Biyolojik küçük açılı x-ışını saçılımı makromolekül ve makromoleküler komplekslerin yapısal ölçümlerini sağlar. İdeal olarak, ölçülecek örnek monodispersed olmalıdır. Bazı durumlarda, boyut dışlama kromatografisi SAXS monodispersity üretmek için yeterli olmasa da, saxs verilerinin yazılım tabanlı dekonvolution idealize Edilmiş Bir SAXS eğrisi üretmek için yapılabilir.
Bu protokolü takiben Vaccinia virüsü DNA polimeraz exominus mutantlarını analiz etmek için bir dekonvolution programı ve kullanıcı dostu Scatter programı kullanılabilir. Boyut dışlama kromatografisi verilerinin arka plan çıkarmasını gerçekleştirmek için Java tabanlı Scatter 4 programını açın ve SEC sekmesini açın. Azaltılmış veri dosyalarını pencerenin altındaki damla verilerine sürükleyin ve bırakın ve çıktı dizini düğmesini tıklatın ve verilerin kaydedileceği çıktı dizini ayarlamak için açın.
Kaydet kutusuna örnek adı girin ve İzlemeyi tıklatın. Deneysel ayrıntıları ve ilgili alanları doldurmak için ayrıntıları edin düğmesine tıklayın. Arabellek çerçevelerini el ile seçmek için arabellek leri ayarla'yı tıklatın.
Yaklaşık 100 karelik boyut dışlama kromatografisi sütununun geçersiz hacminden önce izleme eğrisiüzerinde arabelleği düz olarak yeniden seçmek için sol tıklatın ve sürükleyin ve SEC dosyasını yeniden hesaplamak için arabelleği ve güncelleştirmeyi ayarla'yı tıklatın. Sinyal çiziminde ilgi çekici bir bölge seçmek için sol tıklatın ve sürükleyin ve birleştirme için kullanılacak çerçevelerin yakınlaştırma ve alt kümesini seçmek için ısı haritası çizimindeki çapraz tüyleri sol tıklatın ve sürükleyin. Başka bir sol tıklatma ile, çapraz tüylerin sağ alt alanına karşılık gelen ısı haritasındaki çerçeveleri vurgulayın.
İdeal olarak, çerçeve ağırlıklı olarak silüan rengi ve girdap kararlı bir yarıçapı olan bir bölge vurgulamak gerekir. Seçili çerçevelerden memnun olduğunuzda, çıkarılan çerçeveleri birleştirmek için birleştirme'yi tıklatın ve verileri görüntülemek için çözümsekmesi sekmesini tıklatın. Verilerin deconvolution için, deconvolution programına veri kümesi yükleyin.
Dosyaların altındaki denetim panelinde, verileri bulmak ve tüm DAT dosyalarını vurgulamak için klasör simgesini kullanın. Seri çiziminde kare numarasına karşı tümleşik yoğunlukta bir çizim çizilir. Seri sekmesinin altında, eğriyi vurgulamak ve LC çözümlemesi açılır penceresini açmak için tıklatın.
Uygun bir arabellek bölgesi seçmek için, kromatogramın zirvesinden önce bir alan seçmek için bölge ekle'yi ve çözücü ön ve ayar arabelleği tıklattıktan sonra bir alan seçin. Açılır pencereler, arka plan için çerçevelerin seçilmediğini gösterir. EFA'yı başlatmak için vurgulanan dosyaya sağ tıklayın ve menüden EFA'yı seçin.
Açılır pencerede, veri kümesinin tek değer ayrışması gözlenmelidir. Denetimler kutusunda, deconvolute için tüm tepe alanı yoğunluk çizimi kaplı olduğunu onaylamak için kullanım çerçeveleri kutusu değerlerini işaretleyin. Tekil değerler çizimi, taban çizgisinin üzerindeki tekil değerlerin yoğunluğunu gösterir.
Sol ve sağ tek vektörler eşleşmiyorsa, önemli tekil vektör sayısını ikiye değiştirin ve kareleri sol ve sağ tekil vektörler benzer olana kadar hareket ettirin. EFA hesaplanacak, her vektör için ileri ve geri yönde çizimler üretilecek ve bileşenlerin seçilen boyut dışlama kromatografisi SAXS verileri için çözüm profilini ne zaman başlatıp çıkaracağını gösterir. RAW aralıkları tanımlamaya çalışır.
Gerekirse, her dairenin taban çizgisinden yükselen veya taban çizgisine düşen bir çekim noktasının başlangıcı olması için aralıkları değiştirmek için okları kullanın ve sonrakini tıklatın. Ani artışları azaltmak veya ortadan kaldırmak için, bileşen aralığı denetimlerini ayarlamak için aralık denetim oklarını kullanarak hangi çerçevenin başak ile karşılık olduğunu belirleyin. En az Bir Chi kareelde edildiğinde, doğrulama denetimi gerçekleştirmek için geri tıklayın.
Özgün EFA çizimleri hala geçerli görünüyorsa, sonrakini tıklatın ve çizimleri kaydetmek için EFA verilerini kaydedin. Ardından EFA penceresini kapatmak için yapılanları tıklatın. Daha sonra RAW penceresinde, eğrileri görüntülemek için çizim panelindeki profilleri açın.
Denetim panelinin profiller sekmesinde, eğrileri DAT dosyaları olarak kaydetmek için sağ tıklatın. SAXS tayini için dağılım analizi sekmesini açın ve manuel Guinier analiz aracını seçmek için G'yi seçin. Arsa, eklemek veya artıkbir gülümseme veya kaş çatma özelliği yok gibi noktaları kaldırın.
Guinier uyumundaki seçili veriler, 1,3 girdap sınırıyarıçapı ile çarpılarak en yüksek sırayı aşmamalıdır. Normalleştirilmiş Kratky'yi tıklatın. Ortaya çıkan çizim makromolekülün yapısal durumunun, küresel, silindirik, düzensiz, kütle için normalleştirilmiş ve konsantrasyonun bir değerlendirmesini sağlar.
Korelasyon hacmini tıklatın. Toplam dağınık yoğunluk ve Q çizimlerinin bir fonksiyonu olarak toplam dağınık yoğunluğun tümleşik alanı, saçılma eğrisinin kalitesini doğrulamak için hızlı bir başvuru olarak görünür. Esneklik çözümlemesi başlatmak için esneklik'i tıklatın.
Açılır penceredeki her panel, kompakt ve uzatılmış esnek biyopolimerler arasında var olan bir güç yasası ilişkisini istismar eden bir çizim gösterecektir. Çizimlerden birinde bir plato ulaşılAna kadar verilerin görünümünü değiştirmek için kutunun altındaki kaydırıcıyı kullanın. Esneklik çözümlemesi yaptıktan hemen sonra ses düzeyini tıklatın.
Üç grafiklik bir açılır pencere oluşturulur. Porod-Debye çizimi, esneklik çizimindeki kaydırıcının bırakıldığı yeri izler ve platolanmış alan verilerini gösterir. Parçacığın hacmini hesaplamak için, başlangıç ve bitiş noktalarını, çizimdeki mavi çizgi yaylalı bölgeye uyana kadar hareket ettirin.
Tarafsız bir sonuç için, Porod-Debye üs güç yasası uygun artıkları hiçbir desen göstermelidir. R'nin P sekmesi altında, gerçek boşluk dağılımı ve örnek için dağılım eğrisi gözlemlenebilir. İdeal olarak, dağıtım eğrisi hiçbir dalga ile pürüzsüz olmalı ve sadece yavaşça x-eksenine dokunmalıdır.
Örnek adı sağ tıklatın ve yeni bir pencere açmak için DMAX'ı bul'a tıklayın. Maksimum boyut sınırları önerilen maksimum Q aralığı, hesaplama için kullanılacak maksimal veri noktaları, alt ve üst maksimum boyut sınırları ve alt ve üst alfa skoru ile önceden ayarlanır. Başlat'ı tıklatın.
Önerilen maksimum boyut ve alfa düzeyiyle birlikte bileşik bir dağılım oluşturulur. Bu veriler kabul edilebilirse, karşılıklı alan çiziminin önerilen maksimum Q aralığıyla eşleşecek şekilde kırpılanınca R'nin P sekmesine dönmek için pencereyi kapatın. Daha fazla model seçin ve açılır pencereden önerilen değerlere alfa düzeyini ve maksimum boyutu ayarlamak için arka planı tıklatın.
Rafine'i tıklatın. Herhangi bir noktanın kırmızıda belirtildiği şekilde reddedilmesi gerekip gerekmediğini gösteren bir çapraz doğrulama çizimi açılır. Yalnızca birkaç reddedilen nokta varsa ve dağıtım iyi görünüyorsa, model iyidir.
Analiz sekmesine bir rapor yazdıracaksınız. Örneği vurgulamak için sol tıklatın ve örnek adına sağ tıklayın. Tek veri kümesinden rapor oluştur'u seçin.
Yorumlara izin vermek için bir metin kutusu açılır ve oluşturulan tüm rakamları ve değerleri gösteren bir PDF belgesi oluşturulur. Bu temsili analizde, E9 DNA polimeraz ekonukleaz eksi mutant DNA'ya bağlandı ve boyut dışlama kromatografisi küçük açılı x-ışını saçılımı kullanılarak çalıştırıldı. İki zirve gözlendi.
İlk büyük tepe, E9 DNA polimeraz eksonekleaz eksi mutant DNA kompleksini temsil eder. Ve ikincisi, bağlanmamış durumu gösterir. Çerçeveleri seçme klasik yaklaşım ilk tepede karmaşık girdap istikrarlı bir yarıçap sağlarken, ikinci zirve açıkça birleştirilir ve arsa genelinde girdap yarıçapı ilgi ikinci zirve çapraz tepe kontaminasyon nedeniyle gyrasyon istikrarlı bir yarıçapı olmadığını gösterir.
Bu analizde, sadece beş kare girdap yarı kararlı yarıçapı gösterdi kullanılabilir. Çıkarılınca, 36.3 angstrom'luk bir girdap yarıçapı verdiler. Zirveler EFA kullanılarak dekonvoluted edildiğinde, ikinci tepe için karşılık gelen eğri orijinal ile kaplanmış, gürültü ve 34.1 angstroms jivrasyon düşük yarıçapı sinyal net bir azalma gösteren.
Verilerin Kratky bir arsa kıvrık tepe ile karmaşık daha küresel olarak deconvoluted eğrisi için 108.5 angstroms maksimum boyut verir PR eğrisi tarafından doğrulandı ortaya koymaktadır. Bu analiz için deconvoluted olmayan veriler daha fazla 120 angstroms maksimum boyut ile uzatılmış, büyük olasılıkla bağlanmamış E9 polimeraz eksi eksoneklease mutant kaynaklanan heterojenite nedeniyle. En kritik adımlar tekil değerleri ve bu büyük ölçüde deconvolution doğruluğunu etkiler olarak kullanılan veri aralığı seçiminde vardır.
Sonuçlar kendi başlarına alınmamalı, daha fazla analitik santrifüj veya çok açılı lazer ışık saçılımı gibi ek teknikler kullanılarak biyolojik yorumlanmasına izin verilmelidir. In-line sütun-deconvolution ve program Scatter gibi kullanıcı dostu arayüzü ile birlikte saxs bile özünde zor sistemlerden anlamlı yapısal veri sağlamak için güçlü bir pakettir.
