This project was supported by Agriculture and Food Research Initiative Competitive Grant no. 2100-68003-30395 from the USDA National Institute of Food and Agriculture.

NOTA: Todos os procedimentos de recolha de sangue foram conduzidos de acordo com as diretrizes estabelecidas pela Appalachian State University (ASU) Institutional Review Board (IRB). 1. Recolha de Sangue Total <ol><li> Tenha um phlebotomist certificada tirar sangue de acordo com as diretrizes da Organização Mundial de Saúde. </li><li> Tirar sangue em um 4 ml tubo de colheita de sangue contendo ácido Di-Potássio etilenodiaminotetracético (EDTA K 2). Inverta tubo de recolha de sangue de acordo com as instruções do fabricante. Mantenha tubo de coleta de sangue à temperatura ambiente num agitador de bancada até à separação. </li></ol> 2. Preparação de células alvo marcadas com DiO <ol><li> Crescer as células K562 em completa de Iscove Modified Meios de Dulbecco (IMDM) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e 1% de penicilina estreptomicina durante várias semanas, antes do ensaio para assegurar a saúde das células. Ajuste o concentratde iões das células a 3 x 10 5 células / mL diariamente através da realização de uma contagem de células e subsequente passagem de células. Executar uma mudança de meio completo a cada 2 a 3 dias. </li><li> No dia do ensaio, executar uma contagem de células utilizando uma mistura 1: 1 hemocitómetro. <ol><li> Retirar 10 mL do frasco K562 e coloque em 1,5 mL tubo. </li><li> Adicionar 10 ul de corante azul de tripano para o mesmo tubo de 1,5 ml para um factor de diluição de 1: 1. </li><li> Agite suavemente o tubo para misturar K562 células e tripan corante azul. </li><li> Permitir K562 corante azul de tripano de células-se a incubar durante 1 minuto à temperatura ambiente. </li><li> Remover 15 mL de células K562 coradas de tubo. </li><li> Pipeta hemocitómetro para contagem de células. </li><li> Contagem de células nas quatro esquinas, bem como o quadrado do meio para um total de cinco quadrados. </li><li> Calcular a contagem de células utilizando a equação: Total de células / ml = Total de células contadas X (fator de diluição / Número de quadrados) X 10.000 / mL </li></ol></li&gt; <li> Ressuspender as células alvo K562 a uma densidade final de 1 x 10 6 culas / ml em meio de cultura IMDM isento de soro. </li><li> Para células alvo K562 não coradas, adicionar 10 ml de células alvo K562 para um tubo de 15 ml a uma densidade de 1 x 10 6 células / ml para um total de 10 x 10 6 células K562. Colocar em uma incubadora a 37 ° C com 5% de CO 2 até que esteja pronto para uso. </li><li> Para células alvo K562 DiO manchado, adicionam-se 10 ml de células K562 alvo para um tubo de 15 ml a uma densidade de 1 x 10 6 células / ml para um total de 10 x 10 6 células K562. <ol><li> Adicionar 1 mL de solução-DiO rotulagem de células por ml de suspensão de células em 15 ml de tubo designada por coloração DiO e suavemente vórtice. Por exemplo, adicionar 10 ul de solução de marcação celular DiO a 10 x 10 6 K562 células / ml num volume de 1 x 10 6 células / ml. </li><li> Incubar solução K562-DiO durante 20 min a 37 ° C com 5% de CO 2 em um tubo de 15 ml. </li></ol></li><li> Segueing de incubação, adicionar 3 ml de solução salina à temperatura ambiente fosfato tamponada (PBS) a uma solução K562-DiO contendo 15 ml de tubo. </li><li> Centrifugar durante 10 minutos a 135 xg à temperatura ambiente. </li><li> Cuidadosamente remover o sobrenadante sem perturbar o pelete de células com uma pipeta de volume ajustável 1000 ul. </li><li> Adicionar 10 ml de IMDM fresco para pellet contendo células 15 mL tubo. </li><li> Suavemente o tubo de vórtice para ressuspender as células. </li><li> Repita os passos 2.7 a 2.10 por mais duas vezes. </li><li> Células de loja em um 37 ° C incubadora com 5% de CO 2 até que esteja pronto para uso. NOTA: As células podem ser armazenadas no incubador durante até 24 horas, mas é preferível usá-los no mesmo dia. </li></ol> 3. Preparação de Controles <ol><li> Transferir o seguinte em separados e devidamente rotulados tubos de 1,5 ml: <ol><li> Adicionar 500 mL de IMDM fresco contendo ressuspenso DIO-rotulados K562 células para o &quot;Double positiva&quot; rotuladas 1,5 tubo mL. </li><li> Adicionar 500 mL de IMDM fresco contendo novamente suspensas células K562 DIO-etiquetados para a &quot;única dio&quot; rotulados 1,5 tubo mL. </li><li> Adicionar 500 mL de IMDM fresco contendo células K562 não marcadas ressuspendidas em a &quot;iodeto de propídio (PI), apenas&quot; marcado tubo 1,5 mL. </li></ol></li><li> Coloque a ponta positiva Duplo e PI apenas tubos em um 55 ° C banho de água durante 5 minutos. </li><li> Após a 5 min tiver decorrido, remover os tubos e limpe com 70% de etanol. </li><li> Adicionar 10 L de PI ao Duplo positiva e PI apenas 1,5 tubos mL. </li><li> Coloque todos os três controlos de células alvo K562 na incubadora a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Após os 30 min de incubação tiver decorrido, centrifugar os três controlos de células alvo K562 durante 2 minutos a 163 x g. </li><li> Cuidadosamente remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento celular. </li><li> Ressuspender cada controlo com 20 mL de meio fresco cultura de células IMDM, e deixar na incubadora a 37 ° C com 5% de CO 2 durante pelo menos30 min para o sinal DiO óptima. NOTA: Os controles são agora pronto para ser executado através do fluxo de imagem citômetro. </li></ol> 4. NK celular separação automatizada <ol><li> Ligue separador de células e permitir que o ciclo de start-up para terminar. </li><li> Certifique-se de que todas as garrafas iluminações de fluidos são verdes e que o frasco de resíduos está vazio. </li><li> Obter uma temperatura de 15 mL suporte de tubos quarto. NOTA: A seleção é baseado em volumes de amostra. Por exemplo, para um volume de menos do que 3 ml de utilizar um suporte de tubos de 15 ml e para um volume de mais de 3 mL usar um suporte para tubos de 50 mL. </li><li> tubos de amostra de etiqueta em conformidade (Repita por amostra / participante): Participante 1 Whole Amostra de Sangue; Participante 1 fracção negativa; Participante 1 fracção positiva. </li><li> Gentilmente pipeta 1,5 ml de sangue total a partir do Passo 1.2 em &quot;Whole Amostra de Sangue&quot; tubo de 15 mL. </li><li> Coloque 15 ml tubo adequadamente rotulado como &quot;Whole Amostra de Sangue&quot; do Passo 4.5 e rotulado 15 mL &quot;fracção negativa&quot; e&quot;fracção positiva&quot; tubos de Passo 4.4 no suporte de tubos. Utilize suporte de amostras thefollowing set-up: Fileira (R1) A: Whole Amostra de Sangue, Row (R2) B: fração magneticamente marcados positiva,: Negativo, fração não marcado, Row (R4) C. </li><li> Insira o rack separador para o MiniSampler para autolabeling. </li><li> Seleccionar &quot;Reagente&quot; no menu e realçar a posição em que o frasco vai ser colocado na prateleira de separação. </li><li> Selecione &quot;Ler Reagente&quot; para activar o leitor de código 2D. </li><li> Colocar o frasco do reagente apropriado em frente do leitor de código de 2D entre 0,5-2,5 cm da tampa do leitor de código. NOTA: Por exemplo, o reagente necessário para a separação de células NK é CD56. </li><li> Segure frasco de reagente em um ângulo na frente do leitor de código 2D para leitura ideal. </li><li> Colocar o frasco de reagente para a posição adequada cremalheira separador. </li><li> Destacar as posições desejadas na aba Separação na tela. </li><li> No submenu Labeling, atribuir um auprograma tolabeling. </li><li> Atribuir a célula de separação MicroBeads Reagente CD56 para acumular posições 1, 2, 3 e 4. </li><li> Selecione o programa de separação &quot;posselwb&quot;. </li><li> Selecione a opção &quot;lavar&quot; programa de lavagem. </li><li> Inserir um volume de amostra de 1.500 mL no submenu &quot;Volume&quot; usando o teclado numérico. </li><li> Selecione a opção &quot;Enter&quot; no teclado. </li><li> Selecione &quot;Executar&quot; para iniciar a separação de células. </li><li> Selecione &quot;OK&quot; para confirmar que tampão suficiente disponível para o processamento de todas as amostras. </li></ol> 5. Contagem de Células NK Separação Após celular <ol><li> Imediatamente após a separação de células com o separador de células, recuperar a fração positiva. Deixe em temperatura ambiente. Esta fracção contém a população de células NK puro desejado. </li><li> Para cada amostra individual, executar uma contagem de células utilizando um hemocitómetro, como por Etapa 2.2. <ol><li> Após os cálculos, registre a contagem de células. </li&gt; </ol></li></ol> 6. Ensaio de Citotoxicidade Preparação da Amostra <ol><li> Preparar e rotular tubos de 1,5 ml para cada amostra / participante em conformidade. </li><li> Pipeta desejada proporção de células NK e células K562 DIO-rotulados para cada tubo. NOTA: Por exemplo, a proporção desejada de células alvo K562 e células efectoras NK é de 1: 5. </li><li> Centrifugar durante 5 minutos a 135 x g. </li><li> Cuidadosamente remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento celular. </li><li> Ressuspender NK-DiO marcado mistura de células K562 em 500? L de meio celular NK sem interleucina-2 (IL-2) e 2-mercaptoetanol (2-ME) (incompleta meios de cultura de células NK). NOTA: O meio de cultura de células NK é incompleta Meio Essencial Mínimo de Eagle com bicarbonato de sódio, sem L-glutamina, ribonucleósidos e desoxiribonucleósidos. </li><li> Adicionar 5 mL de PI a cada tubo. </li><li> Centrifugar durante 2 minutos a 163 x g. </li><li> Incubar as células a 37 ° C durante 2 h. </li><li> Após 2 h de incubação, centrifuGE durante 2 minutos a 163 x g. </li><li> Cuidadosamente remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento celular. </li><li> Ressuspender as células em 25 ul incompleta meios de cultura celular NK. </li></ol> 7. Preparação de espontânea ( &quot;S&quot;) Amostra <ol><li> Pipetar 500 ul de células K562 DIO-marcados (concentração de 1 x 10 6 células / ml) no tubo de 1,5 mL. </li><li> Adicionar 10 ul de PI de cada um dos tubos. </li><li> tubo de centrifugação durante 2 minutos a 163 x g. </li><li> Incubar as células a 37 ° C durante 2 h. </li><li> Após 2 h de incubação, centrifuga-se durante 2 min a 163 x g. </li><li> Cuidadosamente remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento celular. </li><li> Ressuspender as células em 25 ul incompleta Meio Essencial (MEM-α) Meios de cultura de células alfa-mínimos. </li></ol> 8. Aquisição de Dados com imagens de fluxo Citómetro <ol><li> Pressione o botão verde no interior da porta da frente da imagem de citometria de fluxo para ligar o instrumento. </li><li> Ligue all computadores associados com a imagiologia de fluxo FACSCalibur. </li><li> Inicie o fluxo de imagem citômetro software. </li><li> Clique no botão &quot;Iniciar&quot; para limpar o sistema e preparar a linha de amostra. </li><li> Uma vez que o &quot;Startup&quot; estiver concluída, feche a janela &quot;calibrações&quot;. </li><li> Atribuir canais: no lado superior esquerdo, clique em cada canal, a fim de atribuir-lhes. </li><li> No lado direito, clique no botão gráfico de dispersão para criar 4 scatterplots: Raw Max Pixel _MC_6 vs Area_M06, Raw Max Pixel _MC_2 vs Area_M02, Raw Max Pixel _MC_5 vs Area_M05 e FieldArea_M01 vs AspectRatio_M01. </li><li> Comece analisando amostras usando primeiro o controle &quot;Double positiva&quot;. <ol><li> Clique em &quot;Load&quot;. </li><li> Coloque o tubo de 1,5 ml com a amostra &quot;Double positiva&quot; de Passos 3,4 para 3,9 no carregador de amostra. </li><li> Selecione o objetivo 40X sob a guia &quot;Ampliação&quot;. </li><li> Ligue a 405 mW e642 lasers MW. </li><li> Ligue o canal &quot;Brightfield&quot;. </li><li> Clique em &quot;Selecionar intensidade.&quot; </li><li> Com base na amostra de controlo &quot;Duplo positiva&quot;, determinar a intensidade desejada para o laser de 405 mW de modo que o detector não está sobrecarregado. Nota: Por exemplo, a intensidade ideal para este experimento foi fixado em 11 mW. </li></ol></li><li> Após a desejada set-up é conseguido, adquirir dados. <ol><li> Sob a guia &quot;Aquisição Arquivo&quot;, digite em um texto nome personalizado. Selecione uma pasta para salvar o arquivo (s) de dados. </li><li> Digite o número de células de adquirir ao lado de &quot;Collect&quot;. Tipicamente, este número varia entre 1.000 a 10.000. </li><li> Clique em &quot;Adquirir&quot;. NOTA: Uma vez que o número desejado de células é adquirido, o arquivo de dados é salvo automaticamente na pasta selecionada anteriormente. </li></ol></li><li> Após a aquisição for concluída, carregar a amostra de controlo seguinte - DiO único controle. </strong&gt; <ol><li> Clique em &quot;Load&quot;. </li><li> Coloque o tubo de 1,5 mL com o &quot;único dio&quot; amostra para o carregador de amostra. </li><li> Deixar o objetivo 40X sob a guia &quot;Ampliação&quot; selecionado. </li><li> Deixar o laser 405 mW ligado. </li><li> Desligue a mW laser de 642 e o canal &quot;Brightfield&quot;. NOTA: Agora que a desejada configuração foi alcançado, os dados podem ser adquiridos. </li><li> Sob a guia &quot;Arquivo Aquisição&quot;, digite em um texto nome personalizado e escolha uma pasta para salvar o arquivo (s) de dados. Digite o número de células de adquirir ao lado de &quot;Collect.&quot;. Normalmente este número é de 1.000. </li><li> Clique em &quot;Adquirir&quot;. NOTA: Uma vez que o número desejado de células é adquirido o arquivo de dados é salvo automaticamente na pasta selecionada anteriormente. </li></ol></li><li> Repita o passo 8,10 para o &quot;único PI&quot; amostra de controlo. As amostras experimentais estão agora prontos para serem recolhidos. </li><li> Lidar com as remaining amostras experimentais, incluindo as &quot;amostras&quot; S &quot;espontânea&quot; da seguinte forma: <ol><li> Deixar o objetivo 40X sob a guia &quot;Ampliação&quot; selecionado. </li><li> Ligue a 405 mW e 642 lasers MW. </li><li> Ligue o canal &quot;Brightfield&quot;. </li><li> Clique em &quot;Intensidade Set.&quot; </li><li> Sob a guia &quot;Arquivo Aquisição&quot;, digite em um texto nome personalizado e escolha uma pasta para salvar o arquivo (s) de dados. Digite em um texto nome personalizado. </li><li> Digite o número de células de adquirir ao lado de &quot;Recolha&quot;. </li><li> Clique no botão &quot;Acquire&quot;. NOTA: Uma vez que o número desejado de células é adquirido o arquivo de dados é salvo automaticamente na pasta selecionada anteriormente. </li></ol></li><li> Repita o passo 8,12 para todas as amostras experimentais. </li><li> Depois de todos os dados experimentais e arquivos foram recolhidos, clique no botão &quot;Shutdown&quot; para esterilizar o sistema. </li></ol> 9. ImaginAnálise de amostras g Citómetro de fluxo <ol><li> Abra o fluxo de imagiologia citómetro de aplicação de software de análise. </li><li> Em &quot;Arquivo&quot;, abra um arquivo .RIF experimental. </li><li> Construir uma nova matriz usando os arquivos .RIF única cor (OID somente controlar e controle somente-PI, criado durante as etapas de 8.10 e 8.11), selecionando &quot;Criar um novo Matrix&quot; sob a guia de Compensação no fluxo de imagens citômetro software. NOTA: O software irá pedir para a seleção dos arquivos de uma só cor e fundi-los para criar um arquivo de matriz (extensão de arquivo .ctm), que está a ser selecionado para aplicar a compensação de canal. </li><li> Criar gráficos de pontos utilizando a função de &quot;blocos de construção&quot; do software. <ol><li> Criar um ponto-plot (BrightFieldGradient_RMS vs frequência) para a porta do células focalizados. Ligue para o portão &quot;Focus&quot; (Figura 1A). </li><li> Usando o portão &quot;Focus&quot;, criar um gráfico de pontos de Bright Área Campo vs Campo brilhante proporção para g<html> comeu as células singlet. Ligue para o portão &quot;Single&quot; (Figura 1B). </li><li> Usando o portão &quot;Single&quot;, criar um gráfico de pontos de Intensity_MC_Ch02 vs Intensity_MC_Ch5. Utilize este plano para identificar e células dupla positivos (metas, mortos) gate DIO-positiva apenas células (alvos, vivo) e PI-DiO (Figura 1C). NOTA: Todas as parcelas descrito nos passos 9.4.1, 9.4.2 e 9.4.3 podem ser criados usando a função de &quot;blocos de construção&quot; do software. </li></ol></li><li> Clique na função de estatísticas do gráfico de pontos para acessar os números de células de cada portão. </li><li> Calcula-se a percentagem de alvos na amostra mortas espontânea e amostras experimentais utilizando a seguinte fórmula: % alvos mortos na amostra = (alvos #dead x 100) / (# viver alvos + #dead alvos) </li><li> Calcular a citotoxicidade utilizando a seguinte fórmula: % Citotoxicidade = [(Experimental mortos mortos-espontânea) / (morto 100 espontânea)] x100 </li></ol>_content &quot;fo: manter-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54779/54779fig1.jpg" /> Figura 1: histogramas representativos, gráficos de dispersão e imagens para análise da atividade citotóxica. Análise (A) células foco. (B) Análise única célula. Análise (C) coloração das células alvo. Todas as determinações são feitas usando a imagem anexada para cada evento. Isso pode ser acessado no software de análise, basta clicar sobre o evento nos gráficos. (D) imagem representativa de um evento de gibão, mostrando uma célula NK apoptótica e um alvo K562 ao vivo. Ch01, Brightfield. CH02, a DIO. CH05, PI. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54779/54779fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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The authors have nothing to disclose.

O método descrito neste estudo mede directamente a actividade específica de células NK de um indivíduo em resposta a estímulos (neste caso particular, o exercício prolongado). Tipicamente, as células NK são isolados a partir de um do sangue utilizando um gradiente de densidade ou de triagem de células, usando uma combinação de marcadores. Embora estes métodos sejam largamente usadas, elas têm muitas desvantagens: eles são morosos, envolvem manipulações múltiplas, e dependem fortemente do usuário. Como ...

células assassinas naturais são um elemento essencial do sistema imune inato. Embora eles são muito regulado, eles têm a capacidade de reconhecer e eliminar células anormais através de contacto célula-a-célula e sem activação prévia 1. Como tal, eles formam uma linha rápida de defesa contra as infecções. O exercício, especialmente intensa, tem sido demonstrado para deprimir o sistema imunitário de forma transiente 2, 3, 4, 5. As células NK são particularmente propensos para este efeito 4, 6, 7, de forma eficaz criar uma janela de aumento da sensibilidade à doença. Assim, o estudo de intervenções antes, durante ou após o exercício intenso com o objetivo de reduzir o seu impacto sobre a função das células NK é de particular interesse para o bem-estar dos atletas pós-competições. 8, a cerca de 1% do compartimento de células brancas do sangue; 2) As células NK são muito sensíveis ao stress e dependem de exposição constante a condições fisiológicas para permanecer viável e estável no decurso da experimentação; e 3) ensaios padrão para determinar a citotoxicidade das células NK, como Ficoll gradientes 9 e solte ensaios de 10, não são confiáveis e inconsistente. A variabilidade inerente de amostras humanas único composto estas questões. amostras humanas frescas colhidas durante as intervenções são bastante regulamentado e difícil de obter, pelo menos, quando comparado com as amostras de animais ou linhas celulares imortalizadas. Isso reduz as oportunidades para repetir experiências ou adicionar participantes para o estudo de coorte para alcançar limiares estatísticos significativos. Coletivamente, estas questões apoiar a necessidade de um protocolo simplificado que permite foR tanto de alto rendimento e uma análise de alta fiabilidade da actividade lítica de células NK em amostras humanas. Nós estabelecemos um fluxo de trabalho que encurta o tempo necessário para identificar, isolar e células NK teste de sangue total humano, minimizando a exposição a factores externos. O método de optimizar o uso de dois instrumentos, um separador magnético à base de células e um fluxo de imagens citómetro, e, um T específica optimizado-ensaio: razão E para permitir a detecção das diminuições ou aumentos de citotoxicidade de células NK.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1275">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">K-562 lymphoblasts</td>
			<td style="width:183px;">ATCC</td>
			<td style="width:136px;">CCL-243</td>
			<td style="width:585px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Media</td>
			<td style="width:183px;">ATCC</td>
			<td style="width:136px;">30-2005</td>
			<td>High glucose, with L-Glutamine, with HEPES, Sterile-filtered</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Alpha Minimum Essential medium</td>
			<td style="width:183px;">ATCC</td>
			<td style="width:136px;">CRL-2407</td>
			<td style="width:585px;">Without ribonucleosides and deoxyribonucleosides but with 2 mM L-glutamine and 1.5 g/L sodium bicarbonate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Trypan Blue Solution 0.4%</td>
			<td style="width:183px;">Amresco</td>
			<td style="width:136px;">K940-100ML</td>
			<td>Tissue culture grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Propridium Iodide Staining Solution</td>
			<td style="width:183px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:136px;">51-66211E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Vybranto DiO cell-labeling solution</td>
			<td style="width:183px;">Vybranto</td>
			<td style="width:136px;">V-22886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">autoMACS Pro Separator</td>
			<td style="width:183px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:136px;">130-092-545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">autoMACS Running Buffer</td>
			<td style="width:183px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:136px;">130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">autoMACS Washing Buffer</td>
			<td style="width:183px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:136px;">130-092-987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">autoMACS Columns</td>
			<td style="width:183px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:136px;">130-021-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Whole Blood CD56 MicroBeads, human</td>
			<td style="width:183px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:136px;">130-090-875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageStream X Mark II Imaging Flow Cytometer</td>
			<td style="width:183px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Speedbeads</td>
			<td style="width:183px;">Amnis Corporation</td>
			<td style="width:136px;">400030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.4-0.7% Hypochlorite (Sterilizer)</td>
			<td style="width:183px;">VWR</td>
			<td>JT9416-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coulter Clenz</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td>8546929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70% Isopropanol (Debubbler)</td>
			<td style="width:183px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:136px;">1.3704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-PBS (Sheath fluid)</td>
			<td style="width:183px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:136px;">BSS-1006-B (1X)</td>
			<td>No calcium or magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">INSPIRE Software</td>
			<td style="width:183px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>Version Mark II, September 2013</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ideas Application Software</td>
			<td style="width:183px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>Version 6.1, July 2014</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis of natural killer cell lytic activity in human whole blood

a citotoxicidade das células NK é uma medida utilizada para determinar o efeito de uma intervenção externa sobre a função da célula NK. No entanto, a precisão e reprodutibilidade deste ensaio pode ser considerado instável, quer devido a erros do utilizador ou por causa da sensibilidade das células NK para manipulação experimental. Para eliminar estes problemas, um fluxo de trabalho que eles se reduz a um mínimo foi estabelecida e é apresentada aqui. Para ilustrar, obtivemos amostras de sangue, em vários momentos, desde corredores (n = 4), que foram submetidos a uma intensa sessão de exercício. Primeiro, as células NK são simultaneamente identificados e isolados através de marcação de CD56 e de triagem magnética baseada, directamente a partir de sangue inteiro e de tão pouco como um mililitro. As células NK são ordenados removido de quaisquer anticorpos de reagentes ou de nivelamento. Eles podem ser contados, a fim de estabelecer uma contagem de células NK precisa por mililitro de sangue. Em segundo lugar, as células NK (células efectoras ordenados ou E) pode ser misturado com 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine perclorato (DIO) marcaram células K562 (células alvo ou T) a um ensaio-óptima de 1: 5 razão T: E, e analisadas usando um imaging fluxo-citómetro que permite a visualização de cada evento e a eliminação de qualquer falsa positiva ou falsos negativos (como doublets ou células efetoras). Este fluxo de trabalho pode ser completada em cerca de 4 h, e permite a resultados muito estáveis ​​mesmo quando se trabalha com amostras humanas. Quando disponíveis, as equipes de pesquisa pode testar várias intervenções experimentais em seres humanos, e comparar as medidas em toda a vários pontos de tempo, sem comprometer a integridade dos dados.

Determinação do número de células NK O efeito de funcionamento pesado na contagem de células NK no sangue total foi medida, utilizando o protocolo de exercício descrito na Figura 2. Amostras de sangue foram colhidas antes do exercício, imediatamente após o exercício, 1,5 h após o exercício, e, finalmente, 24 e 48 h após a coleta de sangue inicial. A concentração de células NK por mililitro de sangue total foi medido para cada corredor (Figur...

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Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

Citometria de fluxo e assassinas naturais celular Lytic Actividade em sangue total humano

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

flow-cytometric-analysis-natural-killer-cell-lytic-activity-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.3K visualizações.  North Carolina A&T State University, North Carolina Research Campus. This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

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Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has been in the study of immunological synapse formation, due to the ability of the glass-supported planar lipid bilayers to mimic the surface of a target cell while forming a horizontal interface. The recent advances in super-resolution imaging have further allowed scientists to better view the fine details of synapse structure. In this study, one of these advanced techniques, stimulated emission depletion (STED), is utilized to study the structure of natural killer (NK) cell synapses on the supported lipid bilayer. Provided herein is an easy-to-follow protocol detailing: how to prepare raw synthetic phospholipids for use in synthesizing glass-supported bilayers; how to determine how densely protein of a given concentration occupies the bilayer's attachment sites; how to construct a supported lipid bilayer containing antibodies against NK cell activating receptor CD16; and finally, how to image human NK cells on this bilayer using STED super-resolution microscopy, with a focus on distribution of perforin positive lytic granules and filamentous actin at NK synapses. Thus, combining the glass-supported planar lipid bilayer system with STED technique, we demonstrate the feasibility and application of this combined technique, as well as intracellular structures at NK immunological synapse with super-resolution.

We describe here a combination of the glass-supported lipid bilayer technique of forming immunological synapses with the super-resolution imaging technique of stimulated emission depletion (STED) microscopy. The goal of this protocol is to provide users with the instructions necessary to successfully carry out these two techniques.

Super-Resolution Imaging da Célula Natural Killer imunológica Synapse em um vidro com suporte Planar Lipid Bilayer

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

Imunologia e Infecção

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various nanoparticle systems have been engineered to mimic features of pathogens to improve antigen delivery to draining lymph nodes and increase antigen uptake by antigen-presenting cells, leading to new vaccine formulations optimized for induction of antigen-specific CD8+ T cell responses. In this article, we describe the synthesis of a &#8220;pathogen-mimicking&#8221; nanoparticle system, termed interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles (ICMVs) that can serve as an effective vaccine carrier for co-delivery of subunit antigens and immunostimulatory agents and elicitation of potent cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. We describe methods for characterizing hydrodynamic size and surface charge of vaccine nanoparticles with dynamic light scattering and zeta potential analyzer and present a confocal microscopy-based procedure to analyze nanoparticle-mediated antigen delivery to draining lymph nodes. Furthermore, we show a new bioluminescence whole-animal imaging technique utilizing adoptive transfer of luciferase-expressing, antigen-specific CD8+ T cells into recipient mice, followed by nanoparticle vaccination, which permits non-invasive interrogation of expansion and trafficking patterns of CTLs in real time. We also describe tetramer staining and flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells for longitudinal quantification of endogenous T cell responses in mice vaccinated with nanoparticles.

We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

Imaginologia todo animal e técnicas de citometria de fluxo para CD8 + respostas de células T Análise do antigénio específico da Nanoparticle após vacinação

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

Isolamento e análise de citometria de fluxo de células imunes do cérebro isquêmico Rato

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 malignant gliomas soon after intracranial engraftment if the cancer cells are rendered deficient in their expression of the &#946;-galactoside-binding lectin galectin-1 (gal-1). More recent work now shows that a population of Gr-1+/CD11b+ myeloid cells is critical to this effect. To better understand the mechanisms by which NK and myeloid cells cooperate to confer gal-1-deficient tumor rejection we have developed a comprehensive protocol for the isolation and analysis of glioma-infiltrating peripheral blood mononuclear cells (PBMC). The method is demonstrated here by comparing PBMC infiltration into the tumor microenvironment of gal-1-expressing GL26 gliomas with those rendered gal-1-deficient via shRNA knockdown. The protocol begins with a description of&#160;how to culture and prepare GL26 cells for inoculation into the syngeneic C57BL/6J mouse brain. It then explains the steps involved in the isolation and flow cytometric analysis of glioma-infiltrating PBMCs from the early brain tumor microenvironment. The method is adaptable to a number of in vivo experimental designs in which temporal data on immune infiltration into the brain is required. The method is sensitive and highly reproducible, as glioma-infiltrating PBMCs can be isolated from intracranial tumors as soon as 24 hr post-tumor engraftment with similar cell counts observed from time point matched tumors throughout independent experiments. A single experimentalist can perform the method from brain harvesting to flow cytometric analysis of glioma-infiltrating PBMCs in roughly 4-6 hr depending on the number of samples to be analyzed. Alternative glioma models and/or cell-specific detection antibodies may also be used at the experimentalists&#8217; discretion to assess the infiltration of several other immune cell types of interest without the need for alterations to the overall procedure.

Presented here is a straightforward method for the isolation and flow cytometric analysis of glioma-infiltrating peripheral blood mononuclear cells that yields time-dependent quantitative data on the number and activation status of immune cells entering the early brain tumor microenvironment.

Isolamento e Análise de Citometria de Fluxo infiltrantes Glioma Células Mononucleares do Sangue Periférico

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of monocytes induces effector functions and a concomitant shift from oxidative to glycolytic metabolism that is accompanied by increased glucose transporter expression. This increased glycolytic metabolism is also observed for trained immunity of monocytes, a form of innate immunological memory. Although in vitro protocols examining glucose transporter expression and glucose uptake by monocytes have been described, none have been examined by multi-parametric flow cytometry in whole blood. We describe a multi-parametric flow cytometric protocol for the measurement of fluorescent glucose analog 2-NBDG uptake in whole blood by total monocytes and the classical (CD14++CD16-), intermediate (CD14++CD16+) and non-classical (CD14+CD16++) monocyte subpopulations. This method can be used to examine glucose transporter expression and glucose uptake for total monocytes and monocyte subpopulations during homeostasis and inflammatory disease, and can be easily modified to examine glucose uptake for other leukocytes and leukocyte subpopulations within blood.

Monocytes are integral components of the human innate immune system that rely on glycolytic metabolism when activated. We describe a flow cytometry protocol to measure glucose transporter expression and glucose uptake by total monocytes and monocyte subpopulations in fresh whole blood.

A Fluxo Simples Citometria método para medir glicose Captação e expressão de transportadores de glicose para monócitos subpopulações em sangue total

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in diameter. In addition to a characterization of forward and sideward scatter properties, it enables the use of fluorescent labeled markers like antibodies to detect respective structures. Using indirect antibody staining, flow cytometry is employed here to quantify birch pollen allergen (precisely Bet v 1)-loaded particles of 0.5 to 10 &#181;m in diameter in inhalable particulate matter (PM10, particle size &#8804;10 &#181;m in diameter). PM10 particles may act as carriers of adsorbed allergens possibly transporting them to the lower respiratory tract, where they could trigger allergic reactions.
So far the allergen content of PM10 has been studied by means of enzyme linked immunosorbent assays (ELISAs) and scanning electron microscopy. ELISA measures the dissolved and not the particle-bound allergen. Compared to scanning electron microscopy, which can visualize allergen-loaded particles, flow cytometry may additionally quantify them. As allergen content of ambient air can deviate from birch pollen count, allergic symptoms might perhaps correlate better with allergen exposure than with pollen count. In conjunction with clinical data, the presented method offers the opportunity to test in future experiments whether allergic reactions to birch pollen antigens are associated with the Bet v 1 allergen content of PM10 particles &#62;0.5 &#181;m.

Here, we present a protocol to quantify allergen-loaded particles by flow cytometry. Ambient particulate matter particles may act as carriers of adsorbed allergens. We show here that flow cytometry, a method widely used to characterize suspended solids &#62;0.5 &#181;m in diameter, can be used to measure these allergen-loaded particles.

Citometria de fluxo de partículas ligadas aos Bet v 1 alérgeno no PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore essential for understanding pathogenicity of different pathogens including HIV. Gamma delta (GD) T cells are the prototype of &#39;unconventional&#39; T cells and represent a relatively small subset of T cells defined by their expression of heterodimeric T-cell receptors (TCRs) composed of gamma and delta chains. This sets them apart from the classical and much better known CD4+ helper T cells and CD8+ cytotoxic T cells that are defined by alpha-beta TCRs. GD T cells often show tissue-specific localization and are enriched in epithelium. GD T cells orchestrate immune responses in inflammation, tumor surveillance, infectious disease, and autoimmunity.
Here, we present a method to reproducibly isolate and analyze human endocervical intraepithelial GD T lymphocytes. We have used endocervical cytobrush samples from women participating in the Women&#39;s Interagency HIV Infection Study (WIHS). Knowledge about GD T cells interactions during conditions in which there is an insult to the vaginal mucosal could be applied to any clinical study in which mucosal vulnerability is addressed, including the development of vaginal microbicides.In addition, knowledge about mucosal GD T cell responses has potential for application of GD T cell-based immune therapy in treating infectious diseases.

We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.

Isolamento e Citometria de Fluxo Analysis of Human Endocervical Gama Cells Delta T

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can have pathological significance. An ideal method for examining alterations to monocytes is whole blood flow cytometry as the minimal handling of samples by this method limits artifactual cell activation. However, many different approaches are taken to gate the monocyte subsets leading to inconsistent identification of the subsets between studies. Here we demonstrate a method using whole blood flow cytometry to identify and characterize human monocyte subsets (classical, intermediate, and non-classical). We outline how to prepare the blood samples for flow cytometry, gate the subsets (ensure contaminating cells have been removed), and determine monocyte subset expression of surface markers &#8212; in this example M1 and M2 markers. This protocol can be extended to other studies that require a standard gating method for assessing monocyte subset proportions and monocyte subset expression of other functional markers.

Here we present a protocol for characterizing monocyte subsets by whole blood flow cytometry. This includes outlining how to gate the subsets and assess their expression of surface markers and giving an example of the assessment of the expression of M1 (inflammatory) and M2 markers (anti-inflammatory).

Caracterização de subconjuntos de monócitos humanos por sangue total Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

Preparação de medula óssea inteira para análise de citometria de massa de células de linhagem de neutrófilos

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are cleared from the human lung alveoli by being phagocytosed by innate monocytes and/or neutrophils. This protocol offers a fast and reliable measurement of phagocytosis by flow cytometry using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled conidia for co-incubation with human leukocytes and subsequent counterstaining with an anti-FITC antibody to allow discrimination of internalized and cell-adherent conidia. Major advantages of this protocol are its rapidness, the possibility to combine the assay with cytometric analysis of other cell markers of interest, the simultaneous analysis of monocytes and neutrophils from a single sample and its applicability to other cell wall-bearing fungi or bacteria. Determination of percentages of phagocytosing leukocytes provides a means to microbiologists for evaluating virulence of a pathogen or for comparing pathogen wildtypes and mutants as well as to immunologists for investigating human leukocyte capabilities to combat pathogens.

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

This protocol provides a fast and reliable method to quantitatively measure phagocytosis of Aspergillus fumigatus conidia by human primary phagocytes using flow cytometry and to discriminate phagocytosis of conidia from mere adhesion to leukocytes.

Medição de phagocitose de Aspergillus fumigatus Conidia por Leukocytes Humanos usando citometria flow

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...