This project was supported by Agriculture and Food Research Initiative Competitive Grant no. 2100-68003-30395 from the USDA National Institute of Food and Agriculture.

HINWEIS: Alle Blutsammelverfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien durchgeführt von der Appalachian State University (ASU) Institutional Review Board (IRB) dargelegt. 1. Vollblut-Sammlung <ol><li> Haben Sie einen zertifizierten phlebotomist ziehen Blut nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation Richtlinien. </li><li> Zeichnen Sie Blut in ein 4 ml Blutentnahmeröhrchen , das Di-Kalium Ethylendiamintetraessigsäure (K 2 EDTA). Invert-Blutsammelröhrchen nach den Anweisungen des Herstellers. Halten Sie Blutentnahmeröhrchen bei Raumtemperatur auf einem Benchtop-Rocker bis zur Trennung. </li></ol> 2. Vorbereitung der OVI-markierten Zielzellen <ol><li> Wachsen K562-Zellen in Komplett Iscove modifiziertem Dulbecco-Medium (IMDM), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin mehrere Wochen lang vor dem Assay auf die Gesundheit der Zellen zu gewährleisten. Stellen Sie die KonzentratIonen der Zellen bis 3 x 10 5 Zellen / mL der Fertigstellung einer Zelle täglich durch Zählen und anschließende Passage von Zellen. Führen Sie eine vollständige Medienwechsel alle 2 bis 3 Tage. </li><li> Am Tag des Tests, führen Sie eine 1 ein Zellenzahl: 1 - Hämozytometer. <ol><li> Entfernen 10 &amp; mgr; l aus dem K562 Kolben aufnehmen und in 1,5 ml-Röhrchen. </li><li> Zugabe von 10 ul Trypanblau-Farbstoff in der gleichen 1,5-ml-Röhrchen für einen Verdünnungsfaktor von 1: 1. </li><li> Sanft flick Rohr K562-Zellen und Trypanblaufarbstoff zu mischen. </li><li> Erlauben K562 Zellen Trypanblau für 1 min bei Raumtemperatur inkubieren. </li><li> Entfernen 15 &amp; mgr; l von gefärbten K562-Zellen aus dem Rohr. </li><li> Pipette auf Hemocytometer für Zellzahl. </li><li> Zählen von Zellen in den vier Eckquadrate sowie den mittleren Platz für insgesamt fünf Plätzen. </li><li> Berechnen Zellzahl unter Verwendung der Gleichung: Insgesamt Zellen / ml = Gesamt Zellen gezählt X (Verdünnungsfaktor / Anzahl der Quadrate) X 10000 / mL </li></ol></li&gt; <li> Resuspendieren K562 - Zielzellen zu einer endgültigen Dichte von 1 x 10 6 Zellen / ml in serumfreiem IMDM - Kulturmedium. </li><li> Für ungefärbte K562 - Zielzellen, 10 ml von K562 - Zielzellen zu einem 15 ml - Röhrchen in einer Dichte von 1 x 10 6 Zellen / ml für insgesamt 10 x 10 6 K562 - Zellen. In eine 37 ° C - Inkubator mit 5% CO 2 bis zur Verwendung. </li><li> Dio gefärbten K562 - Zielzellen, mit 10 ml K562 - Zellen zu einem 15 ml - Röhrchen mit einer Dichte von 1 x 10 6 Zellen / ml für insgesamt 10 x 10 6 K562 - Zellen abzielt. <ol><li> 1 &amp; mgr; l der OVI Zellmarkierungslösung pro ml Zellsuspension in 15-ml-Röhrchen Dio-Färbung bezeichnet und sanft Wirbel. Beispielsweise 10 &amp; mgr; l Lösung DiO Zellmarkierungs bis 10 x 10 6 K562 Zellen / ml in einem Volumen von 1 x 10 6 Zellen / ml hinzu. </li><li> Inkubieren K562-DIO - Lösung für 20 min bei 37 ° C mit 5% CO 2 in einem 15 ml Röhrchen. </li></ol></li><li> Folgening Inkubation 3 ml Raumtemperatur phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) auf K562-DIO-Lösung 15 ml Röhrchen mit. </li><li> Zentrifuge für 10 min bei 135 xg bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig Überstand, ohne mit einem 1000 ul Volumen verstellbare Pipette das Zellpellet zu stören. </li><li> In 10 ml frischem IMDM zu Zellpellet enthaltenden 15 ml-Röhrchen. </li><li> Sanft Wirbelrohr um die Zellen zu resuspendieren. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2,7-2,10 zwei weitere Male. </li><li> Store - Zellen in einem 37 ° C - Inkubator mit 5% CO 2 bis zur Verwendung. HINWEIS: Die Zellen können bis zu 24 h im Brutschrank gelagert werden, aber es ist bevorzugt, sie am selben Tag zu verwenden. </li></ol> 3. Herstellung von Kontrollen <ol><li> Übertragen Sie die folgenden in getrennte und in geeigneter Weise 1,5 - ml - Röhrchen beschriftet: <ol><li> Add 500 ul frischem IMDM, enthaltend erneut suspendiert DiO-markierte K562-Zellen in den &quot;Double Positive&quot; bezeichnet 1,5 ml-Röhrchen. </li><li> In 500 ml frisches IMDM, enthaltend erneut suspendiert DiO-markierte K562-Zellen in den &quot;DiO nur&quot; etikettiert 1,5 ml-Röhrchen. </li><li> In 500 ul frischem IMDM enthält, erneut suspendiert unmarkierten K562-Zellen in den &quot;Propidiumiodid (PI) nur&quot; etikettiert 1,5 ml-Röhrchen. </li></ol></li><li> Der doppelte Positive und PI nur Röhrchen in einem 55 ° C Wasserbad für 5 min. </li><li> Nach dem 5 Minuten verstrichen ist, entfernen Sie Rohre und wischen Sie mit 70% Ethanol nach unten. </li><li> In 10 l PI an das Doppel Positive und PI nur 1,5 ml-Röhrchen. </li><li> Platzieren alle drei K562 Zielzelle steuert in dem Inkubator bei 37 ° C für 30 min. </li><li> Nach der 30 min Inkubation Ablauf Zentrifuge alle Steuerelemente Zielzelle K562 drei für 2 min bei 163 x g. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig Überstand ohne das Zellpellet zu stören. </li><li> Resuspendieren jede Steuerung mit 20 &amp; mgr; l frischem IMDM Zellkulturmedien, und lassen Sie in der 37 ° C - Inkubator mit 5% CO 2 für mindestens30 min für eine optimale DiO Signal. HINWEIS: Die Kontrollen sind nun bereit, cytometer durch die Abbildungsfluss ausgeführt werden. </li></ol> 4. NK-Zellen Automatisierte Trennung <ol><li> Schalten Sie Zellseparator und lassen Sie den Start-up-Zyklus zu beenden. </li><li> Stellen Sie sicher, dass alle Flüssigkeit Flaschen Illuminationen sind grün und dass die Abfallflasche ist leer. </li><li> Besorgen Sie sich eine Raumtemperatur 15 ml-Röhrchen-Rack. HINWEIS: Die Auswahl basiert auf Probenvolumina. Zum Beispiel für ein Volumen von weniger als 3 ml verwenden, um ein 15 ml Röhrchen Zahnstangen- und für ein Volumen von mehr als 3 mL verwenden, um eine 50 ml-Röhrchen Rack. </li><li> Label-Probenröhrchen entsprechend (Wiederholung pro Probe / Teilnehmer): Teilnehmer 1 Vollblut-Probe; Teilnehmer 1 Negativ-Fraktion; Teilnehmer 1 Positive Fraktion. </li><li> Pipette vorsichtig 1,5 ml Vollblut aus Schritt 1.2 in &quot;Vollblut-Probe&quot; 15 ml-Röhrchen. </li><li> Legen Sie entsprechend markierten 15 ml &quot;Vollblut-Probe&quot; Röhrchen aus Schritt 4.5 und markierte 15 ml &quot;Negative Fraktion&quot; und&quot;Positive Fraktion&quot; Rohre aus Schritt 4.4 in der Rohrgestell. Verwenden Sie thefollowing Probenrack Set-up: Reihe (R1) A: Vollblut-Probe, Reihe (R2) B: Negativ, unmarkierten Fraktion, Reihe (R4) C: Positiv, magnetisch markierten Fraktion. </li><li> Legen Sie die Separator-Rack auf den Minisampler für autolabeling. </li><li> Wählen Sie &quot;Reagenz&quot; auf dem Menü und markieren Sie die Position, wo das Fläschchen wird in dem Separator Rack platziert werden. </li><li> Wählen Sie &quot;Read-Reagenz&quot;, um den 2D-Code-Leser zu aktivieren. </li><li> Legen Sie das entsprechende Reagenzabfüllung vor dem 2D-Code-Leser zwischen 0,5-2,5 cm von dem Codeleser Abdeckung. HINWEIS: Zum Beispiel ist die erforderliche Reagenz für NK Zelltrennung CD56. </li><li> Halten Reagenzabfüllung in einem Winkel vor 2D-Code-Leser für die optimale Lese. </li><li> Legen Sie die Reagenzabfüllung in die richtige Trennzeichen Rackposition. </li><li> Markieren Sie die gewünschten Positionen unter der Trennung Registerkarte auf dem Bildschirm. </li><li> Aus dem Labeling Untermenü zuweisen ein Autolabeling Programm. </li><li> die Zellseparation Reagenz CD56 MicroBeads Weisen Positionen Rack 1, 2, 3 und 4. </li><li> Wählen Sie den &quot;posselwb&quot; Trennung Programm. </li><li> Wählen Sie den &quot;spülen&quot; Waschprogramm. </li><li> Legen Sie ein Probenvolumen von 1.500 &amp; mgr; l in der &quot;Lautstärke&quot; Untermenü mit der Zifferntastatur. </li><li> Wählen Sie die &quot;Enter&quot; auf der Tastatur. </li><li> Wählen Sie &quot;Ausführen&quot;, um die Zelltrennung starten. </li><li> Wählen Sie &quot;OK&quot;, um zu bestätigen, dass genügend Puffer für die Bearbeitung aller Proben zur Verfügung steht. </li></ol> 5. NK Cell Count Nach Zellseparation <ol><li> Unmittelbar im Anschluss an die Zelltrennung mit dem Zellseparator, rufen Sie die positive Fraktion. Lassen Sie bei Raumtemperatur. Diese Fraktion enthält die gewünschten reinen NK-Zell-Population. </li><li> Für jede einzelne Probe, führen Sie eine Zellzahl einer Zählkammer gemäß Schritt 2.2 verwendet wird . <ol><li> Nach Berechnungen, die Zellenzahl aufzuzeichnen. </li&gt; </ol></li></ol> 6. Zytotoxizitätstest Probenvorbereitung <ol><li> Bereiten Sie und beschriften entsprechend 1,5 ml Röhrchen für jede Probe / Teilnehmer. </li><li> Pipette gewünschte Verhältnis von NK-Zellen und DiO-labled K562-Zellen in jedes Röhrchen. HINWEIS: Zum Beispiel ist das gewünschte Verhältnis von K562-Zielzellen und Effektorzellen NK 1: 5. </li><li> Zentrifuge für 5 Minuten bei 135 x g. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig Überstand ohne das Zellpellet zu stören. </li><li> Resuspendieren NK-DiO markierten K562 Zellgemisch in 500 &amp; mgr; l von NK-Zell-Medium ohne Interleukin-2 (IL-2) und 2-Mercaptoethanol (2-ME) (incomplete NK Zellkulturmedien). HINWEIS: Die unvollständige NK Zellkulturmedien ist, Minimum Essential Medium Eagle mit Natriumbicarbonat, ohne L-Glutamin, Ribonukleosiden und Desoxyribonukleosiden. </li><li> Werden 5 ul PI zu jedem Röhrchen. </li><li> Zentrifuge für 2 min bei 163 x g. </li><li> Inkubiere Zellen bei 37 ° C für 2 h. </li><li> Nach 2 h Inkubation centrifuge für 2 min bei 163 x g. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig Überstand ohne das Zellpellet zu stören. </li><li> Resuspendiere Zellen in 25 ul unvollständiges NK Zellkulturmedien. </li></ol> 7. Herstellung von Spontaneous ( &quot;S&quot;) Probe <ol><li> Pipette 500 ul DiO-markierte K562 - Zellen (Konzentration von 1 x 10 6 Zellen / ml) in 1,5 ml - Röhrchen. </li><li> Zugabe von 10 &amp; mgr; l von PI zu jedem Röhrchen. </li><li> Zentrifugenröhrchen für 2 min bei 163 x g. </li><li> Inkubiere Zellen bei 37 ° C für 2 h. </li><li> Folgenden 2 h Inkubation Zentrifuge für 2 min bei 163 x g. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig Überstand ohne das Zellpellet zu stören. </li><li> Die Zellen in 25 ul unvollständig alpha-Minimum Essential Medium (α-MEM) Zellkulturmedien. </li></ol> 8. Datenerfassung mit Imaging Durchflusszytometer <ol><li> Drücken Sie die grüne Taste in der vorderen Tür des Abbildungs ​​Durchflusszytometer auf das Gerät einzuschalten. </li><li> Schalten Sie all Computer mit der Imaging-assoziierten Durchflusszytometer. </li><li> Starten Sie die Imaging-Durchflusszytometer Software. </li><li> Klicken Sie auf die &quot;Inbetriebnahme&quot;, um das System zu spülen und die Probenleitung vorzubereiten. </li><li> Sobald die &quot;Inbetriebnahme&quot; abgeschlossen ist, schließen Sie das &quot;Calibra&quot; Fenster. </li><li> Weisen Sie Kanäle: auf der oberen linken Seite, klicken Sie auf jedem Kanal, um sie zu vergeben. </li><li> Auf der rechten Seite klicken Sie auf den Streudiagramm-Taste 4 Scatterplots zu erstellen: Rohmaterial Max Pixel _MC_6 vs Area_M06, Rohmaterial Max Pixel _MC_2 vs Area_M02, Rohmaterial Max Pixel _MC_5 vs Area_M05 und FieldArea_M01 vs AspectRatio_M01. </li><li> Beginnen Analyse von Proben , indem zuerst die &quot;Double Positive&quot; Steuerung. <ol><li> Klicken Sie auf &quot;Laden&quot;. </li><li> Legen Sie die 1,5-ml-Röhrchen mit dem &quot;Double Positive&quot; Probe aus den Schritten von 3,4 bis 3,9 in den Probenlader. </li><li> Wählen Sie das 40X-Objektiv unter der &quot;Vergrößerung&quot; aus. </li><li> Schalten Sie die 405 mW und642 mW Laser. </li><li> Schalten Sie das &quot;Hellfeld&quot; Kanal. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Wählen Sie Intensität.&quot; </li><li> Basierend auf dem &quot;Double Positive&quot; Kontrollprobe, bestimmen die gewünschte Intensität für die 405 mW Laser so dass der Detektor nicht überlastet wird. Hinweis: Zum Beispiel wurde bei 11 mW die optimale Intensität für dieses Experiment eingestellt. </li></ol></li><li> Nachdem die gewünschte Set-up erreicht, Daten erfassen. <ol><li> Im Rahmen der &quot;Acquisition Datei&quot;, geben Sie in einem benutzerdefinierten Dateinamen Text. Wählen Sie einen Ordner zum Speichern der Datendatei (en). </li><li> Geben Sie die Anzahl der Zellen neben &quot;Collect&quot; zu erwerben. Typischerweise variiert diese Zahl zwischen 1.000 bis 10.000. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Acquire&quot;. HINWEIS: Wenn die gewünschte Anzahl von Zellen gewonnen wird, wird die Datendatei in dem zuvor ausgewählten Ordner automatisch gespeichert. </li></ol></li><li> Nach dem Erwerb abgeschlossen ist , legen Sie die nächste Kontrollprobe - DiO nur Kontrolle. </strong&gt; <ol><li> Klicken Sie auf &quot;Laden&quot;. </li><li> Legen Sie die 1,5-ml-Röhrchen mit dem &quot;DiO nur&quot; Probe in die Probenzuführung. </li><li> Lassen Sie das 40X-Objektiv unter der &quot;Vergrößerung&quot; Registerkarte ausgewählt. </li><li> Lassen Sie das 405-mW-Laser eingeschaltet. </li><li> Schalten Sie den 642-mW-Laser und das &quot;Hellfeld&quot; Kanal. HINWEIS: Nun, da die gewünschte Set-up erreicht wurde, können die Daten erfasst werden. </li><li> Unter dem &quot;File Acquisition&quot;, geben Sie in einem benutzerdefinierten Dateinamen Text und wählen Sie die Datendatei einen Ordner für das Speichern (s). Geben Sie die Anzahl der Zellen neben erwerben &quot;sammeln.&quot;. Typischerweise ist diese Zahl 1000. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Acquire&quot;. HINWEIS: Wenn die gewünschte Anzahl von Zellen, die Datendatei automatisch in dem zuvor ausgewählten Ordner gespeichert wird, erfasst wird. </li></ol></li><li> Wiederholen Sie Schritt 8,10 für die &quot;PI nur&quot; Kontrollprobe. Die experimentellen Proben sind nun bereit, gesammelt werden. </li><li> Behandeln Sie die remaining experimentellen Proben, einschließlich der &quot;Spontane&quot; S &quot;Samples&quot; wie folgt: <ol><li> Lassen Sie das 40X-Objektiv unter der &quot;Vergrößerung&quot; Registerkarte ausgewählt. </li><li> Schalten Sie die 405 mW und 642 mW Laser. </li><li> Schalten Sie die &quot;Hellfeld&quot; Kanal. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Set Intensität.&quot; </li><li> Unter dem &quot;File Acquisition&quot;, geben Sie in einem benutzerdefinierten Dateinamen Text und wählen Sie die Datendatei einen Ordner für das Speichern (s). Geben Sie in einem benutzerdefinierten Dateinamen Text. </li><li> Geben Sie die Anzahl der Zellen zu erwerben neben &quot;sammeln.&quot; </li><li> Klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;Erfassen&quot;. HINWEIS: Wenn die gewünschte Anzahl von Zellen, die Datendatei automatisch in dem zuvor ausgewählten Ordner gespeichert wird, erfasst wird. </li></ol></li><li> Wiederholen Sie Schritt 8.12 für alle experimentellen Proben. </li><li> Nachdem alle experimentellen Daten und Dateien gesammelt wurden, klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;Shutdown&quot; um das System zu sterilisieren. </li></ol> 9. Imaging Durchflusszytometer Probenanalyse <ol><li> Öffnen Sie die Imaging-Durchflusszytometer-Analyse-Software-Anwendung. </li><li> Unter &quot;Datei&quot;, öffnen Sie eine experimentelle .RIF Datei. </li><li> Erstellen Sie eine neue Matrix, die die einzelnen Farb .RIF Dateien mit (DIO-only steuern und PI-only-Steuerung, erstellt während der Schritte 8.10 und 8.11), indem Sie &quot;Erstellen einer neuen Matrix&quot; unter der Kompensation Registerkarte in der Abbildungs ​​Durchflusszytometer Software. HINWEIS: Die Software fordert für die Auswahl der einzelnen Farbdateien und kombiniere sie mit einer Matrix-Datei (.ctm Dateierweiterung) zu erstellen, dh ausgewählt werden Kanalkompensation anzuwenden. </li><li> Erstellen Sie Dot - Plots unter Verwendung der &quot;Bausteine&quot; Funktion der Software. <ol><li> Erstellen Sie ein Punkt-Plot (BrightFieldGradient_RMS vs Frequenz) die fokussierten Zellen Tor. Rufen Sie das Tor &quot;Focus&quot; (Abbildung 1A). </li><li> den &quot;Focus&quot; Tor benutzen, ein Punkt-Diagramm von Bright Field Bereich vs Hell Feld Seitenverhältnis g schaffen<html> aßen die Singulett-Zellen. Rufen Sie das Tor &quot;Single&quot; (1B). </li><li> Mit dem &quot;Single&quot; Tor, erstellen Sie ein Punktdiagramm von Intensity_MC_Ch02 vs Intensity_MC_Ch5. Verwenden Sie diese Handlung zu identifizieren und Gate DiO-positive Zellen nur (Ziele, lebendig) und PI-DIO doppelt positiven Zellen (Targets, tot) (1C). HINWEIS: Alle Grundstücke in den Schritten 9.4.1, 9.4.2 und 9.4.3 kann unter Verwendung der &quot;Bausteine&quot; Funktion der Software erstellt werden. </li></ol></li><li> Klicken Sie auf die Statistik-Funktion des Dot-Plot zu Zellzahlen von jedem Gate zugreifen. </li><li> Berechnen Sie den Prozentsatz der toten Ziele in der spontanen Probe und experimentellen Proben unter Verwendung folgender Formel: % Tote Ziele in Probe = (#dead Ziele x 100) / (# leben Ziele + #dead Ziele) </li><li> Berechnen Zytotoxizität unter Verwendung der folgenden Formel: % Zytotoxizität = [(Experimental dead-Spontane tot) / (100-Spontane tot)] x100 </li></ol>_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54779/54779fig1.jpg" /> Abbildung 1: Repräsentative Histogramme, Streudiagramme und Bilder für zytotoxische Aktivität Analyse. (A) Fokus Zellanalyse. (B) Einzelzellanalyse. (C) Zielzellfärbung Analyse. Alle Bestimmungen werden unter Verwendung des Bildes zu jedem Ereignis angebracht gemacht. Dies kann durch einfaches Klicken auf die Veranstaltung in den Diagrammen in der Analyse-Software zugegriffen werden. (D) repräsentatives Bild eines Dubletts Ereignis, eine apoptotische NK - Zellen und eine Live - K562 Ziel zeigt. Ch01, Hellfeld. Ch02, OVI. CH05, PI. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54779/54779fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54779/54779fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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The authors have nothing to disclose.

Das Verfahren in dieser Studie beschriebenen Maßnahmen direkt auf die spezifische Aktivität eines NK-Zellen des Individuums als Reaktion auf Reize (in diesem speziellen Fall längerer Übung). Typischerweise werden NK-Zellen aus einem das Blut unter Verwendung von Dichtegradienten oder eine Zelle durch die Verwendung einer Kombination von Markern Sortierung isoliert. Obwohl diese Verfahren weit verbreitet sind, haben sie viele Nachteile: sie zeitraubend sind, beinhalten mehrere Manipulationen und sind stark Benutzer a...

Natürliche Killerzellen sind ein wesentlicher Bestandteil des angeborenen Immunsystems. Während sie sehr geregelt werden, haben sie die Fähigkeit , zu erkennen und abnormalen Zellen durch Zell-zu-Zell - Kontakt und ohne vorherige Aktivierung 1 beseitigen. Als solche bilden sie eine schnelle Verteidigungslinie gegen Infektionen. Exercise, besonders intensiv, wurde gezeigt , dass die transient das Immunsystem 2, 3, 4, 5 drücken. NK - Zellen sind besonders anfällig für diese Wirkung 4, 6, 7, effektiv ein Fenster mit erhöhter Empfindlichkeit gegenüber Krankheiten zu schaffen. Daher, bevor die Untersuchung von Interventionen, während oder nach intensivem Training mit dem Ziel, ihre Auswirkungen zu verringern auf NK-Zell-Funktion ist von besonderem Interesse für das Wohlbefinden der Athleten post-Wettbewerben. 8, bei etwa 1% der weißen Blutkörperchen Fach; 2) NK-Zellen sind sehr empfindlich gegenüber Stress und verlassen sich auf ständige Exposition gegenüber physiologischen Bedingungen während des Experimentierens lebensfähig und stabil zu bleiben; und 3) Standardassays NK - Zell - Cytotoxizität zu bestimmen, wie beispielsweise Ficoll - Gradienten 9 und Freisetzungsassays 10, sind unzuverlässig und inkonsistent. Die inhärente Variabilität der menschlichen Proben nur diese Fragen Verbindung. Frischen menschlichen Proben bei Eingriffen gesammelt sind ziemlich geregelten und schwer zu beschaffen, zumindest im Vergleich zu den Tierproben oder immortalisierten Zelllinien. Dies reduziert die Möglichkeiten Experimente zu wiederholen, oder fügen Sie die Teilnehmer der Studie Kohorte signifikanten statistischen Schwellenwerte zu erreichen. Zusammengefasst unterstützen diese Fragen die Notwendigkeit für eine optimierte Protokoll, das fo erlaubtr beide Hochdurchsatz und eine Hochzuverlässigkeitsanalyse von NK-Zell-lytische Aktivität in menschlichen Proben. Wir haben ein Workflow, der die notwendige Zeit zu identifizieren, zu isolieren und zu testen NK-Zellen aus menschlichem Vollblut verkürzt, während der Exposition gegenüber äußeren Faktoren zu minimieren. Das Verfahren optimiert die Verwendung von zwei Instrumenten, eine Magnetbasis Zellsortierer und eine Abbildungs ​​Durchflusszytometer und eine Assay-spezifische, optimierte T: E-Verhältnis die Detektion abnimmt oder zunimmt von NK-Zell-Cytotoxizität zu ermöglichen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1275">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">K-562 lymphoblasts</td>
			<td style="width:183px;">ATCC</td>
			<td style="width:136px;">CCL-243</td>
			<td style="width:585px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Media</td>
			<td style="width:183px;">ATCC</td>
			<td style="width:136px;">30-2005</td>
			<td>High glucose, with L-Glutamine, with HEPES, Sterile-filtered</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Alpha Minimum Essential medium</td>
			<td style="width:183px;">ATCC</td>
			<td style="width:136px;">CRL-2407</td>
			<td style="width:585px;">Without ribonucleosides and deoxyribonucleosides but with 2 mM L-glutamine and 1.5 g/L sodium bicarbonate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Trypan Blue Solution 0.4%</td>
			<td style="width:183px;">Amresco</td>
			<td style="width:136px;">K940-100ML</td>
			<td>Tissue culture grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Propridium Iodide Staining Solution</td>
			<td style="width:183px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:136px;">51-66211E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Vybranto DiO cell-labeling solution</td>
			<td style="width:183px;">Vybranto</td>
			<td style="width:136px;">V-22886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">autoMACS Pro Separator</td>
			<td style="width:183px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:136px;">130-092-545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">autoMACS Running Buffer</td>
			<td style="width:183px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:136px;">130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">autoMACS Washing Buffer</td>
			<td style="width:183px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:136px;">130-092-987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">autoMACS Columns</td>
			<td style="width:183px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:136px;">130-021-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Whole Blood CD56 MicroBeads, human</td>
			<td style="width:183px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:136px;">130-090-875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageStream X Mark II Imaging Flow Cytometer</td>
			<td style="width:183px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Speedbeads</td>
			<td style="width:183px;">Amnis Corporation</td>
			<td style="width:136px;">400030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.4-0.7% Hypochlorite (Sterilizer)</td>
			<td style="width:183px;">VWR</td>
			<td>JT9416-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coulter Clenz</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td>8546929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70% Isopropanol (Debubbler)</td>
			<td style="width:183px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:136px;">1.3704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-PBS (Sheath fluid)</td>
			<td style="width:183px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:136px;">BSS-1006-B (1X)</td>
			<td>No calcium or magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">INSPIRE Software</td>
			<td style="width:183px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>Version Mark II, September 2013</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ideas Application Software</td>
			<td style="width:183px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>Version 6.1, July 2014</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis of natural killer cell lytic activity in human whole blood

NK-Zell-Cytotoxizität ist eine weit verbreitete Maßnahme, um die Wirkung der Intervention von außen auf NK-Zell-Funktion zu bestimmen. Jedoch kann die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit des Assays instabil betrachtet werden, entweder weil der Benutzer-Fehler oder wegen der Empfindlichkeit von NK-Zellen auf experimentelle Manipulation. Um diese Probleme zu beseitigen, wird ein Workflow, der sie auf ein Minimum reduziert wurde etabliert und wird hier vorgestellt. Zu veranschaulichen, erhalten wir Blutproben zu verschiedenen Zeitpunkten, von Läufern (n = 4), die zu einem intensiven Trainingseinheit vorgelegt wurden. Zunächst werden NK-Zellen gleichzeitig identifiziert und isoliert durch CD56-Tagging und magnetische-basierte Sortierung, direkt aus Vollblut und von so wenig wie ein Milliliter. Die sortierten NK-Zellen sind von irgendwelchen Reagenz oder Capping-Antikörper entfernt. Sie können, um gezählt werden, eine genaue NK-Zellzahl pro Milliliter Blut zu schaffen. Zweitens können die sortierten NK-Zellen (Effektoren Zellen oder E) mit 3,3&#39;-Diotade gemischt werdencyloxacarbocyanine Perchlorat (DIO) markierte K562-Zellen (Zielzellen oder T) bei einem Test-optimal 1: 5 T: E-Verhältnis, und analysiert, um eine Bildgebungs Durchflusszytometer verwenden, die für die Visualisierung jedes Ereignisses und die Beseitigung aller falschen positiven erlaubt oder falsch-negative Ergebnisse (wie Dubletten oder Effektor-Zellen). Dieser Arbeitsablauf kann in etwa 4 h vollendet werden, und ermöglicht eine sehr stabile Ergebnisse, selbst wenn sie mit menschlichen Proben arbeiten. Wenn verfügbar, Forschungsteams können mehrere experimentelle Eingriffe am Menschen zu testen und zu vergleichen, Messungen über mehrere Zeitpunkte, ohne die Datenintegrität zu beeinträchtigen.

Bestimmung der NK-Zellzahl Die Wirkung von schweren Lauf auf NK - Zellzahl im Vollblut wurde gemessen, die Übung Protokoll in Abbildung 2 beschrieben ist . Blutproben wurden vor dem Training gezogen, unmittelbar nach dem Training, 1,5 Stunden nach dem Training, und schließlich 24 und 48 Stunden nach der ersten Blutentnahme. Die Konzentration von NK - Zellen pro Milliliter Vollblut wurde für jede Kufe (3A) gemessen und im Schnitt (Figur ...

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Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

Durchflusszytometrische Analyse von natürlichen Killerzellen lytische Aktivität in menschlichem Vollblut

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

flow-cytometric-analysis-natural-killer-cell-lytic-activity-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.3K Aufrufe.  North Carolina A&T State University, North Carolina Research Campus. This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

Serie: Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has been in the study of immunological synapse formation, due to the ability of the glass-supported planar lipid bilayers to mimic the surface of a target cell while forming a horizontal interface. The recent advances in super-resolution imaging have further allowed scientists to better view the fine details of synapse structure. In this study, one of these advanced techniques, stimulated emission depletion (STED), is utilized to study the structure of natural killer (NK) cell synapses on the supported lipid bilayer. Provided herein is an easy-to-follow protocol detailing: how to prepare raw synthetic phospholipids for use in synthesizing glass-supported bilayers; how to determine how densely protein of a given concentration occupies the bilayer's attachment sites; how to construct a supported lipid bilayer containing antibodies against NK cell activating receptor CD16; and finally, how to image human NK cells on this bilayer using STED super-resolution microscopy, with a focus on distribution of perforin positive lytic granules and filamentous actin at NK synapses. Thus, combining the glass-supported planar lipid bilayer system with STED technique, we demonstrate the feasibility and application of this combined technique, as well as intracellular structures at NK immunological synapse with super-resolution.

We describe here a combination of the glass-supported lipid bilayer technique of forming immunological synapses with the super-resolution imaging technique of stimulated emission depletion (STED) microscopy. The goal of this protocol is to provide users with the instructions necessary to successfully carry out these two techniques.

Super-Resolution Imaging der natürlichen Killerzell Immunologische Synapse auf einem Glas-gestützten Planar Lipiddoppelschicht

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various nanoparticle systems have been engineered to mimic features of pathogens to improve antigen delivery to draining lymph nodes and increase antigen uptake by antigen-presenting cells, leading to new vaccine formulations optimized for induction of antigen-specific CD8+ T cell responses. In this article, we describe the synthesis of a &#8220;pathogen-mimicking&#8221; nanoparticle system, termed interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles (ICMVs) that can serve as an effective vaccine carrier for co-delivery of subunit antigens and immunostimulatory agents and elicitation of potent cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. We describe methods for characterizing hydrodynamic size and surface charge of vaccine nanoparticles with dynamic light scattering and zeta potential analyzer and present a confocal microscopy-based procedure to analyze nanoparticle-mediated antigen delivery to draining lymph nodes. Furthermore, we show a new bioluminescence whole-animal imaging technique utilizing adoptive transfer of luciferase-expressing, antigen-specific CD8+ T cells into recipient mice, followed by nanoparticle vaccination, which permits non-invasive interrogation of expansion and trafficking patterns of CTLs in real time. We also describe tetramer staining and flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells for longitudinal quantification of endogenous T cell responses in mice vaccinated with nanoparticles.

We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

Whole-Tier Imaging und Fließzytometrieverfahren zur Analyse von Antigen-spezifischen CD8 + T-Zellantworten nach der Nanopartikel-Impfung

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

Isolation und Analyse über Durchflusszytometrie von Immunzellen aus dem ischämischen Gehirn der Maus

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 malignant gliomas soon after intracranial engraftment if the cancer cells are rendered deficient in their expression of the &#946;-galactoside-binding lectin galectin-1 (gal-1). More recent work now shows that a population of Gr-1+/CD11b+ myeloid cells is critical to this effect. To better understand the mechanisms by which NK and myeloid cells cooperate to confer gal-1-deficient tumor rejection we have developed a comprehensive protocol for the isolation and analysis of glioma-infiltrating peripheral blood mononuclear cells (PBMC). The method is demonstrated here by comparing PBMC infiltration into the tumor microenvironment of gal-1-expressing GL26 gliomas with those rendered gal-1-deficient via shRNA knockdown. The protocol begins with a description of&#160;how to culture and prepare GL26 cells for inoculation into the syngeneic C57BL/6J mouse brain. It then explains the steps involved in the isolation and flow cytometric analysis of glioma-infiltrating PBMCs from the early brain tumor microenvironment. The method is adaptable to a number of in vivo experimental designs in which temporal data on immune infiltration into the brain is required. The method is sensitive and highly reproducible, as glioma-infiltrating PBMCs can be isolated from intracranial tumors as soon as 24 hr post-tumor engraftment with similar cell counts observed from time point matched tumors throughout independent experiments. A single experimentalist can perform the method from brain harvesting to flow cytometric analysis of glioma-infiltrating PBMCs in roughly 4-6 hr depending on the number of samples to be analyzed. Alternative glioma models and/or cell-specific detection antibodies may also be used at the experimentalists&#8217; discretion to assess the infiltration of several other immune cell types of interest without the need for alterations to the overall procedure.

Presented here is a straightforward method for the isolation and flow cytometric analysis of glioma-infiltrating peripheral blood mononuclear cells that yields time-dependent quantitative data on the number and activation status of immune cells entering the early brain tumor microenvironment.

Isolierung und Analyse über Durchflusszytometrie von Gliom-Infiltration peripheren mononukleären Blutzellen

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of monocytes induces effector functions and a concomitant shift from oxidative to glycolytic metabolism that is accompanied by increased glucose transporter expression. This increased glycolytic metabolism is also observed for trained immunity of monocytes, a form of innate immunological memory. Although in vitro protocols examining glucose transporter expression and glucose uptake by monocytes have been described, none have been examined by multi-parametric flow cytometry in whole blood. We describe a multi-parametric flow cytometric protocol for the measurement of fluorescent glucose analog 2-NBDG uptake in whole blood by total monocytes and the classical (CD14++CD16-), intermediate (CD14++CD16+) and non-classical (CD14+CD16++) monocyte subpopulations. This method can be used to examine glucose transporter expression and glucose uptake for total monocytes and monocyte subpopulations during homeostasis and inflammatory disease, and can be easily modified to examine glucose uptake for other leukocytes and leukocyte subpopulations within blood.

Monocytes are integral components of the human innate immune system that rely on glycolytic metabolism when activated. We describe a flow cytometry protocol to measure glucose transporter expression and glucose uptake by total monocytes and monocyte subpopulations in fresh whole blood.

Eine einfache Durchflusszytometrischer Methode Glukoseaufnahme und Glukosetransporter-Expression für Monozytensubpopulationen in Vollblut zu messen

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in diameter. In addition to a characterization of forward and sideward scatter properties, it enables the use of fluorescent labeled markers like antibodies to detect respective structures. Using indirect antibody staining, flow cytometry is employed here to quantify birch pollen allergen (precisely Bet v 1)-loaded particles of 0.5 to 10 &#181;m in diameter in inhalable particulate matter (PM10, particle size &#8804;10 &#181;m in diameter). PM10 particles may act as carriers of adsorbed allergens possibly transporting them to the lower respiratory tract, where they could trigger allergic reactions.
So far the allergen content of PM10 has been studied by means of enzyme linked immunosorbent assays (ELISAs) and scanning electron microscopy. ELISA measures the dissolved and not the particle-bound allergen. Compared to scanning electron microscopy, which can visualize allergen-loaded particles, flow cytometry may additionally quantify them. As allergen content of ambient air can deviate from birch pollen count, allergic symptoms might perhaps correlate better with allergen exposure than with pollen count. In conjunction with clinical data, the presented method offers the opportunity to test in future experiments whether allergic reactions to birch pollen antigens are associated with the Bet v 1 allergen content of PM10 particles &#62;0.5 &#181;m.

Here, we present a protocol to quantify allergen-loaded particles by flow cytometry. Ambient particulate matter particles may act as carriers of adsorbed allergens. We show here that flow cytometry, a method widely used to characterize suspended solids &#62;0.5 &#181;m in diameter, can be used to measure these allergen-loaded particles.

Durchflusszytometrische Analyse von partikelgebundenen Bet v 1 Allergens in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore essential for understanding pathogenicity of different pathogens including HIV. Gamma delta (GD) T cells are the prototype of &#39;unconventional&#39; T cells and represent a relatively small subset of T cells defined by their expression of heterodimeric T-cell receptors (TCRs) composed of gamma and delta chains. This sets them apart from the classical and much better known CD4+ helper T cells and CD8+ cytotoxic T cells that are defined by alpha-beta TCRs. GD T cells often show tissue-specific localization and are enriched in epithelium. GD T cells orchestrate immune responses in inflammation, tumor surveillance, infectious disease, and autoimmunity.
Here, we present a method to reproducibly isolate and analyze human endocervical intraepithelial GD T lymphocytes. We have used endocervical cytobrush samples from women participating in the Women&#39;s Interagency HIV Infection Study (WIHS). Knowledge about GD T cells interactions during conditions in which there is an insult to the vaginal mucosal could be applied to any clinical study in which mucosal vulnerability is addressed, including the development of vaginal microbicides.In addition, knowledge about mucosal GD T cell responses has potential for application of GD T cell-based immune therapy in treating infectious diseases.

We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.

Isolierung und Analyse über Durchflusszytometrie der Menschen Endozervikale Gamma-Delta-T-Zellen

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can have pathological significance. An ideal method for examining alterations to monocytes is whole blood flow cytometry as the minimal handling of samples by this method limits artifactual cell activation. However, many different approaches are taken to gate the monocyte subsets leading to inconsistent identification of the subsets between studies. Here we demonstrate a method using whole blood flow cytometry to identify and characterize human monocyte subsets (classical, intermediate, and non-classical). We outline how to prepare the blood samples for flow cytometry, gate the subsets (ensure contaminating cells have been removed), and determine monocyte subset expression of surface markers &#8212; in this example M1 and M2 markers. This protocol can be extended to other studies that require a standard gating method for assessing monocyte subset proportions and monocyte subset expression of other functional markers.

Here we present a protocol for characterizing monocyte subsets by whole blood flow cytometry. This includes outlining how to gate the subsets and assess their expression of surface markers and giving an example of the assessment of the expression of M1 (inflammatory) and M2 markers (anti-inflammatory).

Charakterisierung der menschliche Monocyte Teilmengen von Vollblut Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

Vorbereitung des ganzen Knochenmarks für die Mass Cytometry Analyse von Neutrophilen-Linienzellen

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are cleared from the human lung alveoli by being phagocytosed by innate monocytes and/or neutrophils. This protocol offers a fast and reliable measurement of phagocytosis by flow cytometry using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled conidia for co-incubation with human leukocytes and subsequent counterstaining with an anti-FITC antibody to allow discrimination of internalized and cell-adherent conidia. Major advantages of this protocol are its rapidness, the possibility to combine the assay with cytometric analysis of other cell markers of interest, the simultaneous analysis of monocytes and neutrophils from a single sample and its applicability to other cell wall-bearing fungi or bacteria. Determination of percentages of phagocytosing leukocytes provides a means to microbiologists for evaluating virulence of a pathogen or for comparing pathogen wildtypes and mutants as well as to immunologists for investigating human leukocyte capabilities to combat pathogens.

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

This protocol provides a fast and reliable method to quantitatively measure phagocytosis of Aspergillus fumigatus conidia by human primary phagocytes using flow cytometry and to discriminate phagocytosis of conidia from mere adhesion to leukocytes.

Messung der Phagozytose von Aspergillus fumigatus Conidia durch menschliche Leukozyten mit Flow Cytometrie

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...