This work was funded by two ANR grants (ANR-11-BSV8-016 and ANR-10-IDEX-0001-02). We also acknowledge the PICT-IBiSA for providing access to chemical imaging equipment.

Dikkat: kullanmadan önce çeşitli reaktif malzeme güvenliği veri sayfaları (MSDS) başvurun. Numune hazırlama sırasında kullanılan kimyasalların çeşitli ve / veya üreme için, toksik, kanserojen, mutajen bulunmaktadır. örnek işlerken davlumbaz altında kişisel koruyucu donanım (eldiven, laboratuvar önlüğü, tam uzunlukta pantolon ve kapalı ayak ayakkabılar) ve çalışmayı kullanma. Ultramikrotomla örnek kesit keskin aletlerin kullanımını gerektirir ve bu araçların dikkatli kullanılması zorunludur. Aşağıdaki açıklanan adımların, yazarlar örnek, bir hücre kültürü örneği olduğu varsayılmaktadır. Protokol örnek tipi, özellikle santrifüj adımlarına göre modifiye edilmesi gerekebilir. Tamponlar ve Karışımların hazırlanması 1. <ol><li> Fosfat tamponlu tuz (PBS) çözeltisi hazırlayın (137 mM NaCI, 2.7 mM KCI, 10 mM Na-2 HPO 4 ve 1.76 mM KH 2 PO 4). </li><li> % 30,% 50 ve% 70 et içeren çözümleri hazırlayınNumune dehidrasyon için PBS içinde HANOL. yavaş yavaş etanol konsantrasyonları artan inkübe edilmesiyle örnek dehidratasyon gerçekleştirin. </li><li> (Süksinik anhidrür (9 mL), metil-5-norbornen-2,3-dikarboksilik (11 ml) ve 2,4,6-tris dodesenil bisfenol-A- (epiklorohidrin) (20 mL) karıştırılarak epoksi reçine hazırlanması dimetilaminometil) fenol (0.7 mL); Diğer karışım oranları reçine arzu edilen sertliğine bağlı kullanılabilir. </li><li> Örnek yerleştirilmesi için etanol içinde% 30,% 50, ve% 70 epoksi reçine içeren çözeltiler hazırlayın. yavaş yavaş reçine artan konsantrasyonlarda ile inkübe edilmesiyle reçine katıştırma gerçekleştirin. NOT: Bu şekilde hazırlanan solüsyonlardan hacimleri incelenmiştir numune tipine bağlıdır. Daha çözeltileri hücre kültürleri için daha dokular için ihtiyaç vardır. </li></ol> Örnek 2. Fiksasyon ve Renklendirme <ol><li> x g 5,000 5 dakika boyunca hücre kültürü santrifüj. aynı koşullar kullanılarak, aşağıdaki santrifüj tümünü gerçekleştirebilir.</li><li> Süpernatant atılır ve% 4 paraformaldehid ve% 2 glutaraldehid ile, PBS (1 mL) içinde yeniden süspanse hücre pelletini düzeltin. 30 dakika (Şekil 1A), oda sıcaklığında inkübe edin. Alternatif olarak, bir gecede ya da hafta sonu 4 ° C&#39;de hücreleri saptamak. </li><li> Santrifüj işleminden sonra, süpernatant kaldırmak ve tam olarak tespit edici maddeler uzaklaştırmak için PBS (1 mL) ile pelet 3 kez yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca PBS (1 mL) içinde% 1 OsO 4 örnek sonrası düzeltin. </li><li> Santrifüj işleminden sonra, süpernatant kaldırmak ve tam olarak OsO 4 kaldırmak için, PBS (1 mL) ile pelet 3 kez yıkayın. Petrol ve ıskarta olarak OSO 4 devre dışı bırakın. </li><li> Bir kontrast maddesi olarak PBS (1 mL) içinde% 2&#39;lik üranil asetat ilave edilir ve oda sıcaklığında (Şekil 1B), 30 dakika boyunca örnek inkübe edin. </li><li> Santrifüj işleminden sonra, süpernatant kaldırmak ve bağlanmamış uranil ac uzaklaştırmak için PBS (1 mL) ile pelet 3 kere yıkayınasetatın; uranil asetat radyoaktif elementler içerir ve radyoaktif atık adanmış bir bin atılmalıdır. Not: Örnek ölçülerine uygun bir bekleme süresi değiştirilebilir. örneğin tespit ve doku örnekleri gibi kalın örneklerde, boyama için, uzun inkübasyon süreleri gerektirir. Daha uzun inkübasyon süreleri de dehidrasyon ve katıştırma adımlar için daha iyi olabilir. Uranil asetat Gadolinyum tuzlar içeren bir &quot;uranil-az&quot; bir çözüm ile değiştirilebilir. </li></ol> 3. Numune Dehidrasyon <ol><li> Santrifüj işleminden sonra, süpernatant atılır ve% 30 etanol ile PBS içinde 4 ° C&#39;de (1 mL) içinde (Şekil 1C), 30 dakika boyunca örnek inkübe edin. </li><li> giderek artan etanol konsantrasyonları ile (% 50,% 70, ve% 100&#39;e kadar) çözümlerini kullanarak adımı tekrarlayın 3.1. Bu dehidrasyon adımları sırasında, numune saklama amaçlı 4 ° C &#39;de örnek muhafaza. </li><li> Santrifüj işleminden sonra, supernat atmakAnt ve saf etanol (1 mL) içinde tekrar süspansiyon pelet; 4 ° C&#39;de bir gece inkübe edilir. </li></ol> 4. Reçine Gömme <ol><li> Santrifüj işleminden sonra, süpernatant atılır ve oda sıcaklığında (Şekil 1D) 30 dakika boyunca% 30 epoksi reçine (1 mL) ile etanol içinde pelletini. </li><li> giderek artan epoksi reçine konsantrasyonları ile çözümlerini kullanarak adımı yineleyin 4,1 (% 50,% 70, ve% 100&#39;e kadar). </li><li> Santrifüj işleminden sonra, süpernatant atılır ve saf epoksi reçinesi (1 mL) içinde tekrar süspansiyon pelet; Gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. reçine polimerizasyonu tetikleyebilir DMP-30 sertleşme varlığı; Bu olursa, epoksi reçine iki toplu, ile bir ve DMP-30 olmadan birini hazırlamak. </li><li> Santrifüj işleminden sonra, saf epoksi reçinesi 200 uL plastik bir kapsül içinde (bir sertleştirici içeren) pelet tekrar süspansiyon; Numune plastik kapsül altında olmalıdır. </li></ol> 5. Reçine Polimerizasyon <ol><li> ben48 saat boyunca 60 ° C&#39;ye ayarlanmış bir inkübatörde örneği içeren plastik kapsül ncubate; reçine diğer tür farklı ayarlarla polimerize olabilir. </li><li> inkübatör kapsülü çıkartın ve reçine polimerize olduğunu doğrulamak; Sert bir yüzeye bastırılır eğer reçine zor olmalı. </li><li> örnek içeren polimerize reçinenin üzerine (sertleştirici ihtiva eder) saf epoksi reçinesi ekleme; reçine bu ekstra katman daha kolay örnek kesmek için yapacaktır. 48 saat boyunca 60 ° C &#39;de kapsül inkübe edin. </li></ol> 6. Numune Kesit <ol><li> Numune üste doğru olacak şekilde numune tutucu örnek ters monte edin ve ultramicrotome kırpma blok üzerine sabitleyin. Sıkıca ultramicrotome için düzeltme bloğu sabitlemek için kolu kilitleyin. </li><li> Bir jilet veya benzeri keskin kesme aleti kullanılarak, polimerize reçine ayırmak için plastik kapsül kesip. örnek içeren böylece reçinenin kesinbir piramit yaklaşık şeklindeki reçine Ed. Tüm plastik kapsül kaldırmak için gerek yoktur; Sadece polimerize örnek kaplayan kısmını kaldırın. </li><li> kapsül ve kırpma blok kapalı numune tutucu alın ve ultramicrotome hareketli koluna monte edin. </li><li> bıçak blokta bir düzeltme bıçağı takın ve doğru bir piramit yüzleri kırpın. dürbün kullanımı piramit için mükemmel bir şekil vermek için tavsiye edilir; piramit daha iyi bölümler olacak. </li><li> kırpma bıçağı çıkar ve daha kalın 0.5 mikron olan bölümleri kesmek için kullanılabilecek bir histoloji bıçakla değiştirin. </li><li> uygun miktarda su ile histolojik bıçağının küvet doldurduktan sonra, numunenin yüzeyine bıçağın kesici kenar getirmek ve bıçak piramit dik dilim böylece kapsülün hatve açısını ayarlamak için dürbün kullanın. </li><li> İstenilen göre kesme hızını ayarlayınkesit kalınlığı homojen bölümleri kurtarmak için. </li><li> su üzerinde bölüm şamandıra edelim ve bir döngü ile balık. </li><li> filtre kağıdı üzerine yerleştirilmiş olan bir elektron mikroskobu bakır ızgara doğru döngü hareket ettirin. NOT: Izgara onun hydrophilicity artırmak için önceden tedavi edilmiş olması gerekirdi. Bu ızgara kaplama kalem ile gerçekleştirilebilir. </li><li> Nedeniyle filtre kağıdı su emilimi, bölüm ızgara dönelim. Elektron mikroskobu yerleştirmeden önce birkaç dakika kurumaya bırakın. </li></ol> Through-odak Tilt-serisi 7. Tasarım <ol><li> sabit odak aralıklarla aracılığıyla odak görüntüleri toplayın. NOT: aracılığıyla odak tilt serisi tilt-serisi her eğim açısı toplanır aracılığıyla odak görüntülerin bir dizi oluşur. Bütün odaklama genliği, tüm numune kalınlığının karşılamak için yeterli olmalıdır. </li><li> Odak aralığı değerini belirler. aralığı d eşitseepth-of-field, odak tüm örnek toplamak; Bu ayar mümkün olan en yüksek örnekleme temsil eder. aralık derinliği alanında büyükse, numunenin bazı bölümleri numunenin bazı kısımları odak tahsil edilmeyecektir, yani odak elde edilmeyecektir. </li><li> derinliğini alan elektronun dalga boyu arasında bir elektron ışını ve elektron ışını yakınsama yarı açısı hesaplanır. Elektronların dalga boyu doğrudan ivme gerilimine bağlı iken, elektron mikroskobu üreticisi tarafından sağlanan yakınsama yarı açı kullanmak veya bilinen numune 16 kırınım deseninden deneysel olarak belirler. Elektronlar bir dalga boyu l hızlandırılmış Çünkü bir elektron mikroskobu a bir yakınsama yarı açı ile örnek vurmak, derinliği alanını (DOF) belirlemek için aşağıdaki denklemi kullanın: <img alt="Denklem" src="/files/ftp_upload/55215/55215eq1.jpg" /></li><li> dizaynBütün odak genlik maksimal belirgin kalınlıkta örnek kapsayacak şekilde odak serisi (yani en yüksek hızıyla). NOT: Odak genlik fazla 2.19 mikron olmalı böylece A 0,75 mikron kalınlığında numune, 70 ° hızıyla 2.19 mikron belirgin bir kalınlığa sahip olacak. Yukarıda belirlenen odak aralığı 50 nm&#39;ye eşit ise, bu örnek için, bu maksimum belirgin kalınlıkta örnek kapak 44 görüntü (2.19 um / 50 nm) gerektirecektir. Bütün odak genlik odak adım sayısı ile çarpılır odak aralığının değerine eşittir. En yüksek eğim (θ) &#39;de, örnek görülür kalınlığı şu şekilde tanımlanır: <img alt="Denklem" src="/files/ftp_upload/55215/55215eq2.jpg" /></li></ol> 8. Örnek Görüntüleme NOT: KÖK modunda bir elektron mikroskobu kurmak için nasıl açıklamak için bu protokol kapsamı dışındadır; Bu bilgilerin çoğunu bulunabilir in referans el kitabı elektron mikroskobu üreticisi tarafından sağlanan. Ancak, aşağıdaki noktalara dikkat edin: i) spot büyüklüğü istenen büyütme göre seçilmelidir; ii) Ronchigram iyi hizada olmalıdır; ve iii) BF modunda, kamera uzunluğu dedektörün iyi aydınlatma korurken unscattered elektronları seçmek için ayarlanması gerekir. elektron mikroskobu bakır ızgaralar üzerinde biriken reçine bölümleri küçülmesini önlemek için görüntü alımı öncesinde ışıklı olmalıdır. Reçine büzülme ve şarj etkileri görüntü alımı sırasında eleştirilmiştir olabilir. Şarj etkiler ortaya çıktığında bir objektif lens açıklığı kullanımı örnek istikrarı geliştirmek olabilir. Ancak, KÖK kurulumları özelinde, objektif diyafram HAADF görüntüleme modu ile uyumlu değildir ve çok küçük objektif delikler BF görüntüleme modu ile uyumlu değildir. <ol><li> Düşük büyütme (STEM olarak 20,000X civarında) kullanılarak, numune göz atabilir ve ilgi bölgeyi bulun. </li><li> t ayarlayınörnek dönerken ilgi bölge sürüklenip kalmaması o yüksekliği (Z ekseni) eucentric. </li><li> ilgi nesnesi tüm eğim aralığı boyunca görünür kalacaktır emin olun. </li><li> Çünkü içinden odak tilt-serisi sırasında elde edilen görüntü önemli sayıda, otomatik toplama yazılımı kullanın. Ya bir ticari çözüm kullanmak ya da istenirse özel bir veri toplama yazılım tasarımı. yazılım programı üç aşağıdaki adımları gerçekleştirmek mümkün olduğundan emin olun: <ol><li> Parça ve standart eğim serisi toplama düzeni olarak odaklanır. </li><li> ile odak görüntüler numunenin Z-pozisyonunda örtüşüyor emin olun. </li><li> Otomatik olarak her eğim açısında aracılığıyla-fokal görüntüleri bir dizi kazanır. </li></ol></li><li> Yazılım programı aracılığıyla odak tilt-serisinin ana parametreleri vermek (yani, odak aralıkları, fokal adım, asgari eğim açısı, maksimum eğim açısı, eğim adım ve tarama hızı). </li><li> BaşlamaYazılım programı bitirmek için görüntü toplama süreci ve bekleyin. </li></ol> 9. Görüntü İşleme NOT: Bu protokol, through-fokal tilt serisi işleme ImageJ eklentileri 17 kullanılarak gerçekleştirilir. Ek Veriler 1 hizalama adım (Turboreg) ve üç odak değerleri ile tasarlanmış aracılığıyla odak tilt-serisi için de odak bilgisini (Alan Genişletilmiş Derinliği) birleştirmek için bir ImageJ makro gösterir. <ol><li> Aynı eğim açısı (yani yoluyla-odak görüntüler) toplanan görüntüleri hizalayın. görüntüler aynı olarak odak bilgiye sahip olmadığı için, onlar uyum için aynı özellikleri liman yok; komşu görüntüleri ikişer ikişer hizalayarak hizalama işlemini (yani, ilk yakın odak değerleri ile bir piramidal hiyerarşi, aşağıdaki) Turboreg 18, bir ImageJ eklentisi kullanarak. </li><li> Sürekli her eğim açısında aracılığıyla odak görüntülerin uyum doğrulayın.görsel denetim geliştirmek için hizalanmış aracılığıyla odak görüntüleri Stack. NOT: yığının üzerinden tarama yaparken sadece bölge odakta hareket etmelidir. Bir sonraki adım, farklı görüntüleri odak bilgilerin geri kazanımı oluşur çünkü doğru hizalama, en önemli şeydir. </li><li> Alan 19, bir ImageJ eklentisi Genişletilmiş derinliği kullanarak odakta olan bilgileri birleştirmek; Bu sonuçta görüntüleri yığından tek bir görüntü oluşturur. Çeşitli ayarlar derinliği alanında kurtarma sırasında kullanılan, ancak görüntü bilgilerini korumak için en yüksek ayarlarını kullanmak olabilir. NOT: tilt-serisi şimdi eğim açısı başına tek bir görüntü oluşur, içinde odak bilgilerini içeren her bir görüntü ile odak görüntüleri kurtarıldı. </li><li> veri işlemek. NOT: Veri artık standart eğim serisi azaltılmış beri uyum ve yeniden inşası için standart araçlar kullanılabilir. Bu protokolde, TomoJ bizized veri hizalama ve veri yeniden 20, 21. TomoJ nasıl kullanılacağı hakkında daha fazla detay orijinal yayın 22 bulunabilir. </li><li> tilt-serisi ince ayarı gerçekleştirin. NOT: İyi bir strateji doğru görüntüler arasında vardiya izlemek için referans belirteç olarak altın boncuk kullanmaktır. altın boncuk örnek eklenemez halinde, yerel minimum de kullanılabilir. </li><li> hizalanmış verilerin 3D rekonstrüksiyon gerçekleştirin; çeşitli algoritmalar gerçek uzayda veya Fourier uzayında, avantaj ve sınırlamaları ile her rekonstrüksiyon gerçekleştirmek için kullanılabilir. </li><li> tilt-serisi son hizalama kötüyse, ilk adımları optimize ederek bazı iyileştirmeler yapmak. Nihai 3D rekonstrüksiyon bulanık ya da deforme görünüyorsa hizalama adımlarını yinelemek; Uygulamada, toplanan odak düzlemleri daha fazla sayıda, daha iyi kontrast ve 3 boyutlu rekonstrüksiyon ayrıntıları. NOT: SeVeral yazılım programları aracılığıyla odak tilt-serisi işlemek için kullanılabilir. Ancak, bu protokolde kullanılan araçlar seçildi çünkü, bizim deneyim, onlar en iyi performansı. Turboreg 18 odak gradyanı mevcut olduğu zaman görüntüleri hizalama açısından iyi performans gösterdi. Daha fazla bilgi adanmış web sitesinde 23 bulunabilir. Diğer araçlar görünür piksel değişiklikler sonuçlandı oysa Alan eklentisi 19 Genişletilmiş Derinlik, farklı görüntüleri de-odak bilgileri kurtarma açısından çok iyi bir performans. Daha fazla bilgi, özellikle ilgili senaryo yazma, bu adanmış web sitesinde 24 bulunabilir. </li></ol>

<ol>
	<li>De Rosier, D. J., Klug, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+three+dimensional+structures+from+electron+micrographs.">Reconstruction of three dimensional structures from electron micrographs.</a> Nature. 217 (5124), 130-134 (1968).</li><li>Gan, L., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+tomography+of+cells.">Electron tomography of cells.</a> Q Rev Biophys. 45 (1), 27-56 (2012).</li><li>Lucic, V., Rigort, A., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+tomography:+the+challenge+of+doing+structural+biology+in+situ.">Cryo-electron tomography: the challenge of doing structural biology in situ.</a> J Cell Biol. 202 (3), 407-419 (2013).</li><li>Al-Amoudi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+vitreous+sections.">Cryo-electron microscopy of vitreous sections.</a> EMBO J. 23 (18), 3583-3588 (2004).</li><li>Koguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+STEM+for+observing+nanostructures.">Three-dimensional STEM for observing nanostructures.</a> J Electron Microsc (Tokyo). 50 (3), 235-241 (2001).</li><li>Midgley, P. A., Weyland, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+electron+microscopy+in+the+physical+sciences:+the+development+of+Z-contrast+and+EFTEM+tomography.">3D electron microscopy in the physical sciences: the development of Z-contrast and EFTEM tomography.</a> Ultramicroscopy. 96 (3-4), 413-431 (2003).</li><li>Sousa, A. A., Azari, A. A., Zhang, G., Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-axis+electron+tomography+of+biological+specimens:+Extending+the+limits+of+specimen+thickness+with+bright-field+STEM+imaging.">Dual-axis electron tomography of biological specimens: Extending the limits of specimen thickness with bright-field STEM imaging.</a> J Struct Biol. 174 (1), 107-114 (2011).</li><li>Sousa, A. A., Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+STEM+for+the+biological+sciences.">Development and application of STEM for the biological sciences.</a> Ultramicroscopy. , 38-49 (2012).</li><li>Ercius, P., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incoherent+bright+field+STEM+for+imaging+and+tomography+of+ultra-thick+TEM+cross-sections.">Incoherent bright field STEM for imaging and tomography of ultra-thick TEM cross-sections.</a> Microsc Microanal. 15, (2009).</li><li>Hyun, J. K., Ercius, P., Muller, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beam+spreading+and+spatial+resolution+in+thick+organic+specimens.">Beam spreading and spatial resolution in thick organic specimens.</a> Ultramicroscopy. 109 (1), 1-7 (2008).</li><li>Aoyama, K., Takagi, T., Hirase, A., Miyazawa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STEM+tomography+for+thick+biological+specimens.">STEM tomography for thick biological specimens.</a> Ultramicroscopy. 109 (1), 70-80 (2008).</li><li>Biskupek, J., Leschner, J., Walther, P., Kaiser, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+STEM+tomography+acquisition--a+comparison+of+convergent+beam+and+parallel+beam+STEM+tomography.">Optimization of STEM tomography acquisition--a comparison of convergent beam and parallel beam STEM tomography.</a> Ultramicroscopy. 110 (9), 1231-1237 (2010).</li><li>Hovden, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+Crowther+limit:+combining+depth-sectioning+and+tilt+tomography+for+high-resolution,+wide-field+3D+reconstructions.">Breaking the Crowther limit: combining depth-sectioning and tilt tomography for high-resolution, wide-field 3D reconstructions.</a> Ultramicroscopy. 140, 26-31 (2014).</li><li>Dahmen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+scanning+transmission+electron+microscopy+tilt-+and+focal+series.">Combined scanning transmission electron microscopy tilt- and focal series.</a> Microsc Microanal. 20 (2), 548-560 (2014).</li><li>Trepout, S., Messaoudi, C., Perrot, S., Bastin, P., Marco, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+transmission+electron+microscopy+through-focal+tilt-series+on+biological+specimens.">Scanning transmission electron microscopy through-focal tilt-series on biological specimens.</a> Micron. 77, 9-15 (2015).</li><li>Weyland, M., Muller, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+the+convergence+angle+for+optimum+STEM+performance.">Tuning the convergence angle for optimum STEM performance.</a> FEI Nanosolutions. 1 (24), (2005).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).</li><li>Forster, B., Van De Ville, D., Berent, J., Sage, D., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+wavelets+for+extended+depth-of-field:+a+new+method+for+the+fusion+of+multichannel+microscopy+images.">Complex wavelets for extended depth-of-field: a new method for the fusion of multichannel microscopy images.</a> Microsc Res Tech. 65 (1-2), 33-42 (2004).</li><li>Messaoudii, C., Boudier, T., Sanchez Sorzano, ., O, C., Marco, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TomoJ:+tomography+software+for+three-dimensional+reconstruction+in+transmission+electron+microscopy.">TomoJ: tomography software for three-dimensional reconstruction in transmission electron microscopy.</a> BMC Bioinformatics. 8, 288 (2007).</li><li>Sorzano, C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marker-free+image+registration+of+electron+tomography+tilt-series.">Marker-free image registration of electron tomography tilt-series.</a> BMC Bioinformatics. 10, 124 (2009).</li><li>Kohl, L., Bastin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+flagellum+of+trypanosomes.">The flagellum of trypanosomes.</a> Int Rev Cytol. 244, 227-285 (2005).</li><li>Luft, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvements+in+epoxy+resin+embedding+methods.">Improvements in epoxy resin embedding methods.</a> J Biophys Biochem Cytol. 9, 409-414 (1961).</li><li>Mielanczyk, L., Matysiak, N., Michalski, M., Buldak, R., Wojnicz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Closer+to+the+native+state.+Critical+evaluation+of+cryo-techniques+for+Transmission+Electron+Microscopy:+preparation+of+biological+samples.">Closer to the native state. Critical evaluation of cryo-techniques for Transmission Electron Microscopy: preparation of biological samples.</a> Folia Histochem Cytobiol. 52 (1), 1-17 (2014).</li><li>Hovden, R., Xin, H. L., Muller, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+depth+of+field+for+high-resolution+scanning+transmission+electron+microscopy.">Extended depth of field for high-resolution scanning transmission electron microscopy.</a> Microsc Microanal. 17 (1), 75-80 (2011).</li><li>Dahmen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ettention+software+package.">The Ettention software package.</a> Ultramicroscopy. 161, 110-118 (2016).</li><li>Murata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+imaging+of+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae+by+high-voltage+scanning+transmission+electron+tomography.">Whole-cell imaging of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae by high-voltage scanning transmission electron tomography.</a> Ultramicroscopy. 146, 39-45 (2014).</li><li>Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ion+beam+scanning+electron+microscopy+in+biology.">Focused ion beam scanning electron microscopy in biology.</a> J Microsc. 254 (3), 109-114 (2014).</li><li>Kubota, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+developments+in+electron+microscopy+for+serial+image+acquisition+of+neuronal+profiles.">New developments in electron microscopy for serial image acquisition of neuronal profiles.</a> Microscopy (Oxf). 64 (1), 27-36 (2015).</li><li>Levin, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomaterial+datasets+to+advance+tomography+in+scanning+transmission+electron+microscopy.">Nanomaterial datasets to advance tomography in scanning transmission electron microscopy.</a> Sci Data. 3, 160041 (2016).</li></ol>

We have no conflict of interest to disclose.

Bu makalede, biz aracılığıyla odak tomografi STEM kullanarak kalın biyolojik örnekler üzerinde 3D analizlerini gerçekleştirmek için bir adım-adım kılavuz ile birlikte geleneksel numune hazırlama protokol mevcut. Biyolojik örneklerin reçine gömme yıllardır 26 için kullanılır olmuştur, ve örneklerin farklı uyarlanmış alternatif protokoller literatürde 27 boyunca bulunabilir. Bunun aksine, STEM görüntüleme kalınlıkta numuneler yeni bir teşebb...

1970&#39;lerin başından beri, tomografi yaygın biyolojik örneklerin 1, 2, 3 yapısal karakterizasyonu için kullanılmıştır transmisyon elektron mikroskobu (TEM) yaklaşımları. Transmisyon elektron tomografi Temyizinizi hücre mimarisi ve makromoleküler kompleksler ve proteinlerin yapı organellerin ultrastrüktürü arasında, nanometre ölçeğinde biyolojik yapıların geniş bir çalışma için kullanılabilir olmasıdır. Bununla birlikte, elektron tomografisi çok kalın örnekleri (daha büyük 0,5 um) incelemek için kullanılabilir olabilir. Nitekim, kalın örnekleri düşük sinyal-gürültü oranı (SNR) görüntüler oluşturmak, çok dağınık elektronlar üretir. Buna ek olarak, tomografi eğim açısı ile artan numunenin belirgin kalınlıkta, eğimli örneklerin görüntüleri koleksiyonu içerir. Hatta inelastik saçılma filtre edilebilir olsa daEnerji filtreleri kullanarak, yüksek SNR görüntüler için gerekli elektron kritik miktarı ancak TEM ulaşılır. Bu nedenle, kalın biyolojik örnekler sadece 4 kesit kullanılarak incelenmiştir. onlar kesilir bazı düşürebilir, ve diğerleri kendi karmaşıklığını anlamak için kendi bütünlüğü içinde çalışılması gereken: Bazı numuneler dilimlenmiş edilemez. Alternatif bir yaklaşım, tarama modu 5, 6, 7, 8 TEM kullanmaktır. transmisyon elektron mikroskobu (STEM) tarayarak olarak, elektronların optik yol, geleneksel TEM farklıdır. Elastik dağılmış olan koyu alan (DF) detektörü ile optik eksenden belirli bir açı ile toplanabilir ise saçılma olmadan örnek geçen elektronlar, parlak-alan (BF) detektörü 9 optik eksen üzerinde toplanabilir.KÖK diğer avantajı odaklanmış bir elektron ışını görüntüleri piksel-piksel toplama sağlayan numunenin yüzeyi taranır olmasıdır. Numune 10 geçerken elektron ışını genişletir olsa da, bu özel koleksiyon düzeni geleneksel TEM daha esnek olmayan dağınık elektron daha az duyarlıdır. Ayrıca, bu suretle TEM oluşabilir kromatik sapmaları kaçınarak STEM hiçbir objektif sonrası numune vardır. BF detektörü esas unscattered elektronlar algılaması için Kamera boyu ayarlanabilir. Kalın örnekleri incelemek için DF dedektörü kullanılarak, çünkü yanlış görüntüler üretir çoklu saçılma, tavsiye edilmez. Bunun yerine, BF detektörü 11 kullanılabilir. KÖK yüksek SNR görüntüler üretmek mümkün olmakla birlikte, kalın elde edilebilir derinlemesine bilgi miktarını azaltarak, çünkü TEM kıyasla nispeten yüksek ışın yakınsama nispeten düşük derinliği-of-field vardırnumuneler. odakta bilgi sadece birkaç nanometre bir odak düzlemi kaynaklanan şekilde yakınsama açısı 30 Mrad kadar yüksek olabilir sapmaları düzeltilmiş KÖK mikroskobu, durumunda, derinliği alanı kadar düşük olabilir . Paralel mod elektron ışını ayarlama derinliğini alan elektron ışınının çözünürlüğü 12 zararına artırır. Bununla birlikte, bu kurulum her zaman mümkün değildir. Bir yakınsak elektron demeti kullanımı için gerekli olan zaman, tek bir kalın örnekleri incelenirken derinliğini alan elektron ışını arttırmak teknikleri kullanmak gerekir. Son çalışmalar içinde odak bilgileri 13, 14 maksimum miktarda kurtarmak için numune boyunca çeşitli odak düzlemleri birden fazla görüntü alımını bildirdi. İki çalışmalar, farklı odak düzlemleri bilgi işlemek için farklı yolları açıklanmaktadır. Hovden ve diğ.Çeşitli odak düzlemleri toplanmıştır görüntüleri Fourier uzayında birleştirildi ve nihai imar 13 dönüşümü 3D ters Fourier doğrudan elde edilmiştir. Bunun aksine, Dahmen ve ark. Gerçek uzayda çeşitli odak düzlemleri 14 3D hacmini yeniden bir yakınsak ışın yeniden motorunu geliştirdi. Laboratuvarımız ayrıca kalın biyolojik örneklerin görüntüleme için bir yöntem geliştirdi. Bizim stratejimiz, biz çeşitli odak düzlemleri içinde odak olan bilgileri birleşti ve bir paralel ışın projektörü 15 kullanarak gerçek uzayda son 3D hacmini yeniden ki yukarıda anlatılan iki yöntemden farklı oldu. Amacımız, kolaylıkla bir elektron mikroskobu laboratuarda yapılabilir bir yöntem geliştirmektir. Bu amaçla, geleneksel tomografi deneylerin zaman çerçevesi ile karşılaştırılabilir zaman sınırlı bir miktarda, odak görüntüleri toplamak amaçlanmıştır. Ayrıca, önerilen yöntem chizalama ve yeniden yazılım farklı tipleri ile kullanılmak üzere uyarlanabilir ould. 2015 15 bizim yayın bağlamda, görselleştirmek ve derinliği alanının kurtarma karakterize etmek istedim, bu yüzden biz 25 mrad büyük bir yakınsama yarı açı kullanılır. Burada, 2015 yılında 15 laboratuvarda geliştirilen yönteme göre STEM yoluyla odak görüntüleme gerçekleştirmek için bir adım-adım protokolü mevcut ve biz 2015 verileri işlendi nasıl sunuyoruz. Bu yöntem kalın (750 nm) biyolojik numune boyunca birçok odak düzlemleri gelen odak bilgileri kurtarır ve yüksek kaliteli 3D rekonstrüksiyon sağlar. Uygun durumlarda, diğer gruplar tarafından kullanılan yöntemlerden karşı bu metodoloji farklılıklar da sunulmuştur.

<table><tbody><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2860</td><td></td></tr><tr><td>Epoxy resin</td><td>EMS</td><td>14120</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Add paraformaldehyde powder to PBS heated at approximately 60 &amp;deg;C.&lt;br/&gt; Increase pH by adding 1 N NaOH until no PFA powder is visible.</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Osmium Tetroxyde</td><td>EMS</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>Uranyl Acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>73943</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin Capsule</td><td>EMS</td><td>70110</td><td></td></tr><tr><td>Triming and Histo knives</td><td>LFG Distribution</td><td>Diatome diamond knives</td><td></td></tr><tr><td>Electron Microscopy copper grid</td><td>LFG Distribution</td><td>G200-Cu</td><td></td></tr><tr><td>Grid Coating Pen</td><td>LFG Distribution</td><td>70624</td><td></td></tr><tr><td>Specimen Holder</td><td>JEOL</td><td>EM-21311 HTR</td><td></td></tr><tr><td>Electron Microscope</td><td>JEOL</td><td>JEM-2200FS</td><td></td></tr></tbody></table>

preparation and observation of thick biological samples by scanning transmission electron tomography

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It also describes an imaging method for studying the 3D structure of thick biological specimens by scanning transmission electron tomography. The sample preparation protocol is based on conventional methods in which the sample is fixed using chemical agents, treated with a heavy atom salt contrasting agent, dehydrated in a series of ethanol baths, and embedded in resin. The specific imaging conditions for observing thick samples by scanning transmission electron microscopy are then described. Sections of the sample are observed using a through-focus method involving the collection of several images at various focal planes. This enables the recovery of in-focus information at various heights throughout the sample. This particular collection pattern is performed at each tilt angle during tomography data collection. A single image is then generated, merging the in-focus information from all the different focal planes. A classic tilt-series dataset is then generated. The advantage of the method is that the tilt-series alignment and reconstruction can be performed using standard tools. The collection of through-focal images allows the reconstruction of a 3D volume that contains all of the structural details of the sample in focus.

Bizim çalışmamızda, elektronlar alan emisyon silah transmisyon elektron mikroskobu 200 kV hız verilmiştir. Görüntüler 20 uS bekleme süresi kullanılarak KÖK BF modunda toplanmıştır. ile odak tilt-serisinin tasarımı ile ilgili olarak, biz bir 750 nm kalınlığında biyolojik numune bile elektron ışınının derinliği alan olmasına rağmen sadece ultrastrüktürel çalışma için tatmin edici sonuçlar verdi nm 150 o odak aralıkları bulundu 3 nm beri 25 mrad çok b?...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography at JoVE.com

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

This report describes a sample preparation protocol and specific imaging conditions for performing scanning transmission electron tomography of thick biological specimens.

Tarama Transmisyon Elektron Tomografi ile hazırlanması ve Kalın Biyolojik Örneklerinin Gözlem

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

preparation-observation-thick-biological-samples-scanning

Research

JoVE Journal

Biology

9.2K Görüntüleme.  Campus Universitaire d'Orsay. This report describes a sample preparation protocol and specific imaging conditions for performing scanning transmission electron tomography of thick biological specimens.

Video: Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

Sample Preparation Method of Scanning and Transmission Electron Microscope for the Appendages of Woodboring Beetle

This report described sample preparation methods that scanning and transmission electron microscope observations, demonstrated by preparing appendages of the woodboring beetle, Chlorophorus caragana Xie &#38; Wang (2012), for both types of electron microscopy. The scanning electron microscopy (SEM) sample preparation protocol was based on sample chemical fixation, dehydration in a series of ethanol baths, drying, and sputter-coating. By adding Tween 20 (Polyoxyethylene sorbitan laurate) to the fixative and the wash solution, the insect body surface of woodboring beetle was washed more cleanly in SEM. This study&#39;s transmission electron microscopy (TEM) sample preparation involved a series of steps including fixation, ethanol dehydration, embedding in resin, positioning using fluorescence microscopy, sectioning, and staining. Fixative with Tween 20 enabled penetrate the insect body wall of woodboring beetle more easily than it would had been without Tween 20, and subsequently better fixed tissues and organs in the body, thus yielded clear transmission electron microscope observations of insect sensilla ultrastructures. The next step of this preparation was determining the positions of insect sensilla in the sample embedded in the resin block by using fluorescence microscopy to increase the precision of target sensilla positioning. This improved slicing accuracy.

In order to observe ultrastructure of insect sensilla, scanning and transmission electron microscopy (SEM and TEM, respectively) sample preparation protocol were presented in the study. Tween 20 was added into the fixative to avoid sample deformation in SEM. Fluorescence microscopy was helpful for improving slicing accuracy in TEM.

Woodboring Böceği uzantıları için Tarama ve İletim Elektron Mikroskobu Örnek Hazırlama Yöntemi

This report described sample preparation methods that scanning and transmission electron microscope observations, demonstrated by preparing appendages of ...

Çevre

A Method for Obtaining Serial Ultrathin Sections of Microorganisms in Transmission Electron Microscopy

Observing cells and cell components in three dimensions at high magnification in transmission electron microscopy requires preparing serial ultrathin sections of the specimen. Although preparing serial ultrathin sections is considered to be very difficult, it is rather easy if the proper method is used. In this paper, we show a step-by-step procedure for safely obtaining serial ultrathin sections of microorganisms. The key points of this method are: 1) to use the large part of the specimen and adjust the specimen surface and knife edge so that they are parallel to each other; 2) to cut serial sections in groups and avoid difficulty in separating sections using a pair of hair strands when retrieving a group of serial sections onto the slit grids; 3) to use a 'Section-holding loop' and avoid mixing up the order of the section groups; 4) to use a 'Water-surface-raising loop' and make sure the sections are positioned on the apex of the water and that they touch the grid first, in order to place them in the desired position on the grids; 5) to use the support film on an aluminum rack and make it easier to recover the sections on the grids and to avoid wrinkling of the support film; and 6) to use a staining tube and avoid accidentally breaking the support films with tweezers. This new method enables obtaining serial ultrathin sections without difficulty. The method makes it possible to analyze cell structures of microorganisms at high resolution in 3D, which cannot be achieved by using the automatic tape-collecting ultramicrotome method and serial block-face or focused ion beam scanning electron microscopy.

This study presents reliable and easy procedures for obtaining serial ultrathin sections of a microorganism without expensive equipment in transmission electron microscopy.

Transmisyon elektron mikroskobu mikroorganizmaların seri Ultrathin bölümler elde etmek için bir yöntem

Observing cells and cell components in three dimensions at high magnification in transmission electron microscopy requires preparing serial ultrathin ...

Mühendislik

Processing Embryo, Eggshell, and Fungal Culture for Scanning Electron Microscopy

Although scanning electron microscopy (SEM) is being widely used for the ultra-structural analysis of various biological and non-biological samples, methods involved in processing different biological samples involve unique practices. All conventional practices described in the literature for processing samples still find useful applications, but subtle changes in the sample preparation can alter image quality, as well as, introduce artifacts. Hence, using a unique sample preparation technique specific to the type of tissue analyzed is required to obtain a good quality image with ultrastructural resolution. The focus of this study is to provide the optimal sample preparation protocols for imaging embryos, rigid eggshells, and fungal cultures using SEM. The following optimizations were recommended to yield good results for the three different delicate biological samples studied. Use of milder fixatives like 4% paraformaldehyde or 3% glutaraldehyde followed by dehydration with ethanol series is mandatory. Fungal mycelium on agar blocks obtained by slide cultures yields a better ultrastructural integrity compared to cultures taken directly from agar plates. Chemical drying of embryos with HMDS provides drying without introducing surface tension artifacts compared to critical point drying. HMDS prevents cracking caused by shrinkage as samples are less brittle during drying. However, for fungal culture, critical point drying provides acceptable image quality compared to chemical drying. Eggshells can be imaged with no special preparation steps except for thorough washing and air drying prior to mounting. Preparation methodologies were standardized based on acceptable image quality obtained with each trial.&#160;

Here, we present detailed processing protocols for imaging delicate tissue samples using scanning electron microscopy (SEM). Three different processing methods, namely, hexamethyl disilazana (HMDS) chemical drying, simple air drying, and critical point drying are described for preparing rigid eggshells, embryos at early developmental stages, and fungal cultures respectively.

Taramalı Elektron Mikroskobu için Embriyo, Yumurta Kabuğu ve Mantar Kültürünün İşlenmesi

Although scanning electron microscopy (SEM) is being widely used for the ultra-structural analysis of various biological and non-biological samples, ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

We present a protocol on how to utilize high-throughput cryo-electron tomography to determine high resolution in situ structures of molecular machines. The protocol permits large amounts of data to be processed, avoids common bottlenecks and reduces resource downtime, allowing the user to focus on important biological questions.

Tomoauto kullanma: Bir Protokol Yüksek verim Otomatik Cryo-elektron Tomografi için

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

Biyomühendislik

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein complexes to atomic resolution. However, protein isolation techniques and sample preparation methods for EM remain a bottleneck. A relatively small number (100,000 to a few million) of individual protein particles need to be imaged for the high-resolution analysis of proteins by the single particle EM approach, making miniaturized sample handling techniques and microfluidic principles feasible.
A miniaturized, paper-blotting-free EM grid preparation method for sample pre-conditioning, EM grid priming and post processing that only consumes nanoliter-volumes of sample is presented. The method uses a dispensing system with sub-nanoliter precision to control liquid uptake and EM grid priming, a platform to control the grid temperature thereby determining the relative humidity above the EM grid, and a pick-and-plunge-mechanism for sample vitrification. For cryo-EM, an EM grid is placed on the temperature-controlled stage and the sample is aspirated into a capillary. The capillary tip is positioned in proximity to the grid surface, the grid is loaded with the sample and excess is re-aspirated into the microcapillary. Subsequently, the sample film is stabilized and slightly thinned by controlled water evaporation regulated by the offset of the platform temperature relative to the dew-point. At a given point the pick-and-plunge mechanism is triggered, rapidly transferring the primed EM grid into liquid ethane for sample vitrification. Alternatively, sample-conditioning methods are available to prepare nanoliter-sized sample volumes for negative stain (NS) EM.
The methodologies greatly reduce sample consumption and avoid approaches potentially harmful to proteins, such as the filter paper blotting used in conventional methods. Furthermore, the minuscule amount of sample required allows novel experimental strategies, such as fast sample conditioning, combination with single-cell lysis for &#34;visual proteomics,&#34; or &#34;lossless&#34; total sample preparation for quantitative analysis of complex samples.

An instrument and methods for the preparation of nanoliter-sized sample volumes for transmission electron microscopy is presented. No paper-blotting steps are required, thus avoiding the detrimental consequences this can have for proteins, significantly reducing sample loss and enabling the analysis of single cell lysate for visual proteomics.

Kırılan numune hazırlama için iletim elektron mikroskobu

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Biyoloji

Array Tomography Workflow for the Targeted Acquisition of Volume Information using Scanning Electron Microscopy

Electron microscopy is applied in biology and medicine for imaging of cellular and structural details at nanometer resolution. Historically, Transmission Electron Microscopy (TEM) provided insight into cell ultrastructure, but in the recent decade, the development of modern Scanning Electron Microscopes (SEM) has changed the way of looking inside the cells. Even though the resolution of TEM is superior when protein-level structural details are needed, SEM-resolution is sufficient for the majority of the organelle-level cell biology-related questions. The advancement in technology enabled automatic volume acquisition solutions such as Serial block-face imaging (SBF-SEM) and Focused ion beam SEM (FIB-SEM). Nevertheless, to this day, these methods remain inefficient when the identification and navigation to areas of interest are crucial. Without the means for precise localization of target areas before imaging, operators need to acquire much more data than they need (in SBF-SEM), or, even worse, prepare many grids and image them all (in TEM). We propose the strategy of "lateral screening" using Array Tomography in SEM, which facilitates the localization of areas of interest, followed by automated imaging of the relevant fraction of the total sample volume. Array tomography samples are conserved during imaging, and they can be arranged into section libraries ready for repeated imaging. Several examples are shown in which lateral screening enables us to analyze structural details that are incredibly challenging to access with any other method.

We describe the preparation of ribbons of serial sections and their collection on large transfer support for use as Array Tomography samples, along with automated imaging procedures in a scanning electron microscope. The protocol allows screening, retrieval, and targeted imaging of local, rare events, and the acquisition of large data volumes.

TaramaLı Elektron Mikroskopisi Kullanılarak Hacim Bilgilerinin Hedefli Edinimi için Dizi Tomografi İş Akışı

Electron microscopy is applied in biology and medicine for imaging of cellular and structural details at nanometer resolution. Historically, Transmission ...

A 3D Cartographic Description of the Cell by Cryo Soft X-ray Tomography

Imaging techniques are fundamental in order to understand cell organization and machinery in biological research and the related fields. Among these techniques, cryo soft X-ray tomography (SXT) allows imaging whole cryo-preserved cells in the water window X-ray energy range (284-543 eV), in which carbon structures have intrinsically higher absorption than water, allowing the 3D reconstruction of the linear absorption coefficient of the material contained in each voxel. Quantitative structural information at the level of whole cells up to 10 &#181;m thick is then achievable this way, with high throughput and spatial resolution down to 25-30 nm half-pitch. Cryo-SXT has proven itself relevant to current biomedical research, providing 3D information on cellular infection processes (virus, bacteria, or parasites), morphological changes due to diseases (such as recessive genetic diseases) and helping us understand drug action at the cellular level, or locating specific structures in the 3D cellular environment. In addition, by taking advantage of the tunable wavelength at synchrotron facilities, spectro-microscopy or its 3D counterpart, spectro-tomography, can also be used to image and quantify specific elements in the cell, such as calcium in biomineralization processes. Cryo-SXT provides complementary information to other biological imaging techniques such as electron microscopy, X-ray fluorescence or visible light fluorescence, and is generally used as a partner method for 2D or 3D correlative imaging at cryogenic conditions in order to link function, location, and morphology.

Here, a protocol describing the sample preparation and data collection steps required in cryo soft X-ray tomography (SXT) to image the ultrastructure of whole cryo-preserved cells at a resolution of 25 nm half pitch, is presented.

Cryo Soft X-ray Tomografisi ile Hücrenin 3D Kartografik Açıklaması

Imaging techniques are fundamental in order to understand cell organization and machinery in biological research and the related fields. Among these ...

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current state-of-the-art cryoET combined with subtomogram averaging analysis enables the high-resolution structural determination of macromolecular complexes that are present in multiple copies within tomographic reconstructions. Tomographic experiments usually require a vast amount of tilt series to be acquired by means of high-end transmission electron microscopes with important operational running-costs. Although the throughput and reliability of automated data acquisition routines have constantly improved over the recent years, the process of selecting regions of interest at which a tilt series will be acquired cannot be easily automated and it still relies on the user's manual input. Therefore, the set-up of a large-scale data collection session is a time-consuming procedure that can considerably reduce the remaining microscope time available for tilt series acquisition. Here, the protocol describes the recently developed implementations based on the SerialEM package and the PyEM software that significantly improve the time-efficiency of grid screening and large-scale tilt series data collection. The presented protocol illustrates how to use SerialEM scripting functionalities to fully automate grid mapping, grid square mapping, and tilt series acquisition. Furthermore, the protocol describes how to use PyEM to select additional acquisition targets in off-line mode after automated data collection is initiated. To illustrate this protocol, its application in the context of high-end data collection of Sars-Cov-2 tilt series is described. The presented pipeline is particularly suited to maximizing the time-efficiency of tomography experiments that require a careful selection of acquisition targets and at the same time a large amount of tilt series to be collected.

The increasing demand for large-scale data collection in cryogenic electron tomography requires high-throughput image acquisition routines. Described here is a protocol that implements the recent developments of advanced acquisition strategies aimed at maximizing the time-efficiency and throughput of tomographic data collection.

Kriyojenik Elektron Tomografi Veri Kazanımının Optimizasyonu stratejileri

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current ...

Cryo-Electron Tomography Remote Data Collection and Subtomogram Averaging

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has been gaining momentum in recent years, especially since the introduction of direct electron detectors, improved automated acquisition strategies, preparative techniques that expand the possibilities of what the electron microscope can image at high-resolution using cryo-ET and new subtomogram averaging software. Additionally, data acquisition has become increasingly streamlined, making it more accessible to many users. The SARS-CoV-2 pandemic has further accelerated remote cryo-electron microscopy (cryo-EM) data collection, especially for single-particle cryo-EM, in many facilities globally, providing uninterrupted user access to state-of-the-art instruments during the pandemic. With the recent advances in Tomo5 (software for 3D electron tomography), remote cryo-ET data collection has become robust and easy to handle from anywhere in the world. This article aims to provide a detailed walk-through, starting from the data collection setup in the tomography software for the process of a (remote) cryo-ET data collection session with detailed troubleshooting. The (remote) data collection protocol is further complemented with the workflow for structure determination at near-atomic resolution by subtomogram averaging with emClarity, using apoferritin as an example.

The present protocol describes high-resolution cryo-electron tomography remote data acquisition using Tomo5 and subsequent data processing and subtomogram averaging using emClarity. Apoferritin is used as an example to illustrate detailed step-by-step processes to achieve a cryo-ET structure at 2.86 &#197; resolution.

Kriyo-elektron Tomografisi Uzaktan Veri Toplama ve Subtomogram Ortalaması

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has been gaining momentum in recent years, especially since the introduction of direct electron detectors, improved ...

Visualization of Organelles In Situ by Cryo-STEM Tomography

Cryogenic electron microscopy (cryo-EM) relies on the imaging of biological or organic specimens embedded in their native aqueous medium; water is solidified into a glass (i.e., vitrified) without crystallization. The cryo-EM method is widely used to determine the structure of biological macromolecules recently at a near-atomic resolution. The approach has been extended to the study of organelles and cells using tomography, but the conventional mode of wide-field transmission EM imaging suffers a severe limitation in the specimen thickness. This has led to a practice of milling thin lamellae using a focused ion beam; the high resolution is obtained by subtomogram averaging from the reconstructions, but three-dimensional relations outside the remaining layer are lost. The thickness limitation can be circumvented by scanned probe imaging, similar to the scanning EM or the confocal laser scanning microscope. While scanning transmission electron microscopy (STEM) in materials science provides atomic resolution in single images, the sensitivity of cryogenic biological specimens to electron irradiation requires special considerations. This protocol presents a setup for cryo-tomography using STEM. The basic topical configuration of the microscope is described for both two- and three-condenser systems, while automation is provided by the non-commercial SerialEM software. Enhancements for batch acquisition and correlative alignment to previously-acquired fluorescence maps are also described. As an example, we show the reconstruction of a mitochondrion, pointing out the inner and outer membrane and calcium phosphate granules, as well as surrounding microtubules, actin filaments, and ribosomes. Cryo-STEM tomography excels in revealing the theater of organelles in the cytoplasm and, in some cases, even the nuclear periphery of adherent cells in culture.

Visualization of Organelles In Situ by Cryo-STEM Tomography

Cryo-STEM tomography provides a means to visualize organelles of intact cells without embedding, sectioning, or other invasive preparations. The 3D resolution obtained is currently in the range of a few nanometers, with a field of view of several micrometers and an accessible thickness in the order of 1 &#181;m.