Bu yöntem, zebra balığındaki kimyasalların neden olduğu kemik toksisitesini tespit etmeye yardımcı olabilir. Alizarin Kırmızı Sabit dokunun boyanması, birkaç örneğin karşılaştırılmasını kolaylaştırabilecek iskelet değişikliklerinin kalıcı bir kaydını oluşturur. Bu teknik, zebra balığı modelinde osteoporozu incelemek için yararlı olabilir, çünkü osteoporozun özelliklerinden biri kemik kütlesindeki azalmadır.
Döllenmeden sonraki dokuz günde her gruptan rastgele 10 zebra balığı larvasını çıkarın ve balıkları iki saat boyunca bir mililitre% 2 paraform aldehit ve 1X PBS'de sabitleyin. Çözeltiyi boşaltın ve zebra balığı larvalarını 100 milimolar Tris HCL kullanarak pH 7.5 veya 10 milimolar Magnezyum Klorür ile yıkayın. Boyama yapmak için, çözeltiyi boşaltın ve larvayı makalede açıklandığı gibi bir dizi çözelti içinde beş dakika boyunca inkübe edin.
Son inkübasyondan sonra, çözeltiyi boşaltın ve% 3 hidrojen peroksit ve% 0.5 potasyum hidroksitten oluşan bir çözelti ile ağartarak pigmenti çıkarın. Pigment tamamen çıkarılana kadar her 10 dakikada bir gözlemleyin. Zebra balığı larvalarını% 25 gliserin,% 0.1 potasyum hidroksit ile kabarcık kalmayana kadar her biri 10 dakika boyunca birkaç kez durulayın.
% 0.01'lik bir mililitreye batırılarak larvada leke Alizarin. Çözeltiyi boşaltın ve arka planı temizlemek için bir mililitre% 50 gliserin veya% 0.1 potasyum hidroksit ekleyin. Daha sonraki gözlemler için balıkları taze% 50 gliserin veya% 0.1 potasyum hidroksit içinde saklayın.
Larvaları sıvı damlasının ortasında tutarak cam slayta bir seferde bir larva aktarın. Larvaları stereo mikroskop altında gözlemleyin. Fotoğraf makinesini açın.
Yazılımı açın ve varsayılan ayarları koruyun. AE'ye tıklayın ve en iyi görüntüyü elde etmek için uygun bir pozlama süresi seçin. Tüm görüntüleri aynı ayarlar altında yakalayın.
Daha sonra analiz etmek üzere görüntüleri nokta tiff biçiminde kaydedin. imageJ simgesine çift tıklayın. Kaydedilen görüntüleri analiz etmek için dosyaya tıklayın, ardından açın, ardından resme tıklayın, ardından sekiz bit yazın ve seçin.
Düzenle'ye tıklayın ve ters çevirin. Analiz et'e tıklayın, ardından kalibre edin. Açılır arayüzde Kalibre edilmemiş OD'yi seçin.
Alt arayüzün sol alt köşesindeki global kalibrasyonu kontrol edin ve Tamam'ı tıklatın. Analiz et'e tıklayın, ölçeği ayarlayın, ardından ölçeği kaldırın. Aşağıdaki global kontrol edin ve Tamam'ı tıklayın.
Analize tıklayın, ardından ölçümleri ayarlayın. Açılır arabirimde öğe alanını seçin. Yalnızca seçilen aralığı ölçmek için aşağıdaki eşik sınırını kontrol edin ve Tamam'ı tıklayın.
Resme tıklayın, ayarlayın, ardından eşik ve açılır arayüzün ortasındaki kaydırıcıyı kaydırın. Bir görüntüde test edilecek tüm hedeflerin seçilmesi için uygun eşiği seçmek için. Ve ayarla'yı tıklayın.
Analiz et'e tıklayın, ardından tarihleri ölçün, kaydedin. Alizarin Kırmızı Boyama, zebra balığı larvalarında kemik mineralizasyonundaki değişiklikleri ölçmek için hassas ve spesifik bir yöntemdir. Döllenmeden dokuz gün sonra, parasfenoid, operküler, seratobranchial ve notokord gibi kafa iskeletinin birçok kemiği mineralize edilir ve bu nedenle kırmızıya boyanır.
Buna karşılık, otolitler gibi kemikli olmayan yapılar kahverengi siyah görünür. Toplam lekeli alanı ölçmek için yapılan dijital analiz, kurşun asetat tedavi gruplarının litre başına 10 ve 20 miligramı için lekeli alanda önemli bir azalma olduğunu göstermiştir. Kemik mineralizasyonundaki değişiklikler doz bağımlılığı gösterdi.
Daha iyi boyama etkisi ve gözlem için, zebra balığı larvalarının orijinal pigmentini çıkarmak ve ağartmadan sonra kabarcıkları çıkarmak önemlidir.
