Bu proje Milli Eğitim Singapur Bakanlığı (MEB, hibe numarası 2013-T2-2-126) ve Sağlık, ABD Ulusal Enstitüsü (NIH, numara 1R21AT008452-01A1 hibe) hibe ile finanse edildi. TY Biyolojik Bilimler NUS Bölümü&#39;nden mezun burs aldı. Biz onların sürekli destek için Biyogörüntüleme Bilimleri NUS Merkezi (CBIS) konfokal birimi teşekkür ederim.

Tüm deneyler National University of Singapore (R14-293) onaylı Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) protokollere uygun olarak yapıldı. 1. Balık Yetiştiriciliği ve Embriyolar Koleksiyonu <ol><li> Raise WT, ctsk: nlGFP 24, RANKL: HSE: OBP 24 ve osx: kontrollü ışık döngüsü altında MCherry 21 tek veya 26 ° C&#39;de bileşik transgenik Medaka balığı (14 saat aydınlık, 10 saat karanlık) yumurtlama uyardığı. </li><li> Işık açıldıktan sonra günlük yumurtlama ilk 30 dakika boyunca gerçekleşir. yumurta filamentler ile birlikte sopa ve birkaç saat dişinin karın eklemek. bir yumurta küme taşıyan bir kadın yetişkin yakalamak için ince örgülü net kullanın. Balık kısaca net dinlenmek ve daha sonra yavaşça dikkatlice kadın karın döllenmiş yumurta küme şerit balıkların karın masaj edelim. NOT: Sağlıklı bir Medaka kadınYaklaşık 5 ay boyunca 20 yumurta her gün - 10 üretebilir. </li><li> 60 mm plastik Petri kabı içine yumurta yerleştirin. 5, embriyolar durulama plastik bir pipet kullanın - 10 mL en 0.3x Danieau çözeltisi (balık ortamı (19.3 mM NaCI, 0.23 mM KCI, 0.13 mM MgSO 4, 0.2 mM Ca NO 3) 2 ve 1.7 mM HEPES, pH 7.0). mantar gelişimini önlemek için% 0.25 ile 1 mL balık ortamı 2.5 L (ağ / hac) metilen mavi stok solüsyonu ekleyin. </li><li> Yavaşça eki filamentler bir düğüm oluşturmak için yumurta küme yuvarlayın. Dikkatlice bireysel embriyolar (Şekil 1A) elde etmek için döllenmiş yumurta kümelerden eki filamentler çıkarmak için forseps kullanın. </li><li> Iwamatsu 2004 13 göre embriyolar Sahne. </li><li> Kültür 20 - 28 ° C inkübatör 60 mm plastik Petri kabı başına 30 embriyolar. embriyoların normal gelişimini sağlamak için her gün orta değiştirin. NOT: kuluçka aşamasında (8 kez etrafında - 9 d postfertilization,DPF) hayatta kalma için kritiktir. temiz ortamı tutmak ve iyi larva sağkalım oranları sağlamak için serbest yüzen chorions çıkarın. </li></ol> 2. Transgenik Embriyo tarama <ol><li> 40X büyütme kullanılarak flüoresan raportör ekspresyonu için transgenik embriyo taranması için floresan görüntüleme ve GFP, RFP ve CFP filtrelerinin cıva lambası ile donatılmış bir stereomikroskop kullanın. </li><li> Görsel OSX tespit: MCherry raportör ekspresyonu ile MCherry embriyolar erken oluşturucu arka kafa (Şekil 1B, ok) ve parasphenoid her iki tarafında, örneğin cleithrum olarak kafatası kemikleri, ventral kafatası merkezi bir konumda ( Şekil 1B, ok başı). NOT: Muhabir ifade itibaren 21 5 DPF başlar. </li><li> Ctsk belirleyin: Güçlü nlGFP ifade tarafından nlGFP embriyolar kafa (Şekil 1C, ok) ve kuyruk (Şekil 1C, ok başı), başlayan6 DPF. NOT: İçsel osteoklastlar sadece 21 DPF sonra oluştururlar. Bu erken aşamada (6 DPF) hücreleri nlGFP ifade eden, bugüne kadar uncharacterized osteoklastlar ancak diğer değil pozitif hücreler 24 ctsk. </li><li> RANKL belirlenmesi: HSE: yerde CFP sentezlenmesiyle CFP transjenik embriyoları 2 dpf veya daha tarama amacıyla yapılan 39 ° C &#39;de 20 dakika boyunca kısa bir ısı şoku muamelesinden sonra. NOT: RANKL ve OBP transgenlerin aynı çift yönlü Isı Şoku Elemanı (SEÇ) kontrolü altındadır. CFP sentezleme başarılı RANKL&#39;ın indüksiyonu 24 gösterir. </li><li> Dolayısıyla osteoporoz gibi fenotip 24 sonuçlanır gövde bölgede, ektopik osteoklastlar çok sayıda ikna etmek için daha sonra 9 DPF 2 saat ısı şoku tedavi veya - 1.5 gerçekleştirin. NOT: endojen tetiklenir uyuyan osteoklast progenitör hücrelerin, bir ektopik aktivasyonu 9 DPF sonuçlara yol açtığı Transgenik RANKL ifade21 DPF önce. kararlı 39 ° C koşulları elde etmek için bir su banyosu kullanın. Petri içeren Medaka embriyolar su yüzeyinde yüzen izin. Emin petri kapak çanak batan önlemek için kuru olduğundan emin olun. </li><li> Bu RANKL bileşik hatları, ekran embriyolar: HSE: CFP / ctsk: nlGFP çift transgenik ve OS X: MCherry / RANKL: HSE: CFP / ctsk: nlGFP üç transjenik, her bir transgen sentezleme desenine göre yöntem. Not: hemizigot ve homozigoz transgenik embriyo raportör transgen farklı floresan seviyeleri ile ayırt edildi. Homozigot embriyolar hemizigot transgeniklerinin kıyasla iki kat, yaklaşık bir floresan yoğunluğu vardı. HSE: CFP ve ctsk: Her iki RANKL için homozigot olan Bileşim hatları nlGFP tekrar birkaç nesil boyunca incrossing ile elde edilmiştir. MCherry / RANKL: HSE: CFP / ctsk: üçlü transgenik osx için nlGFP balık,<html> homozigot RANKL: HSE: CFP / ctsk: mCherry taşıyıcıları: nlGFP balık homozigot osx ile geçti. Elde edilen heterozigot üç transjenik soy kaldırdı ve RANKL için homozigot embriyolar elde etmek üzere incrossed edilmiştir: HSE: CFP. RANKL: HSE: CFP transgen ektopik osteoklastların etkin indüksiyonu elde edilmesi için homozigot olması gerekir. </li></ol><img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55025/55025fig1.jpg" /> Şekil 1: WT ve 7 D postfertilization de transgenik Medaka Embriyolar (DPF). Bir. WT embriyolar aydınlık aydınlatma ile gözlemledik. B. Osx gösteren Transgenik embriyolar: cleithrum (ok) ve parasphenoid (ok) etrafında MCherry ifade. Cı. Ctsk gösteren Transgenik embriyolar: nlGFP kafa (ok) ifadesi ve kuyruk (ok başı). Ölçek çubukları: 500 mikron.025 / 55025fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. Medaka Larva 3. Bifosfonat Tedavisi <ol><li> Doz-cevap çalışmaları bifosfonatlar (bps) farklı konsantrasyonlarda içeren solüsyonlar hazırlayın. NOT: Bu protokolde kullanılan örnek, BP alendronat olduğunu. <ol><li> Bir stok çözeltisi hazırlamak için 100 ug / ml bir konsantrasyonda balık ortam içinde alendronat çözülür. </li><li> Tam çözünmeyi sağlamak için, bir girdaplı karıştırıcı kullanarak. 4 ° C&#39;de stok solüsyonu saklayın. </li><li> Konsantrasyonları bir dizi balık ortamı ile stok çözelti seyreltilerek farklı çalışma çözelti hazırlayın (örneğin, 25, 37.5, 50, 62.5 ve 75 ug / mL). NOT: Farklı ilaçlar bu Medaka larvaları sistemi kullanarak test sırasında dikkate alınması gereken farklı emilim, dağılım, Metabolizma ve Boşaltım (DEME) parametreleri, olabilir. Ayrıca ilaç çözünürlük ve stabilite değişebilirsulu bir çözelti olarak tatbik. Daha az suda çözünür bileşikleri, ilk olarak DMSO gibi bir organik çözücü içinde çözülmüş, gerekebilir. Bu durumda, bir stok çözeltisi daha sonra balık ortamı içinde seyreltilir DMSO içinde hazırlanır. Su (balık ortamı) çalışan çözümler birkaç wk buzdolabında saklanabilir unutmayın. Ancak, DMSO ihtiva eden çözeltiler kristalleşmeyi önlemek için oda sıcaklığında muhafaza edilmesi gerekir. </li></ol></li><li> altı yuvalı plakalar içine aktarın Medaka larvaları (altı larva / oyuk) daha sonra kan basıncı (alendronat) tedavisi için kullanılabilir. </li><li> dikkatli bir şekilde temiz bir plastik pipet kullanılarak balık Ortamı çıkarın ve her bir oyuğa alendronat çözeltinin küçük bir hacim (yakl. 0.5 mi) ilave edin. </li><li> az konsantre alendronat çözümleri için özellikle önemlidir eklendi BP çözüm seyreltilmiş olabileceği gibi artık balık ortamı, kaçının. </li><li> temiz bir plastik pipet ile her çukurdan alendronat çözeltisi (0,5 mL) içindeki bir küçük hacimli çıkarın ve daha büyük bir VOLU ile değiştirinalendronat çözeltisi bana (4 mL) eklenmiştir. </li><li> Normal embriyolar gelişimini sağlamak için orta günlük olarak değiştirin. </li></ol> Mineralize kemik Matrix 4. Canlı Boyama <ol><li> sırası ile,% 1 ve% 0.1 stok çözeltileri hazırlamak için ya da balık ortamı 50 mL kalseinin 0.05 g (alizarin-3-metiliminodiasetik asit ALC) Alizarin komplekson 0.5 g çözündürülür. Tam çözünmeyi sağlamak için, bir girdaplı karıştırıcı kullanarak. Not: metilen mavisi ilave edilmeden balık ortamı Bu kullanılır ve daha sonraki adımlar, larva otofloresan azaltır. </li><li> boyama çözüm süzmek için bir şırınga ve tek kullanımlık filtre (0.2 mikron) kullanın. Oda sıcaklığında, karanlıkta, süzüldü çözelti saklayın. NOT: süzülmüş, berrak ALC boyama çözeltisinin rengi turuncu, sarı karanlık. süzülmüş, berrak kalsein çözeltisi rengi sarı parlak. Çözümler birkaç ay boyunca kullanılabilmektedir. </li><li> Balık ortamında süzülmüş ALC veya kalsein stok solüsyonu 01:10 seyreltilirLarvalar 9 ila 17 DPF kullanıldığında, bir 28 ° C kuluçka makinesi içinde 2.5 saat (% 0.01 kalsein çözeltisi) - 2 saat boyunca (% 0,1 ALC çözelti) ya da 2 - ve 1.5 Medaka larva inkübe edin. Karanlıkta örnekleri tutun. </li><li> temiz bir plastik pipet kullanarak taze balık ortamına larva aktarın. </li><li> temiz bir plastik pipet ile balık orta kaldırmak ve taze balık orta ekleyin. 3 için bu adımı yineleyin - (sırasıyla, ALC veya kalsein) hayır kırmızı- veya sarı lekeli bir çözüm kadar 4 kez üzerinde bırakılır. ortamdan Epifloresans önlemek için görüntüleme için onları takmadan önce 60 dakika - 30 balık ortamda larvaları bırakın. NOT:% 0.1 ALC boyama çözümü genişletilmiş pozlama süreleri için Medaka larva için zararlıdır. en fazla 2 saatlik inkubasyon sürelerinin larvalarının yaşamlarını sürdürmeleri etkiler. Konsantrasyon ve boyama zaman, bu nedenle optimum embriyo hayatta kalma ve boyama sonuçları elde etmek için farklı aşamaları için optimize edilmesi gerekir. </li></ol> 5. Canlı Floresans Görüntüleme </<html> p&gt; <ol><li> Balık bir ortam içinde% 0.01 Tricaine (etil 3-aminobenzoat metansülfonat) ile Medaka larva anestezisi. NOT: Anestezi larvalar 5 sonra hareketsiz hale - Tricaine çözeltisi içinde 10 dakika ve genellikle onların yüzüne ya da sırtlarında ya yalan söylemektedirler. </li><li> ilgi bölgeye göre larva yönlendirmek için plastik Microloader kullanın. Bu protokolde kullanılan larva yönü yanal olduğunu. </li><li> görüntüleme için floresan aydınlatma ile Stereomikroskopta kullanın. larvaları (baş, ön gövde, arka gövde ve kuyruk) farklı bölgelerinde odaklanan görüntüleri çekerken yüksek büyütme kullanın. Uygun bir görüntü işleme yazılımı (Şekil 3G takmalar) kullanarak bölgeleri üst üste birlikte bireysel görüntüleri birleştirin. NOT: Bu doğru odak düzleminde ilgili tüm vücut parçaları görüntü kalitesini artırmak için yardımcı olur. </li><li> görüntüleme sonrası iyileşme için balık ortamına larva dönün. </li></ol>tle &quot;&gt; 6. Canlı Konfokal Görüntüleme <ol><li> onlar hareketsiz hale gelene kadar 10 dakika - 5 için balık ortamında% 0.01 Tricaine ile larva uyutmak. </li><li> Bir mikrodalga fırında ısıtılarak balık ortamı içinde% 1.5 agaroz erime noktası düşük eritin. Serin, yaklaşık 30 ° C&#39;ye kadar bu çözelti. </li><li> Bir cam tabanlı Petri kabı balık ortamında agaroz sıvı% 1.5 düşük erime 1 ml - 0.5 ekleyin. temiz bir plastik pipet kullanarak çözüm içine anestezi larva aktarın. Not: Sıvı, düşük ısıda eriyen agaroz sıcaklığı larva zarar vermeyecek kadar yeterince düşük olduğu özel önlem almak. </li><li> Agaroz katılaşır önce Petri kabı alt larva itmek için plastik bir Microloader kullanmak ve ilgi bölgeye göre larva yolunuzu. Bu protokolde kullanılan larva yönü yanal olduğunu. NOT: agaroz tamamen katılaşır sonra numuneler konfokal canlı görüntüleme için hazırdır. </li><li> ACQ bir konfokal mikroskop kullanmakuire görüntüler. </li><li> MCherry ve ALC boyama analizleri için 543 nm lazer hattı kullanın. nlGFP için 488 nm lazer hattı kullanın ve kalsein boyama analiz eder. </li><li> Görüntüleme sonrası, Petri kabı balık orta eklemek ve dikkatle agaroz larvaları kaldırmak için ince şırınga iğneleri (27 G x 1½ &quot;) bir çift kullanın. residually kurtarmak için balık ortamı ile bir Petri kabı agaroz bağlı olan larvaları transfer . </li><li> Bir görüntü analiz yazılımı 27 kullanarak görüntüleri işleyin. </li></ol>

<ol>
	<li>Ablain, J., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+fish+and+men:+using+zebrafish+to+fight+human+diseases.">Of fish and men: using zebrafish to fight human diseases.</a> Trends Cell Biol. 23 (12), 584-586 (2013).</li><li>Ansai, S., Kinoshita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+mutagenesis+using+CRISPR/Cas+system+in+medaka.">Targeted mutagenesis using CRISPR/Cas system in medaka.</a> Biol Open. 3 (5), 362-371 (2014).</li><li>Apschner, A., Schulte-Merker, S., Witten, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Not+all+bones+are+created+equal-using+zebrafish+and+other+teleost+species+in+osteogenesis+research.">Not all bones are created equal-using zebrafish and other teleost species in osteogenesis research.</a> Methods Cell Biol. 105, 239-255 (2011).</li><li>Bajoghli, B., Aghaallaei, N., Heimbucher, T., Czerny, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+artificial+promoter+construct+for+heat-inducible+misexpression+during+fish+embryogenesis.">An artificial promoter construct for heat-inducible misexpression during fish embryogenesis.</a> Dev Biol. 271 (2), 416-430 (2004).</li><li>Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+high+content,+in+vivo+model+of+glucocorticoid-induced+osteoporosis.">A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis.</a> Biotechnol J. 1 (6), 651-655 (2006).</li><li>Centanin, L., Ander, J. J., Hoeckendorf, B., Lust, K., Kellner, T., Kraemer, I., Urbany, C., Hasel, E., Harris, W. A., Simons, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exclusive+multipotency+and+preferential+asymmetric+divisions+in+post-embryonic+neural+stem+cells+of+the+fish+retina.">Exclusive multipotency and preferential asymmetric divisions in post-embryonic neural stem cells of the fish retina.</a> Development. 141 (18), 3472-3482 (2014).</li><li>Charles, J. F., Aliprantis, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclasts:+more+than+'bone+eaters.">Osteoclasts: more than 'bone eaters.</a> Trends Mol Med. 20 (8), 449-459 (2014).</li><li>DeLaurier, A., Eames, B. F., Blanco-Sanchez, B., Peng, G., He, X., Swartz, M. E., Ullmann, B., Westerfield, M., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+sp7:EGFP:+a+transgenic+for+studying+otic+vesicle+formation,+skeletogenesis,+and+bone+regeneration.">Zebrafish sp7:EGFP: a transgenic for studying otic vesicle formation, skeletogenesis, and bone regeneration.</a> Genesis. 48 (8), 505-511 (2010).</li><li>Du, S. J., Frenkel, V., Kindschi, G., Zohar, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+normal+and+defective+bone+development+in+zebrafish+embryos+using+the+fluorescent+chromophore+calcein.">Visualizing normal and defective bone development in zebrafish embryos using the fluorescent chromophore calcein.</a> Dev Biol. 238 (2), 239-246 (2001).</li><li>Eriksen, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+of+bone+remodeling.">Cellular mechanisms of bone remodeling.</a> Rev Endocr Metab Disord. 11 (4), 219-227 (2010).</li><li>Hockendorf, B., Thumberger, T., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+embryogenesis:+a+perspective+for+light+sheet+microscopy.">Quantitative analysis of embryogenesis: a perspective for light sheet microscopy.</a> Dev Cell. 23 (6), 1111-1120 (2012).</li><li>Inohaya, K., Takano, Y., Kudo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+teleost+intervertebral+region+acts+as+a+growth+center+of+the+centrum:+in+vivo+visualization+of+osteoblasts+and+their+progenitors+in+transgenic+fish.">The teleost intervertebral region acts as a growth center of the centrum: in vivo visualization of osteoblasts and their progenitors in transgenic fish.</a> Dev Dyn. 236 (11), 3031-3046 (2007).</li><li>Iwamatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+normal+development+in+the+medaka+Oryzias+latipes.">Stages of normal development in the medaka Oryzias latipes.</a> Mech Dev. 121 (7), 605-618 (2004).</li><li>Kirchmaier, S., Hockendorf, B., Moller, E. K., Bornhorst, D., Spitz, F., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+site-specific+transgenesis+and+enhancer+activity+tests+in+medaka+using+PhiC31+integrase.">Efficient site-specific transgenesis and enhancer activity tests in medaka using PhiC31 integrase.</a> Development. 140 (20), 4287-4295 (2013).</li><li>Kirchmaier, S., Naruse, K., Wittbrodt, J., Loosli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genomic+and+genetic+toolbox+of+the+teleost+medaka+(Oryzias+latipes).">The genomic and genetic toolbox of the teleost medaka (Oryzias latipes).</a> Genetics. 199 (4), 905-918 (2015).</li><li>Komori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+osteoporosis.">Animal models for osteoporosis.</a> Eur J Pharmacol. 759, 287-294 (2015).</li><li>Mackay, E. W., Apschner, A., Schulte-Merker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bone+to+pick+with+zebrafish.">A bone to pick with zebrafish.</a> Bonekey Rep. 2, 445 (2013).</li><li>MacRae, C. A., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+tools+for+drug+discovery.">Zebrafish as tools for drug discovery.</a> Nat Rev Drug Discov. 14 (10), 721-731 (2015).</li><li>Mitchell, R. E., Huitema, L. F., Skinner, R. E., Brunt, L. H., Severn, C., Schulte-Merker, S., Hammond, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+osteoarthritis+genetics+in+zebrafish.">New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish.</a> Osteoarthritis Cartilage. 21 (2), 269-278 (2013).</li><li>Renn, J., Buttner, A., To, T. T., Chan, S. J., Winkler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+col10a1:nlGFP+transgenic+line+displays+putative+osteoblast+precursors+at+the+medaka+notochordal+sheath+prior+to+mineralization.">A col10a1:nlGFP transgenic line displays putative osteoblast precursors at the medaka notochordal sheath prior to mineralization.</a> Dev Biol. 381 (1), 134-143 (2013).</li><li>Renn, J., Winkler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osterix-mCherry+transgenic+medaka+for+in+vivo+imaging+of+bone+formation.">Osterix-mCherry transgenic medaka for in vivo imaging of bone formation.</a> Dev Dyn. 238 (1), 241-248 (2009).</li><li>Schilling, T. F., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segment+and+cell+type+lineage+restrictions+during+pharyngeal+arch+development+in+the+zebrafish+embryo.">Segment and cell type lineage restrictions during pharyngeal arch development in the zebrafish embryo.</a> Development. 120 (3), 483-494 (1994).</li><li>Spoorendonk, K. M., Peterson-Maduro, J., Renn, J., Trowe, T., Kranenbarg, S., Winkler, C., Schulte-Merker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+and+Cyp26b1+are+critical+regulators+of+osteogenesis+in+the+axial+skeleton.">Retinoic acid and Cyp26b1 are critical regulators of osteogenesis in the axial skeleton.</a> Development. 135 (22), 3765-3774 (2008).</li><li>To, T. T., Witten, P. E., Renn, J., Bhattacharya, D., Huysseune, A., Winkler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rankl-induced+osteoclastogenesis+leads+to+loss+of+mineralization+in+a+medaka+osteoporosis+model.">Rankl-induced osteoclastogenesis leads to loss of mineralization in a medaka osteoporosis model.</a> Development. 139 (1), 141-150 (2012).</li><li>Wakamatsu, Y., Pristyazhnyuk, S., Kinoshita, M., Tanaka, M., Ozato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+see-through+medaka:+a+fish+model+that+is+transparent+throughout+life.">The see-through medaka: a fish model that is transparent throughout life.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 98 (18), 10046-10050 (2001).</li><li>Witten, P. E., Huysseune, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+view+on+mechanisms+and+functions+of+skeletal+remodelling+in+teleost+fish,+with+special+emphasis+on+osteoclasts+and+their+function.">A comparative view on mechanisms and functions of skeletal remodelling in teleost fish, with special emphasis on osteoclasts and their function.</a> Biol Rev Camb Philos Soc. 84 (2), 315-346 (2009).</li><li>Yu, T., Witten, P. E., Huysseune, A., Buettner, A., To, T. T., Winkler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+osteoclast+inhibition+by+bisphosphonates+in+a+medaka+osteoporosis+model.">Live imaging of osteoclast inhibition by bisphosphonates in a medaka osteoporosis model.</a> Dis Model Mech. 9 (2), 155-163 (2016).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip veya mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Protokol çerçevesinde kritik adımlar Farklı numunelerin karşılaştırırken ısı şoku muamelesinden koşulları tutarlı ve stabil olması esastır. Sabit sıcaklık koşullarında, ctsk taranması doğrulanabilir Sonuç olarak, benzer osteoklast formasyonunu transgenik larvalarda RANKL indüksiyon benzer seviyelerde garanti eder ve: nlGFP ifade. Son olarak, bu ALC boyama ile doğrulanmış olarak indüklenen ektopik kemik erimesi, osteoporoz gibi lezyonlar benzer derecede olur...

omurgalı iskelet, organlar için yapısal destek ve koruma sağlayan hareketlilik sağlar ve kalsiyum kaynağı olarak hizmet vermektedir. hayatı boyunca, hücre dışı matriks kemik sürekli kemik istikrar ve sertliği korumak için ters çevrilir. Bu işlem, sıkı bir şekilde koordine aktivitesi ve kemik oluşturan osteoblastların ve kemik erimesi ile ilgili osteoklastı etkileşimi gerektirir. Osteoblastlar multipotent mezenkimal atalarıdır türetilen ve osteoid, kemik matrisinin 10 proteinli kısmını oluşturmak üzere kolajen üretimini edilir. Osteoblastlar kemik homeostazı 7 kontrol etmek için gerekli olan hücre tipleri, her ikisi de dengeli bir etkinlik elde etmek osteoklastlar ile etkileşim. Çünkü bu karmaşık düzenleyici etkileşimlerin, ilaç tedavisi ve kemik homeostazı yanıtları tam in vitro çalışmalar kullanılarak incelenebilir edilemez. Bu nedenle, hayvan modellerinde güçlü bir talep vardır. Hücre kültürü ayarlarına göre, in vivo modellerde sağlayabilirKemik ortamında çok hücreli ağlar değerli bir fikir. Çok sayıda fare modelleri, osteoporoz 16 de dahil olmak üzere, insan kemik bozukluklarının çeşitli ana kadar. Ancak, büyüklüğü ve fare embriyoları erişilebilirliği iskelet süreçlerin canlı görüntüleme için önemli sınırlamalar temsil etmektedir. Küçük Teleost balık, diğer yandan, in vivo görüntüleme için cazip bir alternatif olarak hizmet eder. Balığı (Danio rerio) ve Medaka (Oryzias latipes) son yirmi yıl 17, 19, 22, 24 üzerindeki kemik araştırma için popüler bir hayvan modelleri haline gelmiştir. Teleost balıklarda ve memelilerde kemik yapısal ve fizyolojik bir seviyede hem de çok benzer ve kilit düzenleyici gen ve sinyal yollarının çok 3 muhafaza edilir. Memelilerde gibi teleost balık dikkatle osteoblast ve kemik oluşumunu ve erimesini 26 denge osteoklastların aktivitesi düzenler. fi En önemlisi, optik netlikSH larva, kemik hücreleri ve canlı bir hayvanda hücresel süreçlerin &#39;in gözlemlenmesini kolaylaştırmaktadır kalsifiye iskelet matris 8, 9, 12, 21, 23, etiket, floresan muhabir kullanımına izin verir. Buna ek olarak, genetik bir dizi araç balık biyo-medikal ilgili araştırmaları kolaylaştırmak için oluşturuldu. Özellikle Medaka, CRISPR / Cas9 2, 6 izleme hücre soy ve site-spesifik transgenesis 14 yeni kurulan ve yaygın kullanımda 15 şimdi edilmiş hedeflenen gen mutasyonuna yöntemleri için. Küçük Teleost larvaları başarıyla birkaç farmakolojik olarak ilgili ilaç 1, 18 keşfine yol kimyasal ekranlar için kullanılmıştır. Balık larvaları DMSO düşük konsantrasyonlarına dayanıklı ve deriden veya mide-bağırsak, 1 ile 5 arasındaki, ya da su ortamında gelen bileşikleri emebilmektedir. Bizim laboratuvar önceden temsilcisiÇeşitli osteoblast- ve osteoklast özgü promoterlerin kontrolü altında, kemik hücrelerinde floresan haberci ifade orted transjenik Medaka hatları. 20, 21, olgun osteoblast (osteokalsin, OSC) 27 ve osteoklastlar (katepsin K ctsk) 24; bu erken osteoblast (Osterix, OS X kollajen 10a1, col10a1) içerir. Ayrıca, bir ısı şoku ile uyarılabilir promoterinin 24 kontrolü altında osteoklast başlatıcı faktör Nükleer faktör kB Ligand (RANKL) reseptör Aktivatör eksprese eden bir transgen doğru oluşturulur. Bu sistemde RANKL endüksiyonu aktif osteoklastlar ektopik oluşumu ile sonuçlanır. Bu omur gövdelerinde büyük ölçüde azalır mineralizasyon ile, artmış kemik rezorpsiyonu ve şiddetli osteoporoz gibi fenotipe yol açar. Biz son zamanlarda bu modelde osteoklast aktivitesi bifosfonatlar Etidronate ve alendronat, tw tarafından bloke edilebilir olduğunu gösterdigenel olarak, insan osteoporoz tedavisinde kullanılan O ilaçlar, bu şekilde osteoporoz 27 için uygun bir model sistem olarak Medaka&#39;nın doğrulanması. Büyük olması nedeniyle kuluçka boyutu, hızlı gelişme ve embriyo küçük boyutu, transjenik Medaka larva osteoporoz ilaçların büyük ölçekli tarama ve kemik hücre davranış in vivo analizler için çok uygun olan. Medaka çalışmalar, böylece etkili bir şekilde hücre kültürlerinde ve insan kemik bozuklukları için yeni terapötik hedefler ve yeni tedavilerin keşfetmek amaçlayan farelerde deneyler tamamlayabilir. Bu çalışmada, ortak osteoporoz ilaç, alendronat ile Medaka kemik muhabir larva tedavisi için bir protokol açıklar. monte edilir ve kemik matriks ve kemik hücrelerinin canlı görüntüleme için hazırlanmıştır nasıl tedavi larvaları Biz de ayrıntılı olarak açıklamaktadır. Bu protokoller kolayca diğer küçük kimyasal bileşiklere adapte edilebilir kemik anabolik veya anti-emici ilaç olarak ya da iş. &lt;/ P&gt;

<table><tbody><tr><td>Alendronate&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A4978</td><td></td></tr><tr><td>alizarin-3-methyliminodiacetic acid, Alizarin Complexone</td><td>Sigma</td><td>A3882</td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Sigma</td><td>C0875</td><td></td></tr><tr><td>ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ (1.4.3.67)</td><td>National Institute of Health (NIH)</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr><tr><td>LSM 510 Meta confocal&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM Image Browser (4.2.0.121)</td><td>Zeiss</td><td></td><td>http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/lsm-5-series.html</td></tr><tr><td>Micro-loader</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>Eppendorf ep T.I.P.S 20 &amp;mu;L</td></tr><tr><td>NIS-Elements BR 3.0 software</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photoshop CS6 (13.0.0.0)</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SMZ1000 stereomicroscope&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

drug treatment and in vivo imaging of osteoblast-osteoclast interactions in a medaka fish osteoporosis model

osteoblastlar kemik matriksinin ciro koordine etmek kemik rezorbe osteoklast ile etkileşim ve iskelet homeostazı kontrol etmek için kemik oluşturan. Medaka ve Zebra balığı larvaları yaygın kemik oluşumu, dejenerasyon ve onarım sırasında kemik hücrelerinin davranışını analiz etmek için kullanılır. Optik netlik floresan etiketli kemik hücreleri ve mineralli iskelet matrise bağlı floresan boyalar görselleştirme sağlar. Bizim laboratuvar bir ısı şoku ile uyarılabilir promoterinin kontrolü altında osteoklast başlatıcı faktör Nükleer faktör kB Ligand (RANKL) reseptör Aktivatör transgen Medaka balık üretti. Katepsin K (ctsk) promoterinin kontrolü altında nlGFP ifadesi ile raportör çizgilerle görüntülenmiştir Aktive edilmiş osteoklastlar, aşırı oluşumuna RANKL sonuçları ektopik ekspresyonu. RANKL indüksiyon ve ektopik osteoklast oluşumunu şiddetli osteoporoz gibi fenotipleri yol açar. Bileşik transgenik Medaka lictsk ifade Nes: nlGFP erken osteoblastlarda Osterix (OS X) promoterinin kontrolü altında osteoklastlar, hem de mCherry, her iki hücre tipinde etkileşimini incelemek için kullanılabilir. Bu kemik erimesi ve onarım koşulları altında hücresel davranış in vivo gözlem kolaylaştırır. Burada, genel olarak, insan osteoporoz tedavisinde kullanılan bir ilaç test etme ve canlı görüntüleme için bir protokol tanımlamak için bu sistemin kullanımını tarif eder. Medaka modeli hücre kültürü ve farelerde çalışmaları tamamlar ve iskelet sisteminde ilaç etkisinin in vivo analizi için yeni bir sistem sunmaktadır.

Bol miktarda yumurta sayıları, hem de larva küçük boyutu, Medaka&#39;nın ilaç taraması için ideal bir model haline getirmektedir. Tek bir altı plaka istatistiksel olarak anlamlı bir veri sağlamak için yeterli 36 larva, kadar kültüre kullanıldı. iskelet analizi için balık kullanmanın bir diğer büyük avantajı, canlı görüntüleme yapma imkanı vardır. Balık larvaları asetat kemik hücrelerini, hem de mineralizasyon görselleştirmek için kemik matrisine bağlanır boyaların kullanımını et...

Watch this Scientific Journal Video about Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model at JoVE.com

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.

İlaç Tedavi ve<em&gt; İn Vivo</em&gt; Bir Medaka Balık Osteoporoz Modelinde Osteoblast-Osteoklast Etkileşimler Görüntüleme

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka ...

drug-treatment-vivo-imaging-osteoblast-osteoclast-interactions-medaka

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

9.2K Görüntüleme.  National University of Singapore. Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.

Video: Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Intra-iliac Artery Injection for Efficient and Selective Modeling of Microscopic Bone Metastasis

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely used intra-cardiac and intra-tibial injections, IIA injection brings several advantages. First, it can deliver a large quantity of cancer cells specifically to hind limb bones, thereby providing spatiotemporally synchronized early-stage colonization events and allowing robust quantification and swift detection of disseminated tumor cells. Second, it injects cancer cells into the circulation without damaging the local tissues, thereby avoiding inflammatory and wound-healing processes that confound the bone colonization process. Third, IIA injection causes very little metastatic growth in non-bone organs, thereby preventing animals from succumbing to other vital metastases, and allowing continuous monitoring of indolent bone lesions. These advantages are especially useful for the inspection of progression from single cancer cells to multi-cell micrometastases, which has largely been elusive in the past. When combined with cutting-edge approaches of biological imaging and bone histology, IIA injection can be applied to various research purposes related to bone metastases.

This manuscript provides the detailed procedure of intra-iliac artery (IIA) injection, a technique to deliver cancer cells specifically to hind limb tissues including bones to establish experimental bone metastases. Although initially established with breast tumor models, this protocol can be easily extended to other cancer types.

Mikroskopik Kemik Metastazı Verimli ve Seçici Modelleme için intra-iliak arter Enjeksiyon

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely ...

Kanser Araştırmaları

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows within roughly two weeks after injury. Furthermore, zebrafish are able to heal bone rapidly after trepanation of the skull, and repair fractures that can be easily introduced into zebrafish bony fin rays. These injury assays represent feasible experimental paradigms to test the effect of administered drugs on rapidly forming bone. Here, we describe the use of these 3 injury models and their combined use with systemic glucocorticoid treatment, which exerts bone inhibitory and immunosuppressive effects. We provide a workflow on how to prepare for immunosuppressive treatment in adult zebrafish, illustrate how to perform fin amputation, trepanation of calvarial bones, and fin fractures, and describe how the use of glucocorticoids affects both bone forming osteoblasts and cells of the monocyte/macrophage lineage as part of innate immunity in bone tissue.

Here, we describe 3 adult zebrafish injury models and their combined use with immunosuppressive drug treatment. We provide guidance on imaging of regenerating tissues and on detecting bone mineralization therein.

Kemik doku Yenileyici prednizolon etkilerini incelemek için yetişkin zebra balığı yaralanma modelleri

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...

Gelişim Biyolojisi

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

Ardışık<em&gt; In vivo</em&gt; Kırık Onarım sırasında Osteojenik Kök / Progenitör Hücrelerinin Görüntüleme

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Tıp

Computed Tomography and Optical Imaging of Osteogenesis-angiogenesis Coupling to Assess Integration of Cranial Bone Autografts and Allografts

A major parameter determining the success of a bone-grafting procedure is vascularization of the area surrounding the graft. We hypothesized that implantation of a bone autograft would induce greater bone regeneration by abundant blood vessel formation. To investigate the effect of the graft on neovascularization at the defect site, we developed a micro&#8211;computed tomography (&#181;CT) approach to characterize newly forming blood vessels, which involves systemic perfusion of the animal with a polymerizing contrast agent. This method enables detailed vascular analysis of an organ in its entirety. Additionally, blood perfusion was assessed using fluorescence imaging (FLI) of a blood-borne fluorescent agent. Bone formation was quantified by FLI using a hydroxyapatite-targeted probe and &#181;CT analysis. Stem cell recruitment was monitored by bioluminescence imaging (BLI) of transgenic mice that express luciferase under the control of the osteocalcin promoter. Here we describe and demonstrate preparation of the allograft, calvarial defect surgery, &#181;CT scanning protocols for the neovascularization study and bone formation analysis (including the in vivo perfusion of contrast agent), and the protocol for data analysis.
The 3D high-resolution analysis of vasculature demonstrated significantly greater angiogenesis in animals with implanted autografts, especially with respect to arteriole formation. Accordingly, blood perfusion was significantly higher in the autograft group by the 7th day after surgery. We observed superior bone mineralization and measured greater bone formation in animals that received autografts. Autograft implantation induced resident stem cell recruitment to the graft-host bone suture, where the cells differentiated into bone-forming cells between the 7th and 10th postoperative day. This finding means that enhanced bone formation may be attributed to the augmented vascular feeding that characterizes autograft implantation. The methods depicted may serve as an optimal tool to study bone regeneration in terms of tightly bounded bone formation and neovascularization.

Implantation of autologous and allogeneic bone grafts constitute accepted approaches to treat major craniofacial bone loss. Yet the effect of graft composition on the interplay among neovascularization, cell differentiation and bone formation is unclear. We present a multimodal imaging protocol aimed to elucidate the angiogenesis-osteogenesis interdependence at the graft proximity.

Bilgisayarlı Tomografi ve Osteogenezi-anjiyogenez bağlamalar Optik Görüntüleme Kranial Kemik Otogreftlerin ve allogreft Entegrasyon değerlendirmek için

A major parameter determining the success of a bone-grafting procedure is vascularization of the area surrounding the graft. We hypothesized that ...

Biyomühendislik

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone resorption. Osteoclasts can be generated in vitro from monocyte/macrophage precursor cells in the presence of certain cytokines, which promote survival and differentiation. Here, both in vivo and in vitro techniques are demonstrated, which allow scientists to study different cytokine contributions towards osteoclast differentiation, signaling, and activation. The minicircle DNA delivery gene transfer system provides an alternative method to establish an osteoporosis-related model is particularly useful to study the efficacy of various pharmacological inhibitors in vivo. Similarly, in vitro culturing protocols for producing osteoclasts from human precursor cells in the presence of specific cytokines enables scientists to study osteoclastogenesis in human cells for translational applications. Combined, these techniques have the potential to accelerate drug discovery efforts for osteoclast-specific targeted therapeutics, which may benefit millions of osteoporosis and arthritis patients worldwide.

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Differentiation of precursor cells into osteoclasts is regulated by cytokines and growth factors. Here, a novel gene transfer technique for differentiation of osteoclasts in vivo and cell culture protocols for differentiating precursor cells into osteoclasts in vitro as a method to study the effects of cytokines on osteoclastogenesis are described.

Bir Roman<em&gt; In vivo</em&gt; Gen Transferi Tekniği ve<em&gt; In vitro</emİskelet Hastalıkları Kemik Kaybı Çalışmaları&gt; Hücre Tabanlı Tahliller

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone ...

Semiautomated Longitudinal Microcomputed Tomography-based Quantitative Structural Analysis of a Nude Rat Osteoporosis-related Vertebral Fracture Model

Osteoporosis-related vertebral compression fractures (OVCFs) are a common and clinically unmet need with increasing prevalence as the world population ages. Animal OVCF models are essential to the preclinical development of translational tissue engineering strategies. While a number of models currently exist, this protocol describes an optimized method for inducing multiple highly reproducible vertebral defects in a single nude rat. A novel longitudinal semiautomated microcomputed tomography (&#181;CT)-based quantitative structural analysis of the vertebral defects is also detailed. Briefly, rats were imaged at multiple time points post-op. The day 1 scan was reoriented to a standard position, and a standard volume of interest was defined. Subsequent &#181;CT scans of each rat were automatically registered to the day 1 scan so the same volume of interest was then analyzed to assess for new bone formation. This versatile approach can be adapted to a variety of other models where longitudinal imaging-based analysis could benefit from precise 3D semiautomated alignment. Taken together, this protocol describes a readily quantifiable and easily reproducible system for osteoporosis and bone research. The suggested protocol takes 4 months to induce osteoporosis in nude ovariectomized rats and between 2.7 and 4 h to generate, image, and analyze two vertebral defects, depending on tissue size and equipment.

The goal of this protocol is to generate a nude rat osteoporosis-related vertebral compression fracture model that can be longitudinally evaluated in vivo using a semiautomated microcomputed tomography-based quantitative structural analysis.

Semiautomated boyuna Microcomputed tomografi tabanlı nicel yapısal analizi bir çıplak sıçan vertebra kırığı Osteoporoz ile ilgili Model

Osteoporosis-related vertebral compression fractures (OVCFs) are a common and clinically unmet need with increasing prevalence as the world population ...

Using Alizarin Red Staining to Detect Chemically Induced Bone Loss in Zebrafish Larvae

Chemically induced bone loss due to lead (Pb) exposure could trigger an array of adverse impacts on both human and animal skeletal systems. However, the specific effects and mechanisms in zebrafish remain unclear. Alizarin red has a high affinity for calcium ions and can help visualize the bone and illustrate skeletal mineral mass. In this study, we aimed to detect lead acetate (PbAc)-induced bone loss in zebrafish larvae by using alizarin red staining. Zebrafish embryos were treated with a series of PbAc concentrations (0, 5, 10, 20 mg/L) between 2 and 120 h post fertilization. Whole-mount skeletal staining was conducted on larvae at 9 days post fertilization, and the total stained area was quantified using ImageJ software. The results indicated that the mineralized tissues were stained in red, and the stained area decreased significantly in the PbAc-exposure group, with a dose-dependent change in bone mineralization. This paper presents a staining protocol for investigating skeletal changes in PbAc-induced bone defects. The method can also be used in zebrafish larvae for the detection of bone loss induced by other chemicals.

Here, we have used alizarin red staining to show that lead acetate exposure causes a bone mass change in zebrafish larvae. This staining method can be adapted to the investigation of bone loss in zebrafish larvae loss induced by other hazardous toxicants.

Zebra Balığı Larvalarında Kimyasal Olarak İndüklenen Kemik Kaybını Tespit Etmek için Alizarin Kırmızı Boyama Kullanımı

Chemically induced bone loss due to lead (Pb) exposure could trigger an array of adverse impacts on both human and animal skeletal systems. However, the ...

<meta charset="utf8"></head><body>Zebra Balığı Larvalarında Kemik Rejenerasyonunu İncelemek için Lazer Ablasyon Yöntemi

Two-Photon Laser-Mediated Ablation of Osteoblasts in Developing Zebrafish Larvae

Zebrafish (Danio rerio) have an outstanding capacity to regenerate different organs and appendages. Bone regeneration in zebrafish has been studied using different methods such as fin amputation, scale plucking, skull trepanation, and microscopic approaches. Using a confocal laser scanning setup equipped with a two-photon laser, a laser ablation method was developed as a lesion paradigm to ablate bone-forming cells (osteoblasts) in the developing opercle of zebrafish larvae. The method described here allows the ablation of cells in a precise manner, as the area, shape, and depth can be finely adjusted. In addition, this method allows imaging of the area before and just after the ablation, so that short-term effects of the injury can be analyzed. In this experimental setup, the immune response after ablation of osteoblasts in the injured area was studied. An increase in the recruitment of macrophages was observed after ablation, indicating the relevance of their presence during bone regeneration.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: İmmün Aracılı Kemik Rejenerasyonu — Restoratif Süreçlerde Makrofajların ve Kontrollü İmmünomodülasyonun Kritik Rolü

This protocol describes a two-photon laser ablation approach carried out in zebrafish larvae, which serves as a model to study bone regeneration and the effects of the immune response to ablation.

Gelişmekte Olan Zebra Balığı Larvalarında Osteoblastların İki Foton Lazer Aracılı Ablasyonu

Zebrafish (Danio rerio) have an outstanding capacity to regenerate different organs and appendages. Bone regeneration in zebrafish has been studied using ...

İlaç Tedavi ve

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Mikroskopik Kemik Metastazı Verimli ve Seçici Modelleme için intra-iliak arter Enjeksiyon

Kemik doku Yenileyici prednizolon etkilerini incelemek için yetişkin zebra balığı yaralanma modelleri

Ardışık

Bilgisayarlı Tomografi ve Osteogenezi-anjiyogenez bağlamalar Optik Görüntüleme Kranial Kemik Otogreftlerin ve allogreft Entegrasyon değerlendirmek için

Bir Roman

Semiautomated boyuna Microcomputed tomografi tabanlı nicel yapısal analizi bir çıplak sıçan vertebra kırığı Osteoporoz ile ilgili Model

Zebra Balığı Larvalarında Kimyasal Olarak İndüklenen Kemik Kaybını Tespit Etmek için Alizarin Kırmızı Boyama Kullanımı

Gelişmekte Olan Zebra Balığı Larvalarında Osteoblastların İki Foton Lazer Aracılı Ablasyonu

Gelişmekte Olan Zebra Balığı Larvalarında Osteoblastların İki Foton Lazer Aracılı Ablasyonu

Gelişmekte Olan Zebra Balığı Larvalarında Osteoblastların İki Foton Lazer Aracılı Ablasyonu