Bu yeni kemik iliği nakli protokolü, transplantasyon sonrası konak dendritik hücrelerin greft-versus-host ve greft-versus-lösemi yanıtlarını nasıl düzenlediğini araştırmak için kullanılabilir. Ex vivo hücre rejenerasyonları bu protokolün sadece kültür durumunu değiştirerek makrofaj ve nötrofiller gibi diğer bağışıklık hücre popülasyonunun rolünü test etmek için uyarlanmasına olanak sağlar. Prosedürü benimle birlikte gösteren laboratuvar müdürü Krystal Hossack ve lisans Sanjeev Gurshaney olacaktır.
Donör T-hücre tükenen C57BL/6 kemik iliği hazırlığı için, ötanazi donör farelerin standart protokollerine göre femur ve tibia hasat ve 92 milimetre çapında Petri çanak içine transfer 1%RPMI orta. Makas kullanarak, her kemikten uçları çıkarın ve taze% 1 RPMI orta ile 26 gauge iğne ile donatılmış üç mililitreşlik şırınga doldurun. İğneyi bir kemiğin bir ucuna yerleştirin ve kemik iliğini boşluktan çıkarıp toplama hücresi süzgecinden çıkarmak için pistonun tuşuna basın.
Tüm kemik iliği toplandığında, kemik iliği parçalarını 75 mikrometrelik bir kafes filtresinden geçirin ve tek hücreli süspansiyonu 50 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın. Hücreleri santrifüj ile tortulayın ve pbs'de mililitre konsantrasyonu başına altı hücreye 20 çarpı 10 oranında geri alın ve %0.5 BSA ile tamamlayın. Daha sonra, dört santigrat derecede 30 dakikalık bir kuluçka için altı hücreye 10 kez thi1 antikor 0.05 mikrogram ekleyin.
Kuluçka sonunda, hücreleri 10 mililitre buz gibi pbs ile iki kez yıkayın ve mililitre başına yedi hücreye 2 kez 10%BSA ile takviye %10 genç tavşan komplemanı ve %2 NAAse steril suda 45 dakikalık kuluçka için 37 santigrat dereceye kadar yeniden askıya alın. Kuluçka sonunda, hücreleri yıkama başına 15 mililitre taze PBS ile iki kez yıkayın ve %0,5 BSA içeren 20 mililitre PBS'de peleti yeniden askıya alın. 40 mikrometre gözenek süzgecinde lenf düğümlerini ve dalağını birleştirin ve hücreleri serbest bırakmak için dokuları filtrelerden geçirmek için bir şırınga pistonu kullanın.
Tüm hücreleri toplamak ve santrifüj ile hücreleri tortulamak için% 1 FBS ile desteklenen RPMI orta ile süzgeç ve piston yıkayın. Hücre peletine beş mililitre ACK lisis arabelleği ekleyin. Oda sıcaklığında beş dakika sonra, orta beş mililitre ile reaksiyonu durdurmak 1% FBS ile takviye ve santrifüj ile beyaz kan hücreleri pelet.
Saymak için beş mililitre MACS tamponundaki peleti yeniden askıya alın ve hücreleri taze MACS tamponunda mililitre başına sekiz hücreye kadar iki katı 10'luk bir konsantrasyona seyreltin. Anti-eritrosit uygun konsantrasyonu ekleyin, anti-granülosit, anti-B hücresi, ve anti-NK-hücre tükenmesi antikorları bir kez 10 dört santigrat derecede 15 dakikalık kuluçka için altı hücreye. Kuluçka sonunda, hücreleri 10 mililitre buz gibi MACS tamponuyla yıkayın ve taze MACS tamponundaki mililitre konsantrasyonu başına sekiz hücreye bir kere 10'da peleti yeniden askıya alın.
Daha sonra, dört santigrat derecede 15 dakikalık bir kuluçka için karıştırma ile altı hücre ye 10 kez 10 başına Anti-Biotin MicroBeads 0.22 mikrolitre ekleyin. Kuluçka sonunda, hücreleri 10 mililitre buz gibi MACS tamponuyla yıkayın ve standart boncuk izolasyon protokollerine göre MACSxpress ayırıcısını kullanarak manyetik boncuk ayrıştırma ile bağlanmamış zenginleştirilmiş T-hücrelerini toplayın. Ayırma sonunda, t-hücrelerini santrifüj ile tortular ve peleti saymak için beş mililitre taze MACS tamponu içinde yeniden askıya alın.
Kemik iliği kaynaklı dendritik hücreler oluşturmak için, kemik iliğini vahşi tip veya faktör B nakavt farelerin uyluk kemiğinden izole edin ve kırmızı kan hücrelerini ACK lysis tamponunun beş mililitresinde inceleyin, beş dakika sonra %1 FBS ile takviye edilen 10 mililitre RPMI ile reaksiyonu durdurun. Santrifüj ile tüm kan hücrelerini topladıktan sonra, mililitre konsantrasyonbaşına altıncı hücrelere iki kez 10 kültür orta 10 mililitre pelet resuspend ve 10 mililitre hücre üzerine tek tek 100 mililitre tohumlama önce hücrelere GM-CSF mililitre başına 20 nanogram ekleyin 100 tarafından 15 milimetre Petri yemekleri 37 santigrat derece ve 5% karbon dioksit altı gün boyunca. Altıncı günde, kemik iliği kaynaklı dendritik hücre kültürlerini plaka başına mililitre başına 25 mikrogram ile aktive edin.
Kültürlü kemik iliği hücrelerinin en az %85'i dendritik hücrelere ayrılır. Manyetik boncuk zenginleştirme sonrası T-hücre saflığı %90'dır Majör MHC uyumsuz C57BL/6 BALB/c modeli transplantasyon sonrası GVHD gelişimine yakından karşılık gelmektedir. Şiddetin doruğu hücre transferinden yaklaşık 11 gün sonra ortaya çıkar ve ardından klinik skorlarda azalma ve 16.
Alıcılar 30 ila 40 gün sonra GVHD'ye yenik düştüler. İlginçtir, faktör B nakavt dendritik hücreleri ile transplantasyon alıcı sağkalım ve GVHD klinik skorları artırır. Luciferase transdükse A20 B hücreli lenfoma canlı hayvanlarda tümör büyümesinin izlenmesini sağlar.
Bu temsili deneyde, tek başına kemik iliği ve A20 alan tüm yabani balb/c alıcıları tümör nüksünden öldü. Kemik iliği kaynaklı ACC1-tükenmiş donör T-hücreleri ile nakledilen yabani tip BALB/c alıcıları GVHD'den öldü. Buna ek olarak, donör kemik iliği ve ACC1-tükenmiş T-hücreleri alınan hayvanlar hem GVHD ve tümör nüks öldü.
Yeterli kemik iliği hücresi oluşturmak için, toplanan tibia ve femur kemikleri kemik iliği düzeltme önce kas dokusu tamamen serbest olmalıdır. Biyotinylaz anti-CD3 ve Anti-Biotin MikroBoncuklar ile kemik iliği hücrelerinin negatif saflaştırma da kemik iliği lenfosit tüketmek için yapılan başına olabilir.
