Bu proje Milli Eğitim Singapur Bakanlığı (MEB, hibe numarası 2013-T2-2-126) ve Sağlık, ABD Ulusal Enstitüsü (NIH, numara 1R21AT008452-01A1 hibe) hibe ile finanse edildi. TY Biyolojik Bilimler NUS Bölümü&#39;nden mezun burs aldı. Biz onların sürekli destek için Biyogörüntüleme Bilimleri NUS Merkezi (CBIS) konfokal birimi teşekkür ederim.

Tüm deneyler National University of Singapore (R14-293) onaylı Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) protokollere uygun olarak yapıldı. 1. Balık Yetiştiriciliği ve Embriyolar Koleksiyonu <ol><li> Raise WT, ctsk: nlGFP 24, RANKL: HSE: OBP 24 ve osx: kontrollü ışık döngüsü altında MCherry 21 tek veya 26 ° C&#39;de bileşik transgenik Medaka balığı (14 saat aydınlık, 10 saat karanlık) yumurtlama uyardığı. </li><li> Işık açıldıktan sonra günlük yumurtlama ilk 30 dakika boyunca gerçekleşir. yumurta filamentler ile birlikte sopa ve birkaç saat dişinin karın eklemek. bir yumurta küme taşıyan bir kadın yetişkin yakalamak için ince örgülü net kullanın. Balık kısaca net dinlenmek ve daha sonra yavaşça dikkatlice kadın karın döllenmiş yumurta küme şerit balıkların karın masaj edelim. NOT: Sağlıklı bir Medaka kadınYaklaşık 5 ay boyunca 20 yumurta her gün - 10 üretebilir. </li><li> 60 mm plastik Petri kabı içine yumurta yerleştirin. 5, embriyolar durulama plastik bir pipet kullanın - 10 mL en 0.3x Danieau çözeltisi (balık ortamı (19.3 mM NaCI, 0.23 mM KCI, 0.13 mM MgSO 4, 0.2 mM Ca NO 3) 2 ve 1.7 mM HEPES, pH 7.0). mantar gelişimini önlemek için% 0.25 ile 1 mL balık ortamı 2.5 L (ağ / hac) metilen mavi stok solüsyonu ekleyin. </li><li> Yavaşça eki filamentler bir düğüm oluşturmak için yumurta küme yuvarlayın. Dikkatlice bireysel embriyolar (Şekil 1A) elde etmek için döllenmiş yumurta kümelerden eki filamentler çıkarmak için forseps kullanın. </li><li> Iwamatsu 2004 13 göre embriyolar Sahne. </li><li> Kültür 20 - 28 ° C inkübatör 60 mm plastik Petri kabı başına 30 embriyolar. embriyoların normal gelişimini sağlamak için her gün orta değiştirin. NOT: kuluçka aşamasında (8 kez etrafında - 9 d postfertilization,DPF) hayatta kalma için kritiktir. temiz ortamı tutmak ve iyi larva sağkalım oranları sağlamak için serbest yüzen chorions çıkarın. </li></ol> 2. Transgenik Embriyo tarama <ol><li> 40X büyütme kullanılarak flüoresan raportör ekspresyonu için transgenik embriyo taranması için floresan görüntüleme ve GFP, RFP ve CFP filtrelerinin cıva lambası ile donatılmış bir stereomikroskop kullanın. </li><li> Görsel OSX tespit: MCherry raportör ekspresyonu ile MCherry embriyolar erken oluşturucu arka kafa (Şekil 1B, ok) ve parasphenoid her iki tarafında, örneğin cleithrum olarak kafatası kemikleri, ventral kafatası merkezi bir konumda ( Şekil 1B, ok başı). NOT: Muhabir ifade itibaren 21 5 DPF başlar. </li><li> Ctsk belirleyin: Güçlü nlGFP ifade tarafından nlGFP embriyolar kafa (Şekil 1C, ok) ve kuyruk (Şekil 1C, ok başı), başlayan6 DPF. NOT: İçsel osteoklastlar sadece 21 DPF sonra oluştururlar. Bu erken aşamada (6 DPF) hücreleri nlGFP ifade eden, bugüne kadar uncharacterized osteoklastlar ancak diğer değil pozitif hücreler 24 ctsk. </li><li> RANKL belirlenmesi: HSE: yerde CFP sentezlenmesiyle CFP transjenik embriyoları 2 dpf veya daha tarama amacıyla yapılan 39 ° C &#39;de 20 dakika boyunca kısa bir ısı şoku muamelesinden sonra. NOT: RANKL ve OBP transgenlerin aynı çift yönlü Isı Şoku Elemanı (SEÇ) kontrolü altındadır. CFP sentezleme başarılı RANKL&#39;ın indüksiyonu 24 gösterir. </li><li> Dolayısıyla osteoporoz gibi fenotip 24 sonuçlanır gövde bölgede, ektopik osteoklastlar çok sayıda ikna etmek için daha sonra 9 DPF 2 saat ısı şoku tedavi veya - 1.5 gerçekleştirin. NOT: endojen tetiklenir uyuyan osteoklast progenitör hücrelerin, bir ektopik aktivasyonu 9 DPF sonuçlara yol açtığı Transgenik RANKL ifade21 DPF önce. kararlı 39 ° C koşulları elde etmek için bir su banyosu kullanın. Petri içeren Medaka embriyolar su yüzeyinde yüzen izin. Emin petri kapak çanak batan önlemek için kuru olduğundan emin olun. </li><li> Bu RANKL bileşik hatları, ekran embriyolar: HSE: CFP / ctsk: nlGFP çift transgenik ve OS X: MCherry / RANKL: HSE: CFP / ctsk: nlGFP üç transjenik, her bir transgen sentezleme desenine göre yöntem. Not: hemizigot ve homozigoz transgenik embriyo raportör transgen farklı floresan seviyeleri ile ayırt edildi. Homozigot embriyolar hemizigot transgeniklerinin kıyasla iki kat, yaklaşık bir floresan yoğunluğu vardı. HSE: CFP ve ctsk: Her iki RANKL için homozigot olan Bileşim hatları nlGFP tekrar birkaç nesil boyunca incrossing ile elde edilmiştir. MCherry / RANKL: HSE: CFP / ctsk: üçlü transgenik osx için nlGFP balık,<html> homozigot RANKL: HSE: CFP / ctsk: mCherry taşıyıcıları: nlGFP balık homozigot osx ile geçti. Elde edilen heterozigot üç transjenik soy kaldırdı ve RANKL için homozigot embriyolar elde etmek üzere incrossed edilmiştir: HSE: CFP. RANKL: HSE: CFP transgen ektopik osteoklastların etkin indüksiyonu elde edilmesi için homozigot olması gerekir. </li></ol><img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55025/55025fig1.jpg" /> Şekil 1: WT ve 7 D postfertilization de transgenik Medaka Embriyolar (DPF). Bir. WT embriyolar aydınlık aydınlatma ile gözlemledik. B. Osx gösteren Transgenik embriyolar: cleithrum (ok) ve parasphenoid (ok) etrafında MCherry ifade. Cı. Ctsk gösteren Transgenik embriyolar: nlGFP kafa (ok) ifadesi ve kuyruk (ok başı). Ölçek çubukları: 500 mikron.025 / 55025fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. Medaka Larva 3. Bifosfonat Tedavisi <ol><li> Doz-cevap çalışmaları bifosfonatlar (bps) farklı konsantrasyonlarda içeren solüsyonlar hazırlayın. NOT: Bu protokolde kullanılan örnek, BP alendronat olduğunu. <ol><li> Bir stok çözeltisi hazırlamak için 100 ug / ml bir konsantrasyonda balık ortam içinde alendronat çözülür. </li><li> Tam çözünmeyi sağlamak için, bir girdaplı karıştırıcı kullanarak. 4 ° C&#39;de stok solüsyonu saklayın. </li><li> Konsantrasyonları bir dizi balık ortamı ile stok çözelti seyreltilerek farklı çalışma çözelti hazırlayın (örneğin, 25, 37.5, 50, 62.5 ve 75 ug / mL). NOT: Farklı ilaçlar bu Medaka larvaları sistemi kullanarak test sırasında dikkate alınması gereken farklı emilim, dağılım, Metabolizma ve Boşaltım (DEME) parametreleri, olabilir. Ayrıca ilaç çözünürlük ve stabilite değişebilirsulu bir çözelti olarak tatbik. Daha az suda çözünür bileşikleri, ilk olarak DMSO gibi bir organik çözücü içinde çözülmüş, gerekebilir. Bu durumda, bir stok çözeltisi daha sonra balık ortamı içinde seyreltilir DMSO içinde hazırlanır. Su (balık ortamı) çalışan çözümler birkaç wk buzdolabında saklanabilir unutmayın. Ancak, DMSO ihtiva eden çözeltiler kristalleşmeyi önlemek için oda sıcaklığında muhafaza edilmesi gerekir. </li></ol></li><li> altı yuvalı plakalar içine aktarın Medaka larvaları (altı larva / oyuk) daha sonra kan basıncı (alendronat) tedavisi için kullanılabilir. </li><li> dikkatli bir şekilde temiz bir plastik pipet kullanılarak balık Ortamı çıkarın ve her bir oyuğa alendronat çözeltinin küçük bir hacim (yakl. 0.5 mi) ilave edin. </li><li> az konsantre alendronat çözümleri için özellikle önemlidir eklendi BP çözüm seyreltilmiş olabileceği gibi artık balık ortamı, kaçının. </li><li> temiz bir plastik pipet ile her çukurdan alendronat çözeltisi (0,5 mL) içindeki bir küçük hacimli çıkarın ve daha büyük bir VOLU ile değiştirinalendronat çözeltisi bana (4 mL) eklenmiştir. </li><li> Normal embriyolar gelişimini sağlamak için orta günlük olarak değiştirin. </li></ol> Mineralize kemik Matrix 4. Canlı Boyama <ol><li> sırası ile,% 1 ve% 0.1 stok çözeltileri hazırlamak için ya da balık ortamı 50 mL kalseinin 0.05 g (alizarin-3-metiliminodiasetik asit ALC) Alizarin komplekson 0.5 g çözündürülür. Tam çözünmeyi sağlamak için, bir girdaplı karıştırıcı kullanarak. Not: metilen mavisi ilave edilmeden balık ortamı Bu kullanılır ve daha sonraki adımlar, larva otofloresan azaltır. </li><li> boyama çözüm süzmek için bir şırınga ve tek kullanımlık filtre (0.2 mikron) kullanın. Oda sıcaklığında, karanlıkta, süzüldü çözelti saklayın. NOT: süzülmüş, berrak ALC boyama çözeltisinin rengi turuncu, sarı karanlık. süzülmüş, berrak kalsein çözeltisi rengi sarı parlak. Çözümler birkaç ay boyunca kullanılabilmektedir. </li><li> Balık ortamında süzülmüş ALC veya kalsein stok solüsyonu 01:10 seyreltilirLarvalar 9 ila 17 DPF kullanıldığında, bir 28 ° C kuluçka makinesi içinde 2.5 saat (% 0.01 kalsein çözeltisi) - 2 saat boyunca (% 0,1 ALC çözelti) ya da 2 - ve 1.5 Medaka larva inkübe edin. Karanlıkta örnekleri tutun. </li><li> temiz bir plastik pipet kullanarak taze balık ortamına larva aktarın. </li><li> temiz bir plastik pipet ile balık orta kaldırmak ve taze balık orta ekleyin. 3 için bu adımı yineleyin - (sırasıyla, ALC veya kalsein) hayır kırmızı- veya sarı lekeli bir çözüm kadar 4 kez üzerinde bırakılır. ortamdan Epifloresans önlemek için görüntüleme için onları takmadan önce 60 dakika - 30 balık ortamda larvaları bırakın. NOT:% 0.1 ALC boyama çözümü genişletilmiş pozlama süreleri için Medaka larva için zararlıdır. en fazla 2 saatlik inkubasyon sürelerinin larvalarının yaşamlarını sürdürmeleri etkiler. Konsantrasyon ve boyama zaman, bu nedenle optimum embriyo hayatta kalma ve boyama sonuçları elde etmek için farklı aşamaları için optimize edilmesi gerekir. </li></ol> 5. Canlı Floresans Görüntüleme </<html> p&gt; <ol><li> Balık bir ortam içinde% 0.01 Tricaine (etil 3-aminobenzoat metansülfonat) ile Medaka larva anestezisi. NOT: Anestezi larvalar 5 sonra hareketsiz hale - Tricaine çözeltisi içinde 10 dakika ve genellikle onların yüzüne ya da sırtlarında ya yalan söylemektedirler. </li><li> ilgi bölgeye göre larva yönlendirmek için plastik Microloader kullanın. Bu protokolde kullanılan larva yönü yanal olduğunu. </li><li> görüntüleme için floresan aydınlatma ile Stereomikroskopta kullanın. larvaları (baş, ön gövde, arka gövde ve kuyruk) farklı bölgelerinde odaklanan görüntüleri çekerken yüksek büyütme kullanın. Uygun bir görüntü işleme yazılımı (Şekil 3G takmalar) kullanarak bölgeleri üst üste birlikte bireysel görüntüleri birleştirin. NOT: Bu doğru odak düzleminde ilgili tüm vücut parçaları görüntü kalitesini artırmak için yardımcı olur. </li><li> görüntüleme sonrası iyileşme için balık ortamına larva dönün. </li></ol>tle &quot;&gt; 6. Canlı Konfokal Görüntüleme <ol><li> onlar hareketsiz hale gelene kadar 10 dakika - 5 için balık ortamında% 0.01 Tricaine ile larva uyutmak. </li><li> Bir mikrodalga fırında ısıtılarak balık ortamı içinde% 1.5 agaroz erime noktası düşük eritin. Serin, yaklaşık 30 ° C&#39;ye kadar bu çözelti. </li><li> Bir cam tabanlı Petri kabı balık ortamında agaroz sıvı% 1.5 düşük erime 1 ml - 0.5 ekleyin. temiz bir plastik pipet kullanarak çözüm içine anestezi larva aktarın. Not: Sıvı, düşük ısıda eriyen agaroz sıcaklığı larva zarar vermeyecek kadar yeterince düşük olduğu özel önlem almak. </li><li> Agaroz katılaşır önce Petri kabı alt larva itmek için plastik bir Microloader kullanmak ve ilgi bölgeye göre larva yolunuzu. Bu protokolde kullanılan larva yönü yanal olduğunu. NOT: agaroz tamamen katılaşır sonra numuneler konfokal canlı görüntüleme için hazırdır. </li><li> ACQ bir konfokal mikroskop kullanmakuire görüntüler. </li><li> MCherry ve ALC boyama analizleri için 543 nm lazer hattı kullanın. nlGFP için 488 nm lazer hattı kullanın ve kalsein boyama analiz eder. </li><li> Görüntüleme sonrası, Petri kabı balık orta eklemek ve dikkatle agaroz larvaları kaldırmak için ince şırınga iğneleri (27 G x 1½ &quot;) bir çift kullanın. residually kurtarmak için balık ortamı ile bir Petri kabı agaroz bağlı olan larvaları transfer . </li><li> Bir görüntü analiz yazılımı 27 kullanarak görüntüleri işleyin. </li></ol>

<ol>
	<li>Ablain, J., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+fish+and+men:+using+zebrafish+to+fight+human+diseases.">Of fish and men: using zebrafish to fight human diseases.</a> Trends Cell Biol. 23 (12), 584-586 (2013).</li><li>Ansai, S., Kinoshita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+mutagenesis+using+CRISPR/Cas+system+in+medaka.">Targeted mutagenesis using CRISPR/Cas system in medaka.</a> Biol Open. 3 (5), 362-371 (2014).</li><li>Apschner, A., Schulte-Merker, S., Witten, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Not+all+bones+are+created+equal-using+zebrafish+and+other+teleost+species+in+osteogenesis+research.">Not all bones are created equal-using zebrafish and other teleost species in osteogenesis research.</a> Methods Cell Biol. 105, 239-255 (2011).</li><li>Bajoghli, B., Aghaallaei, N., Heimbucher, T., Czerny, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+artificial+promoter+construct+for+heat-inducible+misexpression+during+fish+embryogenesis.">An artificial promoter construct for heat-inducible misexpression during fish embryogenesis.</a> Dev Biol. 271 (2), 416-430 (2004).</li><li>Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+high+content,+in+vivo+model+of+glucocorticoid-induced+osteoporosis.">A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis.</a> Biotechnol J. 1 (6), 651-655 (2006).</li><li>Centanin, L., Ander, J. J., Hoeckendorf, B., Lust, K., Kellner, T., Kraemer, I., Urbany, C., Hasel, E., Harris, W. A., Simons, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exclusive+multipotency+and+preferential+asymmetric+divisions+in+post-embryonic+neural+stem+cells+of+the+fish+retina.">Exclusive multipotency and preferential asymmetric divisions in post-embryonic neural stem cells of the fish retina.</a> Development. 141 (18), 3472-3482 (2014).</li><li>Charles, J. F., Aliprantis, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclasts:+more+than+'bone+eaters.">Osteoclasts: more than 'bone eaters.</a> Trends Mol Med. 20 (8), 449-459 (2014).</li><li>DeLaurier, A., Eames, B. F., Blanco-Sanchez, B., Peng, G., He, X., Swartz, M. E., Ullmann, B., Westerfield, M., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+sp7:EGFP:+a+transgenic+for+studying+otic+vesicle+formation,+skeletogenesis,+and+bone+regeneration.">Zebrafish sp7:EGFP: a transgenic for studying otic vesicle formation, skeletogenesis, and bone regeneration.</a> Genesis. 48 (8), 505-511 (2010).</li><li>Du, S. J., Frenkel, V., Kindschi, G., Zohar, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+normal+and+defective+bone+development+in+zebrafish+embryos+using+the+fluorescent+chromophore+calcein.">Visualizing normal and defective bone development in zebrafish embryos using the fluorescent chromophore calcein.</a> Dev Biol. 238 (2), 239-246 (2001).</li><li>Eriksen, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+of+bone+remodeling.">Cellular mechanisms of bone remodeling.</a> Rev Endocr Metab Disord. 11 (4), 219-227 (2010).</li><li>Hockendorf, B., Thumberger, T., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+embryogenesis:+a+perspective+for+light+sheet+microscopy.">Quantitative analysis of embryogenesis: a perspective for light sheet microscopy.</a> Dev Cell. 23 (6), 1111-1120 (2012).</li><li>Inohaya, K., Takano, Y., Kudo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+teleost+intervertebral+region+acts+as+a+growth+center+of+the+centrum:+in+vivo+visualization+of+osteoblasts+and+their+progenitors+in+transgenic+fish.">The teleost intervertebral region acts as a growth center of the centrum: in vivo visualization of osteoblasts and their progenitors in transgenic fish.</a> Dev Dyn. 236 (11), 3031-3046 (2007).</li><li>Iwamatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+normal+development+in+the+medaka+Oryzias+latipes.">Stages of normal development in the medaka Oryzias latipes.</a> Mech Dev. 121 (7), 605-618 (2004).</li><li>Kirchmaier, S., Hockendorf, B., Moller, E. K., Bornhorst, D., Spitz, F., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+site-specific+transgenesis+and+enhancer+activity+tests+in+medaka+using+PhiC31+integrase.">Efficient site-specific transgenesis and enhancer activity tests in medaka using PhiC31 integrase.</a> Development. 140 (20), 4287-4295 (2013).</li><li>Kirchmaier, S., Naruse, K., Wittbrodt, J., Loosli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genomic+and+genetic+toolbox+of+the+teleost+medaka+(Oryzias+latipes).">The genomic and genetic toolbox of the teleost medaka (Oryzias latipes).</a> Genetics. 199 (4), 905-918 (2015).</li><li>Komori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+osteoporosis.">Animal models for osteoporosis.</a> Eur J Pharmacol. 759, 287-294 (2015).</li><li>Mackay, E. W., Apschner, A., Schulte-Merker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bone+to+pick+with+zebrafish.">A bone to pick with zebrafish.</a> Bonekey Rep. 2, 445 (2013).</li><li>MacRae, C. A., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+tools+for+drug+discovery.">Zebrafish as tools for drug discovery.</a> Nat Rev Drug Discov. 14 (10), 721-731 (2015).</li><li>Mitchell, R. E., Huitema, L. F., Skinner, R. E., Brunt, L. H., Severn, C., Schulte-Merker, S., Hammond, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+osteoarthritis+genetics+in+zebrafish.">New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish.</a> Osteoarthritis Cartilage. 21 (2), 269-278 (2013).</li><li>Renn, J., Buttner, A., To, T. T., Chan, S. J., Winkler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+col10a1:nlGFP+transgenic+line+displays+putative+osteoblast+precursors+at+the+medaka+notochordal+sheath+prior+to+mineralization.">A col10a1:nlGFP transgenic line displays putative osteoblast precursors at the medaka notochordal sheath prior to mineralization.</a> Dev Biol. 381 (1), 134-143 (2013).</li><li>Renn, J., Winkler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osterix-mCherry+transgenic+medaka+for+in+vivo+imaging+of+bone+formation.">Osterix-mCherry transgenic medaka for in vivo imaging of bone formation.</a> Dev Dyn. 238 (1), 241-248 (2009).</li><li>Schilling, T. F., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segment+and+cell+type+lineage+restrictions+during+pharyngeal+arch+development+in+the+zebrafish+embryo.">Segment and cell type lineage restrictions during pharyngeal arch development in the zebrafish embryo.</a> Development. 120 (3), 483-494 (1994).</li><li>Spoorendonk, K. M., Peterson-Maduro, J., Renn, J., Trowe, T., Kranenbarg, S., Winkler, C., Schulte-Merker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+and+Cyp26b1+are+critical+regulators+of+osteogenesis+in+the+axial+skeleton.">Retinoic acid and Cyp26b1 are critical regulators of osteogenesis in the axial skeleton.</a> Development. 135 (22), 3765-3774 (2008).</li><li>To, T. T., Witten, P. E., Renn, J., Bhattacharya, D., Huysseune, A., Winkler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rankl-induced+osteoclastogenesis+leads+to+loss+of+mineralization+in+a+medaka+osteoporosis+model.">Rankl-induced osteoclastogenesis leads to loss of mineralization in a medaka osteoporosis model.</a> Development. 139 (1), 141-150 (2012).</li><li>Wakamatsu, Y., Pristyazhnyuk, S., Kinoshita, M., Tanaka, M., Ozato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+see-through+medaka:+a+fish+model+that+is+transparent+throughout+life.">The see-through medaka: a fish model that is transparent throughout life.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 98 (18), 10046-10050 (2001).</li><li>Witten, P. E., Huysseune, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+view+on+mechanisms+and+functions+of+skeletal+remodelling+in+teleost+fish,+with+special+emphasis+on+osteoclasts+and+their+function.">A comparative view on mechanisms and functions of skeletal remodelling in teleost fish, with special emphasis on osteoclasts and their function.</a> Biol Rev Camb Philos Soc. 84 (2), 315-346 (2009).</li><li>Yu, T., Witten, P. E., Huysseune, A., Buettner, A., To, T. T., Winkler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+osteoclast+inhibition+by+bisphosphonates+in+a+medaka+osteoporosis+model.">Live imaging of osteoclast inhibition by bisphosphonates in a medaka osteoporosis model.</a> Dis Model Mech. 9 (2), 155-163 (2016).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip veya mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Protokol çerçevesinde kritik adımlar Farklı numunelerin karşılaştırırken ısı şoku muamelesinden koşulları tutarlı ve stabil olması esastır. Sabit sıcaklık koşullarında, ctsk taranması doğrulanabilir Sonuç olarak, benzer osteoklast formasyonunu transgenik larvalarda RANKL indüksiyon benzer seviyelerde garanti eder ve: nlGFP ifade. Son olarak, bu ALC boyama ile doğrulanmış olarak indüklenen ektopik kemik erimesi, osteoporoz gibi lezyonlar benzer derecede olur...

omurgalı iskelet, organlar için yapısal destek ve koruma sağlayan hareketlilik sağlar ve kalsiyum kaynağı olarak hizmet vermektedir. hayatı boyunca, hücre dışı matriks kemik sürekli kemik istikrar ve sertliği korumak için ters çevrilir. Bu işlem, sıkı bir şekilde koordine aktivitesi ve kemik oluşturan osteoblastların ve kemik erimesi ile ilgili osteoklastı etkileşimi gerektirir. Osteoblastlar multipotent mezenkimal atalarıdır türetilen ve osteoid, kemik matrisinin 10 proteinli kısmını oluşturmak üzere kolajen üretimini edilir. Osteoblastlar kemik homeostazı 7 kontrol etmek için gerekli olan hücre tipleri, her ikisi de dengeli bir etkinlik elde etmek osteoklastlar ile etkileşim. Çünkü bu karmaşık düzenleyici etkileşimlerin, ilaç tedavisi ve kemik homeostazı yanıtları tam in vitro çalışmalar kullanılarak incelenebilir edilemez. Bu nedenle, hayvan modellerinde güçlü bir talep vardır. Hücre kültürü ayarlarına göre, in vivo modellerde sağlayabilirKemik ortamında çok hücreli ağlar değerli bir fikir. Çok sayıda fare modelleri, osteoporoz 16 de dahil olmak üzere, insan kemik bozukluklarının çeşitli ana kadar. Ancak, büyüklüğü ve fare embriyoları erişilebilirliği iskelet süreçlerin canlı görüntüleme için önemli sınırlamalar temsil etmektedir. Küçük Teleost balık, diğer yandan, in vivo görüntüleme için cazip bir alternatif olarak hizmet eder. Balığı (Danio rerio) ve Medaka (Oryzias latipes) son yirmi yıl 17, 19, 22, 24 üzerindeki kemik araştırma için popüler bir hayvan modelleri haline gelmiştir. Teleost balıklarda ve memelilerde kemik yapısal ve fizyolojik bir seviyede hem de çok benzer ve kilit düzenleyici gen ve sinyal yollarının çok 3 muhafaza edilir. Memelilerde gibi teleost balık dikkatle osteoblast ve kemik oluşumunu ve erimesini 26 denge osteoklastların aktivitesi düzenler. fi En önemlisi, optik netlikSH larva, kemik hücreleri ve canlı bir hayvanda hücresel süreçlerin &#39;in gözlemlenmesini kolaylaştırmaktadır kalsifiye iskelet matris 8, 9, 12, 21, 23, etiket, floresan muhabir kullanımına izin verir. Buna ek olarak, genetik bir dizi araç balık biyo-medikal ilgili araştırmaları kolaylaştırmak için oluşturuldu. Özellikle Medaka, CRISPR / Cas9 2, 6 izleme hücre soy ve site-spesifik transgenesis 14 yeni kurulan ve yaygın kullanımda 15 şimdi edilmiş hedeflenen gen mutasyonuna yöntemleri için. Küçük Teleost larvaları başarıyla birkaç farmakolojik olarak ilgili ilaç 1, 18 keşfine yol kimyasal ekranlar için kullanılmıştır. Balık larvaları DMSO düşük konsantrasyonlarına dayanıklı ve deriden veya mide-bağırsak, 1 ile 5 arasındaki, ya da su ortamında gelen bileşikleri emebilmektedir. Bizim laboratuvar önceden temsilcisiÇeşitli osteoblast- ve osteoklast özgü promoterlerin kontrolü altında, kemik hücrelerinde floresan haberci ifade orted transjenik Medaka hatları. 20, 21, olgun osteoblast (osteokalsin, OSC) 27 ve osteoklastlar (katepsin K ctsk) 24; bu erken osteoblast (Osterix, OS X kollajen 10a1, col10a1) içerir. Ayrıca, bir ısı şoku ile uyarılabilir promoterinin 24 kontrolü altında osteoklast başlatıcı faktör Nükleer faktör kB Ligand (RANKL) reseptör Aktivatör eksprese eden bir transgen doğru oluşturulur. Bu sistemde RANKL endüksiyonu aktif osteoklastlar ektopik oluşumu ile sonuçlanır. Bu omur gövdelerinde büyük ölçüde azalır mineralizasyon ile, artmış kemik rezorpsiyonu ve şiddetli osteoporoz gibi fenotipe yol açar. Biz son zamanlarda bu modelde osteoklast aktivitesi bifosfonatlar Etidronate ve alendronat, tw tarafından bloke edilebilir olduğunu gösterdigenel olarak, insan osteoporoz tedavisinde kullanılan O ilaçlar, bu şekilde osteoporoz 27 için uygun bir model sistem olarak Medaka&#39;nın doğrulanması. Büyük olması nedeniyle kuluçka boyutu, hızlı gelişme ve embriyo küçük boyutu, transjenik Medaka larva osteoporoz ilaçların büyük ölçekli tarama ve kemik hücre davranış in vivo analizler için çok uygun olan. Medaka çalışmalar, böylece etkili bir şekilde hücre kültürlerinde ve insan kemik bozuklukları için yeni terapötik hedefler ve yeni tedavilerin keşfetmek amaçlayan farelerde deneyler tamamlayabilir. Bu çalışmada, ortak osteoporoz ilaç, alendronat ile Medaka kemik muhabir larva tedavisi için bir protokol açıklar. monte edilir ve kemik matriks ve kemik hücrelerinin canlı görüntüleme için hazırlanmıştır nasıl tedavi larvaları Biz de ayrıntılı olarak açıklamaktadır. Bu protokoller kolayca diğer küçük kimyasal bileşiklere adapte edilebilir kemik anabolik veya anti-emici ilaç olarak ya da iş. &lt;/ P&gt;

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1101">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:249px;">Alendronate&#160;</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">A4978</td>
			<td style="width:535px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:249px;">alizarin-3-methyliminodiacetic acid, Alizarin Complexone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:249px;">ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ImageJ (1.4.3.67)</td>
			<td style="width:177px;">National Institute of Health (NIH)</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:249px;">LSM 510 Meta confocal&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:249px;">LSM Image Browser (4.2.0.121)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/lsm-5-series.html</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micro-loader</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td>Eppendorf ep T.I.P.S 20 &#956;l</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:249px;">NIS-Elements BR 3.0 software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:249px;">Photoshop CS6 (13.0.0.0)</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:249px;">SMZ1000 stereomicroscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

drug treatment and in vivo imaging of osteoblast-osteoclast interactions in a medaka fish osteoporosis model

osteoblastlar kemik matriksinin ciro koordine etmek kemik rezorbe osteoklast ile etkileşim ve iskelet homeostazı kontrol etmek için kemik oluşturan. Medaka ve Zebra balığı larvaları yaygın kemik oluşumu, dejenerasyon ve onarım sırasında kemik hücrelerinin davranışını analiz etmek için kullanılır. Optik netlik floresan etiketli kemik hücreleri ve mineralli iskelet matrise bağlı floresan boyalar görselleştirme sağlar. Bizim laboratuvar bir ısı şoku ile uyarılabilir promoterinin kontrolü altında osteoklast başlatıcı faktör Nükleer faktör kB Ligand (RANKL) reseptör Aktivatör transgen Medaka balık üretti. Katepsin K (ctsk) promoterinin kontrolü altında nlGFP ifadesi ile raportör çizgilerle görüntülenmiştir Aktive edilmiş osteoklastlar, aşırı oluşumuna RANKL sonuçları ektopik ekspresyonu. RANKL indüksiyon ve ektopik osteoklast oluşumunu şiddetli osteoporoz gibi fenotipleri yol açar. Bileşik transgenik Medaka lictsk ifade Nes: nlGFP erken osteoblastlarda Osterix (OS X) promoterinin kontrolü altında osteoklastlar, hem de mCherry, her iki hücre tipinde etkileşimini incelemek için kullanılabilir. Bu kemik erimesi ve onarım koşulları altında hücresel davranış in vivo gözlem kolaylaştırır. Burada, genel olarak, insan osteoporoz tedavisinde kullanılan bir ilaç test etme ve canlı görüntüleme için bir protokol tanımlamak için bu sistemin kullanımını tarif eder. Medaka modeli hücre kültürü ve farelerde çalışmaları tamamlar ve iskelet sisteminde ilaç etkisinin in vivo analizi için yeni bir sistem sunmaktadır.

Bol miktarda yumurta sayıları, hem de larva küçük boyutu, Medaka&#39;nın ilaç taraması için ideal bir model haline getirmektedir. Tek bir altı plaka istatistiksel olarak anlamlı bir veri sağlamak için yeterli 36 larva, kadar kültüre kullanıldı. iskelet analizi için balık kullanmanın bir diğer büyük avantajı, canlı görüntüleme yapma imkanı vardır. Balık larvaları asetat kemik hücrelerini, hem de mineralizasyon görselleştirmek için kemik matrisine bağlanır boyaların kullanımını et...

Watch this Scientific Journal Video about Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model at JoVE.com

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.

İlaç Tedavi ve<em&gt; İn Vivo</em&gt; Bir Medaka Balık Osteoporoz Modelinde Osteoblast-Osteoklast Etkileşimler Görüntüleme

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka ...

drug-treatment-vivo-imaging-osteoblast-osteoclast-interactions-medaka

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

9.1K Görüntüleme.  National University of Singapore. Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.

Video: Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Automated Quantification of Hematopoietic Cell &#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. However, the analysis and quantification of cellular localization is difficult, as in many cases it relies on manual counting, thus bearing the risk of introducing a rater-dependent bias and reducing interrater reliability. Moreover, it is often difficult to judge whether the co-localization between two cells results from random positioning, especially when cell types differ strongly in the frequency of their occurrence. Here, a method for unbiased quantification of cellular co-localization in the bone marrow is introduced. The protocol describes the sample preparation used to obtain histological sections of whole murine long bones including the bone marrow, as well as the staining protocol and the acquisition of high-resolution images. An analysis workflow spanning from the recognition of hematopoietic and non-hematopoietic cell types in 2-dimensional (2D) bone marrow images to the quantification of the direct contacts between those cells is presented. This also includes a neighborhood analysis, to obtain information about the cellular microenvironment surrounding a certain cell type. In order to evaluate whether co-localization of two cell types is the mere result of random cell positioning or reflects preferential associations between the cells, a simulation tool which is suitable for testing this hypothesis in the case of hematopoietic as well as stromal cells, is used. This approach is not limited to the bone marrow, and can be extended to other tissues to permit reproducible, quantitative analysis of histological data.

A strategy to quantitatively analyze histological data in the bone marrow is presented. Confocal microscopy of fluorescently labeled cells in tissue sections results in 2-dimensional images, which are automatically analyzed. Co-localization analyses of different cell types are compared to data from simulated images, giving quantitative information about cellular interactions.

Hematopoetik Hücre Otomatik Ölçümü - undekalsifiye Kemik histolojik Görüntüler stromal hücre etkileşimleri

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. ...

Gelişim Biyolojisi

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

Analiz<em&gt; İn Vivo</em&gt; Hücre Göç Zebra balığı Embriyolar hücre nakli ve Time-lapse Görüntüleme kullanılarak

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Transcriptional Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

The placenta derives from one extra-embryonic lineage, the trophectoderm. In the peri-implantation murine blastocyst, mural trophectoderm cells differentiate into primary trophoblast giant cells (TGCs) while the polar trophectoderm overlying the inner cell mass continues to proliferate later differentiating into secondary TGCs. TGCs play a key role in developing placenta and are essential for a successful pregnancy. Investigation of transcriptional regulation of specific genes during post-implantation development can give insights into TGCs development. Cells of the ectoplacental cone (EPC) from embryos at 7-7.5 days of gestation (E7-7.5), derived from the polar trophectoderm, differentiate into secondary TGCs1. TGCs can be studied in situ, on cryostat sections of embryos at E7 although the number of TGCs is very low at this stage. An alternative means of analyzing secondary TGCs is to use short-term cultures of individual EPCs from E7 embryos. We propose a technique to investigate the transcriptional status of genes of interest both in vivo and in vitro at the single-cell level using fluorescent in situ hybridization (RNA FISH) to visualize nascent transcripts. This technique provides a direct readout of gene expression and enables assessment of the chromosomal status of TGCs, which are large endoreplicating cells. Indeed, a key feature of terminal differentiation of TGCs is that they exit the cell cycle and undergo multiple rounds of endoreplication.This approach can be applied to detect expression of any gene expressed from autosomes and/or sex chromosomes and can provide important information into developmental mechanisms as well as placental diseases.

Transcriptional  Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

Trophoblast giant cells (TGCs) play a key role in the placenta to ensure a healthy pregnancy. We present a protocol for assessing the transcriptional status of genes in TGCs by nascent fluorescent in situ hybridization on cryostat sections of post-implantation embryos or short-term cultures of embryonic day 7 ectoplacental cones.

ve Doğan RNA FISH ile kopyalanma Analizi<em&gt; İn Vivo</em&gt; Trofoblast Dev Hücreler ya da<em&gt; İn Vitro</em&gt; Ectoplacental Koni Eksplantlarından kısa vadeli Kültürler

The placenta derives from one extra-embryonic lineage, the trophectoderm. In the peri-implantation murine blastocyst, mural trophectoderm cells ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

İlkel ve kesin hematopoetik ataları insan Pluripotent kök hücrelerden farklılaşma yönetmen

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Fare İkincil Palin Füzyonunun Canlı Görüntüsü

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

The four C. elegans excretory canals are narrow tubes extended through the length of the animal from a single cell, with almost equally far extended intracellular endotubes that build and stabilize the lumen with a membrane and submembraneous cytoskeleton of apical character. The excretory cell expands its length approximately 2,000 times to generate these canals, making this model unique for the in vivo assessment of de novo polarized membrane biogenesis, intracellular lumen morphogenesis and unicellular tubulogenesis. The protocol presented here shows how to combine standard labeling, gain- and loss-of-function genetic or RNA interference (RNAi)-, and microscopic approaches to use this model to visually dissect and functionally analyze these processes on a molecular level. As an example of a labeling approach, the protocol outlines the generation of transgenic animals with fluorescent fusion proteins for live analysis of tubulogenesis. As an example of a genetic approach, it highlights key points of a visual RNAi-based interaction screen designed to modify a gain-of-function cystic canal phenotype. The specific methods described are how to: label and visualize the canals by expressing fluorescent proteins; construct a targeted RNAi library and strategize RNAi screening for the molecular analysis of canal morphogenesis; visually assess modifications of canal phenotypes; score them by dissecting fluorescence microscopy; characterize subcellular canal components at higher resolution by confocal microscopy; and quantify visual parameters. The approach is useful for the investigator who is interested in taking advantage of the C. elegans excretory canal for identifying and characterizing genes involved in the phylogenetically conserved processes of intracellular lumen and unicellular tube morphogenesis.

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

The C. elegans excretory canal is a unique single-cell model for the visual in vivo analysis of de novo polarized membrane biogenesis. This protocol describes a combination of standard genetic/RNAi and imaging approaches, adaptable for the identification and characterization of molecules directing unicellular tubulogenesis, and apical membrane and lumen biogenesis.

C. elegans Excretory kanal hücre içi Lumen morfogenez ve In Vivo polarize membran Biyogenez tek bir hücrede için bir Model olarak: etiketleme GFP-füzyon, RNAi etkileşimi ekran ve görüntüleme

The four C. elegans excretory canals are narrow tubes extended through the length of the animal from a single cell, with almost equally far extended ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Diseksiyon ve mantar vücut immünfloresan boyama ve yetişkin Drosophila melanogaster beynindeki nöronlar Photoreceptor

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding and invasion. Current animal models for the study of T. cruzi allow limited observation of parasites in vivo, representing a challenge for understanding parasite behavior during the initial stages of infection in humans. This protozoan has a flagellar stage in both vector and mammalian hosts, but there are no studies describing its motility in vivo.The objective of this project was to establish a live vertebrate zebrafish model to evaluate T. cruzi motility in the vascular system. Transparent zebrafish larvae were injected with fluorescently labeled trypomastigotes and observed using light sheet fluorescence microscopy (LSFM), a noninvasive method to visualize live organisms with high optical resolution. The parasites could be visualized for extended periods of time due to this technique&#39;s relatively low risk of photodamage compared to confocal or epifluorescence microscopy. T. cruzi parasites were observed traveling in the circulatory system of live zebrafish in different-sized blood vessels and the yolk. They could also be seen attached to the yolk sac wall and to the atrioventricular valve despite the strong forces associated with heart contractions. LSFM of T. cruzi-inoculated zebrafish larvae is a valuable method that can be used to visualize circulating parasites and evaluate their tropism, migration patterns, and motility in the dynamic environment of the cardiovascular system of a live animal.

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

In this protocol, fluorescently labeled T. cruzi&#160;were injected into transparent zebrafish larvae, and parasite motility was observed in vivo using light sheet fluorescence microscopy.

Kuruluş, larva Zebra balığı bir hayvan modeli araştırmak Trypanosoma cruzi hareketliliği In Vivo olarak

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from animals to humans. Therefore, the powerful Drosophila model system can be used to study concepts of muscle-tendon development that can also be applied to human muscle biology. Here, we describe in detail how morphogenesis of the adult muscle-tendon system can be easily imaged in living, developing Drosophila pupae. Hence, the method allows investigating proteins, cells and tissues in their physiological environment. In addition to a step-by-step protocol with helpful tips, we provide a comprehensive overview of fluorescently tagged marker proteins that are suitable for studying the muscle-tendon system. To highlight the versatile applications of the protocol, we show example movies ranging from visualization of long-term morphogenetic events &#8211; occurring on the time scale of hours and days &#8211; to visualization of short-term dynamic processes like muscle twitching occurring on time scale of seconds. Taken together, this protocol should enable the reader to design and perform live-imaging experiments for investigating muscle-tendon morphogenesis in the intact organism.

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Here, we present an easy-to-use and versatile method to perform live imaging of developmental processes in general and muscle-tendon morphogenesis in particular in living Drosophila pupae.

Vivo Kas-tendon morfogenez Drosophila pupa içinde görüntüleme

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled by multiple mechanisms that include the Spindle Assembly Checkpoint (SAC). The SAC is part of a complex feedback system that is responsible for prevention of a cell progress through mitosis unless all chromosomal kinetochores have attached to spindle microtubules. Chromosomal lagging and abnormal chromosome segregation is an indicator of dysfunctional cell cycle control checkpoints and can be used to measure the genomic stability of dividing cells. Deregulation of the SAC can result in the transformation of a normal cell into a malignant cell through the accumulation of errors during chromosomal segregation. Implementation of the SAC and the formation of the kinetochore complex are tightly regulated by interactions between kinases and phosphatase such as Protein Phosphatase 2A (PP2A). This protocol describes live cell imaging of lagging chromosomes in mouse embryonic fibroblasts isolated from mice that had a knockout of the PP2A-B56&#947; regulatory subunit. This method overcomes the shortcomings of other cell cycle control imaging techniques such as flow cytometry or immunocytochemistry that only provide a snapshot of a cell cytokinesis status, instead of a dynamic spatiotemporal visualization of chromosomes during mitosis.

This protocol describes an easy and convenient method to label and visualize live chromosomes in mitotic cells using Histone2B-GFP BacMam 2.0 label and a spinning disc confocal microscopy system.

Kromozom segregasyon mitoz sırasında canlı hücre görüntüleme

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

İlaç Tedavi ve

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler