilen hücrelerin daha yüksek bir numaraları ile tutarlı hfRPE primer kültürlerinde üretmek için gerekli çoklu adımları kolaylaştırmak için tasarlanmış, daha önce yayınlanan teknikler 3 ek değişiklikler açıklanmaktadır. Orijinal prosedür her değişiklik, titizlikle değişiklikler eserleri tanıtmak etmedi ve sürekli olarak bu hücreleri kullanarak birçok diğer laboratuvarlar tarafından test edilen sağlamak için birden fazla fizyoloji ve moleküler biyoloji deneyleri test edildi. Son olarak, ek deneyler, hayvan modellerinde in vitro sonuçlar benzer tedirginlikler karşılaştırmak için yapılmıştır .

Diseksiyonu protokol için gerekli Aletleri <ol><li> Stereo Mikroskop - diseksiyon için gerekli çalışma büyütme x250 ile herhangi bir </li><li> Diseksiyon çanak - örneğin Kimble 100 x 20mm # 23062 (diseksiyon başına bir) herhangi bir kaynaktan </li><li> Sylgard 184 - TEFE Kedi. # SYLG184 * * Çanak Sylgard 184 karıştırma talimatları takip diseksiyon hazırlamak için, 5-8mm tabaka oluşturur karışık sıvı elastomer Petri kabı içine dökün. Elastomer en az 24 saat için tedavi etmek için izin ver. Tedavi elastomer Bulaşık% 70 etanol ve tekrar birden çok kez (~ 100 kat) ile sterilize edilebilir </li><li> 27 G iğne BD PrecissionGlide 1 ¼ uzunluğu (diseksiyon başına 5) herhangi bir kaynaktan </li><li> Ca ve Mg tuzları içeren HBSS 1X Çözüm - Gibco Kedi # 14025 500ml (çok diseksiyonlarının iyi). </li><li> Iris makas karbür tırtıklı bıçağı, kavisli - FST Kedi # 14.559-11 (bir). </li><li> Retina makas - Katena Kedi # K4-5300 (bir). </li><li> Forseps - örneğin Dumont Cımbız # 5 TEFE Cat cilalı ipuçları # 500.085 (2 adet). </li><li> Bıçak SidePort - Alcon, k seçik 1mm, Çift Konik, açılı Kedi # 8065921540. </li><li> Tüp 15ml Santrifüj (bir göz için) herhangi bir kaynaktan </li><li> Pasteur, cam pipet (diseksiyon başına bir) herhangi bir kaynaktan </li><li> Plaka iyi 12 (diseksiyon başına bir) herhangi bir kaynaktan </li><li> Primaria 25cm 2 balon - (göz için 2-3) herhangi bir kaynaktan </li></ol>

experimental models for study of retinal pigment epithelial physiology and pathophysiology

Biz yerli insan RPE morfolojik, fizyolojik ve genetik özellikleri ile birincil insan fetal retina pigment epitel (hfRPE) kültürler konfluent mono tabakaları büyük miktarlarda üretebilir bir hücre kültürü prosedürü geliştirdik. Bu hfRPE hücre kültürleri ağır pigmentasyon sergi ve elektron mikroskobu geniş apikal membran mikrovilluslar göstermektedir. Junctional kompleksleri çeşitli sıkı kavşak proteinlerin immünofloresan etiketlenmesi ile tespit edildi. Bu kolayca tekrarlanabilir birincil kültürlerin Epitel polarite ve fonksiyon yakından Daha önce insan dahil olmak üzere yerli RPE memeli modelleri, çalışılan benzerler. Bu sonuçlar, birçok hayvan modellerinde insan göz hastalığı tedavi edici girişimlerin geliştirilmesi ile uzatıldı. Biz, retina veya subretinal alan anormal sıvı birikimi kaldırılması için stratejiler üzerinde duruldu. Ekstrasellüler subretinal alan fotoreseptör dış segmentleri ve RPE apikal membran ayırır ve retina ekleri bakım ve RPE / retinanın etkileşimi bir bütün ana için kritik öneme sahiptir.

Watch this Scientific Journal Video about Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology at JoVE.com

Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

Biz insan fetal retina pigment epitel hücreleri (hfRPE) hücrelerin kültür konfluent mono tabakaları, morfoloji, fizyoloji, polarite, ve yetişkin doğal doku protein ve gen ekspresyonu sergilediği için tekrarlanabilir bir yöntem sağlar. Bu çalışma, çeşitli göz hastalıkları bir hayvan modeli uzatıldı.

Retina Pigment Epitel Fizyoloji ve Patofizyoloji Çalışma Deneysel Modeller

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium ...

experimental-models-for-study-retinal-pigment-epithelial-physiology

Research

JoVE Journal

Neuroscience

19.1K Görüntüleme.  National Institutes of Health. Biz insan fetal retina pigment epitel hücreleri (hfRPE) hücrelerin kültür konfluent mono tabakaları, morfoloji, fizyoloji, polarite, ve yetişkin doğal doku protein ve gen ekspresyonu sergilediği için tekrarlanabilir bir yöntem sağlar. Bu çalışma, çeşitli göz hastalıkları bir hayvan modeli uzatıldı.

Video: Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

Retina pigment epiteli Tüm Mount Fare Göz Diseksiyon

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Nörobilim

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Serebellar Granül Nöronlar Genetik Manipülasyon<em&gt; In Vitro</em&gt; Ve<em&gt; In Vivo</em&gt; Nöronal morfoloji ve Göç Eğitim için

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in retinopathies using non-viral and viral gene delivery to the retina and retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injection is the best approach to deliver viral vectors directly to RPE cells. Before the clinical trial of a gene therapy, it is inevitable to validate the efficacy of the therapy in animal models of various retinopathies. Thus, subretinal injection in mice becomes a fundamental technique for an ocular gene therapy. In this protocol, we provide the easy and replicable technique for subretinal injection of viral vectors to experimental mice. This technique is modified from the intravitreal injection, which is widely used technique in ophthalmology clinics. The representative results of RPE/choroid/scleral complex flat-mount will help to understand the efficacy of this technique and adjust the volume and titer of viral vectors for the extent of gene transduction.

Subretinal injection is a surgical technique for effective gene delivery to retinal pigment epithelium in the mouse eye. Here we describe an easy and replicable method for subretinal injection of viral vectors to retinal pigment epithelium in experimental mice.

Fareler Retina Pigment Epitel Gen Tedavisi için Viral Vektörler Limbal Yaklaşım-Subretinal Enjeksiyon

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility in genetic and chemical manipulation of individual cells or defined networks. Such ease of manipulation is simpler in the reduced culture system when compared to the intact brain tissue. While many methods for the isolation and growth of these primary neurons exist, each has its own limitations. This protocol describes a method for culturing low-density and high-purity rodent embryonic hippocampal neurons on glass coverslips, which are then suspended over a monolayer of glial cells. This &#39;sandwich culture&#39; allows for exclusive long-term growth of a population of neurons while allowing for trophic support from the underlying glial monolayer. When neurons are of sufficient age or maturity level, the neuron coverslips can be flipped-out of the glial dish and used in imaging or functional assays. Neurons grown by this method typically survive for several weeks and develop extensive arbors, synaptic connections, and network properties.

This article describes the protocol for culturing low-density primary hippocampal neurons growing on glass coverslips inverted over a glial monolayer. The neuron and glial layers are separated by paraffin wax beads. The neurons grown by this method are suitable for high-resolution optical imaging and functional assays.

Düşük Yoğunluk İlköğretim Hipokampal Nöron Kültürü

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is characterized by the degeneration of retinal pigment epithelial (RPE) cells, which are a monolayer of cells functionally supporting and anatomically wrapping around the neural retina. Current pharmacological treatments for the non-neovascular AMD (dry AMD) only slow down the disease progression but cannot restore vision, necessitating studies aimed at identifying novel therapeutic strategies. Replacing the degenerative RPE cells with healthy cells holds promise to treat dry AMD in the future. Extensive preclinical studies of stem cell replacement therapies for AMD involve the transplantation of stem cell-derived RPE cells into the subretinal space of animal models, in which the subretinal injection technique is applied. The approach most frequently used in these preclinical animal studies is through the trans-scleral route, which is made difficult by the lack of direct visualization of the needle end and can often result in retinal damage. An alternative approach through the vitreous allows for direct observation of the needle end position, but it carries a high risk of surgical traumas as more eye tissues are disturbed. We have developed a less risky and reproducible modified trans-scleral injection method that uses defined needle angles and depths to successfully and consistently deliver RPE cells into the rat subretinal space and avoid excessive retinal damage. Cells delivered in this manner have been previously demonstrated to be efficacious in the Royal College of Surgeons (RCS) rat for at least 2 months. This technique can be used not only for cell transplantation but also for delivery of small molecules or gene therapies.

Subretinal injection has been widely applied in preclinical studies of stem cell replacement therapy for age-related macular degeneration. In this visualized article, we describe a less risky, reproducible and precisely modified subretinal injection technique via the trans-scleral approach to deliver cells into rat eyes.

Sıçan gözlerinin içine insan retina Pigment epitel hücrelerinin Trans-scleral Subretinal nakli için rafine bir protokol geliştirilmesi

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Experimental Models to Study the Neuroprotection of Acidic Postconditioning Against Cerebral Ischemia

Stroke is one of the leading causes of mortality and disability worldwide, with limited therapeutic approaches. As an endogenous strategy for neuroprotection, postconditioning treatments have proven to be promising therapies against cerebral ischemia. However, complicated procedures and potential safety issues limit their clinical application. To overcome these disadvantages, we have developed acidic postconditioning (APC) as a therapy for experimental focal cerebral ischemia. APC refers to the mild acidosis treatment by inhaling CO2 during reperfusion following ischemia. Here we present two models to execute APC in vitro and in vivo, respectively. The oxygen-glucose deprivation (OGD) treatment of mice and the corticostriatal occlusion and middle cerebral artery occlusion (MCAO) of mice were employed to mimic cerebral ischemia. APC can be simply achieved by transferring brain slices to acidic buffer bubbled with 20% CO2, or by mice inhaling 20% CO2. APC showed significant protective effects against cerebral ischemia, as reflected by tissue viability and brain infarct volume.

Acidic postconditioning protects against cerebral ischemia. Here we present two models to execute APC. They are achieved respectively by transferring corticostriatal slices to acidic buffer after oxygen-glucose deprivation in vitro and by inhaling 20% CO2 after middle cerebral artery occlusion in vivo.

Serebral İskemiye Karşı Asitik Sonrası Sonrasyonun Sinir Korumasını Çalıştırmak için Deney Modelleri

Stroke is one of the leading causes of mortality and disability worldwide, with limited therapeutic approaches. As an endogenous strategy for ...

Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for determining the mechanisms underlying retinal diseases. Maintaining structural integrity throughout the tissue preparation is vital for obtaining reproducible retinal IHC data but can be challenging due to the fragility and complexity of retinal cytoarchitecture. Strong fixatives like 10% formalin or Bouin's solution optimally preserve the retinal structure, they often impede IHC analysis by enhancing the background fluorescence and/or diminishing antibody-epitope interactions, a process known as epitope masking. Milder fixatives, on the other hand, like 4% paraformaldehyde, reduces background fluorescence and epitope-masking, meticulous dissection techniques must be utilized to preserve the retinal structure. In this article, we present a comprehensive method to prepare mouse ocular posterior cups for IHC that is sufficient to preserve most antibody-epitope interactions without loss of retinal structural integrity. We include representative IHC with antibodies to various retinal cell type markers to illustrate tissue preservation and orientation under optimal and sub-optimal conditions. Our goal is to optimize IHC studies of the retina by providing a complete protocol from ocular posterior cup dissection to IHC.

This report describes comprehensive methods for preparing frozen mouse retina sections for immunohistochemistry (IHC). Methods described include dissection of the ocular posterior cup, paraformaldehyde fixation, embedding in Optimal Cutting Temperature (OCT) media and tissue orientation, sectioning and immunostaining.

Immünhistokimya için fare retinal Cryo-bölümler hazırlanması

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for ...

Kültürlenmiş Primer Murin RPE'nin Karakterizasyonu ve Morfolojik Dinamiği

A Simplified Method for Isolation and Culture of Retinal Pigment Epithelial Cells from Adult Mice

Retinal pigment epithelial cells (RPE) are critical for the proper function of the retina. RPE dysfunction is involved in the pathogenesis of important retinal diseases, such as age-related macular degeneration, retinitis pigmentosa, and diabetic retinopathy. We present a streamlined approach for the isolation of RPE from murine adult eyes. In contrast to previously reported methods, this approach enables the isolation and culture of highly pure RPE from adult mice. This simple and fast method does not require extensive technical skill and is achievable with basic scientific tools and reagents. Primary RPE are isolated from C57BL/6 background mice aged 3- to 14-weeks by enucleation of the eye followed by the removal of the anterior segment. Enzymatic trypsinization and centrifugation are used to dissociate and isolate the RPE from the eyecup. In conclusion, this approach offers a quick and effective protocol for the utilization of RPE in the study of retinal function and disease.

Yazar Spotlight: Retinopati Araştırmaları için Yetişkin Farelerden Primer Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin Verimli İzolasyonu

Retinal pigment epithelium (RPE) acts as a crucial barrier between the choroid and retina, promoting the health and function of retinal cell types, such as photoreceptors. Herein, we describe a simple and effective protocol for isolating and culturing adult murine RPE.

Yetişkin Farelerden Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü için Basitleştirilmiş Bir Yöntem

Retinal pigment epithelial cells (RPE) are critical for the proper function of the retina. RPE dysfunction is involved in the pathogenesis of important ...