AFM analysis was performed on instrumentation supported by the Pennsylvania Muscle Institute and the Institute for Translational Medicine and Therapeutics, Perelman School of Medicine, the University of Pennsylvania. This work was supported by NIH grants HL62250 and AG047373. YHB was supported by post-doctoral fellowship from the American Heart Association.

Bu çalışmada hayvan çalışmaları Pennsylvania Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri tarafından onaylandı. Yöntemi onaylanmış talimatlarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir. 1. Fare ve Aort izolasyonu hazırlanması <ol><li> periton boşluğu içine - (2 mg / kg 1) - (- 100 mg / kg 80), ksilazin (8, 10 mg / kg) ve ketamin asepromazin bir fare anestezisi. Bir kuyruk tutam testi ile anestezi onaylayın. Fare tamamen uyuşturulduktan sonra, servikal dislokasyon ile fare euthanize. </li><li> Sırtında fare yerleştirin ve bir diseksiyon kurulu fare pin. % 70 ile karın bölgeyi temizleyin (v / v) etanol mendil. </li><li> orta çizgisinde cildi çimdik ve karın orta ölçekli mikrocerrahi makas ile küçük bir başlangıç ​​kesi yapmak. forseps ile cilt tutarken, sternum karın deri ve periton kesmek için orta ölçekli mikrocerrahi makas kullanın. </li><li> b kaburga kesiporta ölçekli mikrocerrahi makas ile oth taraf. Dikkatle küçük boyutlu mikrocerrahi makas ile akciğerler ve karaciğer kaldırmak ve kalp ve aort bırakın. Bir mikroskop fare ve diseksiyon tahtası aktarın. </li><li> küçük forseps ile aort çevreleyen yağ kavrayın ve küçük bir makas kullanın dikkatle aort etrafında yağ kesip. </li><li> Yavaşça, forseps ile aorta kapmak sadece abdominal aorta üzerinde, çıkan aort ve inen aort sonunda başka bir kesimin başında küçük boyutlu mikrocerrahi makas ile bir kesim yapmak. </li><li> (Kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS) 1 x fosfat tamponlu tuzlu su ihtiva eden bir 60-mm çanak kesilerek aort aktarın. </li><li> küçük boyutlu mikrocerrahi makas kullanarak aort kalan yağ dokusu uzak teşrih devam ediyor. uzunlamasına aorta açmak için küçük bir makas kullanın. </li><li> İnen aorta ve aorti küçük bir parça (~ 2 x 4 mm) kesmek için, küçük ölçekli mikrocerrahi makas kullanınAFM analizi c kemer (Şekil 1). 60 mm&#39;lik plastik tabak doku yerleştirin ve PBS damla nemli tutmak. </li></ol><img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54630/54630fig1.jpg" /> Şekil 1:. Bir fare Farklı Aort Bölümleri Yer gösteriliyor An Image aort diyaframa kalbinden izole edildi ve inen aort küçük bir kısmı ve aortik ark elastik modüle belirlemek için kullanıldı. Ölçek çubuğu, 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54630/54630fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> AFM Ölçümleri 2. Hazırlama Doku Örnekleri <ol><li> Dikkatlice aort dokunmadan laboratuvar silin kullanarak PBS kaldırmak. doku luminal tarafı yukarı bakacak şekilde emin olun. </li><li> Yavaşça eklenti tarafından plakaya açılan aorta her bir ucunu tutkal<html> 5 ing - jel yükleme ucu siyanoakrilat yapıştırıcı madde 10 ul (Şekil 2). Not: sıkıca her bir ucunda doku bağlamak için gerekli olan tutkal miktarı deneysel olarak tespit edilmelidir. Aort Bu işlem sırasında gergin olmadığı önemlidir. </li><li> katlanmış veya yüzer değil emin olmak için yapıştırılmış aort kontrol edin. aort tutkal hava kurutulduktan sonra (30-60 sn), nazikçe PBS ekleyin ve örnek daldırın. Not: - Doku analiz için hazırlanmıştır edilirken gerçekleştirilebilir Preparasyon AFM (5 3 adım). </li></ol><img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54630/54630fig2.jpg" /> Şekil 2: Bir Aort Segment Karikatür Siyanoakrilat Yapıştırıcı kullanarak 60 mm Kültür Bulaşık üzerine yapıştırılmış siyanoakrilat yapıştırıcı AFM ölçümleri için hazırlık aort numunenin kenarına uygulanmaktadır..com / files / ftp_upload / 54630 / 54630fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. 3. Probe yükleniyor <ol><li> Sonda yük standın üzerine bir sıvı sonda tutucu monte edin. </li><li> Cımbız kullanarak, küresel uçlu bir silisyum nitrür AFM probu (0.06 N / m konsol) kaydırın prob tutucu (biz 1-mikron çaplı SiO2 parçacık kullanmış ancak daha büyük boyutlarda da kullanılabilir). AFM probu sıkıca prob tutucuya tespit olduğundan emin olun. </li><li> AFM kafa monte Z-tarayıcı üzerine sonda yuvasını ve prob tutucu sıkıca bağlı olduğundan emin olun. </li></ol> 4. Prob Lazer hizalama <ol><li> AFM yazılımını açın. Yazılımın deneme türünü seçin, Deney Kategori sıvısında Modu İletişim sıvı ve Deney Modu İletişim Mode, Deney Grubu İletişim için. Yük exp tıklayınyazılım eriment; Bu lazer açılacaktır. </li><li> 50 mm &#39;lik cam taban çanak damıtık su 3 ml ilave edilir ve lazer ayar biriminin sahnede çanak yerleştirin. Bu birim konsol sırtına lazer ışınını odaklama sürecini kolaylaştırır. </li><li> lazer hizalama ünitesi üzerindeki lazer hizalama ünitesi ve güç üzerine dik bir pozisyonda AFM baş takın. AFM ucunda bir damlacık oluşturulması için damıtılmış suyun yaklaşık 50 ul ekle. </li><li> AFM ucu çanak su ile temas yapar böylece joystick&#39;i kullanarak, AFM baş aşağı indirin. iletişim çanak AFM ucu ile su arasında yapılmaması durumunda kontak yapılıncaya kadar, hafifçe çanak yükseltmek. AFM ucu hizalama biriminin LCD ekranda görünümünde yani odak, parlaklık ve XY konumunu ayarlayın. </li><li> AFM baş lazer konumlandırma düğmeleri ayarlayarak AFM prob ucuna lazer nokta yerleştirin. varsaymak ayarlamak, AFM kafasına detektör konumlandırma düğmeleri kullanarak0 ve -1 V arasında değerler kadar fotodiyot iyon dikey saptırma için elde edilir ve ~ 0 V yatay saptırma için elde edilir. </li><li> Lazer toplamı sinyali maksimize emin olmak için kontrol edin. Gerekirse, adımı tekrarlayın 4.5 AFM ucunda lazer ışını ve maksimum toplam sinyalini elde etmek fotodiyot pozisyon konumunu yeniden ayarlamak için. NOT: adım 4.5 tekrarlanır bile maksimum toplamı sinyali elde etmek prob tutucu AFM probu yeniden konumlandırmak için gerekli olabilir. </li></ol> 5. AFM Probe Sapma Duyarlılık ve Bahar Constant kalibre <ol><li> Bir forsepsi ile 60 mm kültür kaplarına bir çizik yapın ve saf su ile çanak doldurun. Numune tutucu plaka üzerinde kültür çanak yerleştirin. Bu durumda, bir ters mikroskop motorlu XY tarama sahnede çanak monte edin. </li><li> o görüntüleme sırasında güvenli tutmak için plaka üstünde manyetik plaka tutucu yerleştirin. </li><li> tıklayın <strong&gt; Neredeyse en yüksek konuma AFM baş yukarı taşımak için yazılıma Navigasyon menüsünde &#39;Up&#39; ok AFM prob çanak dokunmayın emin olmak için. NOT: AFM ucu kırılma önler bu adım çok önemlidir. </li><li> mikroskop sahnede AFM baş yerleştirin. </li><li> plaka üzerinde sıfırdan odaklanmak mikroskop kullanın. Joystick&#39;i kullanın, ya da yavaş ve dikkatli PBS içine AFM probu düşürmek için, Navigasyon menüsünden &#39;down&#39; oku tıklatın. Biraz plaka sıfırdan yukarıdaki baş pozisyonu. NOT: AFM başın başlangıç konumu numunesi yakın ise, önemli ölçüde azalacaktır zaman meşgul. </li><li> çekici önce, AFM ucunda lazer ışını ve gerektiğinde maksimum TOPLA sinyalini elde etmek fotodiyot pozisyon konumunu yeniden ayarlayın. </li><li> Kurulum menüsünde Değiştir Probe tıklayarak bir ipucu türünü seçin. </li&gt; <li> Parametreleri kontrol edin ve parametrelerini ayarlamak düğmesini tıklayın: 256 1 Hz, Numune / hattına, 0 Tarama Hızı Tarama Boyutu ve Sapma Ayar Noktası 20 nm. Engage tıklayın. Sonda plaka yüzeyi ile temas edene kadar Engage Durum penceresi açık kalacaktır. Prob katıldıktan sonra, Rampa tıklayın. </li><li> Parametreleri Tara Araç Çubuğu menüsünde Mode Expanded ve set seçeneğini tıklayın: 2 Hz Rampa Oranı, nm 500 ile 1 mikron Rampa Boyutu, 256 Numune Sayısı, İpucu Radius 500 nm, 0.5 (Numune Poisson Oranı malzemesini varsayar ölçülecek 20 ila 100 nm Karşılıklı ve tetikleme eşiğini 0 ila Tip yarım açı, Tetik modu), mükemmel sıkıştırılamaz. </li><li> obta için Rampa Çubuğu menüsünde Rampa Sürekli tıklayınplaka (Şekil 3A) üzerine bir kuvvet eğrisi. Bu kuvvet eğrisinin, saptırma hata kanal 1 olarak ayarlayın. NOT: Bu yazılım z pozisyonuna karşı dikey saptırma olarak sonuçları grafik sağlayacaktır. <ol><li> Kuvvet eğrisinin sol veya sağ ucunda tıklayın ve kuvvet eğrisi (Şekil 3A, kesik kırmızı çizgiler) lineer bir bölgeyi kapsayacak şekilde imleci sürükleyin. düz bir çizgi ile uygun olması eğimli bölgenin sınırlarını işaretlemek için bu iki satır kullanın. </li></ol></li><li> Araç Çubuğu Rampa seçeneğini seçiniz ve Update Duyarlılığı tıklayın. değerini kaydedin ve bu adımı dört kez daha tekrarlayın. Araç Çubuğu Kalibre seçin ve ardından Dedektörü tıklayın. Giriş Saptırma duyarlılık kutusuna beş ölçümün ortalama bir değer. </li><li> AFM baş yükseltmek için 3 kez - 2 Çekme tıklayın. Bu adım önlemek için önemlidirAFM ucu ve termal ayar işlemi sırasında plaka arasındaki etkileşim. Araç Çubuğu Termal Melodisi tıklayın. </li><li> Dikdörtgen konsollar için V şeklindeki konsollar için 1.144 ve 1.106 100 kHz (Bu bilgiler üreticinin katalog temin edilebilir) ve Eğilme Duyarlılık Düzeltme - Termal 1 Tune Aralığı ayarlayın. </li><li> Termal Dinle menüsünde, termal ayar eğrisi (Şekil 3B) elde etmek için Veri Al&#39;ı tıklatın. AFM yazılımı kullanarak, yer kırmızı montaj için sınırlarını tanımlamak için grafiğin kenarından fareyi sürükleyerek (Şekil 3B görüldüğü gibi) eğrisinin iki tarafında kesikli çizgiler. Seçin ya Lorentz (Hava) veya daha iyi verilere uygun olduğu bağlı Basit Harmonik osilatör (Akışkan) modeli. </li><li> Fit Veri ardından Bahar K hesaplayın ve bu değeri kaydetmek tıklayın. Yenidenyay sabiti kalibrasyon sağlamaktadır birkaç kez turba ve ortalama değeri kullanın. Birkaç kez çekin tıklayın. </li><li> mikroskop aşamasından AFM baş kaldırmak ve hizalama ünitesinde üzerine yerleştirin. mikroskop aşamasından çanak çıkarın. </li></ol><img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54630/54630fig3.jpg" /> Şekil 3: AFM Sondalar kalibrasyonu Kullanılan AFM Kuvvet Eğrileri. (A) temsilci AFM kuvvet eğrisi (kalibrasyon eğrisi). Dikey kırmızı arasındaki kuvvet eğrisinin uzatma bölümü çizgileri konsol saptırma duyarlılığını belirlemek için kullanılmıştır kesik. (B), daha önce 20 açıklanan konsolun yay sabitini hesaplamak için kullanılan basit bir harmonik osilatör uygun grafik. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54630/54630fig3large.jpg" target="_blank">Görüntülemek için tıklayınız Bu rakamın daha büyük bir versiyonu.</a> Ex Vivo Elastik Modülü Ölçme <ol><li> mikroskop sahnede aort doku içeren 60 mm kültür çanak yerleştirin ve manyetik plaka tutucu plaka sabitleyin. </li><li> mikroskop sahnede AFM baş yerleştirin. AFM prob aorta ile temas etmediğinden emin olun ama nazikçe PBS ile temas eder ve bir menisküs oluşturur. Gerekirse, hizalama ünitedeki AFM baş koyun ve sonra, teması önlemek mikroskop sahnede AFM baş yerleştirmek için yeterli açıklık kalmayıncaya kadar Çekme tıklayın. </li><li> Şuraya tıklayın. Yavaşça AFM probu düşürmek, joystick kullanarak veya ok &#39;Aşağı&#39; düğmesini tıklayarak aort üzerinde konsol bulmak için. Gerekirse AFM kafasına detektör konumlandırma düğmeleri kullanarak fotodiyot konumunu ayarlayın. </li><li> Konsol aorta ile temas kurmaya izin Engage seçeneğini tıklayın. </li><li> Bir kereAort devreye girer, piezo merkezi istikrarlı olmasını sağlamak ve Rampa tıklayın. Piezo merkezi dalgalanan ise, bu yanlış bir angajman sonucu olabilir. prob çekin ve küçük artışlarla fotodiyot üzerine lazer ofset dikey artırmak (~ 0.5 V) ve yeniden meşgul. <ol><li> Sonda çok örnek yüzeyinin üzerinde ise de, elle yakın örnek yüzeyine probu düşürmek yeniden çekici önce. Önceki adımlar dalgalanmayı ortadan kaldırmak yoksa, prob alışverişi deneyin. </li></ol></li><li> 3 um, Bağıl Trigger Mode ve 100 nm Tetik Eşik Rampa Boyutu ayarını ve Rampa Sürekli tıklayın. prob ve numune arasındaki temas noktası Z rampa döngüsünün ¾ alt yaklaşık merkezinde meydana gözlemleyin. Bu gözlenmez ise, örnek boşa gerektiği gibi Rampa boyutunu ayarlamak ve örnek yeniden meşgul. </li><li>Menü Bar Mikroskop tıklayın ve ardından Ayarlar Engage. SPM 30 mikron Çekme değiştirin. Rampa Araç Çubuğu menüsünde Rampa Sürekli tıklayın. </li><li> Kuvvet eğrisi gözlemledikten sonra, Menü çubuğundaki yakalama tıklatın ve Dosya adı yakalayın. biten &quot;.000&quot; (bu ek yakalanan dosyalar 1 ile sayısındaki artış sağlayacak) ile istenen dosya adı girin. belirlenmiş-klasörü seçin ve verileri kaydetmek. </li><li> Yakalama Araç Çubuğu menüsünde yakalama tıklayın. Sonra Şuraya çekiniz ve tıklayın. Aort başka alana konsol konumlandırmak için Joystick veya yazılım kontrollerini kullanın (sonraki başlangıçta ölçülen noktaya; Şekil 4). </li><li> , Rampa Engage tıklayın ve sırasıyla, Sürekli Rampa. Kuvvet eğrisi gözlemledikten sonra, Durdur &#39;u tıklatın </stRong&gt; ve ardından yakalayın. </li><li> 6.10 - yineleyin 6.9 adımları. . Alan başına yakalama en az 5 ölçümleri, Şekil 4 Not gösterildiği gibi: Bu tipik olarak 15 toplama - Şekil 4 &#39;de gösterildiği gibi, sırasıyla, her bir doku 5 farklı yerle - 3 ila 25 güç eğrileri. </li></ol><img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54630/54630fig4.jpg" /> . Şekil 4: Genel sertliğini elde etmek her arter - 5 farklı yerlerde (5 Alanları 1 -) - 3 25 kez Cantilever Yaklaşıyor ve Doku Hizalama (Alan 1) Cartoon Bu AFM ölçümü 15 kadar tekrarlanır doku numunesi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54630/54630fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> 7. Veri analizi <ol><li> Açık kuvvet eğrisi analizi yazılımı. </li><li> ClTran bulun ve menü çubuğunda Aç ve dosya üzerinde çift tıklayın analiz edilecek. </li><li> Saptırma duyarlılığını, Sabit Bahar, İpucu Radius, İpucu Yarım Açısı ve Poisson oranını kontrol etmek için araç çubuğu menüsünden Değiştir Kuvvet Parametreleri tıklayın. Parametreler yanındaki kutuyu işaretleyin ve yeni değer sütununa doğru değerleri girin değiştirmek için. Sonra Çalıştır &#39;ı tıklatın. </li><li> Kuvvet eğrileri gürültülü ise Yön 0 inci 3 ve Filtre Order, Ortalama Puan uzatın için, Boxcar Filtre tıklayın ve girdileri ayarlayın. Verileri düzeltmek için Yürüt düğmesini tıklatın. </li><li> Menü çubuğundaki Temel Düzeltme tıklayın ve 1 st Yön uzatın için girdiler, Force Plot Birimleri, Ayırma Tipi, Düzeltme Sipariş ayarlamak ve Temel Kaynak Extend </stRong&gt; uzatmak için. Kuvvet eğrisinin düz kısmı kapsayacak şekilde dikey noktalı mavi çizgiler ayarlayın ve sonra Çalıştır &#39;ı tıklatın. </li><li> Araç çubuğu menüsünden girinti tıklayın ve uyulmuş değişkeni davranın Point Esaslı, Temas Noktası Algoritma İletişim Genişletilmiş, sığdır Yöntem Aktif Eğrisi için girdi ayarlamak, No yapışma Gücü Max Kuvvet Fit Sınır% 30, Min Kuvvetleri Fit Sınırının için ekleyin % 0 ve Hertz (Spherical) sığdır Modeli. NOT: Bizim ölçümlerinde, ucu ve örnek (retraksiyon eğrisinde konsolun olumsuz sapma) arasında önemli yapışma nadiren gözlenmiştir. Bu yapışma görülen durumlarda, uygun bir model (DMT ya JKR) analiz 18,19 için kullanılmalıdır. </li><li> Young modülü değerlerini kaydedin. 3 Her Young (elastik) modülü analiz- Şekil 4 &#39;de gösterildiği gibi birbirine küçük mesafede alınan 5 alanı (alan başına 5 kuvveti eğrileri). NOT: eserler kaldırmak Young modülüne&gt; 100 kPa hariç tutmak için (normalde ~ toplam ölçümlerin% 10) analizinden. </li><li> 3 her biri için bir ortalama Young Modülü değerini hesaplayın - (ölçülmüştür) 5 alanları ve bir bütün olarak aort için ortalama bir esneklik modülüne hesaplamak için bu değerleri kullanır. NOT: En az 3 ve daha sık 4-6 ayrı aorta arteriyel sertlik doğru bir şekilde değerlendirmesini elde etmek için kullanılır. Nihai sonuçlar, &quot;n&quot; bağımsız deneyin ortalama ± SEM olarak çizilmiştir. gerekli aorta tam sayısı, tabii ki, gerekli hassasiyet düzeyine bağlı olacaktır. </li></ol>

<ol>
	<li>Kothapalli, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+Protection+by+ApoE+and+ApoE-HDL+Linked+to+Suppression+of+ECM+Gene+Expression+and+Arterial+Stiffening.">Cardiovascular Protection by ApoE and ApoE-HDL Linked to Suppression of ECM Gene Expression and Arterial Stiffening.</a> Cell Rep. 2, 1259-1271 (2012).</li><li>Liu, S. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase-12+is+an+essential+mediator+of+acute+and+chronic+arterial+stiffening.">Matrix metalloproteinase-12 is an essential mediator of acute and chronic arterial stiffening.</a> Sci Rep. 5, 17189 (2015).</li><li>Lakatta, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+arterial+aging+and+the+epidemic+of+systolic+hypertension+and+atherosclerosis.">Central arterial aging and the epidemic of systolic hypertension and atherosclerosis.</a> J Am Soc Hypertens. 1, 302-340 (2007).</li><li>Stehouwer, C. D. A., Henry, R. M. A., Ferreira, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arterial+stiffness+in+diabetes+and+the+metabolic+syndrome:+a+pathway+to+cardiovascular+disease.">Arterial stiffness in diabetes and the metabolic syndrome: a pathway to cardiovascular disease.</a> Diabetologia. 51, 527-539 (2008).</li><li>Steppan, J., Barodka, V., Berkowitz, D. E., Nyhan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+Stiffness+and+Increased+Pulse+Pressure+in+the+Aging+Cardiovascular+System.">Vascular Stiffness and Increased Pulse Pressure in the Aging Cardiovascular System.</a> Cardiol Res Pract. 2011, 263585 (2011).</li><li>Duprez, D. A., Cohn, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arterial+stiffness+as+a+risk+factor+for+coronary+atherosclerosis.">Arterial stiffness as a risk factor for coronary atherosclerosis.</a> Curr Atheroscler Rep. 9, 139-144 (2007).</li><li>Mitchell, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arterial+Stiffness+and+Cardiovascular+Events:+The+Framingham+Heart+Study.">Arterial Stiffness and Cardiovascular Events: The Framingham Heart Study.</a> Circulation. 121, 505-511 (2010).</li><li>Sutton-Tyrrell, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+Aortic+Pulse+Wave+Velocity,+a+Marker+of+Arterial+Stiffness,+Predicts+Cardiovascular+Events+in+Well-Functioning+Older+Adults.">Elevated Aortic Pulse Wave Velocity, a Marker of Arterial Stiffness, Predicts Cardiovascular Events in Well-Functioning Older Adults.</a> Circulation. 111, 3384-3390 (2005).</li><li>Klein, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Cycle+Control+by+Physiological+Matrix+Elasticity+and+In+Vivo+Tissue+Stiffening.">Cell-Cycle Control by Physiological Matrix Elasticity and In Vivo Tissue Stiffening.</a> Curr Biol. 19, 1511-1518 (2009).</li><li>Bae, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FAK-Cas-Rac-lamellipodin+signaling+module+transduces+extracellular+matrix+stiffness+into+mechanosensitive+cell+cycling.">A FAK-Cas-Rac-lamellipodin signaling module transduces extracellular matrix stiffness into mechanosensitive cell cycling.</a> Sci signal. 7, ra57 (2014).</li><li>Thyberg, J., Hedin, U., Sj&#246;lund, M., Palmberg, L., Bottger, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+differentiated+properties+and+proliferation+of+arterial+smooth+muscle+cells.">Regulation of differentiated properties and proliferation of arterial smooth muscle cells.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 10, 966-990 (1990).</li><li>Owens, G. K., Kumar, M. S., Wamhoff, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Regulation+of+Vascular+Smooth+Muscle+Cell+Differentiation+in+Development+and+Disease.">Molecular Regulation of Vascular Smooth Muscle Cell Differentiation in Development and Disease.</a> Physiol Rev. 84, 767-801 (2004).</li><li>Huynh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Related+Intimal+Stiffening+Enhances+Endothelial+Permeability+and+Leukocyte+Transmigration.">Age-Related Intimal Stiffening Enhances Endothelial Permeability and Leukocyte Transmigration.</a> Sci Transl Med. 3, 112ra122 (2011).</li><li>Safar, M. E., Levy, B. I., Struijker-Boudier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Perspectives+on+Arterial+Stiffness+and+Pulse+Pressure+in+Hypertension+and+Cardiovascular+Diseases.">Current Perspectives on Arterial Stiffness and Pulse Pressure in Hypertension and Cardiovascular Diseases.</a> Circulation. 107, 2864-2869 (2003).</li><li>Raffetto, J. D., Khalil, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinases+and+their+inhibitors+in+vascular+remodeling+and+vascular+disease.">Matrix metalloproteinases and their inhibitors in vascular remodeling and vascular disease.</a> Biochem Pharmacol. 75, 346-359 (2008).</li><li>Muller, D. J., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+as+a+multifunctional+molecular+toolbox+in+nanobiotechnology.">Atomic force microscopy as a multifunctional molecular toolbox in nanobiotechnology.</a> Nat Nanotechnol. 3, 261-269 (2008).</li><li>Hsu, B. Y., Bae, Y. H., Mui, K. L., Liu, S. -. L., Assoian, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+E3+Inhibits+Rho+to+Regulate+the+Mechanosensitive+Expression+of+Cox2.">Apolipoprotein E3 Inhibits Rho to Regulate the Mechanosensitive Expression of Cox2.</a> PLoS ONE. 10, e0128974 (2015).</li><li>Johnson, K. L., Kendall, K., Roberts, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+Energy+and+the+Contact+of+Elastic+Solids.">Surface Energy and the Contact of Elastic Solids.</a> Proc R Soc Lond A. 324, 301-313 (1971).</li><li>Derjaguin, B. V., Muller, V. M., Toporov, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+contact+deformations+on+the+adhesion+of+particles.">Effect of contact deformations on the adhesion of particles.</a> J Colloid Interface Sci. 53, 314-326 (1975).</li><li>Hutter, J. L., Bechhoefer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calibration+of+atomic-force+microscope+tips.">Calibration of atomic-force microscope tips.</a> Rev Sci Instrum. 64, 1868-1873 (1993).</li><li>Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelial+surface+layer.">The endothelial surface layer.</a> Pflugers Arch EJP. 440, 653-666 (2000).</li><li>Pogoda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depth-sensing+analysis+of+cytoskeleton+organization+based+on+AFM+data.">Depth-sensing analysis of cytoskeleton organization based on AFM data.</a> Eur Biophys J. 41, 79-87 (2012).</li><li>Mendez, M. G., Restle, D., Janmey, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vimentin+Enhances+Cell+Elastic+Behavior+and+Protects+against+Compressive+Stress.">Vimentin Enhances Cell Elastic Behavior and Protects against Compressive Stress.</a> Biophys J. 107, 314-323 (2014).</li><li>Moreno-Flores, S., Benitez, R., Md Vivanco, ., Toca-Herrera, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+relaxation+and+creep+on+living+cells+with+the+atomic+force+microscope:+a+means+to+calculate+elastic+moduli+and+viscosities+of+cell+components.">Stress relaxation and creep on living cells with the atomic force microscope: a means to calculate elastic moduli and viscosities of cell components.</a> Nanotechnology. 21, 445101 (2010).</li><li>Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelastic+properties+of+human+mesenchymally-derived+stem+cells+and+primary+osteoblasts,+chondrocytes,+and+adipocytes.">Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes.</a> J Biomech. 41, 454-464 (2008).</li><li>Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Elastic+Moduli+of+Thin+Layers+of+Soft+Material+Using+the+Atomic+Force+Microscope.">Determination of Elastic Moduli of Thin Layers of Soft Material Using the Atomic Force Microscope.</a> Biophys J. 82, 2798-2810 (2002).</li><li>Mahaffy, R. E., Shih, C. K., MacKintosh, F. C., K&#228;s, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+Probe-Based+Frequency-Dependent+Microrheology+of+Polymer+Gels+and+Biological+Cells.">Scanning Probe-Based Frequency-Dependent Microrheology of Polymer Gels and Biological Cells.</a> Phys Rev Lett. 85, 880-883 (2000).</li><li>Amin, M., Le, V. P., Wagenseil, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+Testing+of+Mouse+Carotid+Arteries:+from+Newborn+to+Adult.">Mechanical Testing of Mouse Carotid Arteries: from Newborn to Adult.</a> J Vis Exp. , e3733 (2012).</li><li>Laurent, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expert+consensus+document+on+arterial+stiffness:+methodological+issues+and+clinical+applications.">Expert consensus document on arterial stiffness: methodological issues and clinical applications.</a> Eur Heart J. 27, 2588-2605 (2006).</li><li>Plodinec, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nanomechanical+signature+of+breast+cancer.">The nanomechanical signature of breast cancer.</a> Nat Nano. 7, 757-765 (2012).</li><li>Raman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+nanomechanical+properties+of+live+cells+using+multi-harmonic+atomic+force+microscopy.">Mapping nanomechanical properties of live cells using multi-harmonic atomic force microscopy.</a> Nat Nano. 6, 809-814 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

AFM girinti hücre ve dokuların sertliği (esneklik katsayısı) karakterize etmek için kullanılabilir. Bu yazıda fare azalan aort ve aort arkı izole etmek ve bu arter bölgelerin ex vivo elastik modüle belirlemek için ayrıntılı adım adım protokolleri sağlar. Biz şimdi özetlemek ve bu yazıda anlatılan yöntemin teknik konuları ve sınırlamaları tartışmak. Çeşitli teknik konular izolasyonu ve bunların küçük ve ince yapısı verilen fare aorta analizinde or...

The biomechanical properties of arteries are a critical determinant in cardiovascular disease (CVD) and aging. Arterial stiffness, a major cholesterol independent risk factor and an indicator for the progression of CVD, increases with vascular injury, atherosclerosis, age, and diabetes1-8. Arterial wall stiffening is associated with increased dedifferentiation, migration, and proliferation of vascular smooth muscle cells9-12. In addition, increased arterial stiffness has been linked to enhanced macrophage adhesion1, endothelial permeability and leukocyte transmigration13, and vessel wall remodeling14,15. Thus, therapies that could prevent arterial stiffening in CVD or aging might complement currently available pharmacological interventions that treat CVD by reducing high blood cholesterol. 
AFM is a powerful analytical tool used for various physical and biological applications. AFM is increasingly used to obtain the high-resolution images and characterize the biomechanical properties of soft biological samples such as tissues and cells1,2,10,16,17 with a great degree of accuracy at nanoscale levels. A major advantage of AFM is the fact that it can be used with living cells.
This paper describes our method for measuring the elastic modulus of mouse arteries ex vivo using AFM. The described method shows how we 1) properly isolate mouse arteries (descending aorta and aortic arch) and 2) measure the elastic modulus of these tissues by AFM. Measurements of unloaded elastic moduli in arteries can help to elucidate changes in the extracellular matrix (ECM) that occur in response to vascular injury, CVD, and aging.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="836">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:272px;">BioScope Catalyst AFM system</td>
			<td style="width:191px;">Bruker</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nikon Eclipse TE 200 inverted microscope</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Silicon nitride AFM probe</td>
			<td>Novascan Technologies</td>
			<td>PT.SI02.SN.1</td>
			<td>0.06 N/m cantilever; 1 &#181;m SiO2 particle</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>See section 1.4</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont #5SF forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-00</td>
			<td>See section 1.8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Fine Scissors-ToughCut</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">14058-11</td>
			<td>See section 1.4 (medium sized)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vannas-T&#252;bingen spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15008-08</td>
			<td>See section 1.6 (small sized)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">60mmTC-treated cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline, 1X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CM</td>
			<td>Without calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Krazy Glue instant all purpose liquid</td>
			<td>Krazy Glue</td>
			<td>KG58548R</td>
			<td>See section 2.2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gel-loading tips, 1-200 &#181;L</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-707-139</td>
			<td>See section 2.2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tip Tweezers</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>78092-CP</td>
			<td>See section 3.2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">50-mm, clear wall glass bottom dishes</td>
			<td>TED PELLA</td>
			<td>14027-20</td>
			<td>See section 4.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring the stiffness of ex vivo mouse aortas using atomic force microscopy

Arteriyel sertleşme önemli bir risk faktörüdür ve kardiyovasküler hastalık için biomarker ve yaşlanma bir özelliğidir. Atomik kuvvet mikroskopisi (AFM), sert (plastik, cam, metal, vs.) herhangi bir alt-tabaka üzerinde hücrelere yüzeyleri arasında değişen çeşitli malzemeler için viskoelastik mekanik özelliklerini karakterize etmek için çok yönlü bir analiz aracı. Yaygın hücre sertliğini ölçmek için kullanılan, daha az sıklıkla aorta sertliğini ölçmek için kullanılmıştır. Bu yazıda, yüksüz fare arterlerin ex vivo elastik modülü ölçmek için temas modunda AFM kullanarak işlemleri anlatacağım. Biz fare aorta izolasyonu için prosedürü tarif ve sonra AFM analizi için ayrıntılı bilgi sağlar. Bu lazer ışını uyumu, yay sabiti ve AFM prob sapma duyarlılığı kalibrasyonu ve kuvvet eğrileri elde edilmesi için adım adım yönergeler içerir. Biz aynı zamanda veri analy için ayrıntılı bir protokol sağlarkuvvet eğrilerinin sis.

<html> Şekil 5A 6 aylık, erkek C57BL / 6 fare azalan (torakal) aorta bir faz kontrast görüntü gösterir. AFM konsol doğrudan dokuda üzerinde yer alıyor ve girinti hazır. Şekil 5B ve 5C temas modunda AFM girinti ile elde edilen temsili kuvvet eğrileri göstermektedir. Şekil 5B ve 5C gösterilen yeşil çizgiler bir küre için Hertz modeli kullanılarak elde en uygun eğrileri temsil etmektedir. Metinde tarif edildiği gibi <s...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy at JoVE.com

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

sertliği ölçme<em&gt; Ex Vivo</emAtomik Kuvvet Mikroskobu Kullanma&gt; Fare aorta

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

measuring-stiffness-ex-vivo-mouse-aortas-using-atomic-force

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

10.4K Görüntüleme.  University of Pennsylvania. We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

Video: Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Targeted Expression of GFP in the Hair Follicle Using Ex Vivo Viral Transduction

There are many cell types in the hair follicle, including hair matrix cells which form the hair shaft and stem cells which can initiate the hair shaft during early anagen, the growth phase of the hair cycle, as well as pluripotent stem cells that play a role in hair follicle growth but have the potential to differentiate to non-follicle cells such as neurons. These properties of the hair follicle are discussed. The various cell types of the hair follicle are potential targets for gene therapy. Gene delivery system for the hair follicle using viral vectors or liposomes for gene targeting to the various cell types in the hair follicle and the results obtained are also discussed.

The hair follicle is a highly complex appendage of the skin containing a multiplicity of cell types. The follicle undergoes constant cycling through the life of the organism including growth and resorption with growth dependent on specific stem cells. The targeting of the follicle by genes and stem cells to change its properties, in particular, the nature of the hair shaft is, discussed. Hair follicle delivery systems are described, such as liposomes and viral vectors for gene therapy. The nature of the hair follicle stem cells is discussed, in particular, its pluripotency.

Ex Vivo Viral İletimi Saç Folikül GFP Hedeflenen İfade

There are many cell types in the hair follicle, including hair matrix cells which form the hair shaft and stem cells which can initiate the hair shaft ...

Biyoloji

Measuring the Bending Stiffness of Bacterial Cells Using an Optical Trap

We developed a protocol to measure the bending rigidity of filamentous rod-shaped bacteria. Forces are applied with an optical trap, a microscopic three-dimensional spring made of light that is formed when a high-intensity laser beam is focused to a very small spot by a microscope's objective lens. To bend a cell, we first bind live bacteria to a chemically-treated coverslip. As these cells grow, the middle of the cells remains bound to the coverslip but the growing ends are free of this restraint. By inducing filamentous growth with the drug cephalexin, we are able to identify cells in which one end of the cell was stuck to the surface while the other end remained unattached and susceptible to bending forces. A bending force is then applied with an optical trap by binding a polylysine-coated bead to the tip of a growing cell. Both the force and the displacement of the bead are recorded and the bending stiffness of the cell is the slope of this relationship.

We present a protocol for bending filamentous bacterial cells attached to a cover-slip surface with an optical trap to measure the cellular bending stiffness.

Optik Tuzak kullanarak Bakteriyel Hücre Bükme Rijitlik Ölçüm

We developed a protocol to measure the bending rigidity of filamentous rod-shaped bacteria. Forces are applied with an optical trap, a microscopic ...

Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to investigate cells behavior at sub-cellular level with high spatial and temporal resolution was developed. Thus, an atomic force microscope (AFM) was integrated with total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy and fast-spinning disk (FSD) confocal microscopy. The integrated system is broadly applicable across a wide range of molecular dynamic studies in any adherent live cells, allowing direct optical imaging of cell responses to mechanical stimulation in real-time. Significant rearrangement of the actin filaments and focal adhesions was shown due to local mechanical stimulation at the apical cell surface that induced changes into the cellular structure throughout the cell body. These innovative techniques will provide new information for understanding live cell restructuring and dynamics in response to mechanical force. A detailed protocol and a representative data set that show live cell response to mechanical stimulation are presented.

This paper aims to instruct the reader in the operation of an integrated atomic force-optical imaging microscope for mechanical stimulation of live cells in culture. A step-by-step protocol is presented. A representative data set that shows live cell response to mechanical stimulation is presented.

Tümleşik Optik ve Atomik Kuvvet Mikroskobu eğitimi Mekanik Uyarım Canlı Hücre Tepki

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to ...

Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3. On the macro scale the stiffness of tissues and organs within the human body span several orders of magnitude4. Much less is known about how stiffness varies spatially within tissues, and what the scope and spatial scale of stiffness changes are in disease processes that result in tissue remodeling. To better understand how changes in matrix stiffness contribute to cellular physiology in health and disease, measurements of tissue stiffness obtained at a spatial scale relevant to resident cells are needed. This is particularly true for the lung, a highly compliant and elastic tissue in which matrix remodeling is a prominent feature in diseases such as asthma, emphysema, hypertension and fibrosis. To characterize the local mechanical environment of lung parenchyma at a spatial scale relevant to resident cells, we have developed methods to directly measure the local elastic properties of fresh murine lung tissue using atomic force microscopy (AFM) microindentation. With appropriate choice of AFM indentor, cantilever, and indentation depth, these methods allow measurements of local tissue shear modulus in parallel with phase contrast and fluorescence imaging of the region of interest. Systematic sampling of tissue strips provides maps of tissue mechanical properties that reveal local spatial variations in shear modulus. Correlations between mechanical properties and underlying anatomical and pathological features illustrate how stiffness varies with matrix deposition in fibrosis. These methods can be extended to other soft tissues and disease processes to reveal how local tissue mechanical properties vary across space and disease progression.

The stiffness of the extracellular matrix strongly influences multiple behaviors of adherent cells. Matrix stiffness varies spatially throughout a tissue, and undergoes modification in various disease conditions. Here we develop methods to characterize spatial variations in stiffness in normal and fibrotic mouse lung tissue using atomic force microscopy microindentation.

Atomik Kuvvet Mikroskobu kullanarak Akciğer Doku Mikro-Mekanik Karakterizasyonu

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3.  On the macro scale the stiffness of tissues and organs ...

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes. More than 700 human miRNAs have been identified so far with each having up to hundreds of unique target mRNAs. Computational tools, expression and proteomics assays, and chromatin-immunoprecipitation-based techniques provide important clues for identifying mRNAs that are direct targets of a particular miRNA. In addition, 3'UTR-reporter assays have become an important component of thorough miRNA target studies because they provide functional evidence for and quantitate the effects of specific miRNA-3'UTR interactions in a cell-based system. To enable more researchers to leverage 3'UTR-reporter assays and to support the scale-up of such assays to high-throughput levels, we have created a genome-wide collection of human 3'UTR luciferase reporters in the highly-optimized LightSwitch Luciferase Assay System. The system also includes synthetic miRNA target reporter constructs for use as positive controls, various endogenous 3'UTR reporter constructs, and a series of standardized experimental protocols.
Here we describe a method for co-transfection of individual 3'UTR-reporter constructs along with a miRNA mimic that is efficient, reproducible, and amenable to high-throughput analysis.

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and have been shown to play a role in numerous biological processes. To better understand miRNA-UTR interactions, we have created a genome-wide collection of 3 UTR luciferase reporters paired with a novel luciferase gene and assay reagent, the LightSwitch system.

3&#39;UTR muhabiri oluşturur ve bir microRNA kullanarak LightSwitch Lusiferaz Test Sistemi ile İnsan microRNA belirlenmesi Hedefler yapışık hücrelere Mimik

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

Yeni Bir<em&gt; Ex vivo</emEmbriyonik Fare Kalp için&gt; Kültür Yöntemi

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

Tek Virion Atomik Kuvvet Mikroskopisi ve Süper Çözünürlüklü Floresan Görüntüleme için Numune Hazırlama

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Visualizing Lymph Node Structure and Cellular Localization using Ex-Vivo Confocal Microscopy

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are strategically interposed in the path of the lymphatic vessels, allowing intimate contact of tissue antigens with all resident immune cells in the LN. Thus, understanding the cellular composition, distribution, location and interaction using ex vivo whole LN imaging will add to the knowledge on how the body coordinates local and systemic immune responses. This protocol shows an ex vivo imaging strategy following an in vivo administration of fluorescent-labeled antibodies that allows a very reproducible and easy-to-perform methodology by using conventional confocal microscopes and stock reagents. Through subcutaneous injection of antibodies, it is possible to label different cell populations in draining LNs without affecting tissue structures that can be potentially damaged by a conventional immunofluorescence microscopy technique.

This protocol describes a technique to image different cell populations in draining lymph nodes without alterations in the organ structure.

Ex-Vivo Konfokal Mikroskopi ile Lenf Nodal Yapısı nın Ve Hücresel Lokalizasyonun Görselleştirilmesi

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are ...

Measuring Cell-Edge Protrusion Dynamics during Spreading using Live-Cell Microscopy

The development and homeostasis of multicellular organisms rely on coordinated regulation of cell migration. Cell migration is an essential event in the construction and regeneration of tissues, and is critical in embryonic development, immunological responses, and wound healing. Dysregulation of cell motility contributes to pathological disorders, such as chronic inflammation and cancer metastasis. Cell migration, tissue invasion, axon, and dendrite outgrowth all initiate with actin polymerization-mediated cell-edge protrusions. Here, we describe a simple, efficient, time-saving method for the imaging and quantitative analysis of cell-edge protrusion dynamics during spreading. This method measures discrete features of cell-edge membrane dynamics, such as protrusions, retractions, and ruffles, and can be used to assess how manipulations of key actin regulators impact cell-edge protrusions in diverse contexts.

This protocol aims to measure the dynamic parameters (protrusions, retractions, ruffles) of protrusions at the edge of spreading cells.

Canlı Hücre Mikroskobu ile Yayılma Sırasında Hücre-Kenar Çıkıntı Dinamiğinin Ölçülmesi

The development and homeostasis of multicellular organisms rely on coordinated regulation of cell migration. Cell migration is an essential event in the ...

Characterizing Mechanical Properties of Primary Cell Wall in Living Plant Organs Using Atomic Force Microscopy

The mechanical properties of the primary cell walls determine the direction and rate of plant cell growth and, therefore, the future size and shape of the plant. Many sophisticated techniques have been developed to measure these properties; however, atomic force microscopy (AFM) remains the most convenient for studying cell wall elasticity at the cellular level. One of the most important limitations of this technique has been that only superficial or isolated living cells can be studied. Here, the use of atomic force microscopy to investigate the mechanical properties of primary cell walls belonging to the internal tissues of a plant body is presented. This protocol describes measurements of the apparent Young&#39;s modulus of cell walls in roots, but the method can also be applied to other plant organs. The measurements are performed on vibratome-derived sections of plant material in a liquid cell, which allows (i) avoiding the use of plasmolyzing solutions or sample impregnation with wax or resin, (ii) making the experiments fast, and (iii) preventing dehydration of the sample. Both anticlinal and periclinal cell walls can be studied, depending on how the specimen was sectioned. Differences in the mechanical properties of different tissues can be investigated in a single section. The protocol describes the principles of study planning, issues with specimen preparation and measurements, as well as the method of selecting force-deformation curves to avoid the influence of topography on the obtained values of elastic modulus. The method is not limited by sample size but is sensitive to cell size (i.e., cells with a large lumen are difficult to examine).

Studies of cell wall biomechanics are essential for understanding plant growth and morphogenesis. The following protocol is proposed to investigate thin primary cell walls in the internal tissues of young plant organs using atomic force microscopy.

Canlı Bitki Organlarında Primer Hücre Duvarının Mekanik Özelliklerinin Atomik Kuvvet Mikroskobu Kullanılarak Karakterize Edilmesi

The mechanical properties of the primary cell walls determine the direction and rate of plant cell growth and, therefore, the future size and shape of the ...