This work is supported by the V Foundation Scholar (AGF) and the MPN Research Foundation (AGF).

Bu çalışma onaylanmış ve California, Irvine Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından önerileri doğrultusunda gerçekleştirilmiştir. Tüm işlemler izofluran anestezi altında yapılan ve tüm çabaları acı en aza indirmek için yapılmıştır. Ekotropik retrovirüs 1. Üretim <ol><li> ticari bir maksi-hazırlık kiti ve sezyum klorür arıtma kullanarak en az 1 ug / ml bir konsantrasyonda yüksek kaliteli plazmidler hazırlayın. Not: Bu, bir MSCV omurgası (CALR 7,8 bu durumda) ilgili geni kodlayan vektör ve (vs GFP, Neo) seçim işaretleyici olarak ekotropik bir paketleme plazmiti kodlayan gag-pol-env içerir (de ifade burada plazmid gibi). </li><li> DMEM çözülme ve genişletme düşük geçiş 293T hücreleri, penisilin / streptomisin (D10) ile,% 10 FBS ve L-glutamin ile takviye edilmiştir. Nemlendirilmiş bir 10 cm doku kültürü ile muamele edilmiş çanak levha 5 x 10 6 hücredoku kültürü, 37 ° C&#39;de kuluçka% 5 CO2. </li><li> kültür içinde, 293T hücreleri genişletmek. Transfeksiyondan bir gün önce, bir vakum şişesi içine, 1 ml PBS ve aspirat süpernatan ilave edilerek hücrelerin yıkanması. </li><li> Hücreleri tripsinize edin için, 2 mi% 0.05 tripsin ekleyip inkübe yemekler 2 nemlendirilmiş bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde - 3 dakika 37 ° C&#39;de ve% 5 CO2. </li><li> , Trypsinization durdurmak 15 ml konik tüp çanak 3 ml D10 ve transfer hücreleri ekleyin. 10 dakika boyunca 400 xg&#39;de hücreleri dönerler. </li><li> 2 ml D10 bir termos ve tekrar süspansiyon hücre pelet haline Süpernatant aspire. </li><li> hemasitometre kullanarak tripan mavi dışlama hücreleri saymak. </li><li> Tohum oluşturulan virüs başına üç 10 cm doku kültürü ile tedavi edilen yemeklerin içine çanak başına 2 x 10 6 hücre. NOT: En iyi sonuçlar için, hücreler 30 aşmasına izin vermez - transfeksiyon veya kötü virüs verim elde edilebilir anda% 50 izdiham. </li><li> Transfeksiyondan hemen önceve bir termos içine aspire medya 5 ml taze D10 ile değiştirin. </li><li> Her 10 cm Petri kabı bağımsız bir 1.5 mL steril mikrosantrfuj tüp hazırlanması transfekte edilmesi. </li><li> Pipet her mikrosantrifüj tüpe düşük serum ortamında 760 ul, daha sonra dikkatlice doğrudan ortama transfeksiyon reaktif 40 ul ekleyin. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında doku kültürü kaputu inkübe edin. </li><li> ilgili gen (boş vektör kullanılarak 15 ug varsa) olarak her bir ilgili tüp plazmid 5 ug MSCV vektörünün 30 ug ekleyin ve aşağı yukarı pipetleme yavaşça karıştırın. ilave bir 15 dakika boyunca doku kültürü kaputu oda sıcaklığında inkübe edin. NOT: Daha küçük vektörler yüksek viral verim sahip olma eğilimindedir. </li><li> Dikkatle damla damla, ilgili 10 cm Petri kabı içine her reaksiyon (yaklaşık 800 ul) toplam hacmi ekleyin ve hafifçe karıştırın yanlara doğru çanak eğin. nemlendirilmiş doku cu hücreleri dönünlture inkübatör. </li><li> doku kültürü kuluçka makinesi içinde bir 8 saat veya bir gece inkübe edildikten sonra, yavaşça aspire bir vakum şişesi içine ortam ve taze D10, 10 ml ile değiştirin. </li><li> 48 saat sonra, transfeksiyondan &#39;de 35 ml şırınganın içine süpernatan toplamak ve hücre debrisini uzaklaştırmak için 0.45 um&#39;lik bir membrandan filtre. </li><li> İSTEĞE BAĞLI: 293T hücreleri ve ek virüs yerleştirin 10 ml taze D10 geri 72 saat sonrası transfeksiyon hasat edilebilir. </li><li> Hiçbir ek virüs tahsil edildiğinde biyolojik tehlike atık 293T hücrelerinin imha edin. </li><li> (Örneğin virüs titresi 1 ml veya BM enfeksiyonu için 6.5 ml için) tek kullanımlık birimlere kısım viral süpernatant. -80 ° C&#39;de, sıvı azot ve mağaza virüsü ile flaş dondurma virüsü. NOT: onlar büyük ölçüde virüs titresi azaltmak olarak tekrarlanan donma / çözülme döngüleri kaçının. </li></ol> 2. Sitometrisi ile Bağıl Viral titresi belirlemek <ol><li> 3T3 hücreleri çözülme ve D10 korumak. 10 cm Kültür hücreleridoku kültürü CO2, 37 ° C&#39;de, nemlendirilmiş bir doku kültürü inkübatörü içinde çanak muamele edilmiş ve% 5. </li><li> üç kopya halinde viral titresi gerçekleştirin. vakum balona 1 ml PBS ve aspirat süpernatant ekleyerek hücreleri yıkayın, hücreler hazırlamak. </li><li> Hücreleri tripsinize edin için, 2 mi% 0.05 tripsin ekleyip inkübe yemekler nemlendirilmiş bir doku kültürü inkübatörü içinde, 37 ° C&#39;de ve% 5 CO2. </li><li> , Trypsinization durdurmak 15 ml konik tüp çanak 3 ml D10 ve transfer hücreleri ekleyin. 10 dakika boyunca 400 xg&#39;de hücreleri dönerler. </li><li> 2 ml D10 bir termos ve tekrar süspansiyon hücre pelet haline Süpernatant aspire. </li><li> hemasitometre kullanarak tripan mavi dışlama hücreleri saymak. </li><li> Tohum 3T3 beş 60 mm doku kültürü ile muamele edilmiş kaplarına 1 x 10 5 hücre yoğunluğunda hücreler ve gece boyunca inkübe edilir. </li><li> 3, 1:10 1:30, ve 1: 1 ml toplam D10 kullanılarak çözündürüldü viral süpernatanın 100 dilüsyonları 1 sağlayın. Ayrıca virüssüz kontrolünü içerir. </li><li> beni aspirebir vakum şişesi içine 3T3 hücrelerinden çap ve D10, 4 ml ile değiştirin. </li><li> Viral süpernatan seyreltileri ile 3T3 hücreleri Yerleşimi ve her bir çanak 8 ug / ml bir son konsantrasyona kadar polibren ekleyin. 37 ° C&#39;de doku kültürü kuluçka makinesi içinde 48 saat ve% 5 CO2 inkübe edin. </li><li> flow sitometri ile göreli viral titresi belirlemek: <ol><li> Hücreleri yıkamak için, bir vakum balona medya aspire ve 5 ml PBS ekleyin. </li><li> vakum şişe içine PBS aspire. 1 mi% 0.05 tripsin ilave edin ve 2 37 ° C de inkübe - 5 dakika çanak hücreleri ayırmak için. </li><li> plaka kalan hücreleri ayırmak için aşağı 3 ml D10 ekleyin ve yukarı pipet ve. 10 dakika boyunca 400 xg&#39;de FACS tüp ve santrifüj hücreleri aktarın. </li><li> süpernatant süzün ve 3 ml PBS ile yıkama hücreleri. 10 dakika ve decant süpernatant 400 x g&#39;de santrifüj. 200 ul PBS içinde süspanse. </li><li> 9 bir akış sitometre üzerinde çalıştırın hücreler. t içinde 30.000 olayları - 20.000 arasında toplayıno (SSC vs FSC tarafından belirlenen) hücre kapısı yaşamak ve GFP + ve GFP yüzdesini hesaplamak - hücreler. Not: bir viral titresi olarak kabul edilebilir olarak kabul edilir zaman viral süpernatan verim, en az% 50, GFP + 3T3 hücrelerinin 1:30 seyreltme. Eğer en az% 50, GFP + hücreleri, bu seyreltme sonuçlar daha sonra optimal iletim sonuçlar elde edilebilir. Viral titresini belirlemek için hesaplama Limon ve ark uyarlanmıştır. , Blood (1997) 9. </li><li> Virüs titresi = parçacık oluşturan birimler (PFU) / ml = [(GFP + hücrelerin frekansı x 3T3 hücre sayısı) yardımıyla yüzücünün (mi) / hacim] x seyreltme faktörü: göreli virüs titresini belirlemek için denklem kullanır. </li></ol></li></ol> 3. transduce Donör Kemik İliği Hücreleri <ol><li> kemik iliği için donör fareler hazırlamak için (BM) hasat önce% 5 Birleştirilen tamamlayıcı olan bir akış oranı ile izofluran buharlaştırıcı ile fareler anestezi/ Dakika, 1 L oksijen. reaksiyonunu değerlendirmek için ayak sıkıştırın. NOT: (az 8 haftalık) Donör fareler (8 gün önce transplantasyon) 5 gün önce kemik iliği hasat hazırlanmalıdır. Bir donör fareler en az 2 alıcılar için yeterli hücre sağlar. </li><li> Enjekte 150 mg / kg, 27 G x ½ &quot;iğne kullanılarak, anestezi uygulanmış farelerde retroorbital enjeksiyon yoluyla 5-fluorourasil (5-FU). DİKKAT! 5-FU, bir anti-kanser kemoterapötik madde. Her zaman yetkili bir kimyasal bir davlumbaz veya kanallı biyogüvenlik kabini içinde 5-FU anlaştım. 5-FU ile tedavi edilen farelerin uygun etiketleme belirlemek için kurumun laboratuvar ve hayvan güvenliği komitesi danışın. <ol><li> yan anestezi fare getirin ve göz kafası biraz çıkıntı şekilde başparmak ve işaret parmağı hem de kullanılarak dizginlemek. </li><li> medial canthus ve yukarı bakacak şekilde eğim ile iğne yanal ile başlayarak, bir 45 ° iğneyimedial yönde açısı ° ve iğne yarım takıldığında durdurun. Yavaşça hücreleri enjekte ve dikkatlice iğneyi kaldır. NOT: Bu teknik doğru yapılırsa, göz hafifçe geri çekilmelidir ve hiçbir direnç iğne sokulması üzerine keçe edilmelidir. </li><li> Böyle şişme veya kanama gibi yaralanma herhangi bir işaret için fareyi inceleyin. </li></ol></li><li> Hasat kemik iliği 5 gün (transplantasyonundan 3 gün önce), 5-FU tedavisi sonrası. <ol><li> / Dakika, 1 L% 5 Birleştirilen ilave oksijen akış hızı ile izofluran buharlaştırıcı ile fareler anestezi. reaksiyonunu değerlendirmek için ayak sıkıştırın. </li><li> servikal dislokasyon ile fare Kurban. kürk ıslak hale gelinceye kadar% 70 EtOH ile cömertçe püskürtülerek fare sterilize edin. </li><li> diseksiyon makas kullanarak, deride bir kesi yapmak ve uzak bacak kaslarından fasya teşrih. Sonra, kalça femur ve ayak bileğinde tibia kesilmesinin fare uzak bacak teşrih. </li><li> virajBir &quot;L&quot; şeklinde bacak ve diseksiyon makas ile diz eklemi keserek her bacak kemiği ayırın. </li><li> her bacak kemiğin distal uçlarında kıkırdak kaldırmak için, kıkırdak devre kadar yavaşça bacak kemik bir uca doğru kas kazımak için kesme makasları kullanın. </li><li> 27 x g ½ inç iğne ile bir şırınga kullanılarak, PBS ile yıkayın, her bacak kemiği 50 ml konik bir tüp içinde 100 uM bir naylon membran üzerinde% 2 FBS ile takviye edilmiştir. Kemik kadar yıkayın kemik hasat hücrelerin sayısını arttırmak için beyaz olur. </li><li> tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için 50 mL konik tüp içine naylon membran aracılığı ile hücreler arasında püre bir şırınga pistonu kullanın. diğer fare bacak ile tekrarlayın. </li></ol></li><li> 4 ° C&#39;de santrifüje hücreler 400 x g&#39;de 10 dakika ve süpernatan atılır. Süspanse BM 5 mi amonyum klorit, potasyum (ACK) tampon içinde, kırmızı kan hücreleri lize etmek için. 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe hücreleri. </li><li> hücre parçalama durdurmak için PBS ile tüp doldurun. Centri4 ° C&#39;de fuge hücreler 400 x g&#39;de 10 dakika ve süpernatan atılır. BM pelet kırmızı rengi varsa parçalama adımı yineleyin. </li><li> 5 ml PBS içinde süspanse ve hemasitometre kullanarak tripan mavi dışlama hücreleri saymak. </li><li> DMEM% 20 FBS, L-glutamin, penisilin / streptomisin ile takviye içeren 2x ön-Stim kokteyl m başına 2 x 10 6 hücre yeniden süspanse hücre, IL-3, (14 ng / ml), IL-6 (24 ng / mi) ve SCF (112 ng / ml). Plaka 6 yuvalı plakalar içinde oyuk başına 2 mi. </li><li> 37 ° C&#39;de gece boyunca inkübe hücreleri ve% 5 CO2. </li><li> içeren her BM hücrelerinin viral süpernatan 2 ml ilave edilir ve polybrene (ug / ml 8 mg) ekleyin. 1,500 x g&#39;de 90 dakika boyunca 30 ° C &#39;de dönel Plakalar daha sonra gece boyunca bir doku kültürü kuluçka makinesine plaka dönüş. </li><li> Pipet hücresi konik tüpler içine süspansiyonu ve 400 x g&#39;de 10 dakika boyunca 4 ° C&#39;de santrifüj plaka atın yoktur. 2 ml yeniden süspanse hücreleri taze 2x öncesi stim kuyu başına kokteyl ve özgün kuyulara geri dönün. </li&gt; <li> Adımları 3,7-3,9 yineleyerek bir 2. spinoculation gerçekleştirin. </li></ol> Alıcı Fare içine 4. Nakli Donör Hücreleri <ol><li> 24 saat önce BM hücrelerinin enjeksiyonu için ölümcül doz, toplam vücut ışınlaması ile &lt;nakli için singeneik alıcı fareler hazırlayın. NOT: BALB / c farelerde için ölümcül doz ışınlama tipik 800-900 cGy ve C57B / 6 10 1,000-1,200 cGy olduğunu. doz tipik olarak, en azından 3-4 saat aralıklı ışınlama iki oturum ayrılmıştır. </li><li> yavaşça konik tüpler içine süpernatant pipetleme 6 kuyucuğu aşama 3.11, hasat transdüksiyona donör hücrelerinden devam etti. Kalıntı hücreleri toplamak ve 50 ml konik tüp eklemek 1 ml PBS ile iyice her yıkama. </li><li> oyuklara% 0.05 tripsin 0.5 ml ilave edilir ve 5 dakika boyunca doku kültür inkübatörü içinde 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> kuyulara 1 ml D10 ekleyin ve yumuşak pipetleme kalan hücreleri ayırmak. ilgili tüp hücreleri ekleme400 x g&#39;de 10 dakika boyunca 4 ° C&#39;de santrifüj ile adım 4.2 ve pelet s. </li><li> 400 x g&#39;de 10 dakika boyunca 4 ° C&#39;de PBS ve santrifüj ile hücreler yıkanır. tripan mavi dışlama hemasitometre kullanarak 5 ml PBS içinde süspanse ve saymak hücreleri. Not: vektör, bir GFP etiketi vardır, o zaman, bir akış sitometresiyle GFP pozitif hücrelerin yüzdesi miktarı belirlenir. </li><li> Farelere enjeksiyon için 100 ul PBS - 50, 2 x 10 6 hücre - 5 x 10 5 süspanse edin. </li><li> steril bir 27 G x ½ &quot;iğne kullanılarak anestezi farelere retroorbital enjeksiyon yoluyla hücreleri enjekte edilir. NOT: Diğer enjeksiyon teknikleri kuyruk ven, dalak, ya da femoral içerir. <ol><li> reaksiyonunu değerlendirmek için izofluran ve tutam ayak kullanarak fare anestezisi. </li><li> yan fare yerleştirin ve göz kafası biraz çıkıntı şekilde başparmak ve işaret parmağı hem de kullanılarak dizginlemek. </li><li> konik yukarı bakacak şekilde, n eklemek45 ° açıyla medial canthus lateral eedle. NOT: Bu teknik doğru yapılırsa, göz hafifçe geri çekilmelidir ve hiçbir direnç iğne sokulması üzerine keçe edilmelidir. </li><li> Böyle şişme veya kanama gibi yaralanma herhangi bir işaret için fareyi inceleyin. NOT: Aşağıdaki nakli fareler birkaç hafta için düşük kan sayımı var ve bu yüzden enfeksiyona duyarlı olacaktır. antibiyotikler veya asitleştirilmiş su kullanımı ile profilaksisi kullanılabilmektedir. </li></ol></li><li> Nakil sonrası bir ay flow sitometri engrafted donör hücreleri bir göstergesi olarak periferik kanda% GFP ölçün. NOT: Tek başına GFP hücrelerinin engraftman başarısını belirleyemiyor. Viral iletimi başarısız olmuş olabilir ama engraftmınt meydana gelmiş olabilir. Bu durumda, hiçbir GFP + hücreler tespit ama nakledilen hücrelerin melezleşmesi başarılı olacaktır. <ol><li> periferik kan b 10 ul alıny 21 G x 1 ½ &quot;şırınga ile safen bacak ven delinmesiyle ve pıhtılaşmasını önlemek için PBS içinde 100 mM EDTA ekleyin. </li><li> 10 dakika boyunca buz üzerinde, kan ve eritmek için 1 mi ACK ekleyin. 10 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüj ile pelet hücreleri. </li><li> Aspire bir vakum şişesi içinde yüzer ve 1 ml PBS ilave lizis durdurmak için% 2 FBS ile takviye edilmiştir. 10 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüj ile pelet hücreleri. </li><li> 100 ul PBS içinde bir vakum şişe ve tekrar süspansiyon pelet aspire süpernatan% 2 FBS ile takviye edilmiştir. </li><li> Bir akış sitometresinde örnekleri çalıştırın ve (SSC vs FSC tarafından belirlenir) canlı hücre kapısının içinde 300.000 olayları toplamak ve GFP + ve GFP yüzdesini hesaplamak - hücrelerinden 9. </li></ol></li><li> Ayrıca 1 ay nakil sonrası da, hastalığın ilerlemesini izlemek için otomatik bir veteriner hematoloji analizörü 18 kullanılarak tam kan sayımı (CBC) gerçekleştirin. NOT:% oranında hastalığı izlemeye devam edinAylık periferik kan ve CBC GFP. </li><li> Denemeyi sonlandırmak için, yanıt değerlendirmek için izofluran ve tutam ayak kullanarak fare uyutmak. histopatoloji için servikal dislokasyon ve hasat dalak ve kemik iliği tarafından fare Kurban. NOT: Deneyin uzunluğu öznel ve bitiş tarihi beklenen hastalık fenotipi dayalı değerlendirilmelidir. </li></ol>

<ol>
	<li>Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+chronic+myelogenous+leukemia+in+mice+by+the+P210bcr/abl+gene+of+the+Philadelphia+chromosome.">Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome.</a> Science(New York, N.Y.). 247 (4944), 824-830 (1990).</li><li>Wernig, G., Mercher, T., Okabe, R., Levine, R. L., Lee, B. H., Gilliland, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Jak2V617F+causes+a+polycythemia+vera-like+disease+with+associated+myelofibrosis+in+a+murine+bone+marrow+transplant+model.">Expression of Jak2V617F causes a polycythemia vera-like disease with associated myelofibrosis in a murine bone marrow transplant model.</a> Blood. 107 (11), 4274-4281 (2006).</li><li>Lacout, C., Pisani, D. F., Tulliez, M., Gachelin, F. M., Vainchenker, W., Villeval, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAK2V617F+expression+in+murine+hematopoietic+cells+leads+to+MPD+mimicking+human+PV+with+secondary+myelofibrosis.">JAK2V617F expression in murine hematopoietic cells leads to MPD mimicking human PV with secondary myelofibrosis.</a> Blood. 108 (5), 1652-1660 (2006).</li><li>Zaleskas, V. M., Krause, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathogenesis+and+therapy+of+polycythemia+induced+in+mice+by+JAK2+V617F.">Molecular pathogenesis and therapy of polycythemia induced in mice by JAK2 V617F.</a> PloS One. 1, e18 (2006).</li><li>Bumm, T. G. P., Elsea, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+murine+JAK2V617F-positive+myeloproliferative+disease.">Characterization of murine JAK2V617F-positive myeloproliferative disease.</a> Cancer Res. 66 (23), 11156-11165 (2006).</li><li>Marty, C., Pecquet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Calreticulin mutants in mice induce an MPL-dependent thrombocytosis with frequent progression to myelofibrosis. , (2015).</li><li>Klampfl, T., Gisslinger, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutations+of+calreticulin+in+myeloproliferative+neoplasms.">Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms.</a> N. Engl. J. Med. 369 (25), 2379-2390 (2013).</li><li>Araki, M., Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+thrombopoietin+receptor+by+mutant+calreticulin+in+CALR-mutant+myeloproliferative+neoplasms.">Activation of the thrombopoietin receptor by mutant calreticulin in CALR-mutant myeloproliferative neoplasms.</a> Blood. , (2016).</li><li>Lim&#243;n, A., Briones, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Titer+Retroviral+Vectors+Containing+the+Enhanced+Green+Fluorescent+Protein+Gene+for+Efficient+Expression+in+Hematopoietic+Cells.">High-Titer Retroviral Vectors Containing the Enhanced Green Fluorescent Protein Gene for Efficient Expression in Hematopoietic Cells.</a> Blood. 90 (9), 3316-3321 (1997).</li><li>Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+bone+marrow+transplantation+(BMT):+providing+optimal+veterinary+and+husbandry+care+to+irradiated+mice+in+BMT+studies.">Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies.</a> J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 48 (1), 11-22 (2009).</li><li>Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Replication-Defective+Retrovirus+by+Transient+Transfection+of+293T+cells.">Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells.</a> J. Vis. Exp. (10), (2007).</li><li>Challen, G. A., Boles, N., Lin, K. K., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Hematopoietic+Stem+Cell+Identification+And+Analysis.">Mouse Hematopoietic Stem Cell Identification And Analysis.</a> Cytometry A. 75 (1), 14-24 (2009).</li><li>Ergen, A. V., Jeong, M., Lin, K. K., Challen, G. A., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+mouse+side+population+cells.">Isolation and characterization of mouse side population cells.</a> Methods Mol. Bio. (Clifton, N.J.). 946, 151-162 (2013).</li><li>Weksberg, D. C., Chambers, S. M., Boles, N. C., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD150-+side+population+cells+represent+a+functionally+distinct+population+of+long-term+hematopoietic+stem+cells.">CD150- side population cells represent a functionally distinct population of long-term hematopoietic stem cells.</a> Blood. 111 (4), 2444-2451 (2008).</li><li>Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLAM+family+markers+resolve+functionally+distinct+subpopulations+of+hematopoietic+stem+cells+and+multipotent+progenitors.">SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).</li><li>Li, J., Kent, D. G., Chen, E., Green, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+myeloproliferative+neoplasms:+JAK+of+all+grades.">Mouse models of myeloproliferative neoplasms: JAK of all grades.</a> Dis. Model. Mech. 4 (3), 311-317 (2011).</li><li>Mullally, A., Lane, S. W., Brumme, K., Ebert, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloproliferative+neoplasm+animal+models.">Myeloproliferative neoplasm animal models.</a> Hematol. Oncol. Clin. North Am. 26 (5), 1065-1081 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bu protokol, hastalığın şoförü olarak CALRdel52 mutasyonu myelofibrotik doğru ilerledikçe bir esansiyel trombositemi gibi hastalık özetlemek için farelerde kemik iliği nakli nasıl gerçekleştirileceği ayrıntılı bir açıklamasını sağlar. artan trombositler, megakaryositler genişlemesi ve kemik iliği fibrozis CALRdel52 sonuçlarını ifade eden hücrelerin başarılı nakli. Kemik iliği nakli çok aşamalı bir süreçtir gibi, teknik bir hata çıkar, hatta fare ölüm geni eksprese eden hücrele...

İletimi transplantasyon farelerde hematolojik maligniteler modellemek için yararlı bir yöntemdir. Bu teknik geri BCR-ABL1 ektopik ifadesi sadakatle farelerde 1 kronik miyeloid lösemi özetlemek olabilir ilk gösteriye kadar uzanan miyeloid malignitelerini çalışmak için özellikle değerli olmuştur. Bu teknik daha sonra miyeloproliferatif neoplazmı (MPN) mutasyona uğramış JAK2 V617F ve MPL W515K / L yoğun çalışma kolaylaştırmıştır. MPN olgun miyeloid hücreleri ve kemik iliği fibrozisi aşırı ile karakterize hematolojik kanserlerde bir grup. Bu hastalıklar, genel olarak, JAK2, MPL veya CALR ya somatik mutasyon kazanmış bir hematopoietik kök hücrenin klonal büyümesi ortaya çıkar. İletimi-transplantasyon JAK2 V617F ve MPL W515K / L modelleri sergi polisitemi vera ve miyelofibrozisin 2 klinik özellikleri - 5 &lt;/ Sup&gt;. Son zamanlarda, kalretikülin mutasyonlu MPN bir fare modeli de transdüksiyon transplantasyon yöntem 6 oluşturuldu. Bu fareler artmış trombositler, megakaryositler sayısının artması, ve kemik iliği fibrozisi olan bir esansiyel trombositemi benzeri hastalığı gelişebilir. Birlikte, bu modeller MPN moleküler patogenezi içgörü kazanmak için fırsat değil, aynı zamanda geliştirmek ve klinik öncesi ortamda terapötiklerin çalışma kapasitesi sağlamıştır sadece. Bu yazının CALRdel52 mutasyon odaklanarak iletim-transplantasyon metodolojisi ayrıntılı bir açıklamasını sağlar. Bu teknik, bir mutant ışınlanmış singeneik alıcı farelere yapısını ifade eden retroviral kalıt kemik iliği hücrelerinin nakli kapsar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CELL LINES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3T3 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLASMIDS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoPak, also known as pCL-Eco</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12371</td>
			<td>Retroviral packaging cell lines, such as EcoPack 2-293, may be used in place of the EcoPak plasmid and standard 293T cells. Additional &#947;-retrovirus envelope and packaging plasmids are available from Addgene and others.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSCV-IRES-GFP (MIG)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>20672</td>
			<td>Additional &#947;-retroviral transfer plasmids are available from Addgene and others.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CONSUMABLES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G x 1/2&#34; needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin/L-glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-30-009-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-25-052-CI</td>
			<td>Can be homemade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10cm dishes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>172931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12565268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60mm dishes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>150288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9840454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-FU</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A13456-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100um cell strainers</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12565270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>130184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-959-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45um syringe filters</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>0974061B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-548E</td>
			<td>Can be homemade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine IL-3</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>213-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine IL-6</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>216-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine SCF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGENE 9</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6365809001</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml centrifuge tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Accuri C6</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray irradiator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transduction-transplantation mouse model of myeloproliferative neoplasm

Transduction-transplantation is a quick and efficient way to model human hematologic malignancies in mice. This technique results in expression of the gene of interest in hematopoietic cells and can be used to study the gene's role in normal and/or malignant hematopoiesis. This protocol provides a detailed description on how to perform transduction-transplantation using calreticulin (CALR) mutations recently identified in myeloproliferative neoplasm (MPN) as an example. In this protocol whole bone marrow cells from 5-flurouracil (5-FU) treated donor mice are transduced with a retrovirus encoding mutant CALR and transplanted into lethally irradiated syngeneic hosts. Donor cells expressing mutant CALR are marked with green fluorescent protein (GFP). Transplanted mice develop an MPN phenotype including elevated platelets in the peripheral blood, expansion of megakaryocytes in the bone marrow, and bone marrow fibrosis. We provide a step-by-step account of how to generate retrovirus, calculate viral titer, transduce whole bone marrow cells, and transplant into irradiated recipient mice.

transdüksiyon Nakil tekniği hücreler, ilgilenilen geni eksprese eden alıcı farelerin hematopoietik sulandırma ile sonuçlanır. Şekil 1 MPN mutasyona uğramış kalretikulin transdüksiyon-transplantasyon fare modelinin bir özetini göstermektedir. Kısaca, CALRwt ya CALRdel52 eksprese retrovirüs bir C57B / 6 verici fare BM hücrelerini enfekte etmek için kullanılır. Transduced hücreler ilk ay sonrası nakli sırasında meydana ışınlanmış C57B / 6 alıc...

Watch this Scientific Journal Video about Transduction-Transplantation Mouse Model of Myeloproliferative Neoplasm at JoVE.com

Transduction-Transplantation Mouse Model of Myeloproliferative Neoplasm

This manuscript provides a description of the methodology used to establish transduction-transplantation mouse models. A detailed account is given of technical errors to avoid when performing bone marrow transplants. A clear understanding should be gained of the importance of high viral titer, transfection/transduction, and irradiation.

Myeloproliferatif tümörün İletimi-Transplantasyon Fare Modeli

Transduction-transplantation is a quick and efficient way to model human hematologic malignancies in mice. This technique results in expression of the ...

transduction-transplantation-mouse-model-myeloproliferative

Research

JoVE Journal

Cancer Research

11.8K Görüntüleme.  University of California, Irvine. This manuscript provides a description of the methodology used to establish transduction-transplantation mouse models. A detailed account is given of technical errors to avoid when performing bone marrow transplants. A clear understanding should be gained of the importance of high viral titer, transfection/transduction, and irradiation. 

Video: Transduction-Transplantation Mouse Model of Myeloproliferative Neoplasm

Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will survive longer than five years. In order to understand and mimic the microenvironment of pancreatic tumors, we utilized a murine orthotopic model of pancreatic cancer that allows non-invasive imaging of tumor progression in real time. Pancreatic cancer cells expressing green fluorescent protein (PANC-1 GFP) were suspended in basement membrane matrix, high concentration, (e.g., Matrigel HC) with serum-free media and then injected into the tail of the pancreas via laparotomy. The cell suspension in the high concentration basement membrane matrix becomes a gel-like substance once it reaches room temperature; therefore, it gels when it comes in contact with the pancreas, creating a seal at the injection site and preventing any cell leakage. Tumor growth and metastasis to other organs are monitored in live animals by using fluorescence. It is critical to use the appropriate filters for excitation and emission of GFP. The steps for the orthotopic implantation are detailed in this article so researchers can easily replicate the procedure in nude mice. The main steps of this protocol are preparation of the cell suspension, surgical implantation, and whole body fluorescent in vivo imaging. This orthotopic model is designed to investigate the efficacy of novel therapeutics on primary and metastatic tumors.

A procedure to implant green fluorescent protein-expressing pancreatic cancer cells (PANC-1 GFP) orthotopically into the pancreas of Balb-c Ola Hsd-Fox1nu mice to assess tumor progression and metastasis is presented here.

Pankreas Kanseri Floresan Ortotopik Fare Modeli

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will ...

Kanser Araştırmaları

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. Here we describe a method using targeted peripheral irradiation to induce fatigue-like behavior in mice. With appropriate shielding, the irradiation targets the lower abdominal/pelvic region of the mouse, sparing the brain, in an effort to model radiation treatment received by individuals with pelvic cancers. We deliver an irradiation dose that is sufficient to induce fatigue-like behavior in mice, measured by voluntary wheel-running activity (VWRA), without causing obvious morbidity. Since wheel running is a normal, voluntary behavior in mice, its use should have little confounding effect on other behavioral tests or biological measures. Hence, wheel running can be used as a feasible outcome measure in understanding the behavioral and biological correlates of fatigue. CRF is a complex condition with frequent comorbidities, and likely has causes related both to cancer and its various treatments. The methods described in this paper are useful for investigating radiation-induced changes that contribute to the development of CRF and, more generally, to explore the biological networks that can explain the development and persistence of a peripherally-triggered but centrally-driven behavior like fatigue.

We describe a method using targeted peripheral irradiation to induce fatigue-like behavior in mice. The selected non-lethal irradiation dose leads to a week-long reduction in voluntary wheel-running activity.

Periferik Radyasyonla Bağlı Yorgunluk A Fare Modeli

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate tumor biology and tumor cell dissemination. Orthotopic mouse models have been introduced to overcome these limitations; however, such models are technically demanding, especially in hollow organs such as the large bowel. In order to produce uniform tumors which reliably grow and metastasize, standardized techniques of tumor cell preparation and injection are critical. 
We have developed an orthotopic mouse model of colorectal cancer (CRC) which develops highly uniform tumors and can be used for tumor biology studies as well as therapeutic trials. Tumor cells from either primary tumors, 2-dimensional (2D) cell lines or 3-dimensional (3D) organoids are injected into the cecum and, depending on the metastatic potential of the injected tumor cells, form highly metastatic tumors. In addition, CTCs can be found regularly. We here describe the technique of tumor cell preparation from both 2D cell lines and 3D organoids as well as primary tumor tissue, the surgical and injection techniques as well as the isolation of CTCs from the tumor-bearing mice, and present tips for troubleshooting.

We describe the establishment of orthotopic colorectal tumors via injection of tumor cells or organoids into the cecum of mice and the subsequent isolation of circulating tumor cells (CTCs) from this model.

Kolorektal kanserli bir Ortotopik Fare Modelinde Dolaşan Tümör Hücrelerinin İzolasyonu

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

A Genetically Engineered Mouse Model of Sporadic Colorectal Cancer

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, colorectal cancer mouse models based on tumor cell injection have severe limitations and do not accurately simulate tumor biology and tumor cell dissemination. Genetically engineered mouse models have been introduced to overcome these limitations; however, such models are technically demanding, especially in large organs such as the colon in which only a single tumor is desired.
As a result, an immunocompetent, genetically engineered mouse model of colorectal cancer was developed which develops highly uniform tumors and can be used for tumor biology studies as well as therapeutic trials. Tumor development is initiated by surgical, segmental infection of the distal colon with adeno-cre virus in compound conditionally mutant mice. The tumors can be easily detected and monitored via colonoscopy. We here describe the surgical technique of segmental adeno-cre infection of the colon, the surveillance of the tumor via high-resolution colonoscopy and present the resulting colorectal tumors.

A protocol for the establishment of a genetically engineered mouse model of colorectal cancer by segmental adeno-cre infection and its surveillance via high-resolution colonoscopy is presented.

Sporadik Kolorektal Kanserin Genetik Olarak Geliştirilmiş Fare Modeli

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, colorectal cancer mouse models based on tumor cell injection have severe limitations ...

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when stimulated by T lymphocytes, oncogenic B cells survive and expand autonomously in undefined organ niches. Mantle cell lymphoma (MCL) is one such B cell disorder, where the median survival rate of patients is 4 - 5 years. This calls for the need of effective mechanisms by which the homing and engraftment of these cells are blocked in order to increase the survival and longevity of patients. Therefore, the effort to develop a xenograft mouse model to study the efficacy of MCL therapeutics by blocking the homing mechanism in vivo is of utmost importance. Development of animal recipients for human cell xenotransplantation to test early stage drugs have long been pursued, as relevant preclinical mouse models are crucial to screen new therapeutic agents. This animal model is developed to avoid human graft rejection and to establish a model for human diseases, and it may be an extremely useful tool to study disease progression of different lymphoma types and to perform preclinical testing of candidate drugs for hematologic malignancies, like MCL. We established a xenograft mouse model that will serve as an excellent resource to study and develop novel therapeutic approaches for MCL.

Mantle cell lymphoma (MCL) is a difficult to treat B cell disorder and it is equally difficult to establish a xenograft mouse model of primary MCL to study and develop therapeutics. Here, we describe the successful establishment of MCL xenografts in mice to help understand its underlying biology.

Tümör Engraftment insan Mantle hücreli lenfoma, Xenograft fare modeli

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches including the promising immunotherapeutic strategies. Irreversible electroporation (IRE) is a non-thermal ablation technique that induces tumor cell death without destruction of adjacent collagenous structures, thus enabling the procedure to be performed in tumors very close to blood vessels. Unlike thermal ablation techniques, IRE results in gradual apoptotic cell death, along with immediate ablation induced necrosis, and is currently in clinical use for selected patients with locally advanced PC. An ablative, non-target specific procedure like IRE can induce a myriad of responses in the tumor microenvironment. A few studies have addressed the effects of IRE on tumor growth in other tumor types, but none have focused on PC. We have developed a syngeneic mouse model of PC in which subcutaneous (SQ) and orthotopic tumors can be successfully treated with IRE in a highly controlled setting, facilitating various longitudinal studies post procedure. This animal model serves as a robust system to study the effects of IRE and ways to improve the clinical efficacy of IRE.

Irreversible electroporation (IRE) is a non-thermal ablation technique used for the treatment of locally advanced pancreatic cancer. Being a relatively new technique, the effects of IRE on the tumor growth are poorly understood. We have developed a syngeneic mouse model that facilitates studying the effects of IRE on pancreatic cancer.

Geri dönüşü olmayan Elektroporasyon etkilerini incelemek için bir Syngeneic pankreas kanseri fare modeli

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the limitations of current treatments, as the majority of patients do not respond to immunotherapy. Development of accurate preclinical models to quickly identify novel and effective therapeutic combinations are critical to address this unmet clinical need. Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDA) is a canonical example of an immune checkpoint blockade resistant tumor with only 2% of patients responding to immunotherapy. The genetically engineered KrasG12D+/-;Trp53R172H+/-;Pdx-1 Cre (KPC) mouse model of PDA recapitulates human disease and is a valuable tool for assessing therapies for immunotherapy resistant in the preclinical setting, but time to tumor onset is highly variable. Surgical orthotopic tumor implantation models of PDA maintain the immunobiological hallmarks of the KPC tissue-specific tumor microenvironment (TME) but require a time-intensive procedure and introduce aberrant inflammation. Here, we use an ultrasound-guided orthotopic tumor implantation model (UG-OTIM) to non-invasively inject KPC-derived PDA cell lines directly into the mouse pancreas. UG-OTIM tumors grow in the endogenous tissue site, faithfully recapitulate histological features of the PDA TME, and reach enrollment-sized tumors for preclinical studies by four weeks after injection with minimal seeding on the peritoneal wall. The UG-OTIM system described here is a rapid and reproducible tumor model that may allow for high throughput analysis of novel therapeutic combinations in the murine PDA TME.

We describe a protocol for the ultrasound guided implantation of murine-derived pancreatic ductal adenocarcinoma cell lines directly into the native tumor site. This approach resulted in pancreatic tumors detectable by ultrasound scanning within 2-4 weeks of injection, and significantly reduced the proportion tumor cell seeding on the peritoneal wall as compared to surgical orthotopic implantation.

Murine Pankreatik Duktal Adenokarsinomun Ultrason Eşliğinde Ortotopik İmplantasyonu

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

An Orthotopic Resectional Mouse Model of Pancreatic Cancer

There is a lack of satisfactory animal models to study adjuvant and/or neoadjuvant therapy in patients being considered for surgery of pancreatic cancer (PC). To address this deficiency, we describe a mouse model involving orthotopic implantation of PC followed by distal pancreatectomy and splenectomy. The model has been demonstrated to be safe and suitably flexible for the study of various therapeutic approaches in adjuvant and neo adjuvant settings.
In this model, a pancreatic tumor is first generated by implanting a mixture of human pancreatic cancer cells (luciferase-tagged AsPC-1) and human cancer associated pancreatic stellate cells into the distal pancreas of Balb/c athymic nude mice. After three weeks, the cancer is resected by re-laparotomy, distal pancreatectomy and splenectomy. In this model, bioluminescence imaging can be used to follow the progress of cancer development and effects of resection/treatments. Following resection, adjuvant therapy can be given. Alternatively, neoadjuvant treatment can be given prior to resection.
Representative data from 45 mice are presented. All mice underwent successful distal pancreatectomy/splenectomy with no issues of hemostasis. A macroscopic proximal pancreatic margin greater than 5 mm was achieved in 43 (96%) mice. The technical success rate of pancreatic resection was 100%, with 0% early mortality and morbidity. None of the animals died during the week after resection.
In summary, we describe a robust and reproducible technique for a surgical resection model of pancreatic cancer in mice which mimics the clinical scenario. The model may be useful for the testing of both adjuvant and neoadjuvant treatments.

In the clinical context, patients with localized pancreatic cancer will undergo pancreatectomy followed by adjuvant treatment. This protocol reported here aims to establish a safe and effective method of modelling this clinical scenario in nude mice, through orthotopic implantation of pancreatic cancer followed by distal pancreatectomy and splenectomy.

Pankreas Kanserinin Ortotopik Rezeksiyonlu Fare Modeli

There is a lack of satisfactory animal models to study adjuvant and/or neoadjuvant therapy in patients being considered for surgery of pancreatic cancer ...

Molecular and Immunologic Techniques in a Genetically Engineered Mouse Model of Gastrointestinal Stromal Tumor

Gastrointestinal stromal tumor (GIST) is the most common human sarcoma and is typically driven by a single mutation in the KIT receptor. Across tumor types, numerous mouse models have been developed in order to investigate the next generation of cancer therapies. However, in GIST, most in vivo studies use xenograft mouse models which have inherent limitations. Here, we describe an immunocompetent, genetically engineered mouse model of gastrointestinal stromal tumor harboring a KitV558&#916;/+ mutation. In this model, mutant KIT, the oncogene responsible for most GISTs, is driven by its endogenous promoter leading to a GIST which mimics the histological appearance and immune infiltrate seen in human GISTs. Furthermore, this model has been used successfully to investigate both targeted molecular and immune therapies. Here, we describe the breeding and maintenance of a KitV558&#916;/+ mouse colony. Additionally, this paper details the treatment and procurement of GIST, draining mesenteric lymph node, and adjacent cecum in KitV558&#916;/+ mice, as well as sample preparation for molecular and immunologic analyses.

The goal of this manuscript is to describe the KitV558&#916;/+&#160;mouse model and techniques for successful dissection and processing of mouse specimens.

Gastrointestinal Stromal Tümörün Genetiği Değiştirilmiş Bir Fare Modelinde Moleküler ve İmmünolojik Teknikler

Gastrointestinal stromal tumor (GIST) is the most common human sarcoma and is typically driven by a single mutation in the KIT receptor. Across tumor ...

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites have been the gold standards for conditional or inducible gene targeting. To provide faster and more efficient experimental models, an ex vivo organoid culture system is developed using adenovirus Cre and normal urothelial cells carrying multiple loxP alleles of the tumor suppressors Trp53, Pten, and Rb1. Normal urothelial cells are enzymatically disassociated from four bladders of triple floxed mice (Trp53f/f: Ptenf/f: Rb1f/f). The urothelial cells are transduced ex vivo with adenovirus-Cre driven by a CMV promoter (Ad5CMVCre). The transduced bladder organoids are cultured, propagated, and characterized in vitro and in vivo. PCR is used to confirm gene deletions in Trp53, Pten, and Rb1. Immunofluorescence (IF) staining of organoids demonstrates positive expression of urothelial lineage markers (CK5 and p63). The organoids are injected subcutaneously into host mice for tumor expansion and serial passages. The immunohistochemistry (IHC) of xenografts exhibits positive expression of CK7, CK5, and p63 and negative expression of CK8 and Uroplakin 3. In summary, adenovirus-mediated gene deletion from mouse urothelial cells engineered with loxP sites is an efficient method to rapidly test the tumorigenic potential of defined genetic alterations.

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

This protocol describes the process of the generation and characterization of mouse urothelial organoids harboring deletions in genes of interest. The methods include harvesting mouse urothelial cells, ex vivo transduction with adenovirus driving Cre expression with a CMV promoter, and in vitro as well as in vivo characterization.

Eski Vivo Fare Ürotelyal Hücrelerinde Adenovirüs-Cre Aracılı Gen Delesyonlarının Organoid Modeli

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites ...