Yazarlar tartışmalar için diferansiyel taramalı kalorimetre, Sasmit Deshmukh ve Webster Magcalas kurulum ve eğitim rollerinden ötürü (eski GE Healthcare ile), Joseph Mancini, Pawel Czudec, Thomas Cage (Malvern Instruments sınırlı) için müteşekkiriz.

1. Enstrüman Başlangıç <ol><li> Diferansiyel tarama kalorimetresi açın ve numune kaynamasını engellemek için hücrelerde basıncı artırmak yanı sıra oluşturma yüksek sıcaklıklarda kabarcıklar engeller. Bu, tipik olarak sisteme azot tedarik ederek elde edilir. </li><li> Hücre (örneğin, tantal, altın, platin, vs.) oluşturan malzemeye bağlı olarak, hücrenin zarar görmesini önlemek için üreticinin tavsiye basınca göre azot gazı besleme basıncını ayarlar. Örneğin, hücreye zarar verebilir 80 psi üzerinde bu prosedür geliştirmek için kullanılan cihaz için 45 psi&#39;de azot gaz kaynağının basıncı ve basınç ayarlamak. </li><li> Tüm temizlik maddesi depoları gerekli hacme kadar dolu olduğundan emin olun. gerekli temizleme maddeleri yıkama ve her bir örnek çalışmasından sonra, sırasıyla hücre temizlemek için deterjan ve su içerir. </li><li> Numune tutma bölmenin sıcaklığı ayarlayınuygun bir değer, tercihen 5 ° C&#39;ye kadar, deney öncesinde numunenin bütünlüğünü korumak için. </li></ol> 2. Numune Hazırlama <ol><li> deney için referans olarak kullanılacaktır tampona karşı örnek dialyze. Seçenek olarak ise, protein saflaştırma (örneğin, sütun elüsyon) son aşamasında toplanan elüsyon tamponu kullanılabilir. </li><li> Bu Kjedahl yöntemi 33 veya Lowry yöntemi 34 gibi en uygun protein konsantrasyonu belirleme yöntemini kullanarak protein numune konsantrasyonunu belirlemek. Sonuçların objektif karşılaştırma için, aynı çalışma içinde tutarlı bir şekilde aynı yöntemi kullanın. Gerekli konsantrasyon aralığı enstrüman modeline bağlı olarak değişebilir. 1 mg / ml - Bu protokolde kullanılan enstrüman için tercih çalışma aralığı 0.5 olduğunu. </li><li> vakum örnek ve referans tampon hacmi inaccur neden olabilir mikro kabarcık kurtulmak için DegasACY. Bu adım yeni kalorimetre modelleri için atlanabilir. </li><li> Laminer akış biyolojik tecrit kabininde bir mikropipet ve steril ipuçları kullanılarak, alet ile uyumlu 96 oyuklu plakalara çift örnekleri ve bunların ilgili tampon yükleyin. Tampon-tamponu, sırasıyla su işlemi için su ile tampon ile kuyu ilk iki çift son iki çift doldurun. Tampon tampon taramaları ölçümü (enstrümantasyon hatası yani değerlendirmesini) örnek yanı sıra bir temel kurmak için önce aracın uygunluğunu teyit etmek; Su taramaları çalıştırmak ise hücreleri temizlemek için. </li><li> bir sızdırmazlık film ile 96-plaka Kapak ve kuyular düzgün örnek kirlenmeyi önlemek için Biyogüvenlik Kurulu dışarı tabak almadan önce mühürlü olduğundan emin olun. </li><li> Doğru yönde örnek tutan bölmeye plaka koyun. </li></ol> 3. Deneysel Parametre Ayarı Not: i bağlınstrumentation numuneler manuel bir şırınga kullanarak, ya da otomatik olarak, bir otomatik numune alıcı ile hücre içine yerleştirilebilir. Bu durumda, (örneğin, bir sanayi ortamında) olarak, bir otomatik numune zaman kazanmak için kullanılır. <ol><li> satın alma yazılımı kullanarak, plaka bölüm 2.4 uyarınca yüklenen sırayla örnek bilgileri giriniz. Varsa aksi halde, önceki veri analizi (bölüm 4.2) için analiz yazılımı içine konsantrasyon değerleri girin, konsantrasyonları girin. </li><li> hücrelerde kalan hiçbir deterjan kalıntılarını sağlamak için birden fazla su ile durulama adımlarla takip edilmelidir her numune tarama, önce deterjanla hücrelerin temizlik sağlar seçeneği seçin. </li><li> 20 ° C&#39;ye kadar deney başlangıç ​​sıcaklığına ayarlayın, ancak, bu örnek önceden bilgisine bağlı olarak değişebilir. daha düşük bir başlangıç ​​sıcaklığı bilinmiyor örnekleri için uygulanabilir ise bilinen proteinleri için, önceden belirlenmiş bir başlangıç ​​sıcaklığı kullanılabilir. </li><li> Nihai sıcaklığı ayarlamakDeney, örneğin, 100 ° C&#39;dir. Nihai sıcaklık, numunenin önceki bilgisine bağlı olarak değişebilir. </li><li> Tipik tarama oranı deney tarama hızı, örneğin 60 ° C / h, ayarlayın. Ancak, tarama hızı, örneğin, numunenin önceki bilgisine bağlı olarak 90 ° C / h veya 120 ° C / h değişebilir. Açılım kinetiği değerlendirmek için farklı tarama hızlarında bilinmeyen örnekleri taramak için tavsiye edilir. </li><li> Rescan numuneler açılımı termal geri dönüşlülüğünü araştırmak. İkinci tarama için elde edilen entalpi ilk tarama için entalpi değerinin en az% 80 olması durumunda bir proteinin açılımı geri dönüşümlü olarak kabul edilir. </li><li> Kalorimetre hücrelerinin bütünlüğünü korumak için 10 ° C sonrası deney termostatı ayarlayın. </li><li> Deney ayar parametreleri deney çalıştırmadan önce doğru olduğundan emin olun. Her şey yerinde ise, deney başlar. </li></ol> 4. Veri Analysis <ol><li> Denemeden ham veri alma ve analiz için bir defada bir örnek seçin. Örnek tarama Çıkar referans tarama, yani tampon. NOT: Referans çıkarma DSC araçların yeni modelleri ile otomatik olarak yürütülür. </li><li> bu bölüm 3.1 uyarınca ihmal eğer örnek konsantrasyon değerini girin. </li><li> Fit ve açılımı üzerine su hidrofobik grupların maruz kalma sonucu protein katlanmış ve katlanmamış devletlerin ısı kapasiteleri farklılıkları hesaba edinilen termogramı çizgisinin çıkarın. Doğrusal ya da kübik eğri örnek için DSC profili şekline bağlı olarak uygulanabilir. Tutarlılık için montaj aynı tip bir çalışma, örneğin gerçek zamanlı stabilite çalışması sırasında kullanılacak sahiptir. Bu adım, Tepe noktası entegrasyonu geçiş entalpisi elde etmek için eğri işlemek için gereklidir. </li><li> lineer olmayan en küçük kareler kullanılarak Tepe noktası entegrasyonu gerçekleştirin. Ürünün göreBilgi iki devlet veya non-iki-devlet modelinin uygulayın. İki devlet modeli tek kooperatif termal geçişler için kullanılan ve daha fazla ürün bilgisi kullanılabilir duruma gelene kadar bilinmeyen proteinlerin olmayan iki devletli bir model uygulamak olabilir. Varsa, Ki-kare değeri sabit kalana kadar ekipmanın yazılımın mükerrer eğri işlevini kullanarak uydurma eğrisini ayarlamak. </li><li> Elde edilen sonuçlar geçiş sıcaklıkları (Tm), kalorimetrik entalpisi (AH) ve numunenin van&#39;t Hoff entalpisi (AH VH) orta değerlerini gösterecektir. </li></ol>

<ol>
	<li>Gill, P., Moghadam, T. T., Ranjbar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+scanning+calorimetry+techniques:+applications+in+biology+and+nanoscience.">Differential scanning calorimetry techniques: applications in biology and nanoscience.</a> J. Biomol. Tech. 21 (4), 167-193 (2010).</li><li>Watson, E. S., O'Neil, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+microcalorimeter.">Differential microcalorimeter.</a> Patent. , (1966).</li><li>O'Neill, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Analysis+of+a+Temperature-Controlled+Scanning+Calorimeter.">The Analysis of a Temperature-Controlled Scanning Calorimeter.</a> Anal. Chem. 36 (7), 1238-1245 (1964).</li><li>O'Neil, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Specific+Heat+Functions+by+Differential+Scanning+Calorimetry.">Measurement of Specific Heat Functions by Differential Scanning Calorimetry.</a> Anal. Chem. 38 (10), 1331-1336 (1966).</li><li>Privalov, P. L., Monaselidze, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mol. Biol. 6, 7-33 (1975).</li><li>Privalov, P. L., Plotnikov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adiabatic+differential+microcalorimeter.">Adiabatic differential microcalorimeter.</a> &#1040;&#1076;&#1080;&#1072;&#1073;&#1072;&#1090;&#1080;&#1095;&#1077;&#1089;&#1082;&#1080;&#1081; &#1076;&#1080;&#1092;&#1092;&#1077;&#1088;&#1077;&#1085;&#1094;&#1080;&#1072;&#1083;&#1100;&#1085;&#1099;&#1081; &#1084;&#1080;&#1082;&#1088;&#1086;&#1082;&#1072;&#1083;&#1086;&#1088;&#1080;&#1084;&#1077;&#1090;&#1088;. , (1970).</li><li>Andronikashvili, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calorimetric+study+of+the+nature+of+the+intramolecular+fusion+of+collagen,+isolated+from+transplantable+tumor.">Calorimetric study of the nature of the intramolecular fusion of collagen, isolated from transplantable tumor.</a> Dokl. Akad. Nauk. 183 (1), 212-214 (1968).</li><li>Andronikashvili, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Conformational Changes of Biopolymers in Solution. , 171-173 (1973).</li><li>Andronikashvili, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+transformation+and+changes+in+various+physic-chemical+properties+of+macromolecules+and+supramolecular+structures.">Malignant transformation and changes in various physic-chemical properties of macromolecules and supramolecular structures.</a> Biofizika. 32 (5), 782-799 (1987).</li><li>Velicelebi, G., Sturtevant, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamics+of+the+denaturation+of+lysozyme+in+alcohol-water+mixtures.">Thermodynamics of the denaturation of lysozyme in alcohol-water mixtures.</a> Biochemistry. 18 (7), 1180-1186 (1979).</li><li>Sturtevant, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+capacity+and+entropy+changes+in+processes+involving+proteins.">Heat capacity and entropy changes in processes involving proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 74 (6), 2236-2240 (1977).</li><li>Sturtevant, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+applications+of+differential+scanning+calorimetry.">Biochemical applications of differential scanning calorimetry.</a> Annu. Rev. of Phys. Chem. 38, 463-488 (1987).</li><li>Jackson, W. M., Brandts, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamics+of+protein+denaturation.+A+calorimetric+study+of+the+reversible+denaturation+of+chymotrypsinogen+and+conclusions+regarding+the+accuracy+of+the+two-state+approximation.">Thermodynamics of protein denaturation. A calorimetric study of the reversible denaturation of chymotrypsinogen and conclusions regarding the accuracy of the two-state approximation.</a> Biochem. 9 (11), 2294-2301 (1970).</li><li>Privalov, P. L., Khechinashvili, N. N., Atanasov, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+analysis+of+thermal+transitions+in+globular+proteins.+I.+Calorimetric+study+of+chymotrypsinogen,+ribonuclease+and+myoglobin.">Thermodynamic analysis of thermal transitions in globular proteins. I. Calorimetric study of chymotrypsinogen, ribonuclease and myoglobin.</a> Biopolymers. 10 (10), 1865-1890 (1971).</li><li>Privalov, P. L., Khechinashvili, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thermodynamic+approach+to+the+problem+of+stabilization+of+globular+protein+structure:+a+calorimetric+study.">A thermodynamic approach to the problem of stabilization of globular protein structure: a calorimetric study.</a> J. Mol. Biol. 86 (3), 665-684 (1974).</li><li>Privalov, P. L., Potekhin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+microcalorimetry+in+studying+temperature-induced+changes+in+proteins.">Scanning microcalorimetry in studying temperature-induced changes in proteins.</a> Methods Enzymol. 131, 4-51 (1986).</li><li>Veprintseva, O. D., Emelyanenko, V. I., Konstantinova, V. V., Shnyrov, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+structural+changes+in+bacteriophage+T4+tail+proteins.">The importance of structural changes in bacteriophage T4 tail proteins.</a> Biofizika. 33, 954-961 (1988).</li><li>Shutilova, N., Semenova, G., Klimov, V., Shnyrov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-induced+functional+and+structural+transformations+of+the+photosystem+II+oxygen-evolving+complex+in+spinach+subchloroplast+preparations.">Temperature-induced functional and structural transformations of the photosystem II oxygen-evolving complex in spinach subchloroplast preparations.</a> Biochem. Mol. Biol. Int. 35 (6), 1233-1243 (1995).</li><li>Sanina, N. M., Kostetsky, E. Y. a., Shnyrov, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calorimetric+investigation+of+phosphatidyl+choline+from+membranes+of+marine+invertebrates.">Calorimetric investigation of phosphatidyl choline from membranes of marine invertebrates.</a> J. Evol. Biokhim. Physiol. 23, 451-460 (1987).</li><li>Oreshkin, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+changes+in+the+muscle+proteins+of+cured+beef+during+heating.">Conformational changes in the muscle proteins of cured beef during heating.</a> Meat Science. 16 (4), 297-305 (1986).</li><li>Kirkitadze, M., Hu, J., Tang, M., Carpick, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualification+of+a+differential+scanning+calorimetry+method+for+biophysical+characterization+of+monoclonal+antibodies+and+protein+vaccine+antigens.">Qualification of a differential scanning calorimetry method for biophysical characterization of monoclonal antibodies and protein vaccine antigens.</a> Pharm. Bioprocess. 2 (6), 491-498 (2014).</li><li>Jiskoot, W., Daan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods for structural analysis of protein pharmaceuticals. 3, (2005).</li><li>Plotnikov, V. V., Brandts, M., Lin, L. N., Brandts, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+ultrasensitive+scanning+calorimeter.">A new ultrasensitive scanning calorimeter.</a> Anal. Biochem. 250 (2), 237-244 (1997).</li><li>Plotnikov, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+autosampling+differential+scanning+calorimeter+instrument+for+studying+molecular+interactions.">An autosampling differential scanning calorimeter instrument for studying molecular interactions.</a> Assay Drug Dev. Technol. 1 (1), 83-90 (2002).</li><li>Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+scanning+calorimetry.">Differential scanning calorimetry.</a> Protein Stability and Folding: Theory and Practice. Method in Molecular Biology. 40, 191-218 (1995).</li><li>Freire, E., van Osdol, W. W., Mayorga, O. L., Sanchez-Ruiz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calorimetrically+determined+dynamics+of+complex+unfolding+transitions+in+proteins.">Calorimetrically determined dynamics of complex unfolding transitions in proteins.</a> Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 19, 159-188 (1990).</li><li>Johnson, C. R., Morin, P. E., Arrowsmith, C. H., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+analysis+of+the+structural+stability+of+the+tetrameric+oligomerization+domain+of+p53+tumor+suppressor.">Thermodynamic analysis of the structural stability of the tetrameric oligomerization domain of p53 tumor suppressor.</a> Biochemistry. 34 (16), 5309-5316 (1995).</li><li>Kasimova, M. R., Sam, J. M., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+conformational+equilibrium+of+human+growth+hormone.">The conformational equilibrium of human growth hormone.</a> J. Mol. Biol. 277 (2), 409-418 (1998).</li><li>Saboury, A. A., Moosavi-Movahedi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarification+of+calorimetric+and+van't+hoff+enthalpies+for+evaluation+of+protein+transition+states.">Clarification of calorimetric and van't hoff enthalpies for evaluation of protein transition states.</a> Biochem Edu. 22 (4), 210-211 (1994).</li><li>Privalov, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcalorimetry+of+proteins+and+their+complexes.">Microcalorimetry of proteins and their complexes.</a> Protein Structure, Stability, and Interactions. Method in Molecular Biology. 490, 1-39 (2009).</li><li>Dehghan-Nayeri, N., Rezaei-Tavirani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Interpretation+of+Protein+Structure+Through+Relationship+of+Melting+Point+(Tm)+and+Enthalpy+of+Unfolding+(&#916;HU).">The Interpretation of Protein Structure Through Relationship of Melting Point (Tm) and Enthalpy of Unfolding (&#916;HU).</a> Int J Anal Pharma Biomed Sci. 4 (1), 47-50 (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+testing+of+new+drug+substances+and+products.">Stability testing of new drug substances and products.</a> Guideline, ICH Harmonised Tripartite. 1 (2), (2003).</li><li>Kjeldahl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neue+Methode+zur+Bestimmung+des+Stickstoffs+in+organischen+K&#246;rpern+(New+method+for+the+determination+of+nitrogen+in+organic+substances).">Neue Methode zur Bestimmung des Stickstoffs in organischen K&#246;rpern (New method for the determination of nitrogen in organic substances).</a> Zeitschrift f&#252;r analytische Chemie. 22 (1), 366-383 (1883).</li><li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+measurement+with+the+Folin+phenol+reagent.">Protein measurement with the Folin phenol reagent.</a> J. Biol. Chem. 193 (1), 265-275 (1951).</li><li>H&#214;hne, G., Hemminger, W., Flammersheim, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Differential Scanning Calorimetry. , (2003).</li><li>Porter, L. L., George, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thermodynamic+definition+of+protein+domains.">A thermodynamic definition of protein domains.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (24), 9420-9425 (2012).</li><li>Frokjaer, S., Daniel, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+drug+stability:+a+formulation+challenge.">Protein drug stability: a formulation challenge.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4, 298-306 (2005).</li><li>Johnson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+scanning+calorimetry+as+a+tool+for+protein+folding+and+stability.">Differential scanning calorimetry as a tool for protein folding and stability.</a> Arch. Biochem. Biophys. 531, 100-109 (2013).</li><li>Chiu, M. H., Elmar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+scanning+calorimetry:+an+invaluable+tool+for+a+detailed+thermodynamic+characterization+of+macromolecules+and+their+interactions.">Differential scanning calorimetry: an invaluable tool for a detailed thermodynamic characterization of macromolecules and their interactions.</a> J. Pharm. Bioallied Sci. 3 (1), 39-59 (2011).</li><li>Hirst, J. D., Charles, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicity,+circular+dichroism+and+molecular+dynamics+of+proteins.">Helicity, circular dichroism and molecular dynamics of proteins.</a> J. Mol. Biol. 243 (2), 173-178 (1994).</li><li>Kirkitadze, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+modules+of+the+vaccinia+virus+complement+control+protein+are+not+in+extensive+contact.">Central modules of the vaccinia virus complement control protein are not in extensive contact.</a> Biochem. J. 344 (1), 167-175 (1999).</li><li>Freire, E., Sch&#214;n, A., Hutchins, B. M., Brown, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+denaturation+as+a+tool+in+the+formulation+optimization+of+biologics.">Chemical denaturation as a tool in the formulation optimization of biologics.</a> Drug disc today. 18 (19), 1007-1013 (2013).</li><li>Wen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+differential+scanning+calorimetry+for+thermal+stability+analysis+of+proteins:+qualification+of+DSC.">Applications of differential scanning calorimetry for thermal stability analysis of proteins: qualification of DSC.</a> J. Pharm. Sci. 101 (3), 955-964 (2012).</li></ol>

Tüm yazarlar Sanofi Pasteur çalışanları vardır. iş Sanofi Pasteur tarafından finanse edildi ve bu video-makale için yayın ücreti Sanofi Pasteur tarafından ödendi. Yazarlar hiçbir ilgili bağlılıkları ya da yazının tartışılan konu veya malzeme ile bir finansal çatışma olan herhangi bir örgüt ya da kurum ile finansal katılımı var. Bunlar istihdam, danışmanlıklar, hisse senedi sahipliği veya seçenekleri ya da telif içerir. Hiçbir yazı yardımı bu yazının üretiminde kullanılmıştır.

Bu prosedür başarıyla istikrar ve ürün karşılaştırma çalışmaları 21 dahil olmak üzere çeşitli karakterizasyon testi paketleri, dahil edilmiştir. Gerçek zamanlı stabilite çalışmalarda, DSC, raf ömrünü belirlemek için Tm&#39;ye izlemek, hem de zaman içinde biyolojik F, bir tahmin etmek için kullanılır. Ürün karşılaştırılabilirlik açısından, süreç ve tesis değişikliğinin etkilerini yanı sıra üretilen birçok yapısal konformasyon anahtar üretim aşamalarının etkisini değerlendirmek için kullanılır. Bu genellikle ideal bir ürün olarak tayin edilmiştir referans ürüne üretilen partisinin Sh doğrudan karşılaştırılmasını gerektirir. Buna ek olarak, DSC ürün formülasyon çalışmaları 37 için yararlı bir analitik araç olduğunu kanıtlamıştır. Farklı tamponlar ve farklı konsantrasyonlarda bir proteinin Tm en kararlılık proffers formülasyonu tespit etmek için kullanılabilirProtein. Bu yöntem ve sonuçlarının objektifliği güvenilirliğini sağlamak için, aynı çalışmada (örneğin, aşı formülasyonu çalışması) içinde çalıştırmak için çalışma tutarlı test parametrelerini tutmak önemlidir. Bununla birlikte, işlem çeşitli proteinlerin fiziksel özelliklerde farklılık uyum için değiştirilebilir. Yapılabilir bir modifikasyon örneği deney 38, 39 tarama hızını değiştirmektedir. Daha hızlı bir tarama oranında incelenmiştir ısıtıldığında oluşturucu agrega eğilimli olan proteinler (örneğin, 120 ° C / saat) kalorimetre kılcal tıkanma gibi termik geçiş profilinin agrega katkı önlemek için. Bu oran tarayarak bir DSC deney 38 sonucunu etkileyebilir dikkati çekiyor. Termal geçiş zirve genişletilmesi yanlısı bazı tarama oranlarının artırılması ile gözlenmiştirproteinlerinin; Ancak, Tm oldukça sabit 38 kalmıştır. Ayrıca, numune hazırlama için diyaliz ve gaz giderme adımları da doğru sonuçlar 31 için çok önemlidir. Diyaliz örnek ve tampon kompozisyonu tek fark protein sağlar; Bu şekilde, numune tarafından emilen tüm aşırı ısı proteinin ısı kapasitesi ile de ilişkilendirilebilir. Termodinamik parametre ekstrapolasyon açılımı olay sabit hacim ve basınç 31 altında oluştuğunu varsayar olarak gaz alma, hassas ses analizini sağlar. varsayım sabit basınç kısmı prosedürünün bölüm 1.1 uyarınca sisteme azot basınçlandırma ile muhasebeleştirilir. Bu dairesel dikroizm (CD) Floresans Spektroskopileri olarak protein şeklindeki stabilitesini belirlemek için diğer yöntemler ile karşılaştırıldığında, DSC bir COM bir dizi avantaj sunarmaliyet ve zaman tasarrufu da dahil olmak üzere mercial ayarı. CD ve Floresans Spektroskopileri 6 enstrümantasyon ile ölçümlere göre Birincisi, bir diferansiyel taramalı kalorimetre adyabatik tasarımı daha iyi sıcaklık hassasiyetle termal stabilite ölçümü için izin verir. İkinci olarak, CD farklı olarak, DSC verilerin doğruluğu protein 39, 40 arasında helisite bağlı değildir; Ancak, CD DSC 41 ücretsiz olacağını ikincil yapının açılımı hakkında ek bilgi sağlar. Buna ek olarak, DSC sistemin basınç örnek kaynatmadan geniş bir sıcaklık aralığı test sağlar; Bu yüzden, proteinlere geniş bir DSC ile test edilebilir. DSC biyolojik termal stabilitesini belirlemek için, nispeten hızlı ve basit bir yaklaşım olsa da, sınırlama olmadan değildir. İlk olarak, noktahat çıkarma adımı ham veri analizi, insan tutarsızlık çeşit tanıttı; Böylece sonuçlar farklılıklar, farklı kullanıcılar arasında gözlemlenebilir. İkinci olarak, diferansiyel tarama kalorimetreleri toplu üretim ölçeğinde elde etmek zor olabilir asgari konsantrasyon sınırları var. geri dönüşümsüz termal denatürasyon Üçüncüsü, Sh mutlak değildir; ki içindeki senaryolarda türetilmiş ΔG (protein kararlılığının bir göstergesi) yanıltıcı anlamına gelmektedir. Bundan başka, yöntem, saflaştınlmış numuneler için yararlıdır. Herhangi bir etkileşim olup olmadığını İnceleme proteini veya yeni bir termal geçişler görünümü ile bir etkileşim olup olmadığını yabancı maddelerin varlığı Tm bir değişikliğe neden olabilir ya da. Her durumda termogramları, bu ek özellikler yanlış böylece sonuçların yorumlanmasını etki, örnekler atfedilebilir. Bu kısıtlamalara rağmen, DSC th hakkında detaylı termodinamik bilgi verebilir güvenilir bir yöntem olmaya devamDüzgün 42 uygulanması halinde süreci açılımı e proteini. Sonuç olarak, DSC aşı ürünler ve ara ürün için bir yapısal okuma aracı olarak önemli bir avantaj sunuyor. Aynı ürünün çok bir dizi için toplanan iki parametre, Tm ve Sh, proses değişiklikleri, formülasyon, ve tersiyer yapının depolama koşulları ve protein stabilitesi etkisini incelemek için kullanılabilir ampirik taban çizgisi olabilir ve viral antijenler 21, 43.

Diferansiyel tarama kalorimetrisi (DSC) ile doğrudan düzenlenmiş bir sıcaklık değişimi, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 sırasında bir referans bir numunenin yer alan ısı enerjisi emme farkını ölçer deneysel bir yöntemdir , 10, 11, 12. Bir diferansiyel tarama kalorimetresi Yürütülen yöntem, örnek bir hücre ve aynı zamanda 2, 13 üzerine her iki hücre sıcaklığının artırılması, aynı anda da, bir referans hücresi içine ısı enerjisi sokulması içerir14. , Numune ve referans bileşim içinde fark, farklı enerji miktarı hücreleri, 2, 12, 13 sıcaklığını yükseltmek için gerekli olacaktır. Bu durumda, hücreler arasındaki sıcaklık farkı telafi etmek için gerekli olan enerji, fazla miktarı ölçülür ve doğrudan örnek 1, 3 özel termodinamik özellikleri ile bağıntılandınlabilir. 1960&#39;larda, MJ O&#39;Neil ve Perkin Elmer E. Watson katı maddelerin, 2, 3, 4, ısı akışını ölçmek için, ilk diferansiyel tarama kalorimetre geliştirdi. Buna paralel olarak, PL Privalov ve Fizik Enstitüsü, DR Monaseldze EL Gürcistan Cumhuriyeti (eski SSCB) fo kullanılabilecek eşsiz bir diferansiyel adyabatik kalorimetre yarattır biyokimyasal araştırmalar 5, 6. Daha sonra, Gürcistan Fizik Enstitüsü, Cumhuriyet de Andronikashvili ekibi, bu tür DSC 7, 8, 9 kullanarak lifli ve küresel proteinler, DNA ve RNA gibi biyomoleküllerin ısı kapasitesi bildirdi. Sturtevant 10, 11, 12, Brandts 13 ve Privalov 14, 15, 16 liderliğindeki birkaç takım protein açılımı termodinamik detaylarını araştırmak için teori ve DSC pratik uygulamaların geliştirilmesi üzerinde duruldu. Bu fajlar, kloroplast, fosfolipid, sıvı kristaller, ve et proteinler gibi büyük supramoleküler yapıları okuyan DSC değeri de 17 bildirilmiştir </<html> sup&gt;, 18, 19, 20. DSC şimdi, biyomoleküllerin ısıl kararlılık değerlendirilmesi için özellikle proteinler 1, 21, 22 ilaç araştırma ve geliştirme alanında olağan hale gelmiştir. Bu deney 23, 24 yürütmek için kullanılan aletlerin duyarlılığı ve otomasyon bakımından gelişmeler çoğunlukla kaynaklanmaktadır. Burada, DSC deney, sıcaklığın bir fonksiyonu olarak, yani molar ısı kapasitesi nihai sonucu, aşağıdaki termodinamik parametreleri tahmin etmek için kullanılır (ısı kapasitesi (ΔCp), entalpi (AH), entropi değişim (ΔS) denklemi aşağıda kullanarak ve Gibbs serbest enerjisi (ΔG)): eq1.jpg &quot;/&gt; (1) <img alt="denklem 2" src="/files/ftp_upload/55262/55262eq2.jpg" /> (2) <img alt="denklem 3" src="/files/ftp_upload/55262/55262eq3.jpg" /> (3) <img alt="denklem 4" src="/files/ftp_upload/55262/55262eq4.jpg" /> (4) <img alt="Denklem 5" src="/files/ftp_upload/55262/55262eq5.jpg" /> (5) Nerede Cp ısı kapasitesi ölçülür; q test materyalinin içine ısı akışı olduğu; T 0 ve T, sırasıyla 22, 25 geçiş ilk ve son sıcaklık dereceleridir. Bu denklemler yukarıda iki devletli geçişi ve termal tersinir 22 açılımı tabi olabilir tek alan proteinler için de geçerli olduğunu fazlalaştı. Daha karmaşık proteinler (örneğin, olmayan iki devletli protein ve oligomerler) Analizi hFriere ve arkadaşları tarafından rapor edilmiştir ave. 26; Johnson ve diğ. 27; ve Kasimova ve diğ. 28. Bir protein, iki durum geçişini maruz veya termal denatürasyon sırasında ara maddeleri oluşturur olup olmadığını belirlemek için, deneysel olarak elde edilen entalpi (AH; ayrıca şu şekilde kalorimetrik entalpi Sh Cal adlandırılır), aynı zamanda (aşağıda verilen van&#39;t Hoff denklemi kullanılarak elde edilen entalpi karşılaştırılır van&#39;t Hoff entalpi olarak anılacaktır; Sh VH): <img alt="Denklem 6" src="/files/ftp_upload/55262/55262eq6.jpg" /> (6) Tm geçişin orta noktasını sıcaklığı, R, ideal gaz sabiti (1.987 kal mol-1 K-1) ve Y, katlanmamış durumda 16, 29 protein nüfusun bölümüdür. EğerSh VH Sh Cal eşittir; veya Sh VH / Sh Cal 1&#39;e eşit olduğu, daha sonra protein bir &quot;ya hep ya hiç&quot; geçiş (yani iki devletli geçiş) 16, 25, 29 uğrar. Ancak, Sh VH Sh Cal az ise; veya Sh VH / Sh Cal protein olmayan bir iki devletli geçişi 16, 25, 29 uğrar, daha az 1&#39;dir. Sh VH / Sh Cal oranı da bir termodinamik kooperatif birimi veya etki alanı 26 olarak erir protein yapısında oranına tekabül etmektedir. ΔG ve Sh gibi yukarıda sözü edilen termodinamik parametreler biyolojik içeren proteinlerin termal stabilitesi hakkında yararlı bilgiler sağlar<html> 30. Bu protokol için bildirilen değerler Ancak, vurgu, bu yayındaki T m ve Sh üzerine döşenecek. Tm katlanmış protein kıvrımlanmamış dengede olan geçiş, (örneğin, ΔG = 0) 25, 31 orta noktası sıcaklığıdır. Termal stabilite 31 daha yüksek bir proteinin Tm kadar yüksek olur. Sh (aynı zamanda termogramı olarak da bilinir) sıcaklık grafiğidir ısı kapasitesi tepe (ler) altında kalan alan karşılık gelen DSC deneyi 16, 25 bir ucunda oluşturulan. Bu proteinleri denatüre etmek için ve bir protein formülasyondaki aktif fraksiyonu (F) tahmin etmek için de kullanılabilir gerekli enerji (yani, bir numunedeki aktif yapının proteinlerin oranı), aşağıdaki denklem kullanılarak: jove_content &quot;&gt; <img alt="Denklem 7" src="/files/ftp_upload/55262/55262eq7.jpg" /> (7) Burada Sh protein örneğinin deneysel olarak türetilmiş entalpi ve Q da iyi karakterize edilmiş referans veya standart protein 22 için belirlenen entalpisini. F a tahmini ICH 32 uyarınca stres koşullarında stabilite çalışmaları ürünlerin gerçek zamanlı istikrarı izleme yanı sıra yürütülmesi için önemlidir. Sh karşılaştırılması da bir protein 31 üçüncül yapı konformasyon kompakt hakkında bilgi sağlar. Bu protokol, bir sanayi ortamında protein termal stabilitesini değerlendirmek için bir yöntem detayları ve yoğun aşı formülasyonunda kullanılmıştır. Tekrarlanabilir sonuçlar f üreten bir otomatik diferansiyel tarama kalorimetresi kullanılarak geliştirilmiştirya da 300 ug / mL gibi düşük bir protein konsantreleri.

<table><tbody><tr><td>Differential Scanning Calorimeter</td><td>Malvern Instruments Ltd</td><td>28428948 (Via GE Healthcare)</td><td>Has an autosampler for automated dispensing of samples into the cell to reduce human effort and errors.</td></tr><tr><td>Contrad 100</td><td>Decon Laboratories Inc</td><td>1504</td><td>Dilute with water to 20% before use</td></tr><tr><td>500 &amp;micro;L Polypropylene round bottom 96 well plate</td><td>Canadian Life Science</td><td>ML072100</td><td>Equivalent plates from other suppliers (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, VW) can also be used</td></tr><tr><td>MicroCal ThermoVac&amp;nbsp;</td><td>Malvern Instruments Ltd</td><td>N/Ap</td><td>provided with the Cap VP DSC</td></tr><tr><td>Biosafety cabinet&amp;nbsp;</td><td>Labconco</td><td>Logic+ - A2</td><td>biocontainment laminar flow cabinet for sample preparation</td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer dialysis cassette</td><td>Thermo Scientific</td><td>66810 or 66380</td><td>to equilibrate the sample and buffer</td></tr></tbody></table>

differential scanning calorimetry &#8212; a method for assessing the thermal stability and conformation of protein antigen

Diferansiyel tarama kalorimetrisi (DSC), sıcaklığın bir fonksiyonu olarak numunelerin molar ısı kapasitesini ölçer analitik bir tekniktir. Protein örnekleri durumunda, DSC profilleri termal stabilitesi hakkında bilgi ve bir ölçüde yapısal konformasyonunun değerlendirmek için kullanılabilen bir yapısal &quot;parmak izi&quot; olarak işlev görür. (T m erime sıcaklığı) ve üçüncül yapısını stabilize etkileşimleri bozmak için gerekli olan enerji (entalpi, AH) proteinlerin Termal geçiş sıcaklığını ölçen bir diferansiyel tarama kalorimetresi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Karşılaştırmalar formülasyonlar yanı sıra üretim partiler arasında yapılır ve elde edilen değerleri arasındaki farklar termal stabilite ve yapısal konformasyonunda farklılık gösterir. Stabilite çalışmaları için bir endüstriyel ortamda DSC kullanımını gösteren yanı sıra önemli üretim aşamalarının izlenmesi Veriler bu pro etkinliği kanıtı olarak sunulmaktadırtokol. protein şeklindeki termal stabilitesini değerlendirmek için, diğer yöntemlere göre, DSC ve düşük maliyetli olan birkaç örnek hazırlama adımlarını gerektirir ve aynı zamanda protein açılma işleminin tam bir termodinamik bir profil sağlar.

Kalorimetre, aslında örnek çözeltisi içine ısı akışı hızındaki fark büyüklüğüne ve 35 tampon gibi en DSC deneyleri ham veriler, sıcaklık grafiğidir bir ısı akışı olarak gösterilmiştir. Her iki hücreler (yani örnek ve referans hücreleri) bir deney sırasında aynı çözümler içeriyor, bu nedenle, tarama ham veri gözlemlenebilir zirveleri ile düz bir çizgi olmalıdır. Gözlenen herhangi bir zirve neden örnek öncesinde analiz yeterli bir sistem uygunluk testi tampon taramaları çalışan enstrümantasyon hatası (örneğin hasarlı veya kontamine hücreler), isnat edilebilir. Şekil 1 kalorimetre analizi örnek öncesinde iyi çalışır durumda olduğunu belirten tipik bir tampon tarama sonucunu göstermektedir. Şekil 2, bir DSC deneyi için ham veriler fark ile gerçekleştirilen işlemleri göstermektedirİki protein örneklerinin erent çok. Daha önce ima gibi, gözlenen zirveleri örnekleri ve kendi tamponların ısı akışı farklılıklar vardır. Numune konsantrasyonu farklılıklar kalorimetre tarafından kaydedilen ısı kapasitesi değişikliklere sebep olabilir; Ancak, bu varyasyonlar prosedür bölüm 4.2 uygun olarak örnek analizi boyunca normalleştirilir. Daha yüksek konsantrasyonlar da düşük konsantrasyonlarda geçişe katkıda almayan ek termodinamik etki ortaya çıkarabilir. Buna ek olarak, her bir geçiş proteini 36 bir ya da daha fazla sayıda yapısal alanları içerebilir termodinamik alan temsil eder. Bu durumda, protein 1 işbirliği erime üzere üç yapısal alana sahiptir. Şekil 3 temel çıkarma ve mükerrer eğri fi sonra, yani Şekil 2&#39;de, sunulan protein 1 ve 2 için ham verilerin analizinde elde edilen sonuçları göstermektedirtting. Ortaya çıkan termogramlar oranının taranması için normalize edilmiş ve konsantrasyon (otomatik olarak önceden ayarlanmış analiz yazılımı algoritması tarafından yürütülen); böylece, sıcaklık grafikleri karşı karşılaştırılabilir ısı kapasitesi deney sonuçlarını sunma. Analiz yazılımı açılımı proteinin işbirliğinden bağlı Yukarıda verilen denklemler varyasyonları kullanan diğer termodinamik parametreler elde etmek, bu tür T m ve ΔCp olarak sıcaklık grafikler, karşı ısı kapasitesi verileri kullanır. ayarı, bilinmeyen örnekler test ederken uygun sıcaklık aralığı önemlidir. Şekil 4&#39;te gösterildiği gibi, Aksi takdirde, tam olmayan termogramlar, neden olabilir. Bu profillerden Tm elde edilebilir olsa da, Sh doğru bir şekilde tespit edilemez. Bu nedenle, örnek tamamen ısı geçişi yakalamak için daha büyük bir sıcaklık aralığı ile yeniden test edilmesi gereklidir. Bazı proteinler de yenidenadily formu artan sonrası geçiş ısı kapasitesi sonuçlanan tam denatürasyon sonra agrega: Şekil 2B gösterildiği gibi bu genellikle eksik termogramı olarak görünür. Ancak, daha yüksek bir son sıcaklığı ile yeniden test var termogramın o bölgede bir yapısal geçiş bir olay ya da protein agrega sadece ısı emici etkisi olup olmadığını teyit yardımcı olabilir. Termal stabilite endüstrisinde 37 protein ve protein bazlı ürünlerin en önemli fiziksel özelliklerden biri olan. ilaç olarak, formülasyon tampon ve nem ve sıcaklık gibi çevresel faktörlerin de dahil olmak üzere, farklı koşullar altında biyolojik kararlılığını belirlemek için kullanılır. Aynı zamanda üretim partiler arasında yapısal tutarlılığı sağlamak için önemli üretim aşamasını (örneğin, arıtma ve detoksifikasyon) izlemek için kullanılır. <strong<html> &gt; 5 Şekiller ve 6 kararlılık ve iki farklı proteinin yapısal konformasyon sırasıyla kimyasal detoksifikasyon ve saklama koşulları etkisini incelemek için DSC kullanımını göstermektedir. Tm ve Sh önemli farklılıklar sırasıyla yapısal değişiklikler ve protein parçalanmasını gösterir. Buna ek olarak, Şekil 6 üçüncü geçiş kaybı, bundan başka (örnekler, çok açılı bir ışık saçılım (sek-MALS) ile boyut dışlama kromatografisi ile analiz edildiğinde molekül ağırlığında bir azalma ile doğrulandı bir etki nin degradasyonunu göstermektedir veri gösterilemiyor). <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55262/55262fig1.jpg" /> Şekil 1: Tampon tarar. gözlemlenebilir zirveleri ile her tarama degrade benzerlik enstrüman iyi çalışır durumda olduğunu ve tekrarlanabilir sonuçlar oluşturduğunu gösterir.//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55262/55262fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55262/55262fig2.jpg" /> Şekil 2: DSC Deneyler toplanan ham veriler. Bu grafikler (yani önce bazal çıkarma ve eğri uydurma kadar) deneysel çalıştıktan sonra edinilen unanalyzed (ham) veri iyi temsilidir. Her satır bir üretim yeri temsil eder. Protein 2 termogramı sonrası geçiş bölgesinde, 100 ° C&#39;nin üzerinde bir ısı kapasitesinde artış ile sonuçlanan, ısıtma üzerine hali hazırda daha araya eğilimindedir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55262/55262fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/55262/55262fig3.jpg" /><br/&gt; Şekil 3: DSC Veri Analiz. Bu grafikler (yani bazal çıkarma ve eğri uydurma sonra) analiz DSC verilerinin iyi temsilidir. Kırmızı çizgi termogramı için en uygun eğriyi temsil ederken mavi çizgi, bazal çıkarma sonra termogramı temsil eder. (A) Protein 1 Numune # 12 Tm ve Sh 80,16 ° C ve sırasıyla 1.69 x 10 6 cal / mol vardır. (B) Protein 1 Numune # 13 Tm ve Sh 80,15 ° C ve sırasıyla 1.71 x 10 6 cal / mol vardır. (C) Protein 2 Örnek # 21 Tm ve Sh 75.01 ° C ve sırasıyla 4.08 x 10 6 cal / mol vardır. (D) Protein 2 Örnek # 22 Tm ve Sh 75,67 ° C ve sırasıyla 4.22 x 10 6 cal / mol vardır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55262/55262fig3large.jpg" target="_blank">Için tıklayınız</a>Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/55262/55262fig4.jpg" /> Şekil 4: Bir Eksik termogramını göstermektedir. Ham veri yetersiz sıcaklık aralığında analiz Protein 1 toplamak. Deneyin nihai sıcaklık 120 ° C olarak ayarlandı Şekil 2A için deney ile karşılaştırıldığında proteinin tüm geçiş profili uyum yoktu 90 ° C&#39;ye ayarlandı. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55262/55262fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/55262/55262fig5.jpg" /> Şekil 5: Veri protein 1. (A) proteini 1 tertier yapısı üzerinde kimyasal detoksifıkasyon etkisini gösteren Analiz hektar naif konformasyonuna ve bir toksin olduğu,2.57 x 10 5 cal / mol onun T 56.84 ° C&#39;de m Sh s. (B) Protein 1 (yani toksoid) ve detoksifiye şekli sırasıyla T m ve 81,01 ° C Sh değerlerini ve 1.89 x 10 6 cal / mol vardır. Nedenle, detoksifikasyon adım, detoksifıye edilmiş formuna daha fazla istikrar (daha yüksek Tm) sağlayan proteini 1 yapısal konformasyona varyasyon şekli getirmiştir sonucuna varılabilir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55262/55262fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/55262/55262fig6.jpg" /> Şekil 6: Bu grafikler, depolama sıcaklığının etkisini göstermektedir veri Protein 3. konformasyon üzerinde saklama koşullarının etkisi gösteren Analiz (2-8 ° C) denge ve Pro tertier yapısına3 30 hafta boyunca tein. Tm ve 8. (A) Protein 3 ve depolama 38. haftada (B) Sh değerleri, aşağıdaki Tablo 1 &#39;de verilmiştir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55262/55262fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Numune </td><td> Tm 1 (° C) </td><td> Sh 1 (cal / mol) </td><td> Tm 2 (° C) </td><td> Sh 2 (cal / mol) </td><td> Tm 3 (° C) </td><td> Sh 3 (cal / mol) </td></tr><tr><td> Protein, 3 8 hafta boyunca, 2-8 ° C&#39;de saklandı </td><td> 61.91 </td><td> 1.71 x 10 5 </td><td> 75,54 </td><td> 2.17 x 10 5 </td><td> 90,29 </td><td> 4.17 x 10 5 </td></tr><tr><td&gt; Protein 3 38 hafta boyunca 2-8 ° C&#39;de saklandı </td><td> 61,87 </td><td> 1.66 x 10 5 </td><td> 75,18 </td><td> 1.46 x 10 5 </td><td> 90.22 </td><td> 5.76 x 10 5 </td></tr></tbody></table> Tablo 1: 2 de depolama 8. ve 38. Haftasında Protein 3 Tm ve Sh Değerler - 8 ° C. Her iki zaman noktasında Tm değerleri benzer olmakla birlikte, Sh değerlerindeki fark Protein 3 tertiyer yapısı ile belirlenen saklama koşulu altında 30 hafta boyunca düştüğünü göstermektedir.

Watch this Scientific Journal Video about Differential Scanning Calorimetry â€” A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen at JoVE.com

Differential Scanning Calorimetry &#8212; A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Diferansiyel tarama kalorimetrisi, bir proteinin denatüre edilmesi gerekli ısı geçiş sıcaklığına (ler) ve toplam ısı enerjisini ölçer. elde edilen sonuçlar, aşı formülasyonlarında protein antijenlerinin termal stabilitesini değerlendirmek için kullanılır.

Diferansiyel Taramalı Kalorimetre - Protein Antigen Termal İstikrar ve Yapısının Değerlendirilmesi Bir Yöntem

Differential scanning calorimetry (DSC) is an analytical technique that measures the molar heat capacity of samples as a function of temperature. In the ...

differential-scanning-calorimetry-method-for-assessing-thermal

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Physics

Biochemistry

Unit 1

The First Law of Thermodynamics

SCIENTISTS IN ACTION

38.6K Görüntüleme.  Sanofi Pasteur Limited.  Diferansiyel tarama kalorimetrisi, bir proteinin denatüre edilmesi gerekli ısı geçiş sıcaklığına (ler) ve toplam ısı enerjisini ölçer. elde edilen sonuçlar, aşı formülasyonlarında protein antijenlerinin termal stabilitesini değerlendirmek için kullanılır. 

Video: Differential Scanning Calorimetry — A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding interactions. This information is critical in the design of new pharmaceutical compounds. However, many pharmaceutically relevant ligands are chemically unstable at the high temperatures used in DSC analyses. Thus, measuring binding interactions is challenging because the concentrations of ligands and thermally-converted products are constantly changing within the calorimeter cell. Here, we present a protocol using thermolabile ligands and DSC for rapidly obtaining thermodynamic and kinetic information on the folding, binding, and ligand conversion processes. We have applied our method to the DNA aptamer MN4 that binds to the thermolabile ligand cocaine. Using a new global fitting analysis that accounts for thermolabile ligand conversion, the complete set of folding and binding parameters are obtained from a pair of DSC experiments. In addition, we show that the rate constant for thermolabile ligand conversion may be obtained with only one supplementary DSC dataset. The guidelines for identifying and analyzing data from several more complicated scenarios are presented, including irreversible aggregation of the biomolecule, slow folding, slow binding, and rapid depletion of the thermolabile ligand.

We present a protocol for rapid characterization of biomolecular folding and binding interactions with thermolabile ligands using differential scanning calorimetry.

Biyomoleküler DSC profilleri ile hızlı bir şekilde katlanır ve etkileşimleri bağlama karakterize etmek için Thermolabile ligandlar ölçme

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

Biyokimya

Designing Silk-silk Protein Alloy Materials for Biomedical Applications

Fibrous proteins display different sequences and structures that have been used for various applications in biomedical fields such as biosensors, nanomedicine, tissue regeneration, and drug delivery. Designing materials based on the molecular-scale interactions between these proteins will help generate new multifunctional protein alloy biomaterials with tunable properties. Such alloy material systems also provide advantages in comparison to traditional synthetic polymers due to the materials biodegradability, biocompatibility, and tenability in the body. This article used the protein blends of wild tussah silk (Antheraea pernyi) and domestic mulberry silk (Bombyx mori) as an example to provide useful protocols regarding these topics, including how to predict protein-protein interactions by computational methods, how to produce protein alloy solutions, how to verify alloy systems by thermal analysis, and how to fabricate variable alloy materials including optical materials with diffraction gratings, electric materials with circuits coatings, and pharmaceutical materials for drug release and delivery. These methods can provide important information for designing the next generation multifunctional biomaterials based on different protein alloys.

Blending is an efficient approach to generate biomaterials with a broad range of properties and combined features. By predicting the molecular interactions between different natural silk proteins, new silk-silk protein alloy platforms with tunable mechanical resiliency, electrical response, optical transparency, chemical processability, biodegradability, or thermal stability can be designed.

Biyomedikal Uygulamalar için İpek-ipek Protein Alaşım Materyalleri Tasarlama

Fibrous proteins display different sequences and structures that have been used for various applications in biomedical fields such as biosensors, ...

Biyomühendislik

How to Stabilize Protein: Stability Screens for Thermal Shift Assays and Nano Differential Scanning Fluorimetry in the Virus-X Project

The Horizon2020 Virus-X project was established in 2015 to explore the virosphere of selected extreme biotopes and discover novel viral proteins. To evaluate the potential biotechnical value of these proteins, the analysis of protein structures and functions is a central challenge in this program. The stability of protein sample is essential to provide meaningful assay results and increase the crystallizability of the targets. The thermal shift assay (TSA), a fluorescence-based technique, is established as a popular method for optimizing the conditions for protein stability in high-throughput. In TSAs, the employed fluorophores are extrinsic, environmentally-sensitive dyes. An alternative, similar technique is nano differential scanning fluorimetry (nanoDSF), which relies on protein native fluorescence. We present here a novel osmolyte screen, a 96-condition screen of organic additives designed to guide crystallization trials through preliminary TSA experiments. Together with previously-developed pH and salt screens, the set of three screens provides a comprehensive analysis of protein stability in a wide range of buffer systems and additives. The utility of the screens is demonstrated in the TSA and nanoDSF analysis of lysozyme and Protein X, a target protein of the Virus-X project.

A protocol is presented to rapidly test the thermal stability of proteins in a variety of conditions through thermal shift assays and nano differential scanning fluorimetry. Buffer systems, salts and additives, together comprising three unique stability screens, are assayed with proteins to identify suitable buffers for functional and structural studies.

Protein dengelemek nasıl: istikrar ekranlar için termal kayması deneyleri ve Nano diferansiyel Fluorimetry virüs-X projede tarama

The Horizon2020 Virus-X project was established in 2015 to explore the virosphere of selected extreme biotopes and discover novel viral proteins. To ...

Nano-Differential Scanning Fluorimetry for Screening in Fragment-based Lead Discovery

Thermal shift assays (TSAs) examine how the melting temperature (Tm) of a target protein changes in response to changes in its environment (e.g., buffer composition). The utility of TSA, and specifically of nano-Differential Scanning Fluorimetry (nano-DSF), has been established over the years, both for finding conditions that help stabilize a specific protein and for looking at ligand binding by monitoring changes in the apparent Tm. This paper presents an efficient screening of the Diamond-SGC-iNEXT Poised (DSi-Poised) fragment library (768 compounds) by the use of nano-DSF, monitoring Tm to identify potential fragment binding. The prerequisites regarding protein quality and concentration for performing nano-DSF experiments are briefly outlined followed by a step-by-step protocol that uses a nano-liter robotic dispenser commonly used in structural biology laboratories for preparing the required samples in 96-well plates. The protocol describes how the reagent mixtures are transferred to the capillaries needed for nano-DSF measurements. In addition, this paper provides protocols to measure thermal denaturation (monitoring intrinsic tryptophan fluorescence) and aggregation (monitoring light back-scattering) and the subsequent steps for data transfer and analysis. Finally, screening experiments with three different protein targets are discussed to illustrate the use of this procedure in the context of lead discovery campaigns. The overall principle of the method described can be easily transferred to other fragment libraries or adapted to other instruments.

Monitoring changes in the melting temperature of a target protein (i.e., thermal shift assay, TSA) is an efficient method for screening fragment libraries of a few hundred compounds. We present a TSA protocol implementing robotics-assisted nano-Differential Scanning Fluorimetry (nano-DSF) for monitoring intrinsic tryptophan fluorescence and light back-scattering for fragment screening.

Parça Bazlı Kurşun Keşfinde Tarama için Nano-Diferansiyel Tarama Florüretrisi

Thermal shift assays (TSAs) examine how the melting temperature (Tm) of a target protein changes in response to changes in its environment (e.g., buffer ...

A Package of Established Analytical Tools to Investigate the Solid-State Alteration of Lipid-Based Excipients

Lipid-based excipients (LBEs) are low-toxic, biocompatible, and natural-based, and their application supports the sustainability of pharmaceutical manufacturing. However, the major challenge is their unstable solid-state, affecting the stability of the pharmaceutical product. Critical physical properties of lipids for their processing-such as melt temperature and viscosity, rheology, etc.-are related to their molecular structure and their crystallinity. Additives, as well as thermal and mechanical stress involved in the manufacturing process, affect the solid-state of lipids and thus the performance of pharmaceutical products thereof. Therefore, understanding the alteration in the solid-state is crucial. In this work, the combination of powder x-ray diffraction and differential scanning calorimetry (DSC) is introduced as the gold standard for the characterization of lipids' solid state. X-ray diffraction is the most efficient method to screen polymorphism and crystal growth. The polymorphic arrangement and the lamella length are characterized in the wide- and small-angle regions of x-ray diffraction, respectively. The small-angle x-ray scattering (SAXS) region can be further used to investigate crystal growth. Phase transition and separation can be indicated. DSC is used to screen the thermal behavior of lipids, estimate the miscibility of additives and/or active pharmaceutical ingredients (API) in the lipid matrix, and provide phase diagrams. Four case studies are presented in which LBEs are either used as a coating material or as an encapsulation matrix to provide lipid-coated multiparticulate systems and lipid nanosuspensions, respectively. The lipid solid-state and its potential alteration during storage are investigated and correlated to the alteration in the API release. Qualitative microscopical methods such as polarized light microscopy and scanning electron microscopy are complementary tools to investigate micro-level crystallization. Further analytical methods should be added based on the selected manufacturing process. The structure-function-processability relationship should be understood carefully to design robust and stable lipid-based pharmaceutical products.

This publication shows the application of x-ray diffraction and differential scanning calorimetry as gold standards for investigating the solid-state of lipid-based excipients (LBEs). Understanding the solid-state alteration in LBEs and its effect on the performance of pharmaceutical products thereof is the key factor for manufacturing robust lipid-based dosage forms.

Lipid Bazlı Eksipiyanların Katı Hal Değişimini Araştırmak için Yerleşik Analitik Araçlar Paketi

Lipid-based excipients (LBEs) are low-toxic, biocompatible, and natural-based, and their application supports the sustainability of pharmaceutical ...

Kimya

<meta charset="utf8"></head><body>Protein-ligand etkileşimleri için yüksek verimli termal kayma testleri

Utilizing Thermal Shift Assay to Probe Substrate Binding to Selenoprotein O

Defining the biological importance of proteins with unknown functions poses a significant obstacle in understanding cellular processes. Although bioinformatic and structural predictions have contributed to the study of unknown proteins, in vitro experimental validations are often hampered by the optimal conditions and cofactors required for biochemical activity. Cofactor binding is not only essential for the activity of some enzymes but may also enhance the thermal stability of the protein. One practical application of this phenomenon lies in utilizing the change in thermal stability, as measured by alterations in the protein's melting temperature, to probe ligand binding. 
Thermal shift assay (TSA) can be used to analyze the binding of different ligands to the protein of interest or find a stabilizing condition to perform experiments such as X-ray crystallography. Here we will describe a protocol for TSA utilizing the pseudokinase, Selenoprotein O (SelO), for a simple and high-throughput method for testing metal and nucleotide binding. In contrast to canonical kinases, SelO binds ATP in an inverted orientation to catalyze the transfer of AMP to the hydroxyl side chains of proteins in a posttranslational modification known as protein AMPylation. By leveraging the shift in the melting temperatures, we provide crucial insights into the molecular interactions underlying SelO function.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: Termal Kayma Testleri Yoluyla Proteinlerin Yapısal ve Biyokimyasal Çalışmalarını İlerletmek

Here, we present the thermal shift assay, a high-throughput, fluorescence-based technique used to investigate the binding of small molecules to proteins of interest.

Selenoprotein O'ya Substrat Bağlanmasını Araştırmak için Termal Kaydırma Testinin Kullanılması

Defining the biological importance of proteins with unknown functions poses a significant obstacle in understanding cellular processes. Although ...

Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most of these require access to specialist equipment, and often require a degree of expertise to effectively establish reliable experiments and analyze data. Differential scanning fluorimetry (DSF) is being increasingly used as a robust method for initial screening of proteins for interacting small molecules, either for identifying physiological partners or for hit discovery. This technique has the advantage that it requires only a PCR machine suitable for quantitative PCR, and so suitable instrumentation is available in most institutions; an excellent range of protocols are already available; and there are strong precedents in the literature for multiple uses of the method. Past work has proposed several means of calculating dissociation constants from DSF data, but these are mathematically demanding. Here, we demonstrate a method for estimating dissociation constants from a moderate amount of DSF experimental data. These data can typically be collected and analyzed within a single day. We demonstrate how different models can be used to fit data collected from simple binding events, and where cooperative binding or independent binding sites are present. Finally, we present an example of data analysis in a case where standard models do not apply. These methods are illustrated with data collected on commercially available control proteins, and two proteins from our research program. Overall, our method provides a straightforward way for researchers to rapidly gain further insight into protein-ligand interactions using DSF.

Differential scanning fluorimetry is a widely used method for screening libraries of small molecules for interactions with proteins. Here, we present a straightforward method to extend these analyses to provide an estimate of the dissociation constant between a small molecule and its protein partner.

Diferansiyel Taramalı florimetri Kullanarak Protein-ligand Etkileşimleri belirlenmesi

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most ...

Biyoloji

Floresan kullanarak bileşik-protein bağlanmasının yüksek hassasiyetli tespiti

Detection of CD40 Protein-Umbelliferone Interaction via Differential Scanning Fluorescence

The investigation of interactions between different molecules is a crucial aspect of understanding disease pathogenesis and screening for drug targets. Umbelliferone, an active ingredient in Tibetan medicine Vicatia thibetica, exhibits an immunomodulatory effect with an unknown mechanism. The CD40 protein is a key target in the immune response. Therefore, this study employs the principle of differential scanning fluorescence technology to analyze the interactions between CD40 protein and umbelliferone using fluorescent enzyme markers. Initially, the stability of the protein fluorescent orange dye was experimentally verified, and the optimal dilution ratio of 1:500 was determined. Subsequently, it was observed that the temperature melting (Tm) value of CD40 protein tended to decrease with an increase in concentration. Interestingly, the interaction between CD40 protein and umbelliferone was found to enhance the thermal stability of CD40 protein. This study represents the first attempt to detect the binding potential of small molecule compounds and proteins using fluorescence microplates and fluorescent dyes. The technique is characterized by high sensitivity and accuracy, promising advancements in the fields of protein stability, protein structure, and protein-ligand interactions, thus facilitating further research and exploration.

Yazar Spotlight: Gelişmiş Erişilebilirlik ve Verimlilik için PCR Yöntemlerini Kolaylaştırma

This protocol describes a unique method for detecting the binding between compounds and protein molecules, offering the advantages of minimal protein sample loss and high data accuracy.

Diferansiyel Taramalı Floresan ile CD40 Protein-Umbelliferon Etkileşiminin Tespiti

The investigation of interactions between different molecules is a crucial aspect of understanding disease pathogenesis and screening for drug targets. ...

Diferansiyel Taramalı Kalorimetre - Protein Antigen Termal İstikrar ve Yapısının Değerlendirilmesi Bir Yöntem

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Biyomoleküler DSC profilleri ile hızlı bir şekilde katlanır ve etkileşimleri bağlama karakterize etmek için Thermolabile ligandlar ölçme

Biyomedikal Uygulamalar için İpek-ipek Protein Alaşım Materyalleri Tasarlama

Protein dengelemek nasıl: istikrar ekranlar için termal kayması deneyleri ve Nano diferansiyel Fluorimetry virüs-X projede tarama

Parça Bazlı Kurşun Keşfinde Tarama için Nano-Diferansiyel Tarama Florüretrisi

Lipid Bazlı Eksipiyanların Katı Hal Değişimini Araştırmak için Yerleşik Analitik Araçlar Paketi

Selenoprotein O'ya Substrat Bağlanmasını Araştırmak için Termal Kaydırma Testinin Kullanılması

Selenoprotein O'ya Substrat Bağlanmasını Araştırmak için Termal Kaydırma Testinin Kullanılması

Selenoprotein O'ya Substrat Bağlanmasını Araştırmak için Termal Kaydırma Testinin Kullanılması

Diferansiyel Taramalı florimetri Kullanarak Protein-ligand Etkileşimleri belirlenmesi

Diferansiyel Taramalı Floresan ile CD40 Protein-Umbelliferon Etkileşiminin Tespiti