Name: online size-exclusion and ion-exchange chromatography on a saxs beamline
Uploaded: 2017-01-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline at JoVE.com

We acknowledge financial support for the project from the French grant REPLIPOX ANR-13-BSV8-0014 and by research grants from the Service de Sant&#233; des Arm&#233;es and the D&#233;l&#233;gation G&#233;n&#233;rale pour l'Armement. We are thankful to the ESRF for the SAXS beam time. We thank Andrew McCarthy, Gordon Leonard, Wim Burmeister, and Guy Schoehn for financial and scientific support.

<ol>
	<li>Graewert, M. A., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+and+progress+in+small+and+wide+angle+X-ray+scattering+(SAXS+and+WAXS).">Impact and progress in small and wide angle X-ray scattering (SAXS and WAXS).</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 23, 748-754 (2013).</li><li>Jacques, D. A., Trewhella, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-angle+scattering+for+structural+biology-Expanding+the+frontier+while+avoiding+the+pitfalls.">Small-angle scattering for structural biology-Expanding the frontier while avoiding the pitfalls.</a> Protein Sci. 19, 642-657 (2010).</li><li>Kikhney, A. G., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+small+angle+X-ray+scattering+(SAXS)+of+flexible+and+intrinsically+disordered+proteins.">A practical guide to small angle X-ray scattering (SAXS) of flexible and intrinsically disordered proteins.</a> FEBS Lett. 589, 2570-2577 (2015).</li><li>Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+solution+scattering+(SAXS)+combined+with+crystallography+and+computation:+defining+accurate+macromolecular+structures,+conformations+and+assemblies+in+solution.">X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution.</a> Q. Rev. Biophys. 40, 191-285 (2007).</li><li>Vestergaard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+biostructural+changes,+dynamics,+and+interactions+-+Small-angle+X-ray+scattering+to+the+rescue.">Analysis of biostructural changes, dynamics, and interactions - Small-angle X-ray scattering to the rescue.</a> Arch. Biochem. Biophys. , (2016).</li><li>David, G., P&#233;rez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+sampler+robot+and+high-performance+liquid+chromatography:+a+fully+automated+system+for+biological+small-angle+X-ray+scattering+experiments+at+the+Synchrotron+SOLEIL+SWING+beamline.">Combined sampler robot and high-performance liquid chromatography: a fully automated system for biological small-angle X-ray scattering experiments at the Synchrotron SOLEIL SWING beamline.</a> J. Appl. Crystallogr. 42, 892-900 (2009).</li><li>Graewert, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Pipeline+for+Purification,+Biophysical+and+X-Ray+Analysis+of+Biomacromolecular+Solutions.">Automated Pipeline for Purification, Biophysical and X-Ray Analysis of Biomacromolecular Solutions.</a> Sci. Rep. 5, (2015).</li><li>Lambright, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+techniques+enhance+the+quality+and+scope+of+information+obtained+from+SAXS.">Complementary techniques enhance the quality and scope of information obtained from SAXS.</a> ACA Trans. , 1-12 (2013).</li><li>Mathew, E., Mirza, A., Menhart, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid-chromatography-coupled+SAXS+for+accurate+sizing+of+aggregating+proteins.">Liquid-chromatography-coupled SAXS for accurate sizing of aggregating proteins.</a> J. Synchrotron Radiat. 11, 314-318 (2004).</li><li>Round, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+GH3.+12+protein+conformation+through+HPLC-integrated+SAXS+measurements+combined+with+X-ray+crystallography.">Determination of the GH3. 12 protein conformation through HPLC-integrated SAXS measurements combined with X-ray crystallography.</a> Acta Crystallogr. Sect. D. Biol. Crystallogr. 69, 2072-2080 (2013).</li><li>Watanabe, Y., Inoko, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-exclusion+chromatography+combined+with+small-angle+X-ray+scattering+optics.">Size-exclusion chromatography combined with small-angle X-ray scattering optics.</a> J. Chromatogr. 1216, 7461-7465 (2009).</li><li>Hutin, S., Brennich, M. E., Maillot, B., Round, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+ion-exchange+chromatography+for+small+angle+X-ray+scattering.">Online ion-exchange chromatography for small angle X-ray scattering.</a> Acta Cryst. , (2016).</li><li>Selkirk, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion-exchange+chromatography.">Ion-exchange chromatography.</a> Protein Purification Protocols. , 125-131 (2004).</li><li>Yigzaw, Y., Hinckley, P., Hewig, A., Vedantham, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+exchange+chromatography+of+proteins+and+clearance+of+aggregates.">Ion exchange chromatography of proteins and clearance of aggregates.</a> Curr. Pharm. Biotechnol. 10, 421-426 (2009).</li><li>Pernot, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upgraded+ESRF+BM29+beamline+for+SAXS+on+macromolecules+in+solution.">Upgraded ESRF BM29 beamline for SAXS on macromolecules in solution.</a> J. Synchrotron Radiat. 20, 660-664 (2013).</li><li>Iyer, L. M., Koonin, E. V., Leipe, D. D., Aravind, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+evolution+of+the+archaeo-eukaryotic+primase+superfamily+and+related+palm-domain+proteins:+structural+insights+and+new+members.">Origin and evolution of the archaeo-eukaryotic primase superfamily and related palm-domain proteins: structural insights and new members.</a> Nucleic Acids Res. 33, 3875-3896 (2005).</li><li>Singleton, M. R., Dillingham, M. S., Wigley, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+helicases+and+nucleic+acid+translocases.">Structure and mechanism of helicases and nucleic acid translocases.</a> Annu. Rev. Biochem. 76, 23-50 (2007).</li><li>Hutin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domain+organization+of+vaccinia+virus+helicase-primase+D5.">Domain organization of vaccinia virus helicase-primase D5.</a> J. Virol. , 4604-4613 (2016).</li><li>Round, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioSAXS+Sample+Changer:+a+robotic+sample+changer+for+rapid+and+reliable+high-throughput+X-ray+solution+scattering+experiments.">BioSAXS Sample Changer: a robotic sample changer for rapid and reliable high-throughput X-ray solution scattering experiments.</a> Acta Crystallogr. Sect. D. Biol. Crystallogr. 71, 67-75 (2015).</li><li>De Maria Antolinos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISPyB+for+BioSAXS,+the+gateway+to+user+autonomy+in+solution+scattering+experiments.">ISPyB for BioSAXS, the gateway to user autonomy in solution scattering experiments.</a> Acta Crystallographica Section D. 71, 76-85 (2015).</li><li>Brennich, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+data+analysis+at+the+ESRF+bioSAXS+beamline,+BM29.">Online data analysis at the ESRF bioSAXS beamline, BM29.</a> J. Appl. Crystallogr. 49, (2016).</li><li>Petoukhov, M. V., Konarev, P. V., Kikhney, A. G., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATSAS+2.1-towards+automated+and+web-supported+small-angle+scattering+data+analysis.">ATSAS 2.1-towards automated and web-supported small-angle scattering data analysis.</a> J. Appl. Crystallogr. 40, 223-228 (2007).</li><li>Franke, D., Jeffries, C. M., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+Map,+a+goodness-of-fit+test+for+one-dimensional+X-ray+scattering+spectra.">Correlation Map, a goodness-of-fit test for one-dimensional X-ray scattering spectra.</a> Nat. Methods. 12, 419-422 (2015).</li><li>Schrodinger, LLC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8. , (2015).</li><li>Jensen, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+SAXS+measurements+facilitated+by+online+HPLC+buffer+exchange.">Time-resolved SAXS measurements facilitated by online HPLC buffer exchange.</a> J. Synchrotron Radiat. 17, 769-773 (2010).</li><li>Hynson, R. M., Duff, A. P., Kirby, N., Mudie, S., Lee, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+ultracentrifugation+coupled+to+small-angle+X-ray+scattering+on+macromolecular+complexes.">Differential ultracentrifugation coupled to small-angle X-ray scattering on macromolecular complexes.</a> J. Appl. Crystallogr. 48, 769-775 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Birçok makromoleküller için kromatografi kullanılarak, son bir arıtma adımı kaliteli bir veri seti elde etmek için SAXS veri toplama öncesinde gereklidir. Ancak, tüm numuneler sabit kalır; onlar oligomerizasyon devletler karışımına toplama veya yeniden dengeleme eğilimli olabilir. Bu nedenle, ışın-hattı ile ilgili son bir çevrimiçi saflaştırma adımı en kaliteli SAXS verilerini elde etmek üzere saflaştırma ve veri toplama arasındaki süreyi en aza indirmek için kullanılır. ilgili proteinin biyofiziksel özelliklerine bağlı olarak, sek-SAXS veya IEC-SAXS uygun örnek kalitesini elde etmek için seçilebilir. Burada, helikaz / primaz D5 türetilmiş bir protein yapı üzerinde, hem teknik açıklanmış ve tartışılmıştır. SEC-SAXS veri toplama daha standardize hale geliyor ve birçok BioSAXS ışın demetleri üzerinde temin edilebilir. Veri analizi, özellikle arka plan çıkarma, nispeten basit ve kolaydır. Bununla birlikte, sabit bir tampon sinyalininve makromoleküler türlerin yeterli ayrılması esastır kalır. Nedenle, iyice sütun dengelenmesi için yeterli zaman ayırmak önemlidir. Bu yöntemin arıza çıkar, düşük konsantrasyonlarda, ve radyasyon duyarlı tamponların proteine ​​benzer büyüklükte kalıcı kirletici bağlı olabilir. Uygulamada, ilk, sek-SAXS en makromoleküler örnekler için tercih edilen yöntem olarak kullanılması olasıdır. Yine de, birçok saflaştırma protokolleri kirletici ya toplanmasının varlığı nedeniyle, önceki IEC adım gerektirir. Her bir konsantrasyon ve kromatografi aşaması (% 30-50 olduğu tahmin) örnek ve zaman kayıpları ile bağlantılı olduğu göz önüne alındığında, doğrudan IEC SAXS avantajlıdır. SEC tarafından arıtılmış edilemez numuneler için, nedeniyle benzer büyüklükteki &quot;kirletici&quot; varlığı ya da gerekli konsantrasyonlarda ciddi agrega, IEC-SAXS her zaman daha iyi uygundur yaklaşım olurdu çünkü olsun. Ayrıca, daha yüksek akış hızları desteklenenbirçok kişi tarafından IEC sütun saflaştırma ve ölçüm arasındaki geçiş süresini azaltmak için yardımcı olabilir. Burada verilen örnekte, IEC dikkatle tuz konsantrasyonu adımları seçerek kirletici maddelerden D5 323-785 yakın tepe ayrılması için sağlayan bir adım elüsyon ile kullanılmıştır. Prensip olarak, adım sayısı sınırsızdır ama pratikte, tepe başına en az 1 adım gereklidir ve çok az seçilmelidir. Yukarıda tarif edilen arka plan çıkarma yöntemi için, uygun bir bulmak için farklı tampon terkipleri arasında, nispeten yüksek bir sayısını ölçmek için çok önemlidir. Her iki teknik bir ortak dezavantajı kesin protein konsantrasyonu bilgi eksikliğidir. Buna bağlı olarak, ileri saçılma göre hassas kütlesinin belirlenmesi mümkün değildir. Böyle D5 323-785 olarak küresel proteinler için, poród hacmi son derece esnek ve düzensiz proteinlerin ancak, daha az hassas, kitle tahmin olsa bir alternatif sağlarBu yaklaşım geçerli olmaz. Burada sunulan basamaklı gradyan IEC SAXS yöntemin bir varyasyonu yerine bir doğrusal gradyan kullanılmasıdır. Bu adım adım elüsyon kullanılarak alt tepe izole etmek için arzu edildiği gibi doğrusal gradyan yaklaşımda, birçok adımda çalışmak mümkün olsa da, bunun tamamıyla SAXS başlamadan önce tepe ayırmak üzere dikkatlice gradyan koşulları optimize etmek için gerekli olan deney. Bu yaklaşımda arka plan çıkarma çerçeve bilge yapılabilir ve tek tek kare karşılaştırılması tarafından doğrulandı olabilir, ama daha gelişmiş veri işleme gerektirir ve özel bir yazılım henüz mevcut değil. Bu makromoleküler türlerin ayrılmasına belirler gibi uygun bir sütunu, her iki usul için çok önemlidir. iyon-değişim kolonları tür ve yoğunluk değişiklik gösterir boyut dışlama kolonlar, yükleme kapasitesi, ayrılabilir makromoleküllerin boyut aralığı ve çözünürlükte farklılıkonların hareketsiz ücretleri. Burada sunulan protokol basit prensip olarak herhangi bir diğer SAXS beamline da SDBY beamline BM29, adaptasyon, özel olsa. Ana şartlar oluşturma yeteneğine sahip yeterli derecede yüksek olan X-ışını akışı saniye ya da daha az aralığında uygun bir sinyal-ses verileri elde etmek için, uygun bir detektör (ideal olarak tek foton sayımı), ve bir online sıvı kromatografi sistemi vardır geçişlerini. Tam uygulama, tabii ki, yerel beamline çevre bağlı olacaktır. Iki yöntemi kullanarak D5 323-785 üzerinde elde edilen sonuçlar biraz farklıdır. dönme yarıçapı SEC verileri için olana göre IEC verileri için biraz daha küçük olan, ve dağılma eğrisinin lokal minimum biraz daha büyük yayılma vektörleri kaydırılır. Bu IEC SAXS ölçülen D5 323-785 biraz daha kompakt SEC-SAXS ölçülen D5 323-785 fazla olduğu anlamına gelir. Bu b olabilirSEC-saflaştınldı numunede bir kirletici daha az saflaştırma ve ölçüm tarihleri ​​arasında örnek hazırlama farklılıklar, (IEC hızlı) ya da, bağlı ör. Her iki yöntemde tamamen bağımsız olarak elde boncuk modelleri (Şekil 1H) karşılaştırılabilir. D5 323-785 beklenen içi boş, heksamerik yapıyı 18 göstermektedir. Sonuç olarak, çevrimiçi iyon değiştirme ve çevrimiçi boyut dışlama kromatografisi SAXS 6,7,9-12,25,26 doğrudan akuple edilebilir önemli biyokimyasal saflaştırma yöntemleri bulunmaktadır. IEC-SAXS verilerinin arka plan çıkarma biraz SEC-SAXS için daha zor ve belirsiz, ama yine de mümkündür. ilgili proteinin biyofiziksel özelliklerine bağlı olarak, SEC ve IEC SAXS hem doğal avantajlarına sahip türlerin ayrılması optimizasyonu için izin verir. doğrulama adımları (açıklandığı gibi) doğru gözlenir olduğunu, elde edilen verilerin analiz edilebilir zekâ sağlanmasıh güven ve modeller toplum içinde mevcut standart aletler kullanılarak tespit edilebilir. Birlikte, her iki tekniğin standart statik ölçümler üzerinden erişilebilir değil veri verimli, biyolojik makromoleküllerin geniş bir aralığı için çevrimiçi ayrılmasına izin verildi.

BioSAXS nano-boyutlu nesnelerin 1-4 şeklini belirlemek için güçlü bir araçtır. mil aralığı içinde boyut makromoleküller ihtiva eden bir çözelti ile X-ışını saçılması, çok düşük açılarda kaydedilir. Bu açısal aralık küresel parametreler hakkında bilgi içerir: dönme yarıçapı; en büyük intraparticle mesafe; parçacık şekli; ve katlanır, denatürasyon, ya da bozukluğun derecesi. Belirlenmesinde yararlı olabilir tekniği kristaller gerektirmez, ve makromolekül gibi iyonik vb kuvvet, pH, bu faktörlerin bilgisi olarak hücrenin belirli parametrelerin, taklit koşullarda muhafaza edilebilir ve böylece solüsyon içinde kalır ve, örneğin, veya ilgi bir proteinin fizyolojik ilgili oligomerik devlet bir kompleksin bir teklif modeli doğrulamak için. farklı tampon koşullarında protein-protein etkileşimlerinin karakterizasyonu, eksik etki modellerinin oluşturulması, homoloji model arıtma ve deayrık katlanmış ve katlanmamış devletlerin sona ermesi hızlı ve kolay 5 yapılabilir. un-yorumlanabilir verilere yol açabilir toplanan veya denatüre örnekleri, parçacıkların karışımları, heterojen örnekleri, radyasyon hasarı ve tampon uyumsuzlukları: herhangi bir teknik olduğu gibi, BioSAXS içsel zayıflıkları vardır. Birçok analiz yöntemleri için, dolaylı örnek uygulamada elde etmek oldukça zordur bir gereklilik, tek dağılımlı olduğu kabul edilir. Birçok durumda, numunenin bozulması ince olduğunu ve kendi veri tespit edilemez ve verileri yorumlamak için herhangi bir girişimi yanlış, hatta yanıltıcı sonuçlar verir. Bu engelleri aşmak için, boyut dışlama kromatografisi (SEC) ve SAXS kombinasyonu veri kalitesini sağlamak ve giderek daha zor numuneler 6-11 için bu tekniğin daha erişilebilir hale getirmek için birçok ışın demetleri üzerinde uygulanmıştır. Son zamanlarda, online iyon değişimini geliştirerek repertuarına yeni bir yöntem ekledikromatografi (IEC) SAXS 12 -coupled. Her iki teknik analiz eskiden imkansız biyolojik parçacıkların geniş bir SAXS açıyoruz. kullanılacak yöntem seçimi ilgi partikülerinin biofiziksel özelliklerine bağlıdır. SEC görünür moleküler kütlede en az% 10&#39;luk bir fark ayrılması için gerekli olan, bunun sonucu olarak boyutuna göre makromolekülleri ayırır. kolon ve örneklerin fizyolojik özelliklerinin fiziksel sınırlamalar, hidrofobik yüzeylerin, esneklik ve istikrar eksikliği gibi, aynı zamanda veri toplama, analiz ve yorumlama zorlaştırıyor. IEC kolonuna dolayısıyla bağlanma afinitesine yüklerine göre molekülleri ayıran ve iyon değiştirme kromatografisi, yerine veya SEC ilave olarak kullanılabilir. toplam yük kolayca kontrol el için nispeten basit bir pH değiştirme ya da tampon tuzu konsantrasyonunu değişen sağlayarak manipüle edilebilirIEC sütundan moleküllerin Katkı. yükü kullanarak, aksi takdirde ayrı zor olan benzer türde ve moleküllerin boyutları ayrılması, IEC rutin gerçekleştirilebilir. Buna ek olarak, IEC bir protein denatüre potansiyel riski taşıyan konsantrasyon adımları önlemek için izin seyreltilmiş örnekleri ile başa çıkmak mümkün olma avantajına sahiptir. Yük dağılımı yüksek Örnek bağımlı olduğundan, bu, IEC pH ve tuz konsantrasyonlarında 13,14 ilgili optimizasyon gerektirir. Ifade saflaştırılması, veya her ikisi de zor olan birçok protein için, numunenin sadece düşük miktarlarda çalışma mevcuttur. Etkili olduğu ve bu nedenle, kayıp saflaştırma adımlarının sayısını en aza indirmek ve önemlidir. Bu nedenle, son saflaştırma adımı iyi bir veri seti toplama olasılığını artırmak amacıyla, çevrimiçi SAXS veri toplama doğrudan öncesidir. İşteBiz mevcut ve çevrimiçi SEC-SAXS ve IEC-SAXS karşılaştırın. Her iki teknik Grenoble, Fransa 15 Avrupa Sinkrotron Radyasyon Tesisi&#39;nde (SDBY) en BioSAXS beamline BM29 üzerinde uygulanmıştır. Bir test case olarak, diğer yöntemleri kullanarak yapısal analiz etmek oldukça zor oldu aşı virüsü proteininin D5, bir D5N ve helikaz domain kullanılır. aşı virüsü Poxviridae ailesinin bir üyesidir ve variola virüsü, küçük çiçeği nedeni% 98 aynıdır. aşı sistemini kullanarak, temel sarmal primaz D5 burada odaklanarak, çoğaltma makineleri çalışma. D5 sistein kümesi bir bölge (Res. 240-345) 16, ardından bir N-terminal Archeo-ökaryotik primaz (AEP) alan 16 ile 95 kDa proteinidir. Bundan başka Cı-terminalinde doğru D5N alanı (Res. 340-460) gelir, her D5 tipi helikazlar ile bağlantılı, ve son olarak bir süper 3 (SF3) helikas tanım olan (S. 460-785) 17 (Figüre 1 A). D5 helikas tanım dar DNA bağlanma için gerekli olan bir heksamerik halka yapısını oluşturur. Teşekkürler son SAXS ve EM çalışmalarına, primazm düşük çözünürlüklü yapıları ve sarmal alanları şimdi 18 bilinmektedir. Burada, D5 (323-785 kalıntısı) C-terminal parçası yapısı içgörü kazanmak için SDBY de BioSAXS beamline BM29 uygulanan çevrimiçi kromatografi teknikleri nasıl kullanacağınızı gösterir.

<table><tbody><tr><td>1,4-dithiothreitol [DTT]</td><td>Euromedex</td><td>EU0006-B</td><td></td></tr><tr><td>10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gel</td><td>Biorad</td><td>4561033</td><td></td></tr><tr><td>2x Phusion Flash PCR Master Mix</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>F 548</td><td></td></tr><tr><td>acetic acid glacial</td><td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td><td>20104.298</td><td></td></tr><tr><td>Agarose D-5</td><td>Euromedex</td><td>LF45130653</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra -15 Centrifugal filters Ultracel -30K</td><td>Millipore Ltd</td><td>UFC903024</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin sodium salt</td><td>Euromedex</td><td>EU0400-D</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase</td><td>Novagene</td><td>70750-3</td><td></td></tr><tr><td>bromophenol blue&amp;nbsp;</td><td>MERCK</td><td>8122</td><td></td></tr><tr><td>Complete protease inhibitor cocktail&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>11231400</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Pac 10 DG Desalting column</td><td>Bio-rad</td><td>732-2010</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E-5134</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td><td>24388.295</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Euromedex</td><td>26-128-6405-C</td><td></td></tr><tr><td>HindIII</td><td>Roche</td><td>656313</td><td></td></tr><tr><td>HisSelect HF Nickel Affinity Gel</td><td>Sigma</td><td>H0537</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid (HCl)</td><td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td><td>20252.295</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>AppliChem Panreac</td><td>A1073,0500</td><td></td></tr><tr><td>InstantBlue</td><td>Expedeon</td><td>ISB1L</td><td></td></tr><tr><td>LB broth Miller</td><td>Fluka Analytical</td><td>L3152</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>ICN Biomedicals Inc.</td><td>191421</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td><td>27808.297</td><td></td></tr><tr><td>NcoI</td><td>Fermentas</td><td>ER0571</td><td></td></tr><tr><td>One Shot BL21 Star (DE3)&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>C6010-03</td><td></td></tr><tr><td>pProEx HTb vector&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>10711018</td><td></td></tr><tr><td>Primer</td><td>&amp;nbsp;Eurofins mwg operon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep kit</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel extraction kit</td><td>QIAGEN</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR purification kid</td><td>QIAGEN</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>SDS&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>75746</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5172-01</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA gel stain</td><td>Invitrogen life technology</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>T4 ligase</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>TEV</td><td></td><td></td><td>home made</td></tr><tr><td>TOP 10</td><td>Invitrogen life technology</td><td>C404003&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Euromedex</td><td>26-128-3094-B</td><td></td></tr><tr><td>Uno Q 1R column&amp;nbsp;</td><td>Bio-rad</td><td>720 0011</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-mercaptoethanol</td><td>MPBiomedicals, LLC</td><td>194834</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Softwares&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beamline control software BsXCuBE</td><td>ESRF</td><td>Pernot &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664</td><td>local development</td></tr><tr><td>Camserver software</td><td>Dectris</td><td>n.a.</td><td>detector control software</td></tr><tr><td>DAMAVER</td><td>ATSAS 2.6.0</td><td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td><td>program to align ab initio models&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DAMMIF</td><td>ATSAS 2.6.0</td><td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td><td>&lt;em&gt;ab initio&lt;/em&gt; model reconstruction program</td></tr><tr><td>HPLC program Biologic Duo Flow</td><td>Bio-rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC program LabSolutions</td><td>Shimadzu</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>ISPyB</td><td>ESRF</td><td>De Maria Antolinos &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; (2015). Acta Cryst. D71, 76-85.</td><td>local development</td></tr><tr><td>PRIMUS</td><td>ATSAS 2.6.0</td><td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td><td>program, which performs the manipulation with experimental SAXS</td></tr><tr><td>PyMOL</td><td>DeLano Scientific LLC</td><td>https://www.pymol.org/</td><td>software for visualization</td></tr><tr><td>SUPCOMB</td><td>ATSAS 2.6.0</td><td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td><td>program to superimpose 3D structures</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioLogic Duo Flow</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioLogic Biofrac Fraction collector</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC system</td><td>Shimadzu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Labsonic P</td><td>Sartorius Stedim biotech</td><td>BBI8535108</td><td></td></tr></tbody></table>

online size-exclusion and ion-exchange chromatography on a saxs beamline

Biyolojik küçük açı X-ışını saçılması (BioSAXS) çözeltisi yapısı, parçacık boyutu ve şekli, ve makromoleküller yüzey-hacim oranı belirlemek üzere kullanılan moleküler ve yapısal biyoloji güçlü bir tekniktir. Tekniği vb konsantrasyonları, pH değerleri, iyonik güçlü, sıcaklıklar, katkı maddeleri, geniş bir yelpazede uzanan çözelti koşulları çok çeşitli uygulanabilir, ancak örneği, tek dağılımlı olması gerekmektedir. Bu ihtar SAXS ışın demetleri üzerinde sıvı kromatografisi sistemlerinin uygulanmasına yol açtı. Burada, bir ışın-hattı üzerinde boyut dışlama (SEC) ve iyon değişim kromatografisi (IEC) yukarı entegrasyonu tarif uygun geri çıkarma ve veri azaltılması için farklı yöntemler. Bir örnek olarak, bir D5N helikas tanım aşağıdakilerden oluşan, esas aşı virüsü proteini D5 parça üzerindeki sek- ve IEC SAXS kullanımı açıklanmıştır. Biz th heksamerik yapısını gösteren, genel şeklini ve moleküler ağırlığı belirlemekE proteini.

Modelsiz değişmeyen analizinin sonuçları Tablo 1 &#39;de listelenmiştir. D5 323-785 SEC-SAXS verilerin analizi 338 kDa karşı 345 kDa (a poród analizinden) bir moleküler kütle tahmin gösterdi IEC SAXS kullanılarak gözlemlendi. Her ikisi de bir heksamer için 6 kez 53.5 kDa (321 kDa) beklenen kütle ile uyum içindedir. Her iki veri setinin ab initio modelleme hiçbir empoze simetri ile yapılmıştır (SEC-SAXS: χ 2 = 0.88, IEC-SAXS: χ 2 = 3.1) ve C6 simetrisi kullanarak (SEC-SAXS: χ 2 = 1.0, IEC-SAXS : χ 2 = 4). Her iki rekonstrüksiyon için yayılma verilerine genel uyan iki durumda (Şekil 1D ve E) karşılaştırılabilir olduğu için, C6 simetri varsayılabilir. Bu nedenle, bir model (SEC kısmen engellenmiş görünen bir merkezi kanal, bir altıgen koni benzeri bir yapı ile ilgilidir: Şekil 1F; IEC: <strong&gt; Şekil 1G, bindirme Şekil 1H). Ortalamanın önce bireysel modellerin incelenmesi bu tıkanıklık ortalama sürecinin bir dışlayıcı olması muhtemel olduğunu göstermektedir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54861/54861fig1x.jpg" /> Şekil 1: SAXS veri analizi ve karşılaştırma D5 323 -785 (şekil Kaynaklar 12 ve 18 uyarlanmıştır). D5 protein ve D5 323-785 A) şematik alan yapısı. B) Üç zirveleri göstergesi ile Çevrimdışı iyon değişim kromatogram. Turuncu eğrisi: 280 nm (au), mavi eğri de Absorbans: zirveleri tampon B tampon B. Yüzde yüzdesi belirtilir. C) Online iyon değişim kromatogram. B. olarak renk anahtarı Ayrıca, ölçülen yoğunluk, yeşil olarak gösterilir. Deneysel saçılma eğrisind SEC-SAXS D) ve IEC E) D5 323-785 veri analizi ile elde edilen modelin eğrisi hesaplanır. SEC veri ve G) IEC verilerine dayanarak D5 323-785 F) Boncuk modeli. SEC ve IEC modelleri H) Yerleşimi. F paneller) H) bir moleküler görüntüleme yazılımı 24 kullanılarak oluşturulmuştur. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54861/54861fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Veri toplama parametreleri </td><td></td></tr><tr><td> Enstrüman: </td><td> SDBY BM29 </td></tr><tr><td> Dalga boyu (A) </td><td> 0.99 </td></tr><tr><td> q-aralık (Å -1) </td><td> ,0032-,49 </td></tr><tr><td> Örnek-dedektör mesafesi </td><td> 2,864 m </td></tr><tr><td> Pozlama süresi (sn) </td><td> kare başına 1 </td></tr><tr><td> konsantrasyon aralığı </td><td> na </td></tr><tr><td> Sıcaklık (K) </td><td> 293 </td></tr><tr><td> detektör </td><td> Pilatus 1M (Dectris) </td></tr><tr><td> Akı (fotonlar / s) </td><td> 1 x 10 ila 12 </td></tr><tr><td> Işın boyutu (mikron 2) </td><td> 700 x 700 </td></tr><tr><td> D5 323-785, SEC için yapısal parametreleri </td><td></td></tr><tr><td> Ben 0 (cm-1) [guinier dan] </td><td> 0,0237 </td></tr><tr><td> Rg (A) [guinier dan] </td><td> 48 </td></tr><tr><td> R g dk q - Guinier için kullanılan Qmax Rg </td><td> 0,77-1,24 </td></tr><tr><td> Dmax (a) [p (r)] </td><td> 145 </td></tr><tr><td> p için kullanılan q-aralık (r) (Å -1)</td><td> 0,02-0,17 </td></tr><tr><td> Poród hacmi V (p Å 3) [Scatter dan] </td><td> (570 ± 5) 10 3 × </td></tr><tr><td> Moleküler kütle M r (kDa) [V p itibaren] </td><td> 345 </td></tr><tr><td> dizisinden monomerik Sn Hesaplanan (kDa) </td><td> 321 </td></tr><tr><td> D5 323-785, IEC için yapısal parametreleri </td><td></td></tr><tr><td> Ben 0 (cm-1) [guinier dan] </td><td> 0.386 </td></tr><tr><td> Rg (A) [guinier dan] </td><td> 46.5 ± 0.1 </td></tr><tr><td> R g dk q - Guinier için kullanılan Qmax Rg </td><td> 0,44-1,29 </td></tr><tr><td> Dmax (a) [p (r)] </td><td> 120 </td></tr><tr><td> p için kullanılan q-aralık (r) (Å -1) </td><td> 0,03-0,18 </td></tr><tr><td> Poród hacmi V (p &amp; #197; 3) [Scatter dan] </td><td> (577 ± 5) 10 3 × </td></tr><tr><td> Moleküler kütle M r (kDa) [V p itibaren] </td><td> 339 </td></tr><tr><td> dizisinden heksamerik Sn Hesaplanan (kDa) </td><td> 321 </td></tr></tbody></table> Tablo 1: SAXS veri parametreleri. tablo SAXS veri toplama ve analiz parametrelerini özetlemektedir.

Watch this Scientific Journal Video about Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline at JoVE.com

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

Küçük açılı X-ışını yayma (SAXS) bir protein çözeltisi yapısının belirlenmesi tek dağılımlı örnekleri gerektirir. Burada, örnek hazırlama ile veri kazanımı arasında en az gecikme sağlamak için iki seçenek sunmak: Online boyut dışlama kromatografisi (SEC), çevrimiçi iyon değiştirme kromatografisi (IEC).

Bir SAXS beamline Online Boyut dışlama ve İyon değişim Kromatografi

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

online-size-exclusion-ion-exchange-chromatography-on-saxs

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

17.2K Görüntüleme.  European Synchrotron Radiation Facility.  Küçük açılı X-ışını yayma (SAXS) bir protein çözeltisi yapısının belirlenmesi tek dağılımlı örnekleri gerektirir. Burada, örnek hazırlama ile veri kazanımı arasında en az gecikme sağlamak için iki seçenek sunmak: Online boyut dışlama kromatografisi (SEC), çevrimiçi iyon değiştirme kromatografisi (IEC). 

Video: Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and how the domains are oriented/positioned. Here, a protocol with the potential for elucidating which specific domains mediate interactions in multicomponent system through ab initio modeling is described. A method for calculating solution structures of macromolecules and their assemblies is provided that involves integrating data from small angle X-ray scattering (SAXS), chromatography, and atomic resolution structures together in a hybrid approach. A specific example is that of the complex of full-length nidogen-1, which assembles extracellular matrix proteins and forms an extended, curved nanostructure. One of its globular domains attaches to laminin &#947;-1, which structures the basement membrane. This provides a basis for determining accurate structures of flexible multidomain protein complexes and is enabled by synchrotron sources coupled with automation robotics and size exclusion chromatography systems. This combination allows rapid analysis in which multiple oligomeric states are separated just prior to SAXS data collection. The analysis yields information on the radius of gyration, particle dimension, molecular shape and interdomain pairing. The protocol for generating 3D models of complexes by fitting high-resolution structures of the component proteins is also given.

Here, we present how Small Angle X-Ray Scattering (SAXS) can be utilized to obtain information on low-resolution envelopes representing the macromolecular structures. When used in conjunction with high-resolution structural techniques such as X-Ray Crystallography and Nuclear Magnetic Resonance, SAXS can provide detailed insights into multidomain proteins and macromolecular complexes in-solution.

Küçük açı x-ışını saçılması kullanarak çözüm yapısal oluştururlar çalışmaları

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

Biyokimya

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for even the most challenging projects in structural biology. However, most facilities still require the presence of a scientist on site to perform the experiments. A new generation of automated beamlines dedicated to the fully automatic characterization of, and data collection from, crystals of biological macromolecules has recently been developed. These beamlines represent a new tool for structural biologists to screen the results of initial crystallization trials and/or the collection of large numbers of diffraction data sets, without users having to control the beamline themselves. Here we show how to set up an experiment for automatic screening and data collection, how an experiment is performed at the beamline, how the resulting data sets are processed, and how, when possible, the crystal structure of the biological macromolecule is solved.

Here, we describe how to use the automated screening and data collection options available at some synchrotron beamlines. Scientists send cryocooled samples to the synchrotron, and the diffraction properties are screened, the data sets are collected and processed and, where possible, a structure solution is carried out&#8212;all without human intervention.

Tamamen Özerk karakterizasyonu ve biyolojik oluştururlar kristalleri üzerinden veri toplama

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination of the high-specificity separation technique IEX with the accurate molar mass analysis achieved by MALS allows the characterization of heterogeneous protein samples, including mixtures of oligomeric forms or protein populations, even with very similar molar masses. Therefore, IEX-MALS provides an additional level of protein characterization and is complementary to the standard size-exclusion chromatography with multi-angle light scattering (SEC-MALS) technique.
Here we describe a protocol for a basic IEX-MALS experiment and demonstrate this method on bovine serum albumin (BSA). IEX separates BSA to its oligomeric forms allowing a molar mass analysis by MALS of each individual form. Optimization of an IEX-MALS experiment is also presented and demonstrated on BSA, achieving excellent separation between BSA monomers and larger oligomers. IEX-MALS is a valuable technique for protein quality assessment since it provides both fine separation and molar mass determination of multiple protein species that exist in a sample.

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

This protocol describes the use of high-specificity ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering for an accurate molar mass determination of proteins, protein complexes, and peptides in a heterogeneous sample. This method is valuable for quality assessment, as well as for the characterization of native oligomers, charge variants, and mixed-protein samples.

Protein ayrımı ve karakterizasyonu için birden fazla açıyla ışık saçılma (MALS) birleştiğinde iyon Kromatografi (IEX)

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ratio and conformational changes of macromolecules and macromolecular complexes. A high quality SAXS dataset for structural modeling must be from monodisperse, homogeneous samples and this is often only reached by a combination of inline chromatography and immediate SAXS measurement. Most commonly, size-exclusion chromatography is used to separate samples and exclude contaminants and aggregations from the particle of interest allowing SAXS measurements to be made from a well-resolved chromatographic peak of a single protein species. Still, in some cases, even inline purification is not a guarantee of monodisperse samples, either because multiple components are too close to each other in size or changes in shape induced through binding alter perceived elution time. In these cases, it may be possible to deconvolute the SAXS data of a mixture to obtain the idealized SAXS curves of individual components. Here, we show how this is achieved and the practical analysis of SEC-SAXS data is performed on ideal and difficult samples. Specifically, we show the SEC-SAXS analysis of the vaccinia E9 DNA polymerase exonuclease minus mutant.

SEC-BioSAXS measurements of biological macromolecules are a standard approach for determining solution structure of macromolecules and their complexes. Here, we analyze SEC-BioSAXS data from two types of commonly encountered SEC traces&#8212;chromatograms with fully resolved and partially resolved peaks. We demonstrate the analysis and deconvolution using scatter and BioXTAS RAW.

EFA deconvolution ve Scatter ile SEC-SAXS verilerinin analizi

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

Sample Preparation and Transfer Protocol for In-Vacuum Long-Wavelength Crystallography on Beamline I23 at Diamond Light Source

Long-wavelength macromolecular crystallography (MX) exploits the anomalous scattering properties of elements, such as sulfur, phosphorus, potassium, chlorine, or calcium, that are often natively present in macromolecules. This enables the direct structure solution of proteins and nucleic acids via experimental phasing without the need of additional labelling. To eliminate the significant air absorption of X-rays in this wavelength regime, these experiments are performed in a vacuum environment. Beamline I23 at Diamond Light Source, UK, is the first synchrotron instrument of its kind, designed and optimized for MX experiments in the long wavelength range towards 5 &#197;. 
To make this possible, a large vacuum vessel encloses all endstation components of the sample environment. The necessity to maintain samples at cryogenic temperatures during storage and data collection in vacuum requires the use of thermally conductive sample holders. This facilitates efficient heat removal to ensure sample cooling to approximately 50 K. The current protocol describes the procedures used for sample preparation and transfer of samples into vacuum on beamline I23. Ensuring uniformity in practices and methods already established within the macromolecular crystallography community, sample cooling to liquid nitrogen temperature can be performed in any laboratory setting equipped with standard MX tools. 
Cryogenic storage and transport of samples only require standard commercially available equipment. Specialized equipment is required for the transfer of cryogenically cooled crystals from liquid nitrogen into the vacuum endstation. Bespoke sample handling tools and a dedicated Cryogenic Transfer System (CTS) have been developed in house. Diffraction data collected on samples prepared using this protocol show excellent merging statistics, indicating that the quality of samples is unaltered during the procedure. This opens unique opportunities for in-vacuum MX in a wavelength range beyond standard synchrotron beamlines.

Here, we present a protocol for cryogenic sample preparation and transfer of crystals into the vacuum endstation on beamline I23 at Diamond Light Source, for long-wavelength macromolecular X-ray crystallography experiments.

Diamond Light Source'daki Beamline I23'te Vakum İçi Uzun Dalga Boyu Kristalografisi için Örnek Hazırlama ve Transfer Protokolü

Long-wavelength macromolecular crystallography (MX) exploits the anomalous scattering properties of elements, such as sulfur, phosphorus, potassium, ...

Achieving Efficient Fragment Screening at XChem Facility at Diamond Light Source

In fragment-based drug discovery, hundreds or often thousands of compounds smaller than ~300 Da are tested against the protein of interest to identify chemical entities that can be developed into potent drug candidates. Since the compounds are small, interactions are weak, and the screening method must therefore be highly sensitive; moreover, structural information tends to be crucial for elaborating these hits into lead-like compounds. Therefore, protein crystallography has always been a gold-standard technique, yet historically too challenging to find widespread use as a primary screen.
Initial XChem experiments were demonstrated in 2014 and then trialed with academic and industrial collaborators to validate the process. Since then, a large research effort and significant beamtime have streamlined sample preparation, developed a fragment library with rapid follow-up possibilities, automated and improved the capability of I04-1 beamline for unattended data collection, and implemented new tools for data management, analysis and hit identification.
XChem is now a facility for large-scale crystallographic fragment screening, supporting the entire crystals-to-deposition process, and accessible to academic and industrial users worldwide. The peer-reviewed academic user program has been actively developed since 2016, to accommodate projects from as broad a scientific scope as possible, including well-validated as well as exploratory projects. Academic access is allocated through biannual calls for peer-reviewed proposals, and proprietary work is arranged by Diamond's Industrial Liaison group. This workflow has already been routinely applied to over a hundred targets from diverse therapeutic areas, and effectively identifies weak binders (1%-30% hit rate), which both serve as high-quality starting points for compound design and provide extensive structural information on binding sites. The resilience of the process was demonstrated by continued screening of SARS-CoV-2 targets during the COVID-19 pandemic, including a 3-week turn-around for the main protease.

This paper describes the complete XChem process for crystal-based fragment screening, starting from applying for access and all subsequent steps to data dissemination.

Diamond Light Source'taki XChem Tesisinde Verimli Parça Taramasının Gerçekleştirilmesi

In fragment-based drug discovery, hundreds or often thousands of compounds smaller than ~300 Da are tested against the protein of interest to identify ...

Kimya

Using a Cyclic Ion Mobility Spectrometer for Tandem Ion Mobility Experiments

Accurate characterization of chemical structures is important to understand their underlying biological mechanisms and functional properties. Mass spectrometry (MS) is a popular tool but is not always sufficient to completely unveil all structural features. For example, although carbohydrates are biologically relevant, their characterization is complicated by numerous levels of isomerism. Ion mobility spectrometry (IMS) is an interesting complement because it is sensitive to ion conformations and, thus, to isomerism. 
Furthermore, recent advances have significantly improved the technique: the last generation of Cyclic IMS instruments offers additional capabilities compared to linear IMS instruments, such as an increased resolving power or the possibility to perform tandem ion mobility (IMS/IMS) experiments. During IMS/IMS, an ion is selected based on its ion mobility, fragmented, and reanalyzed to obtain ion mobility information about its fragments. Recent work showed that the mobility profiles of the fragments contained in such IMS/IMS data can act as a fingerprint of a particular glycan and can be used in a molecular networking strategy to organize glycomics datasets in a structurally relevant way. 
The goal of this protocol is thus to describe how to generate IMS/IMS data, from sample preparation to the final Collision Cross Section (CCS) calibration of the ion mobility dimension that yields reproducible spectra. Taking the example of one representative glycan, this protocol will show how to build an IMS/IMS control sequence on a Cyclic IMS instrument, how to account for this control sequence to translate IMS arrival time into drift time (i.e., the effective separation time applied to the ions), and how to extract the relevant mobility information from the raw data. This protocol is designed to clearly explain the critical points of an IMS/IMS experiment and thus help new Cyclic IMS users perform straightforward and reproducible acquisitions.

Ion mobility spectrometry (IMS) is an interesting complement to mass spectrometry for the characterization of biomolecules, notably because it is sensitive to isomerism. This protocol describes a tandem IMS (IMS/IMS) experiment, which allows the isolation of a molecule and the generation of the mobility profiles of its fragments.

Tandem İyon Hareketlilik Deneyleri için Döngüsel İyon Hareketlilik Spektrometresi Kullanma

Accurate characterization of chemical structures is important to understand their underlying biological mechanisms and functional properties. Mass ...

Sample Preparation for Endopeptidomic Analysis in Human Cerebrospinal Fluid

This protocol describes a method developed to identify endogenous peptides in human cerebrospinal fluid (CSF). For this purpose, a previously developed method based on molecular weight cut-off (MWCO) filtration and mass spectrometric analysis was combined with an offline high-pH reverse phase HPLC pre-fractionation step.
Secretion into CSF is the main pathway for removal of molecules shed by cells of the central nervous system. Thus, many processes in the central nervous system are reflected in the CSF, rendering it a valuable diagnostic fluid. CSF has a complex composition, containing proteins that span a concentration range of 8 - 9 orders of magnitude. Besides proteins, previous studies have also demonstrated the presence of a large number of endogenous peptides. While less extensively studied than proteins, these may also hold potential interest as biomarkers.
Endogenous peptides were separated from the CSF protein content through MWCO filtration. By removing a majority of the protein content from the sample, it is possible to increase the sample volume studied and thereby also the total amount of the endogenous peptides. The complexity of the filtrated peptide mixture was addressed by including a reverse phase (RP) HPLC pre-fractionation step at alkaline pH prior to LC-MS analysis. The fractionation was combined with a simple concatenation scheme where 60 fractions were pooled into 12, analysis time consumption could thereby be reduced while still largely avoiding co-elution.
Automated peptide identification was performed by using three different peptide/protein identification software programs and subsequently combining the results. The different programs were complementary rather than comparable with less than 15% of the identifications overlapped between the three.

A method for mass spectrometric analysis of endogenous peptides in human cerebrospinal fluid (CSF) is presented. By employing molecular weight cut-off filtration, chromatographic pre-fractionation, mass spectrometric analysis and a subsequent combination of peptide identification strategies, it was possible to expand the known CSF peptidome nearly ten-fold compared to previous studies.

İnsan serebrospinal sıvı Endopeptidomic analiz için numune hazırlama

This protocol describes a method developed to identify endogenous peptides in human cerebrospinal fluid (CSF). For this purpose, a previously developed ...

Nörobilim

Ion-Exchange Chromatography

Source: Laboratory of Dr. B. Jill Venton - University of Virginia
Ion-exchange chromatography is a type of chromatography that separates analytes based on charge. A column is used that is filled with a charged stationary phase on a solid support, called an ion-exchange resin. Strong cation-exchange chromatography preferentially separates out cations by using a negatively-charged resin while strong anion-exchange chromatography preferentially selects out anions by using a positively-charged resin. This type of chromatography is popular for sample preparation, for example in the cleanup of proteins or nucleic acid samples.
Ion-exchange chromatography is a two-step process. In the first step, the sample is loaded onto the column in a loading buffer. The binding of the charged sample to the column resin is based on ionic interactions of the resin to attract the sample of the opposite charge. Thus, charged samples of opposite polarity to the resin are strongly bound. Other molecules that are not charged or are of the opposite charge are not bound and are washed through the column. The second step is to elute the analyte that is bound to the resin. This is accomplished with a salt gradient, where the amount of salt in the buffer is slowly increased. Fractions are collected at the end of the column as the elution occurs and the purified sample of interest can be recovered in one of these fractions. Another technique, such as spectroscopy, may be needed to identify which fraction contains the sample. Ion-exchange chromatography is especially useful in protein studies, to isolate proteins of interest that have a specific charge or size, as size can determine the number of interactions with the resin.
Ion-exchange chromatography is a more general separation technique than affinity chromatography, which is also often used in preparing protein samples, where an antibody is attached to a column to bind one specific analyte. A new affinity column must be purchased for each analyte, while the same type of ion-exchange column, often with different eluting conditions, can be used to clean up many proteins of the same charge. Ion-exchange chromatography can also be used in conjunction with other types of chromatography that separate based on other properties. For example, size-exclusion chromatography separates based on size and could be used before ion-exchange chromatography to choose compounds of only a given size.

Ion-Exchange Chromatography: Principle and Protein Separation

Source: Laboratory of Dr. B. Jill Venton - University of Virginia
Ion-exchange chromatography is a type of chromatography that separates analytes based on ...

Education

JoVE Science Education

Analitik Kimya

Size-Exclusion Chromatography with Multi-Angle Light Scattering for Protein Oligomers

Source: Some, D. et al., <a href="https://app.jove.com/v/59615">Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS).</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video describes SEC-MALS, which leverages the abilities of size-exclusion chromatography (SEC) and multi-angle light scattering (MALS). In SEC-MALS, the SEC separates proteins or protein complexes based on their size, and the MALS detector determines the average molecular weight by measuring the intensity of the light scattered by the molecule at different angles.

Protein Oligomerleri için Çok Açılı Işık Saçılımlı Boyut Dışlama Kromatografisi

Source: Some, D. et al., Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS). J. Vis. Exp. ...