Name: flow cytometric analysis of natural killer cell lytic activity in human whole blood
Uploaded: 2017-03-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood at JoVE.com

This project was supported by Agriculture and Food Research Initiative Competitive Grant no. 2100-68003-30395 from the USDA National Institute of Food and Agriculture.

NOTA: Todos os procedimentos de recolha de sangue foram conduzidos de acordo com as diretrizes estabelecidas pela Appalachian State University (ASU) Institutional Review Board (IRB). 1. Recolha de Sangue Total <ol><li> Tenha um phlebotomist certificada tirar sangue de acordo com as diretrizes da Organização Mundial de Saúde. </li><li> Tirar sangue em um 4 ml tubo de colheita de sangue contendo ácido Di-Potássio etilenodiaminotetracético (EDTA K 2). Inverta tubo de recolha de sangue de acordo com as instruções do fabricante. Mantenha tubo de coleta de sangue à temperatura ambiente num agitador de bancada até à separação. </li></ol> 2. Preparação de células alvo marcadas com DiO <ol><li> Crescer as células K562 em completa de Iscove Modified Meios de Dulbecco (IMDM) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e 1% de penicilina estreptomicina durante várias semanas, antes do ensaio para assegurar a saúde das células. Ajuste o concentratde iões das células a 3 x 10 5 células / mL diariamente através da realização de uma contagem de células e subsequente passagem de células. Executar uma mudança de meio completo a cada 2 a 3 dias. </li><li> No dia do ensaio, executar uma contagem de células utilizando uma mistura 1: 1 hemocitómetro. <ol><li> Retirar 10 mL do frasco K562 e coloque em 1,5 mL tubo. </li><li> Adicionar 10 ul de corante azul de tripano para o mesmo tubo de 1,5 ml para um factor de diluição de 1: 1. </li><li> Agite suavemente o tubo para misturar K562 células e tripan corante azul. </li><li> Permitir K562 corante azul de tripano de células-se a incubar durante 1 minuto à temperatura ambiente. </li><li> Remover 15 mL de células K562 coradas de tubo. </li><li> Pipeta hemocitómetro para contagem de células. </li><li> Contagem de células nas quatro esquinas, bem como o quadrado do meio para um total de cinco quadrados. </li><li> Calcular a contagem de células utilizando a equação: Total de células / ml = Total de células contadas X (fator de diluição / Número de quadrados) X 10.000 / mL </li></ol></li&gt; <li> Ressuspender as células alvo K562 a uma densidade final de 1 x 10 6 culas / ml em meio de cultura IMDM isento de soro. </li><li> Para células alvo K562 não coradas, adicionar 10 ml de células alvo K562 para um tubo de 15 ml a uma densidade de 1 x 10 6 células / ml para um total de 10 x 10 6 células K562. Colocar em uma incubadora a 37 ° C com 5% de CO 2 até que esteja pronto para uso. </li><li> Para células alvo K562 DiO manchado, adicionam-se 10 ml de células K562 alvo para um tubo de 15 ml a uma densidade de 1 x 10 6 células / ml para um total de 10 x 10 6 células K562. <ol><li> Adicionar 1 mL de solução-DiO rotulagem de células por ml de suspensão de células em 15 ml de tubo designada por coloração DiO e suavemente vórtice. Por exemplo, adicionar 10 ul de solução de marcação celular DiO a 10 x 10 6 K562 células / ml num volume de 1 x 10 6 células / ml. </li><li> Incubar solução K562-DiO durante 20 min a 37 ° C com 5% de CO 2 em um tubo de 15 ml. </li></ol></li><li> Segueing de incubação, adicionar 3 ml de solução salina à temperatura ambiente fosfato tamponada (PBS) a uma solução K562-DiO contendo 15 ml de tubo. </li><li> Centrifugar durante 10 minutos a 135 xg à temperatura ambiente. </li><li> Cuidadosamente remover o sobrenadante sem perturbar o pelete de células com uma pipeta de volume ajustável 1000 ul. </li><li> Adicionar 10 ml de IMDM fresco para pellet contendo células 15 mL tubo. </li><li> Suavemente o tubo de vórtice para ressuspender as células. </li><li> Repita os passos 2.7 a 2.10 por mais duas vezes. </li><li> Células de loja em um 37 ° C incubadora com 5% de CO 2 até que esteja pronto para uso. NOTA: As células podem ser armazenadas no incubador durante até 24 horas, mas é preferível usá-los no mesmo dia. </li></ol> 3. Preparação de Controles <ol><li> Transferir o seguinte em separados e devidamente rotulados tubos de 1,5 ml: <ol><li> Adicionar 500 mL de IMDM fresco contendo ressuspenso DIO-rotulados K562 células para o &quot;Double positiva&quot; rotuladas 1,5 tubo mL. </li><li> Adicionar 500 mL de IMDM fresco contendo novamente suspensas células K562 DIO-etiquetados para a &quot;única dio&quot; rotulados 1,5 tubo mL. </li><li> Adicionar 500 mL de IMDM fresco contendo células K562 não marcadas ressuspendidas em a &quot;iodeto de propídio (PI), apenas&quot; marcado tubo 1,5 mL. </li></ol></li><li> Coloque a ponta positiva Duplo e PI apenas tubos em um 55 ° C banho de água durante 5 minutos. </li><li> Após a 5 min tiver decorrido, remover os tubos e limpe com 70% de etanol. </li><li> Adicionar 10 L de PI ao Duplo positiva e PI apenas 1,5 tubos mL. </li><li> Coloque todos os três controlos de células alvo K562 na incubadora a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Após os 30 min de incubação tiver decorrido, centrifugar os três controlos de células alvo K562 durante 2 minutos a 163 x g. </li><li> Cuidadosamente remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento celular. </li><li> Ressuspender cada controlo com 20 mL de meio fresco cultura de células IMDM, e deixar na incubadora a 37 ° C com 5% de CO 2 durante pelo menos30 min para o sinal DiO óptima. NOTA: Os controles são agora pronto para ser executado através do fluxo de imagem citômetro. </li></ol> 4. NK celular separação automatizada <ol><li> Ligue separador de células e permitir que o ciclo de start-up para terminar. </li><li> Certifique-se de que todas as garrafas iluminações de fluidos são verdes e que o frasco de resíduos está vazio. </li><li> Obter uma temperatura de 15 mL suporte de tubos quarto. NOTA: A seleção é baseado em volumes de amostra. Por exemplo, para um volume de menos do que 3 ml de utilizar um suporte de tubos de 15 ml e para um volume de mais de 3 mL usar um suporte para tubos de 50 mL. </li><li> tubos de amostra de etiqueta em conformidade (Repita por amostra / participante): Participante 1 Whole Amostra de Sangue; Participante 1 fracção negativa; Participante 1 fracção positiva. </li><li> Gentilmente pipeta 1,5 ml de sangue total a partir do Passo 1.2 em &quot;Whole Amostra de Sangue&quot; tubo de 15 mL. </li><li> Coloque 15 ml tubo adequadamente rotulado como &quot;Whole Amostra de Sangue&quot; do Passo 4.5 e rotulado 15 mL &quot;fracção negativa&quot; e&quot;fracção positiva&quot; tubos de Passo 4.4 no suporte de tubos. Utilize suporte de amostras thefollowing set-up: Fileira (R1) A: Whole Amostra de Sangue, Row (R2) B: fração magneticamente marcados positiva,: Negativo, fração não marcado, Row (R4) C. </li><li> Insira o rack separador para o MiniSampler para autolabeling. </li><li> Seleccionar &quot;Reagente&quot; no menu e realçar a posição em que o frasco vai ser colocado na prateleira de separação. </li><li> Selecione &quot;Ler Reagente&quot; para activar o leitor de código 2D. </li><li> Colocar o frasco do reagente apropriado em frente do leitor de código de 2D entre 0,5-2,5 cm da tampa do leitor de código. NOTA: Por exemplo, o reagente necessário para a separação de células NK é CD56. </li><li> Segure frasco de reagente em um ângulo na frente do leitor de código 2D para leitura ideal. </li><li> Colocar o frasco de reagente para a posição adequada cremalheira separador. </li><li> Destacar as posições desejadas na aba Separação na tela. </li><li> No submenu Labeling, atribuir um auprograma tolabeling. </li><li> Atribuir a célula de separação MicroBeads Reagente CD56 para acumular posições 1, 2, 3 e 4. </li><li> Selecione o programa de separação &quot;posselwb&quot;. </li><li> Selecione a opção &quot;lavar&quot; programa de lavagem. </li><li> Inserir um volume de amostra de 1.500 mL no submenu &quot;Volume&quot; usando o teclado numérico. </li><li> Selecione a opção &quot;Enter&quot; no teclado. </li><li> Selecione &quot;Executar&quot; para iniciar a separação de células. </li><li> Selecione &quot;OK&quot; para confirmar que tampão suficiente disponível para o processamento de todas as amostras. </li></ol> 5. Contagem de Células NK Separação Após celular <ol><li> Imediatamente após a separação de células com o separador de células, recuperar a fração positiva. Deixe em temperatura ambiente. Esta fracção contém a população de células NK puro desejado. </li><li> Para cada amostra individual, executar uma contagem de células utilizando um hemocitómetro, como por Etapa 2.2. <ol><li> Após os cálculos, registre a contagem de células. </li&gt; </ol></li></ol> 6. Ensaio de Citotoxicidade Preparação da Amostra <ol><li> Preparar e rotular tubos de 1,5 ml para cada amostra / participante em conformidade. </li><li> Pipeta desejada proporção de células NK e células K562 DIO-rotulados para cada tubo. NOTA: Por exemplo, a proporção desejada de células alvo K562 e células efectoras NK é de 1: 5. </li><li> Centrifugar durante 5 minutos a 135 x g. </li><li> Cuidadosamente remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento celular. </li><li> Ressuspender NK-DiO marcado mistura de células K562 em 500? L de meio celular NK sem interleucina-2 (IL-2) e 2-mercaptoetanol (2-ME) (incompleta meios de cultura de células NK). NOTA: O meio de cultura de células NK é incompleta Meio Essencial Mínimo de Eagle com bicarbonato de sódio, sem L-glutamina, ribonucleósidos e desoxiribonucleósidos. </li><li> Adicionar 5 mL de PI a cada tubo. </li><li> Centrifugar durante 2 minutos a 163 x g. </li><li> Incubar as células a 37 ° C durante 2 h. </li><li> Após 2 h de incubação, centrifuGE durante 2 minutos a 163 x g. </li><li> Cuidadosamente remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento celular. </li><li> Ressuspender as células em 25 ul incompleta meios de cultura celular NK. </li></ol> 7. Preparação de espontânea ( &quot;S&quot;) Amostra <ol><li> Pipetar 500 ul de células K562 DIO-marcados (concentração de 1 x 10 6 células / ml) no tubo de 1,5 mL. </li><li> Adicionar 10 ul de PI de cada um dos tubos. </li><li> tubo de centrifugação durante 2 minutos a 163 x g. </li><li> Incubar as células a 37 ° C durante 2 h. </li><li> Após 2 h de incubação, centrifuga-se durante 2 min a 163 x g. </li><li> Cuidadosamente remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento celular. </li><li> Ressuspender as células em 25 ul incompleta Meio Essencial (MEM-α) Meios de cultura de células alfa-mínimos. </li></ol> 8. Aquisição de Dados com imagens de fluxo Citómetro <ol><li> Pressione o botão verde no interior da porta da frente da imagem de citometria de fluxo para ligar o instrumento. </li><li> Ligue all computadores associados com a imagiologia de fluxo FACSCalibur. </li><li> Inicie o fluxo de imagem citômetro software. </li><li> Clique no botão &quot;Iniciar&quot; para limpar o sistema e preparar a linha de amostra. </li><li> Uma vez que o &quot;Startup&quot; estiver concluída, feche a janela &quot;calibrações&quot;. </li><li> Atribuir canais: no lado superior esquerdo, clique em cada canal, a fim de atribuir-lhes. </li><li> No lado direito, clique no botão gráfico de dispersão para criar 4 scatterplots: Raw Max Pixel _MC_6 vs Area_M06, Raw Max Pixel _MC_2 vs Area_M02, Raw Max Pixel _MC_5 vs Area_M05 e FieldArea_M01 vs AspectRatio_M01. </li><li> Comece analisando amostras usando primeiro o controle &quot;Double positiva&quot;. <ol><li> Clique em &quot;Load&quot;. </li><li> Coloque o tubo de 1,5 ml com a amostra &quot;Double positiva&quot; de Passos 3,4 para 3,9 no carregador de amostra. </li><li> Selecione o objetivo 40X sob a guia &quot;Ampliação&quot;. </li><li> Ligue a 405 mW e642 lasers MW. </li><li> Ligue o canal &quot;Brightfield&quot;. </li><li> Clique em &quot;Selecionar intensidade.&quot; </li><li> Com base na amostra de controlo &quot;Duplo positiva&quot;, determinar a intensidade desejada para o laser de 405 mW de modo que o detector não está sobrecarregado. Nota: Por exemplo, a intensidade ideal para este experimento foi fixado em 11 mW. </li></ol></li><li> Após a desejada set-up é conseguido, adquirir dados. <ol><li> Sob a guia &quot;Aquisição Arquivo&quot;, digite em um texto nome personalizado. Selecione uma pasta para salvar o arquivo (s) de dados. </li><li> Digite o número de células de adquirir ao lado de &quot;Collect&quot;. Tipicamente, este número varia entre 1.000 a 10.000. </li><li> Clique em &quot;Adquirir&quot;. NOTA: Uma vez que o número desejado de células é adquirido, o arquivo de dados é salvo automaticamente na pasta selecionada anteriormente. </li></ol></li><li> Após a aquisição for concluída, carregar a amostra de controlo seguinte - DiO único controle. </strong&gt; <ol><li> Clique em &quot;Load&quot;. </li><li> Coloque o tubo de 1,5 mL com o &quot;único dio&quot; amostra para o carregador de amostra. </li><li> Deixar o objetivo 40X sob a guia &quot;Ampliação&quot; selecionado. </li><li> Deixar o laser 405 mW ligado. </li><li> Desligue a mW laser de 642 e o canal &quot;Brightfield&quot;. NOTA: Agora que a desejada configuração foi alcançado, os dados podem ser adquiridos. </li><li> Sob a guia &quot;Arquivo Aquisição&quot;, digite em um texto nome personalizado e escolha uma pasta para salvar o arquivo (s) de dados. Digite o número de células de adquirir ao lado de &quot;Collect.&quot;. Normalmente este número é de 1.000. </li><li> Clique em &quot;Adquirir&quot;. NOTA: Uma vez que o número desejado de células é adquirido o arquivo de dados é salvo automaticamente na pasta selecionada anteriormente. </li></ol></li><li> Repita o passo 8,10 para o &quot;único PI&quot; amostra de controlo. As amostras experimentais estão agora prontos para serem recolhidos. </li><li> Lidar com as remaining amostras experimentais, incluindo as &quot;amostras&quot; S &quot;espontânea&quot; da seguinte forma: <ol><li> Deixar o objetivo 40X sob a guia &quot;Ampliação&quot; selecionado. </li><li> Ligue a 405 mW e 642 lasers MW. </li><li> Ligue o canal &quot;Brightfield&quot;. </li><li> Clique em &quot;Intensidade Set.&quot; </li><li> Sob a guia &quot;Arquivo Aquisição&quot;, digite em um texto nome personalizado e escolha uma pasta para salvar o arquivo (s) de dados. Digite em um texto nome personalizado. </li><li> Digite o número de células de adquirir ao lado de &quot;Recolha&quot;. </li><li> Clique no botão &quot;Acquire&quot;. NOTA: Uma vez que o número desejado de células é adquirido o arquivo de dados é salvo automaticamente na pasta selecionada anteriormente. </li></ol></li><li> Repita o passo 8,12 para todas as amostras experimentais. </li><li> Depois de todos os dados experimentais e arquivos foram recolhidos, clique no botão &quot;Shutdown&quot; para esterilizar o sistema. </li></ol> 9. ImaginAnálise de amostras g Citómetro de fluxo <ol><li> Abra o fluxo de imagiologia citómetro de aplicação de software de análise. </li><li> Em &quot;Arquivo&quot;, abra um arquivo .RIF experimental. </li><li> Construir uma nova matriz usando os arquivos .RIF única cor (OID somente controlar e controle somente-PI, criado durante as etapas de 8.10 e 8.11), selecionando &quot;Criar um novo Matrix&quot; sob a guia de Compensação no fluxo de imagens citômetro software. NOTA: O software irá pedir para a seleção dos arquivos de uma só cor e fundi-los para criar um arquivo de matriz (extensão de arquivo .ctm), que está a ser selecionado para aplicar a compensação de canal. </li><li> Criar gráficos de pontos utilizando a função de &quot;blocos de construção&quot; do software. <ol><li> Criar um ponto-plot (BrightFieldGradient_RMS vs frequência) para a porta do células focalizados. Ligue para o portão &quot;Focus&quot; (Figura 1A). </li><li> Usando o portão &quot;Focus&quot;, criar um gráfico de pontos de Bright Área Campo vs Campo brilhante proporção para g<html> comeu as células singlet. Ligue para o portão &quot;Single&quot; (Figura 1B). </li><li> Usando o portão &quot;Single&quot;, criar um gráfico de pontos de Intensity_MC_Ch02 vs Intensity_MC_Ch5. Utilize este plano para identificar e células dupla positivos (metas, mortos) gate DIO-positiva apenas células (alvos, vivo) e PI-DiO (Figura 1C). NOTA: Todas as parcelas descrito nos passos 9.4.1, 9.4.2 e 9.4.3 podem ser criados usando a função de &quot;blocos de construção&quot; do software. </li></ol></li><li> Clique na função de estatísticas do gráfico de pontos para acessar os números de células de cada portão. </li><li> Calcula-se a percentagem de alvos na amostra mortas espontânea e amostras experimentais utilizando a seguinte fórmula: % alvos mortos na amostra = (alvos #dead x 100) / (# viver alvos + #dead alvos) </li><li> Calcular a citotoxicidade utilizando a seguinte fórmula: % Citotoxicidade = [(Experimental mortos mortos-espontânea) / (morto 100 espontânea)] x100 </li></ol>_content &quot;fo: manter-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54779/54779fig1.jpg" /> Figura 1: histogramas representativos, gráficos de dispersão e imagens para análise da atividade citotóxica. Análise (A) células foco. (B) Análise única célula. Análise (C) coloração das células alvo. Todas as determinações são feitas usando a imagem anexada para cada evento. Isso pode ser acessado no software de análise, basta clicar sobre o evento nos gráficos. (D) imagem representativa de um evento de gibão, mostrando uma célula NK apoptótica e um alvo K562 ao vivo. Ch01, Brightfield. CH02, a DIO. CH05, PI. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54779/54779fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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The authors have nothing to disclose.

O método descrito neste estudo mede directamente a actividade específica de células NK de um indivíduo em resposta a estímulos (neste caso particular, o exercício prolongado). Tipicamente, as células NK são isolados a partir de um do sangue utilizando um gradiente de densidade ou de triagem de células, usando uma combinação de marcadores. Embora estes métodos sejam largamente usadas, elas têm muitas desvantagens: eles são morosos, envolvem manipulações múltiplas, e dependem fortemente do usuário. Como ...

células assassinas naturais são um elemento essencial do sistema imune inato. Embora eles são muito regulado, eles têm a capacidade de reconhecer e eliminar células anormais através de contacto célula-a-célula e sem activação prévia 1. Como tal, eles formam uma linha rápida de defesa contra as infecções. O exercício, especialmente intensa, tem sido demonstrado para deprimir o sistema imunitário de forma transiente 2, 3, 4, 5. As células NK são particularmente propensos para este efeito 4, 6, 7, de forma eficaz criar uma janela de aumento da sensibilidade à doença. Assim, o estudo de intervenções antes, durante ou após o exercício intenso com o objetivo de reduzir o seu impacto sobre a função das células NK é de particular interesse para o bem-estar dos atletas pós-competições. 8, a cerca de 1% do compartimento de células brancas do sangue; 2) As células NK são muito sensíveis ao stress e dependem de exposição constante a condições fisiológicas para permanecer viável e estável no decurso da experimentação; e 3) ensaios padrão para determinar a citotoxicidade das células NK, como Ficoll gradientes 9 e solte ensaios de 10, não são confiáveis e inconsistente. A variabilidade inerente de amostras humanas único composto estas questões. amostras humanas frescas colhidas durante as intervenções são bastante regulamentado e difícil de obter, pelo menos, quando comparado com as amostras de animais ou linhas celulares imortalizadas. Isso reduz as oportunidades para repetir experiências ou adicionar participantes para o estudo de coorte para alcançar limiares estatísticos significativos. Coletivamente, estas questões apoiar a necessidade de um protocolo simplificado que permite foR tanto de alto rendimento e uma análise de alta fiabilidade da actividade lítica de células NK em amostras humanas. Nós estabelecemos um fluxo de trabalho que encurta o tempo necessário para identificar, isolar e células NK teste de sangue total humano, minimizando a exposição a factores externos. O método de optimizar o uso de dois instrumentos, um separador magnético à base de células e um fluxo de imagens citómetro, e, um T específica optimizado-ensaio: razão E para permitir a detecção das diminuições ou aumentos de citotoxicidade de células NK.

<table><tbody><tr><td>K-562 lymphoblasts</td><td>ATCC</td><td>CCL-243</td><td></td></tr><tr><td>Iscove&#039;s Modified Dulbecco&#039;s Media</td><td>ATCC</td><td>30-2005</td><td>High glucose, with L-Glutamine, with HEPES, Sterile-filtered</td></tr><tr><td>Alpha Minimum Essential medium</td><td>ATCC</td><td>CRL-2407</td><td>Without ribonucleosides and deoxyribonucleosides but with 2 mM L-glutamine and 1.5 g/L sodium bicarbonate</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution 0.4%</td><td>Amresco</td><td>K940-100ML</td><td>Tissue culture grade</td></tr><tr><td>Propridium Iodide Staining Solution</td><td>BD Pharmingen</td><td>51-66211E</td><td></td></tr><tr><td>Vybranto DiO cell-labeling solution</td><td>Vybranto</td><td>V-22886</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Pro Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-545</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Running Buffer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Washing Buffer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-987</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-021-101</td><td></td></tr><tr><td>Whole Blood CD56 MicroBeads, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-875</td><td></td></tr><tr><td>ImageStream X Mark II Imaging Flow Cytometer</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Speedbeads</td><td>Amnis Corporation</td><td>400030</td><td></td></tr><tr><td>0.4-0.7% Hypochlorite (Sterilizer)</td><td>VWR</td><td>JT9416-1</td><td></td></tr><tr><td>Coulter Clenz</td><td>Beckman Coulter</td><td>8546929</td><td></td></tr><tr><td>70% Isopropanol (Debubbler)</td><td>EMD Millipore</td><td>1.3704</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (Sheath fluid)</td><td>EMD Millipore</td><td>BSS-1006-B (1X)</td><td>No calcium or magnesium</td></tr><tr><td>INSPIRE Software</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>Version Mark II, September 2013</td></tr><tr><td>Ideas Application Software</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>Version 6.1, July 2014</td></tr></tbody></table>

flow cytometric analysis of natural killer cell lytic activity in human whole blood

a citotoxicidade das células NK é uma medida utilizada para determinar o efeito de uma intervenção externa sobre a função da célula NK. No entanto, a precisão e reprodutibilidade deste ensaio pode ser considerado instável, quer devido a erros do utilizador ou por causa da sensibilidade das células NK para manipulação experimental. Para eliminar estes problemas, um fluxo de trabalho que eles se reduz a um mínimo foi estabelecida e é apresentada aqui. Para ilustrar, obtivemos amostras de sangue, em vários momentos, desde corredores (n = 4), que foram submetidos a uma intensa sessão de exercício. Primeiro, as células NK são simultaneamente identificados e isolados através de marcação de CD56 e de triagem magnética baseada, directamente a partir de sangue inteiro e de tão pouco como um mililitro. As células NK são ordenados removido de quaisquer anticorpos de reagentes ou de nivelamento. Eles podem ser contados, a fim de estabelecer uma contagem de células NK precisa por mililitro de sangue. Em segundo lugar, as células NK (células efectoras ordenados ou E) pode ser misturado com 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine perclorato (DIO) marcaram células K562 (células alvo ou T) a um ensaio-óptima de 1: 5 razão T: E, e analisadas usando um imaging fluxo-citómetro que permite a visualização de cada evento e a eliminação de qualquer falsa positiva ou falsos negativos (como doublets ou células efetoras). Este fluxo de trabalho pode ser completada em cerca de 4 h, e permite a resultados muito estáveis ​​mesmo quando se trabalha com amostras humanas. Quando disponíveis, as equipes de pesquisa pode testar várias intervenções experimentais em seres humanos, e comparar as medidas em toda a vários pontos de tempo, sem comprometer a integridade dos dados.

Determinação do número de células NK O efeito de funcionamento pesado na contagem de células NK no sangue total foi medida, utilizando o protocolo de exercício descrito na Figura 2. Amostras de sangue foram colhidas antes do exercício, imediatamente após o exercício, 1,5 h após o exercício, e, finalmente, 24 e 48 h após a coleta de sangue inicial. A concentração de células NK por mililitro de sangue total foi medido para cada corredor (Figur...

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Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

Citometria de fluxo e assassinas naturais celular Lytic Actividade em sangue total humano

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

flow-cytometric-analysis-natural-killer-cell-lytic-activity-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.4K visualizações.  North Carolina A&T State University, North Carolina Research Campus. This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

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Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK cells to recognize and lyse HIV-1 infected cells because identifying any aberrancy in NK cell function against HIV-infected cells could potentially lead to therapies that would enhance their cytolytic activity. There is a need to use HIV-infected primary T-cell blasts as target cells rather then infected-T-cell lines in the cytotoxicity assays. T-cell lines, even without infection, are quite susceptible to NK cell lysis. Furthermore, it is necessary to use autologous primary cells to prevent major histocompatibility complex class I mismatches between the target and effector cell that will result in lysis. Early studies evaluating NK cell cytolytic responses to primary HIV-infected cells failed to show significant killing of the infected cells 1,2. However, using HIV-1 infected primary T-cells as target cells in NK cell functional assays has been difficult due the presence of contaminating uninfected cells 3. This inconsistent infected cell to uninfected cell ratio will result in variation in NK cell killing between samples that may not be due to variability in donor NK cell function. Thus, it would be beneficial to work with a purified infected cell population in order to standardize the effector to target cell ratios between experiments 3,4. Here we demonstrate the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected cells by taking advantage of HIV-1's ability to down-modulate CD4 on infected cells and the availability of commercial kits to remove dead or dying cells 3-6. The purified infected primary T-cell blasts can then be used as targets in either a degranulation or cytotoxic assay with purified NK cells as the effector population 5-7. Use of NK cells as effectors in a degranulation assay evaluates the ability of an NK cell to release the lytic contents of specialized lysosomes 8 called "cytolytic granules". By staining with a fluorochrome conjugated antibody against CD107a, a lysosomal membrane protein that becomes expressed on the NK cell surface when the cytolytic granules fuse to the plasma membrane, we can determine what percentage of NK cells degranulate in response to target cell recognition. Alternatively, NK cell lytic activity can be evaluated in a cytotoxic assay that allows for the determination of the percentage of target cells lysed by release of 51Cr from within the target cell in the presence of NK cells.

Cytotoxicity assays to measure natural killer cell lytic responses to HIV-infected cells is limited by the purity of the target cells. We demonstrate here the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected primary T-cell blasts by taking advantage of HIV-1 s ability to down-modulate CD4.

Preparação e Uso de HIV-1 infectados CD4 + T-Primária células como as células-alvo em Ensaios Natural Killer Celular citotóxicos

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Imunologia e Infecção

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells to kill CD4+ T cells loaded with their cognate peptide. Target CD4+ T cells are divided into two populations, labeled with two different concentrations of CFSE. One population is pulsed with the peptide of interest (CFSE-low) while the other remains un-pulsed (CFSE-high). Pulsed and un-pulsed CD4+ T cells are mixed at an equal ratio and incubated with an increasing number of purified CD8+ T cells. The specific killing of autologous target CD4+ T cells is analyzed by flow cytometry after coculture with CD8+ T cells containing the antigen-specific effector CD8+ T cells detected by peptide/MHCI tetramer staining. The specific lysis of target CD4+ T cells measured at different effector versus target ratios, allows for the calculation of lytic units, LU30/106 cells. This simple and straightforward assay allows for the accurate measurement of the intrinsic capacity of CD8+ T cells to kill target CD4+ T cells.

This protocol describes a sensitive, cell-based cytotoxicity assay. By enumerating the decrease in frequency of live target CD4+ T cells in the presence of an increasing number of effector CD8+ T cells, this assay allows for the direct assessment of cytolytic activity of antigen-specific CD8+ T cells.

Baseada em células de Citometria de Fluxo Ensaio medir citotóxicos Atividade

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and virus-infected or malignantly transformed cells due to a set of germline encoded inhibitory and activating receptors. Upon virus or tumor cell recognition a variety of different NK cell functions are initiated including cytotoxicity against the target cell as well as cytokine and chemokine production leading to the activation of other immune cells. It has been demonstrated that accurate NK cell functions are crucial for the treatment outcome of different virus infections and malignant diseases. Here a simple and reliable method is described to analyze different NK cell functions using a flow cytometry-based assay. NK cell functions can be evaluated not only for the whole NK cell population, but also for different NK cell subsets. This technique enables scientists to easily study NK cell functions in healthy donors or patients in order to reveal their impact on different malignancies and to further discover new therapeutic strategies.

A simple and reliable method is described here to analyze a set of NK cell functions such as degranulation, cytokine and chemokine production within different NK cell subsets.

Ensaio de citometria de fluxo baseada para a monitorização das funções das células NK

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, specifically eliminating tumoral and virally infected cells. Approximately 30 known monogenic defects, together with a host of other pathological conditions, cause either functional or classic NK cell deficiency, manifesting in reduced or absent cytotoxic activity. Historically, cytotoxicity has been investigated with radioactive methods, which are cumbersome, expensive and potentially hazardous. This article describes a streamlined, clinically applicable flow cytometry-based method to quantify NK cell cytotoxic activity. In this assay, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or purified NK cell preparations are co-incubated at different ratios with a target tumor cell line known to be sensitive to NK cell-mediated cytotoxicity (NKCC). The target cells are pre-labeled with a fluorescent dye to allow their discrimination from the effector cells (NK cells). After the incubation period, killed target cells are identified by a nucleic acid stain, which specifically permeates dead cells. This method is amenable to both diagnostic and research applications and, thanks to the multi-parameter capabilities of flow cytometry, has the added advantage of potentially enabling a deeper analysis of NK cell phenotype and function.

A flow cytometry-based method to quantitatively determine the cytotoxic activity of human natural killer cells is shown here.

Um ensaio de citotoxicidade baseados em citometria de fluxo para a avaliação da atividade das células NK humana

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

Assessment of Human Natural Killer Cell Events Driven by Fc&#947;RIIIa Engagement in the Presence of Therapeutic Antibodies

One mechanism of action for clinical efficacy by therapeutic antibodies is the promotion of immune-related functions, such as cytokine secretion and cytotoxicity, driven by Fc&#947;RIIIa (CD16) expressed on natural killer (NK) cells. These observations have led to research focusing on methods to increase Fc receptor-mediated events, which include removal of a fucose moiety found on the Fc portion of the antibody. Further studies have elucidated the mechanistic changes in signaling, cellular processes, and cytotoxic characteristics that increase ADCC activity with afucosylated antibodies. Additionally, other studies have shown the potential benefits of these antibodies in combination with small molecule inhibitors. These experiments demonstrated the molecular and cellular mechanisms underlying the benefits of using afucosylated antibodies in combination settings. Many of these observations were based on an artificial in vitro activation assay in which the Fc&#947;RIIIa on human NK cells was activated by therapeutic antibodies. This assay provided the flexibility to study downstream effector NK cell functions, such as cytokine production and degranulation. In addition, this assay has been used to interrogate signaling pathways and identify molecules that can be modulated or used as biomarkers. Finally, other therapeutic molecules (i.e., small molecule inhibitors) have been added to the system to provide insights into the combination of these therapeutics with therapeutic antibodies, which is essential in the current clinical space. This manuscript aims to provide a technical foundation for performing this artificial human NK cell activation assay. The protocol demonstrates key steps for cell activation as well as potential downstream applications that range from functional readouts to more mechanistic observations.

A protocol for studying Fc&#947;RIIIa-driven events by therapeutic antibodies in human natural killer cells is described here. This artificial stimulation platform permits the interrogation of downstream effector functions such as degranulation, chemokine/cytokine production, and signaling pathways mediated by the Fc&#947;RIIIa and Fc portions of antibodies involved in binding.

Avaliação de Eventos celulares assassinos naturais humanos impulsionados pelo engajamento da FcγRIIIa na presença de anticorpos terapêuticos

One mechanism of action for clinical efficacy by therapeutic antibodies is the promotion of immune-related functions, such as cytokine secretion and ...

Analysis of Human Natural Killer Cell Metabolism

Natural Killer (NK) cells mediate mainly innate anti-tumor and anti-viral immune responses and respond to a variety of cytokines and other stimuli to promote survival, cellular proliferation, production of cytokines such as interferon gamma (IFN&#947;) and/or cytotoxicity programs. NK cell activation by cytokine stimulation requires a substantial remodeling of metabolic pathways to support their bioenergetic and biosynthetic requirements. There is a large body of evidence that suggests that impaired NK cell metabolism is associated with a number of chronic diseases including obesity and cancer, which highlights the clinical importance of the availability of a method to determine NK cell metabolism. Here we describe the use of an extracellular flux analyzer, a platform that allows real-time measurements of glycolysis and mitochondrial oxygen consumption, as a tool to monitor changes in the energy metabolism of human NK cells. The method described here also allows for the monitoring of metabolic changes after stimulation of NK cells with cytokines such as IL-15, a system that is currently being investigated in a wide range of clinical trials.

In this paper, we describe a method to measure glycolysis and mitochondrial respiration in primary human Natural Killer (NK) cells isolated from peripheral blood, at rest or following IL15-induced activation. The protocol described could be easily extended to primary human NK cells activated by other cytokines or soluble stimuli.

Análise do Metabolismo celular assassino natural humano

Natural Killer (NK) cells mediate mainly innate anti-tumor and anti-viral immune responses and respond to a variety of cytokines and other stimuli to ...

Profiling of the Human Natural Killer Cell Receptor-Ligand Repertoire

Natural killer (NK) cells are among the first responders to viral infections. The ability of NK cells to rapidly recognize and kill virally infected cells is regulated by their expression of germline-encoded inhibitory and activating receptors. The engagement of these receptors by their cognate ligands on target cells determines whether the intercellular interaction will result in NK cell killing. This protocol details the design and optimization of two complementary mass cytometry (CyTOF) panels. One panel was designed to phenotype NK cells based on receptor expression. The other panel was designed to interrogate expression of known ligands for NK cell receptors on several immune cell subsets. Together, these two panels allow for the profiling of the human NK cell receptor-ligand repertoire. Furthermore, this protocol also details the process by which we stain samples for CyTOF. This process has been optimized for improved reproducibility and standardization. An advantage of CyTOF is its ability to measure over 40 markers in each panel, with minimal signal overlap, allowing researchers to capture the breadth of the NK cell receptor-ligand repertoire. Palladium barcoding also reduces inter-sample variation, as well as consumption of reagents, making it easier to stain samples with each panel in parallel. Limitations of this protocol include the relatively low throughput of CyTOF and the inability to recover cells after analysis. These panels were designed for the analysis of clinical samples from patients suffering from acute and chronic viral infections, including dengue virus, human immunodeficiency virus (HIV), and influenza. However, they can be utilized in any setting to investigate the human NK cell receptor-ligand repertoire. Importantly, these methods can be applied broadly to the design and execution of future CyTOF panels.

Here we design two complementary mass cytometry (CyTOF) panels and optimize a CyTOF staining protocol with the aim of profiling the natural killer cell receptor and ligand repertoire in the setting of viral infections.

Natural killer (NK) cells are among the first responders to viral infections. The ability of NK cells to rapidly recognize and kill virally infected cells ...

Measurement of Natural Killer Cell-Mediated Cytotoxicity and Migration in the Context of Hepatic Tumor Cells

Natural killer (NK) cells are a subset of the cytotoxic lymphocyte population of the innate immune system and participate as a first line of defense by clearing pathogen-infected, malignant, and stressed cells. The ability of NK cells to eradicate cancer cells makes them an important tool in the fight against cancer. Several new immune-based therapies are under investigation for cancer treatment which rely either on enhancing NK cell activity or increasing the sensitivity of cancer cells to NK cell-mediated eradication. However, to effectively develop these therapeutic approaches, cost-effective in vitro assays to monitor NK cell-mediated cytotoxicity and migration are also needed. Here, we present two in vitro protocols that can reliably and reproducibly monitor the effect of NK-cell cytotoxicity on cancer cells (or other target cells). These protocols are non-radioactivity-based, simple to set up, and can be scaled up for high-throughput screening. We also present a flow cytometry-based protocol to quantitatively monitor NK cell migration, which can also be scaled up for high-throughput screening. Collectively, these three protocols can be used to monitor key aspects of NK cell activity that are necessary for the cells&#39; ability to eradicate dysfunctional target cells.

Evasion of natural killer (NK) cell-mediated eradication by cancer cells is important for cancer initiation and progression. Here, we present two non-radioactivity-based protocols to evaluate NK cell-mediated cytotoxicity toward hepatic tumor cells. Additionally, a third protocol is presented to analyze NK cell migration.

Medição da Citotoxicidade e Migração Mediadas por Células Assassinas Naturais no Contexto das Células Tumorais Hepáticas

Natural killer (NK) cells are a subset of the cytotoxic lymphocyte population of the innate immune system and participate as a first line of defense by ...

Medicina

Natural Killer Cell-Mediated Cytotoxicity Assay Sample Preparation for Flow Cytometric Analysis

Source: McBride, J. E., et al. <a href="https://app.jove.com/v/54779">Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates the lytic activity of natural killer cells against fluorescently-stained target cells. The method enables NK cell-induced cytotoxicity measurement by staining dead cells and using a flow cytometer to quantify live and dead target cells.

Preparação de amostra de ensaio de citotoxicidade mediada por células natural killer para análise de citometria de fluxo

1.&#160;Preparation of Controls

	Transfer the following into separate and appropriately labeled 1.5 ml tubes:
	
		Add 500 &#181;L of fresh IMDM ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Imunologia

Imunodiagnóstico

Cellular Immunodiagnostics

An In Vitro Assay for Evaluating Natural Killer Cell Cytotoxicity against Cancer Cells

Source: Baik, C. H., et al. <a href="https://app.jove.com/v/58961">A Plate-based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Rat Placental Natural Killer Cell Cytolytic Function.</a> J. Vis. Exp. (2019)
This video demonstrates performing a lactate dehydrogenase release assay to determine the cytotoxicity of natural killer (NK) cells against the target cancer cells. The assay quantifies the release of the cytoplasmic lactate dehydrogenase enzyme from cancer cells by measuring the absorbance of the red-colored product formed.

Um ensaio in vitro para avaliar a citotoxicidade de células assassinas naturais contra células cancerígenas

1. Cytotoxicity Assay: Assay Protocol

	Use a round bottom, culture treated 96-well plate to set up the plate as suggested in Table 1. This table shows ...