Biz VirusMapper özgün gelişim ve doğrulama katkılarından dolayı Corina Beerli Jerzy Samolej Pedro Matos Pereira, Christopher Bleck ve Kathrin Scherer teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca yazının eleştirel okuma için Artur Yakimovich teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi hibe ile finanse edildi (BB / M022374 / 1) (RH); Moleküler Hücre Biyolojisi MRC Laboratuvarına çekirdek fonlama, University College London (JM); Avrupa Araştırma Konseyi (649.101-UbiProPox) (JM); ve Tıbbi Araştırma Konseyi (MR / K015826 / 1) (RH ve JM). RG Mühendislik ve Fizik Bilimleri Araştırma Konseyi (AP / M506448 / 1) tarafından finanse edilmektedir.

NOT: Bu protokol ve video daha ayrıntılı olarak yazılım paketini açıklayan orijinal kağıt 10 tamamlar. Okuyucular yazılımın kullanımına yönelik ek rehberlik için dikkatli bir şekilde inceleyin teşvik edilmektedir. üç ana aşama vardır: parçacık ekstraksiyon, tek tek parçacıklar halinde bölümler büyük görüntüler; ortak yapılar son aşamada kullanılan tohum üretmek için veri tanımlanır ve hizalanır tohum seçimi; ve şablon uygun bu tohumlar göre modeli üretme, ekstre parçacıkları ve ortalamalar SPA modeller üretmek için bir alt hizalar. 1. Kur öncesinde Yazılım Paketi Koşu için <ol><li> Bir lamel veya ilgili deney koşullarında çalışılan yapının örnekleri hazırlayın. </li><li> Resim gibi yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SİM) 11 veya stimula olarak süper çözünürlüklü floresan mikroskobu ile örnekleri,ted emisyon tükenmesi (STED) 12 mikroskopi. NOT: hazırlamak ve ilgili literatür danışılmalıdır böylece görüntü örnekleri, çalışmanın altında yapının niteliğine büyük ölçüde bağlıdır nasıl kesin detayları. Bir örnek olarak, hazırlama ve burada kullanılanlar gibi aşı virüsü örnekleri, görüntüleme için kesin usul, temsili sonuçlar bölümünde tarif edilmektedir. </li><li> yapı ya da tanecikler, tercihen binlerce ayrı kopyalar, çok sayıda gösteren birkaç bakış alanları görüntü oluşturma. hem de mümkün olduğu kadar birbirlerinden ayrılmış ve görüntüler kir veya ilgi olmayan diğer floresan yapılar olduklarından emin olan Resim parçacıkları. </li><li> Fiji araç çubuğu içine dosyaları sürükleyerek veya&gt; &quot;Aç&quot; &quot;Dosya&quot; seçerek Fiji partikülleri içeren tüm görüntüleri açın. </li><li> bitiştirmek için &quot;Concatenate&quot; &quot;Görüntü&quot;&gt; &quot;Yığın&quot;&gt; &quot;Araçlar&quot;&gt; seçinTek bir yığın halinde ve görüntüler. çıkan görüntü bir hyperstack ise, daha sonra,&gt; &quot;Hyperstacks&quot;&gt; &quot;hyperstack Stack için&quot; &quot;Image&quot; seçeneğini seçerek bir yığın haline getirmek. NOT: Nihai yığın interkalantlı kanalları olmalıdır. iki kanal varsa, istifin ilk dilim ilk görüntü kanal 1 olmalıdır, ikinci dilim karşılık gelen kanal 2, üçüncü dilim ikinci görüntü kanal 1 olabilir, ve böylece gereken olmalıdır. </li></ol> 2. Partiküllerin ekstrakte <ol><li> segmente resim seçin ve &quot;Viral Yapılar Özü&quot; seçeneğini seçin. çıkarılan parçacıkları kaydetmek ve &quot;Özü Viral Yapılar&quot; görmek yeri seçin iletişim (Şekil 2). </li><li> aşağıdaki gibi &quot;Viral Yapılar Özü&quot; iletişim girerek ilk tahminleri ile ekstraksiyon parametrelerinin atayın. görüntü segmentasyon önizledikten sonra bu parametreler ince ayar. <ol><li> uyuşmuş ayarlaimaged farklı floresan kanalların sayısı veri kümesi kanal er (örneğin, 2). </li><li> parçacıklar kanal seçim numarasını girerek bu kanal piklerin tespiti ile ekstre edildiği bir referans kanalı olarak ayarlayın. en tutarlı kanalı seçin; yani, kanal içinde en parçacıklar aynı görünüme sahiptir. NOT: Bu kanalda parçacıkların bir merkezi maksimum olacaktır Mümkünse. </li><li> Önceden tespit Gauss bulanıklığı uygulamak olsun veya olmasın seçin. herhangi bir bulanıklık geçerlidir 0 önceden tespit Gauss bulanıklığı ayarlayın; bu değer arttırılırsa, belirli bir yarıçapın bir Gauss bulanıklığı filtre lokal maksimumlar algılama önce uygulanır. Referans kanal bir orta maksimum (örneğin, halka şekli) sahip değildir, bu özelliği kullanılır; bulanıklaştırma birinin görünümünü uyarır. NOT: Bu özellik sadece kullanımıdır gibi ilgi Parçalara bölgeleri (ROI), kendilerine uygulanan Gauss bulanıklığı yokd referans kanalı olarak ROI konumlandırmak için. </li><li> piksel olarak (her bir yerel maksimum yaklaşık ayarlanacaktır) YG çapındaki ayarlayın. Bu ROI, örneğin Şekil 3&#39;te olduğu gibi büyük partiküllerin, biraz daha büyük olacak şekilde bir değer seçin. büyük parçacıklar (göz ile kabaca tahmin edilen), yaklaşık 30 piksellik bir çapa sahip olduğu görülmektedir, örneğin, daha sonra 20 piksel YG çapındaki ayarlayın. </li><li> 100&#39;ün altında bir ilk, nispeten daha küçük bir değere çerçeve başına kullanımı İB&#39;nin sayısını ayarlar. </li><li> Maksimum YG örtüşme ayarlayın. Partiküller ayrılır, bu küçük tutmak; partiküller, kümelenmiş ise, üst üste gelecek şekilde ROI etkinleştirmek için bu artış. </li></ol></li><li> &quot;Gösterisi önizleme&quot; seçiniz. Not: Bu seçildiğinde, mevcut çerçeve ile ilişkili bir referans kanalı için ekstre ROI&#39;ler görünür. </li><li> YG çapındaki, ROI sayısı ve mümkün olduğu kadar çok partiküller etrafında uygun boyutta ROI için maksimum YG örtüşme ayarlamaŞekil 3&#39;te olduğu gibi. </li><li> segmentasyon çalıştırmak için &quot;OK&quot; i seçin. Görüntüyü ve YG yöneticisini kapatın. NOT: parçacık kümeleri dosyaların isimlerini değiştirmeyin. Bu isimler biçiminde olmalıdır &quot;Viral parçacıklar - channelX&quot; Aşağıdaki bölümler için. </li></ol> 3. Tohumları <ol><li> &quot;Tohumlar üret&quot; Seç çıkarılan parçacıklar kaydedildiği klasörü seçin ve &quot;Tohumlar üret&quot; iletişim ve pencereler (Şekil 4) görmek. </li><li> aşağıdaki gibi, &quot;Seeds üret&quot; iletişim girerek ilk tohum seçimi parametrelerini atama. <ol><li> Tüm kanallar hizalamak ve merkez uydurulur referans kanalı olarak ayarlayın. parçacıkların çoğu aynı görünüme sahip ve mümkünse bu, merkezi bir maksimuma sahip olan bir kanal seç. </li><li> Bir tohum oluşturulacağı için tüm kanallar için kutuları seçin. </li><li> Tohumlar rotat olmalıdır eğer seçin90 ° ed. diğer modelleri ile tutarlı uyum sağlamak için bu özelliği kullanın </li><li> Önceden hizalama Gauss bulanıklığı uygulamak olsun veya olmasın seçin. herhangi bir bulanıklık geçerlidir 0 her bir kanal için bulanıklık çapındaki ayarlayın. yeniden düzenlenmesinden önce verilen yarıçaplı bir Gauss bulanıklığı filtre uygulamak için bu değeri arttırın. parçacıkların bir merkezi maksimum yoksa bu özelliği kullanın; bulanıklaştırma birinin görünümünü uyarır. NOT: Bu özellik, tutarlı uyum almak için tek olduğu gibi tohumları, uygulanan bulanıklık olmaz. </li><li> kontrol ya da her bir kanal için &quot;Kaydırma düzeltme&quot;, kutuları, döndürmek olmamakla birlikte, ayrı ayrı referans olmayan kanallar için tohum merkezi kaydırma düzeltme kullanmak için seçin. NOT: Kanallar birbirlerini iyi hizalanmış değilse bunu kullanın; Bu aynı zamanda kaydırma düzeltme olmaksızın sadece referansa göre diğer kanallar hizalamak için yararlı olabilir. </li></ol></li><li> Tohum olarak kullanmak için parçacıkların seçin. t yoluyla arao model ve çerçeve sayısını kaydetmek için aşağıdaki yapıya benzer bir parçacık bulmak için sekansı partikül. </li><li> Kutusu &quot;kullanmaya Çerçeveler&quot; in numarasını girin ve daha pencereler (Şekil 5) görünecektir. virgülle ayrılmış birden çok çerçeve numarasını girin. </li><li> görünen pencerelerde tohum çerçeveleri ve sonuçta ortalama tohum görüntüle. NOT: Günlük ortalamaya benzer tohum önerir. </li><li> Bulunan tohum kare bir dizi benzer bir görünüme sahip olacak şekilde, tohum seçimi işlemi optimize etmek için bir referans kanalı, Gauss bulanıklığı çapındaki ve kaydırma düzeltme seçeneklerini ayarlayın. Ortalama tohumlar tatminkar modellenmiş edilecek verilerde görülen yapıyı benzediğini oluşturulur kadar eklenmeye tohumları devam edin. </li><li> tohum Ad ve onlar kaydedilebilir ve seçmek olacaktır nerede &quot;Tamam&quot; modeli nesil sonra kullanılmak üzere nihai tohum görüntüleri kaydetmek için. </li></ol> 4. Modelleri üret <ol><li> Select, &quot;tohumları Dayalı modelleri oluşturmak&quot; ekstre parçacıkları kaydedilir klasörü seçin ve &quot;modelleri oluşturmak&quot; iletişim (Şekil 6). </li><li> işaret kutularını kullanarak her bir kanal için tohum yükleyin. NOT: Tohumlar &quot;Seeds üret&quot; iletişim kutusunda seçildi bir alt klasörde kaydedilir. Varsayılan ad &quot;Analiz&quot; dir. Tohum Ortalamalar değil de referans için kaydedilir Çerçeveler, seçmek için özen gösterin. </li><li> aşağıdaki gibi, &quot;Modeller üret&quot; iletişim girerek ilk modeli oluşturma parametrelerini atama. Bu parametreler daha sonra ince ayar. <ol><li> Sadece referans kanalından translasyon ve rotasyon hesaplar ile bütün kanallar için uygular hizalama için bir referans kanalı kullanmak için seçin. Bu seçeneği kullanılıyorsa, referans olarak kullanmak üzere kanalı seçin. NOT: Bu seçenek yalnızca özel bir refere olarak bir kanal kullanmayı tercih edilmelidirBu tür bir referans tabanlı yapı bulma durumu gibi nce. Aksi takdirde, daha az doğru modellere sonuçlanacaktır. kanallar da bu seçeneği kullanılarak eğer aynı hizada olmalıdır. </li><li> Şablon eşleme sırasında görüntü yoğunluklarını kare seçin. Bu küçük farklılıkları vurgulamak, bu nedenle özellikle ince özelliklere sahip bir model oluştururken bunu kullanır. </li><li> &quot;En az bir benzerlik tohum karşı&quot; sürgüyü kullanarak ya da kutuya bir sayı girerek tohum karşı minimum benzerlik seçin. NOT: Sadece kullanılan bu kesme daha büyük tohumlara bir benzerliği olan parçacıklar. % 60-80, tipik ile başlamak için iyi bir seçimdir. </li><li> 1&#39;e Maksimum yineleme sayısı ayarlama tohum karşı en az benzerlik optimize etmek ve gerekirse, daha sonra artar. </li><li> görünecektir model üretme sürecinin unsurlarını seçmek için kutuları işaretleyin. NOT: &quot;Göster tohumlar&quot; kutularda yükledik tohum gösterecektirİletişim kutusunun üstündeki s. &quot;Göster modelleri&quot; tohum karşı asgari benzerlik karşılayan parçacıkların alt kümesini ortalaması alınarak oluşturulan modellerin tüm yinelemeleri gösterecektir. &quot;Göster MSE&quot; En değişkendir modelin yerleri vurgulamaktadır ortalama kare hatası (MSE) karesini gösterir. &quot;Göster parçacıklar&quot; görüntülenir modelin en yüksek yineleme gereği kayıtlı modelleri oluşturmak için kullanılan parçacıkların alt kümesini, gösterecektir. </li></ol></li><li> önizleme modellerini oluşturmak ve sonuçlarını görüntülemek için &quot;göster önizleme&quot; seçiniz. NOT: Bu sürecin en yoğun hesaplama gerektiren adımdır. Bir masaüstü bilgisayarda piksel birkaç onlarca çaplı birkaç bin parçacıkların kümesi için çalışma süresi yaklaşık 10 dakika olmalıdır. hesaplama zamanı sorunu ise, kullanıcılar ilk verilerin daha küçük bir alt kümesinde algoritması denemelisiniz ya da mümkünse, adım 2.2.4 daha küçük bir ROI yarıçapı kullanın. </li><li> üretmek görüntüled model parametreleri, tohum karşı, özellikle en az bir benzerlik optimize. modellenen morfolojisinin tek gerçek parçacıklar modeline dahildir kadar tohum karşı asgari benzerliği arttırın. </li><li> sürgünün &quot;Maksimum yineleme sayısı&quot; kullanarak veya kutusuna bir numara girerek Maksimum yineleme sayısı artırmak ve model üretme işlemi yineleme izin verir. maksimal yineleme için 10 civarında bir değeri kullanın. </li><li> modellerini Ad ve son model üretme sürecinin tüm yinelemeleri ihtiva modeli evrim yığınlarını kaydetmek için &quot;Tamam&quot; ı seçin. NOT: tohum karşı asgari benzerlik yok parçacıklar bu benzerliği var o kadar yüksektir ki, hiçbir şey güncellenecektir. eklenti dondurulacak görünüyorsa, asgari benzerlik çok yüksek olma olasılığını göz önünde bulundurun. </li></ol>

<ol><li>Henriques, R., Griffiths, C., Rego, E. H., Mhlanga, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PALM+and+STORM%3A+Unlocking+live-cell+super-resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">PALM and STORM: Unlocking live-cell super-resolution.</a> Biopolymers. 95 (5), 322-331 (2011).</li>
<li>Gustafsson, N., Culley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+live-cell+conventional+fluorophore+nanoscopy+with+ImageJ+through+super-resolution+radial+fluctuations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Fast live-cell conventional fluorophore nanoscopy with ImageJ through super-resolution radial fluctuations.</a> Nat Commun. 7, 12471(2016).</li>
<li>Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Primer+to+Single-Particle+Cryo-Electron+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Primer to Single-Particle Cryo-Electron Microscopy.</a> Cell. 161 (3), 438-449 (2015).</li>
<li>Szymborska, A., de Marco, A., Daigle, N., Cordes, V. C., Briggs, J. A. G., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+pore+scaffold+structure+analyzed+by+super-resolution+microscopy+and+particle+averaging%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nuclear pore scaffold structure analyzed by super-resolution microscopy and particle averaging.</a> Science. 341 (6146), 655-658 (2013).</li>
<li>Broeken, J., Johnson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+improvement+by+3D+particle+averaging+in+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Appl+Fluoresc%22%5BJournal%5D)">Resolution improvement by 3D particle averaging in localization microscopy.</a> Methods Appl Fluoresc. 3 (1), 14003(2015).</li>
<li>Burns, S., Avena, J., Unruh, J., Yu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structured+illumination+with+particle+averaging+reveals+novel+roles+for+yeast+centrosome+components+during+duplication%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Structured illumination with particle averaging reveals novel roles for yeast centrosome components during duplication.</a> Elife. , (2015).</li>
<li>Lelek, M., Di Nunzio, F., Henriques, R., Charneau, P., Arhel, N., Zimmer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superresolution+imaging+of+HIV+in+infected+cells+with+FlAsH-PALM%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Superresolution imaging of HIV in infected cells with FlAsH-PALM.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 109 (22), 8564-8569 (2012).</li>
<li>Laine, R. F., Albecka, A., Svan de Linde,, Rees, E. J., Crump, C. M., Kaminski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+herpes+simplex+virus+by+optical+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of herpes simplex virus by optical super-resolution imaging.</a> Nat Commun. 6, 5980(2015).</li>
<li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Gray, R. D. M., Beerli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VirusMapper%3A+open-source+nanoscale+mapping+of+viral+architecture+through+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">VirusMapper: open-source nanoscale mapping of viral architecture through super-resolution microscopy.</a> Sci Rep. 6, 29132(2016).</li>
<li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+of+Micros%22%5BJournal%5D)">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J of Micros. 198 (2), 82-87 (2000).</li>
<li>Hell, S. W., Wichmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+diffraction+resolution+limit+by+stimulated+emission%3A+stimulated-emission-depletion+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Let%22%5BJournal%5D)">Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy.</a> Opt Let. 19 (11), 780(1994).</li>
<li>Chung, C. -S., Chen, C. -H., Ho, M. -Y., Huang, C. -Y., Liao, C. -L., Chang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccinia+virus+proteome%3A+identification+of+proteins+in+vaccinia+virus+intracellular+mature+virion+particles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Vaccinia virus proteome: identification of proteins in vaccinia virus intracellular mature virion particles.</a> J Virol. 80 (5), 2127-2140 (2006).</li>
<li>Moss, B. Poxviridae: the viruses and their replication. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoss%2C+B+%22Fields+virology%22">Fields virology</a>. , Ovid. (2010).</li>
<li>Condit, R. C., Moussatche, N., Traktman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+a+nutshell%3A+structure+and+assembly+of+the+vaccinia+virion%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Virus+Res%22%5BJournal%5D)">In a nutshell: structure and assembly of the vaccinia virion.</a> Adv Virus Res. 66 (6), 31-124 (2006).</li>
<li>Schmidt, F. I., Bleck, C. K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccinia+virus+entry+is+followed+by+core+activation+and+proteasome-mediated+release+of+the+immunomodulatory+effector+VH1+from+lateral+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Vaccinia virus entry is followed by core activation and proteasome-mediated release of the immunomodulatory effector VH1 from lateral bodies.</a> Cell Rep. 4 (3), 464-476 (2013).</li>
<li>Nanoj-virusmapper. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper">https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper</a> (2016).</li>
<li>Fortun, D., Guichard, P., Unser, M. <a target="_blank" href="http://ieeexplore.ieee.org/document/7389457/">Reconstruction From Multiple Poses in Fluorescence Imaging: Proof of Concept.</a> IEEE J Sel Topics Signal Process. 10 (1), 61-70 (2016).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu yöntemle, araştırmacılar virüs ve diğer makromoleküler kompleksleri protein mimarisinin yüksek hassasiyet, çok kanallı 2D modellerini oluşturmak için SPA ve SR mikroskobu gücünü birleştirmek için donatılmıştır. Ancak, bazı önemli hususlar dikkate alınmalıdır. Tohumlar sürekli görülen bir yapıyı temsil etmek seçilmelidir. Bu nedenle, ham veriler tohum seçilir önce dikkatlice kontrol edilmelidir. Bu önyargılı modellerini önlenmesi açısından önemlidir. Seçimleri modellerinde parçacıkların belirli bir sayıda içerir için gereken minimum benzerlik eşikleri incelenmesiyle doğrulanabilir. Açıktır ki, tohum seçimi için, daha yüksek Bu eşik parçacıklarının belirli bir sayıda olması gerekmektedir, daha bu yapı verileri belirgindir. veri heterojenlik olduğunda şablon uygun konsept, özellikle yararlıdır. vi olan bütün farklı yapılarsible tespit edilmeli ve farklı modeller her durum için yarattı. bir kanalda heterojen yapıların ayrılması, ancak eş zamanlı olarak ikinci bir kanala modelleri oluşturarak, desen hususu derhal olmazdı ortaya çıkabilir. Diğer bir faktör bu algoritma kullanılarak iterasyon prosedürü stokastik asimetri maksimize edeceği zaman farkında olmak. iki simetrik bir maksimaya sahip bir yapı modellerken Örneğin, maksimum arasındaki tüm hafif asimetriler yineleme sırasında birbirleri ile aynı hizada olacak ve nihai modeli, maksimum asimetrik olacaktır. Bu modellenen yapının bilinen bir simetri yansıtmaz, o zaman bu hesaba alınmalıdır. VirusMapper model üretme sürecine simetri eksenleri dahil etmek için potansiyel bir gelişme olacağını rağmen şu anda bu maksimizasyonu önlemenin tek yolu, 1 yineleme sayısını sınırlamaktır. VirusMapper Herhangi yeni versiyonları avai olacakBaşvurulan web sitesinde tıklamanız yeterli olacaktır (Malzeme Tablo). Kullanıcılar ayrıca herhangi bir ortak sorularına yanıt burada SSS bulacaksınız. açıklandığı gibi yazılım kullanıcı modellemek istediği özelliklere görselleştirmek için yeterli çözünürlüğe sahip görüntülü olabilir herhangi yapıya uygulanabilir. SPA çözünürlüğünü artırabilir rağmen, açıkça aksi görünmez özelliklerin görünürlüğünü artırmak olmayacaktır. Bu protokol, bu nedenle, yöntem, verilerin kalitesini artırmak için değildir. En temiz veri ve iyi çıkan modellerini sağlayacak görüntüleme stratejisinin herhangi bir teknik, dikkatli numune hazırlama ve optimizasyon olduğu gibi. SR görüntüleme yönteminin seçimi genel olarak el altında numunenin bağlı olacaktır, ayrıca önemlidir ve. , VirusMapper SIM ve STED&#39;in 10 iyi çalışacak şekilde valide edilmiş ve aynı zamanda yüksek kaliteli yerelleştirme mikroskopi verileri ile kullanılabilir, ancak bakım bu durumda alınmalıdırolarak seyrek etiketleme asimetri maksimizasyonu benzer sorunlara yol açabilir. Şu anda, VirusMapper floresans görüntüleri tek parçacık analiz ve sadece genel amaçlı 2D SPA ortalama yazılımın tek serbestçe algoritmadır. Aynı ilkeler 4, 6 kullanımı yaptık Diğer çalışmalar, 8 her bir çalışma için uzman özel yazılım kullandık. Hiçbir yazılım sağlandı, ancak 3D veri yeniden inşası için Genel amaçlı algoritmalar, 5, 18 yayınlandı. Bu makalede tarif edildiği gibi kullanıldığında, VirusMapper virüs ve diğer kompleksler makromoleküler proteini mimarisi, hassas, doğru ve sağlam bir modeli üretmek için kullanılabilir. Bu model ile, araştırmacılar yapının ortalama boyutları hassas ölçümler alabilirÇalışmanın altında ures, potansiyel olarak onları başka türlü mümkün olmazdı biyolojik sonuçlara ulaşmanıza olanak verir. Ayrıca, bu tekniğin çok kanallı yetenekleri ile, komplekslerin proteinler ve bileşenlerin sınırsız sayıda eşlemek için ve yeni protein organizasyonu bilgiye mümkündür. Böyle bir virüs yaşam döngüsünün farklı aşamalarında farklı biyolojik ilgili koşullar, içinde nano ölçekli yapısında değişiklikler inceleyen biyoloji değerli bilgiler sunma potansiyeline sahiptir.

Süper çözünürlüklü (SR) mikroskopi onları anlama açısından son derece önemli moleküler özgü etiketleme ile birlikte görüntü anahtar moleküler süreçler yeteneği sağlayarak hücre biyolojisi üzerinde büyük bir etkisi oldu. SR şu anda bu tür görüntü canlı hücreleri 1, 2 potansiyeli gibi ışık mikroskobu önemli faydalar elde edilmesi esnasında, elektron mikroskopisi (EM) ile, daha önce sadece elde çözünürlükleri (20-150 nm) yaklaşmak için ışık mikroskobu sağlar. Bundan başka, nano ölçekli düzeyinde bulunan yapısal koruma SR verilere tek parçacık analizi (SPA), elektron mikroskobu 3 yaygın olarak kullanılan bir kavramın uygulamaya izin verir. SPA kullanarak, bir yapının çok yüksek ölçüde korunmuş kopya görüntülenmiş ve çözünürlük, hassas ya da sinyal-gürültü görüntülenmiştir nesnenin artırmak için birlikte ortalaması alınabilir. SR ile kombinasyon halinde kullanıldığında, SPA yüksek p için güçlü bir araç olduğu gösterilmiştirHIV 7 ve HSV-1 ile 8 olarak çekirdek gözenek kompleks 4, 5 bileşenleri, sentrozom 6 ve virüslerin recision eşleme. Bununla birlikte, SR, SPA rutin birlikte uygulama yazılım mevcut eksikliğinden öne sürülmüştür. Bu nedenle, biz VirusMapper, popüler görüntü işleme yazılımı ImageJ / Fiji 9&#39;a bir eklenti geliştirdi. Bu SR mikroskobu ile görüntülenmiş yapıların hızlı, kullanıcı dostu, çok kanallı naif ortalamayı sağlamak üzere tasarlanmış floresan görüntüleri 10 ile genelleştirilmiş SPA için ilk serbestçe kullanılabilir yazılım paketidir. virüsler için tasarlanmış olsa da, farklı moleküler türler, görüntülenen tanımlanmıştır ve lokalize edilebilir her hangi bir makromoleküler kompleks uygulanabilir. VirusMapper yüksek hassasiyetli molekül üretmek için kullanılabilmektedirortalama boyutları ve diğer parametrelerin hesaplanması için izin veren herhangi bir bilinen yapı model bulunur. algoritma tasarımı farklı yönlerde veya farklı morfolojik durumlarının saptanması için temin yapıların popülasyonları ayrılması için elverişli hale getirmektedir. Buna ek olarak, çok kanallı görüntüleme temel yapısı iyi bilinmektedir burada bu şekilde referans tabanlı yapı bulma için izin durumlarda bir referans kanalı kullanmak için kullanılabilir. Yazılım indirme ve yükleme talimatları üzerine sağlanmaktadır <a href="https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper">https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper</a> . Örnek verileri de orada bulunabilir ve kullanıcıların kendi uygulamak denemeden önce örnek veriler üzerinde yazılım kullanarak uygulama tavsiye edilir. Burada, ham verilerden SPA modeller üretmek için bu eklentisi kullanarak adımları tarif edilmiştir. Yazılım tek o içeren ham görüntüleri alırgiriş olarak çok etiketli yapılar r. Bu yazılım çalıştırıldığında olarak ayarlanır parametrelerin bir dizi konu, döner, görüntülü yapıları içinde etiketlenmiş bileşenlerin ortalama dağılımlarını gösteren SPA modelleri. Bu protokolün amacı, Şekil 1 &#39;de ana hatlarıyla boru hattına göre görüntülenen yapıları içinde bileşenlerinin ortalama lokalizasyonu veren hassas SPA modelleri üretmektir. Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, program akışı yararlı üç aşamaya ayrılır. İlk aşamada, her bir kanal için parçacık yığınları ile sonuçlanan, kademeli bir çok görüntü etmektir. Bu parçacıklar modelleri oluşturmak için ve model üretimi için tohum üretmek için ortalaması alınır birimleridir. İkinci aşamada son aşamada partiküllerinin tüm dizi kaydetmek için kullanılan tohum görüntü oluşturmak için. Bu s katkıda bu kanalda parçacıkların, el ile, bir referans kanalı seçme ve yapılıreeds. Tohumlar, bu referans kanalı olarak seçilir, ancak tüm kanallar için oluşturulabilir. Parçacıklar başlangıçta bu kanalda bir 2D Gauss uydurma ile yeniden düzenlenebilir edilir. Seçilen ve yeniden düzenlendi olan tüm parçacıkları daha sonra bir tohum üretilmesi için ortalaması alınmıştır. modellenecek olan veriler görülen her bir ortak bir yapı için, parçacıklar açık ve doğru bir şekilde yapıyı temsil tohum olarak seçilmelidir. Bu aşamada arayüz ayrıca, yapıları için verileri taramak için faydalıdır. Son aşama şablon eşleştirme kullanarak modellerini üretmektir. Bu, başlangıçta, çapraz korelasyon önceki bölümde oluşturulan tohum resimlere ekstre parçacıklarının kayıt ile elde edilir. Kayıtlı parçacıklarının alt birlikte ortalaması alınır ve proses ayrıca arzu edildiği takdirde, hata kare ortalaması modeli azaltmak için tekrarlanır. Bu alt küme yerine getirilmesi gereken tohum karşı minimum benzerlik kurarak belirlenir. model oluştururkenbirden fazla kanal eş zamanlı olarak s, eklem benzerlik, ya da her bir kanal için benzerlikler ortalama kullanılır. bunlara katkıda elde edilen model ve kayıt parçacıklar daha sonra analiz edilebilir.

<table><tbody><tr><td>Fiji</td><td></td><td></td><td>Open-source image analysis software</td></tr><tr><td>NanoJ-VirusMapper</td><td>developed by the Henriques lab</td><td></td><td>Open source-Fiji plugin (https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper)</td></tr><tr><td>VectaShield antifade mounting medium</td><td>Vector Labs</td><td>H-100</td><td></td></tr><tr><td>Elyra PS1</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZEN BLACK</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Image processing software for SIM</td></tr><tr><td>High performance coverslip</td><td>Zeiss</td><td>&amp;nbsp;474030-9000-000</td><td></td></tr><tr><td>TetraSpeck beads</td><td>ThermoFisher</td><td>T7279</td><td></td></tr></tbody></table>

open-source single-particle analysis for super-resolution microscopy with virusmapper

Süper çözünürlüklü floresan mikroskopi şu anda hücre biyolojisi araştırma devrim yaratıyor. Onun kapasitesi nano ölçekli biyolojik kompleksleri ve süreçlerin rutin görüntüleme için izin verir nm yaklaşık 300 çözünürlüğü sınırı kırmak için. Çözünürlükteki bu artış, aynı zamanda, tek parçacık analizi gibi elektron mikroskopisinde popüler yöntem, hali hazırda süper çözünürlüklü floresan mikroskobu uygulanabilir olduğu anlamına gelir. süper çözünürlük optik görüntüleme ile analitik bir yaklaşım birleştirerek, yarı kararlı bir yapı içinde moleküler elemanlar yapısal haritaları oluşturmak için floresan mikroskopi molekülü özel etiketleme kapasitesi yararlanmak mümkün olur. VirusMapper - - bir, yüksek performanslı kullanımı kolay ve yüksek verimli ImageJ eklentisi olarak paketlenmiş Bu amaçla, yeni bir algoritma geliştirdik. Bu makale, biyolojik m yeni yapısal özelliklere ortaya çıkarmak için yeteneğini vitrine, bu yazılım için derinlemesine bir kılavuz sunuyorolecular kompleksleri. Burada, uyumlu veri araya ve süper çözünürlüklü görüntülere tek parçacık analizi uygulamak için bu algoritmayı nasıl kullanılacağına ilişkin bir adım-adım protokolünü nasıl sağlanacağı sunuyoruz.

Burada, modeli poksvirüs, aşı virüsü yazılımı göstermektedir. En kompleks bir memeli virüsleri, aşı paketi bir 350 x 270 x 250 mil 3 tuğla şekilli parçacık 13, 14 içinde yaklaşık 80 farklı proteinler. Üç altyapılar elektron mikroskobu ile ayırt edilebilen: dsDNA genomu içeren bir merkezi çekirdek; İki protein yapıları, çekirdek kuşatan adı yanal gövdeleri; ve tek bir proteolipid iki tabakalı 15 zarf. Rekombinant floresan protein etiketleme büyük boy, karmaşık bir yapı ve yatkınlığını vaccinia VirusMapper akışını göstermek için mükemmel bir sistem yapmak. Burada açıklandığı gibi yazılım kullanılarak, aşı virionun proteinlerin çeşitli dağılımı modellenebilir. Bir proteini, etiketlenmiş ve kombi muhtemelen, görüntülenmiştirparçacık o proteinin lokalizasyonu ortalama modeller üretmek için tarif edildiği gibi, bir referans olarak bilinen dağıtım başka protein ve yazılım ile ulus kullanılmıştır. Bu örnekte, iki proteinin, iç çekirdek proteini L4 model ve ana yanal gövde bileşeni, F17 edildi. F 17 sahip olan bir rekombinant vaccinia virüsü, GFP&#39;li etiketlenmiş ve MCherry 16 kullanılmıştır L4 etiketli. Saflaştırılmış virüsü 1 mM Tris, pH 9 içinde seyreltilmiş ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca kaplanmasıyla yıkandı ve yüksek performanslı lamelleri bağlanmıştır. Numuneler daha sonra 20 dakika boyunca PBS içinde% 4 formaldehit uygulanması ile tespit edilmiştir. Lameller antifade montaj ortamda slaytların üzerine derhal monte edildi. Görüntüleme ticari bir SİM mikroskop SİM tarafından gerçekleştirilmiştir. görüntü alanı 5 faz değişimleri ve 561 nm 3 ızgara dönüşleri (32 um ızgara pe kullanılarak elde edildi virüs ve yüzlerce görüntü içeren seçildiön em) ve 488 nm (32 um Izgara periyodu) lazerler. Görüntüler bir sCMOS kamera kullanılarak elde ve mikroskop yazılımı kullanılarak işlenmiştir. Kanallar aynı görüntü elde etme ayarları ile görüntülenmiş çok renkli boncuk slayt dayalı hizalanmış edildi. SİM yeniden yapılanma ve kanal hizalama görüntü Fiji açıldı ve tek bir görüntü yığını halinde birleştirilmiş edildikten sonra. Bu tanecikler, bir merkezi en fazla gibi viral partiküller, referans olarak ve herhangi bir Gauss bulanıklığı uygulamadan L4 kanalı kullanarak görüntü elde edildi. Yaklaşık 15,000 parçacıklar, bu deneyde ekstre edildi. Nedeniyle ineklerdeki geometrisine, yanal gövdeleri virüs yönlendirmesine göre belirgin bir şekilde farklı bir görünüme sahiptir. Bu bir ya da iki yan organları ayırt edilebilir olan iki yönelimleri görüntülenmiştir. Biz frontal ve sagittal, saygı gibi bu yönelimlerin anılacaktıryanıtını verdiler. Ön ve sajital yönelimleri için ayrı tohumlar &quot;tohumları oluşturmak&quot; aşamasında parçacık liste boyunca arama yolu ile seçildi (Şekil 4 ve 5); Bir yönde açık olan ya da başka seçilmiştir parçacıkları. L4 kanalı birbirleriyle tohum hizalamak için referans kanalı olarak kullanılmıştır. Yine, herhangi bir Gauss bulanıklığı gerekliydi. Her yönlendirme için 5 parçacıkları, ve tohum üretmek için ortalaması alınmıştır. Modeller bu tohumlar dayalı olarak her bir yönlendirme için üretilmiştir. Bir referans kanalı veya kare yoğunluk değerleri ne kullanılmıştır. Maksimum yineleme sayısı 1 başlangıçta ayarlandı ve en az benzerlik, her yönlendirme için tutarlı bir görünüm veren her bir durumda, yaklaşık 1000 parçacıklar içerir ayarlandı. Maksimum yineleme sayısı, daha sonra yükseltilmiştirModelin yakınlaşma için izin verir. Modeller, böylece iki kanal iki yönelimleri (Şekil 7) için üretilmiştir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55471/55471fig1.jpg" /> Şekil 1: VirusMapper akışı. eklenti üç ana aşamada düzenlenir. Viral parçacıklar geniş görüntülerden çıkarılır, şablon resim veya tohumlar verilerinden yarı elle seçilir ve nihai SPA modelleri tohum başvurarak veriden üretilmesidir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55471/55471fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55471/55471fig2.jpg" /> Şekil 2: iletişim &quot;Viral Yapıları Özü&quot;. seçerken &quot;Viral structur Özü<html> es ROI önizlenemiyor sağlayan Önizleme göster &#39;o zaman seçilebilir&quot;, bu iletişim görünecektir. parametreleri. Optimal segmentasyon için ilk tahminler ile doldurulmalıdır&#39; ve parametreler ince ayar olması. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55471/55471fig2large.jpg" target="_blank">Bir görüntülemek için lütfen tıklayınız Bu rakamın daha büyük versiyonu.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/55471/55471fig3.jpg" /> Şekil 3: ekstraksiyon parametrelerinin ayarlanması. çıkartılacaktır ROI, YG çapındaki, ROI sayısı ve en yüksek YG örtüşme önizleme sonra böyle bir durum elde etmek için ayarlanır. ROI tüm parçacıkların bir ROI dahil edilir ve ROI&#39;ler kümelenmiş parçacıkların ayrılmasına olanak sağlamak için yeterince üst üste binerek, parçacıklar biraz daha büyüktür.ank &quot;&gt; bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayın. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/55471/55471fig4.jpg" /> Şekil 4: şablon uygun tohum üretme. &quot;Tohum üret&quot; iletişim (1) atanacak parametrelerini ortaya koyar. Referans parçacıkları sekansı (2), kullanıcı referans kanalı olarak parçacıklar aracılığıyla tarama sağlar. bir parçacık referans parçacıkları sırayla bakıldığında, her kanal için yeniden düzenlenebilir parçacıklar realigned parçacık önizleme (3) &#39;de izlenebilir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55471/55471fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/55471/55471fig5.jpg" /> Şekil 5: tohum resimler ekleme. Tohumlar eklendikçe<html> kutusu &quot;çerçeveleri kullanımı&quot;, ilgili tüm tohumlar (4) ortalama ve çerçeveler (5) gösterildi. mevcut ortalama tohumlara benzer parçacıklar iletişim kutusunda (6) öneriliyor. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55471/55471fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/55471/55471fig6.jpg" /> Şekil 6: iletişim &quot;Modeller üret&quot;. seçme &quot;Tohum dayanarak Modelleri üret,&quot; Ne zaman bu iletişim görünecektir. parametreleri optimal model üretimi için başlangıç ​​tahminlerinin ile doldurulmalıdır, ve model üretme işleminden unsurları seçilmelidir hesaplama sırasında gösterilebilir. &quot;Önizlemeyi göster&quot; o zaman çalıştırmak için bir model oluşturma sürecini sağlayan seçilebilir ve parametreler ince ayar olması.ftp_upload / 55471 / 55471fig6large.jpg&quot; target = &#39;_ blank&#39;&gt; bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayın. <img alt="Şekil 7," src="/files/ftp_upload/55471/55471fig7.jpg" /> Şekil 7: VirusMapper oluşturulacak modeller. mCherry ile etiketlenmiş L4 çekirdek proteini ve EGFP ile etiketlenmiş F17 lateral vücut proteini ile vaccinia virionlar SIM kullanılarak görüntülendi. protokolde tarif edildiği gibi modeller, daha sonra yazılım ile elde edilmiştir. ön ve sajital iki yönelimleri, yan cisimlerin ortaya çıkması ile ayırt edilir. Ölçü bar = 100 nm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55471/55471fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper at JoVE.com

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Bu yazının nano ölçekli yapının kesin modellerini üretmek için süper çözünürlüklü mikroskopi görüntülere tek parçacık analizi uygulamak için Fiji tabanlı açık kaynak yazılım paketi VirusMapper kullanır.

VirusMapper Süper çözünürlüklü Mikroskopi Açık kaynak Tek parçacık Analizi

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

open-source-single-particle-analysis-for-super-resolution-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

10.0K Görüntüleme.  University College London.  Bu yazının nano ölçekli yapının kesin modellerini üretmek için süper çözünürlüklü mikroskopi görüntülere tek parçacık analizi uygulamak için Fiji tabanlı açık kaynak yazılım paketi VirusMapper kullanır. 

Video: Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, direct visualization of individual viral complexes in their host cellular environment with cryoET is challenging2, due to the infrequent and dynamic nature of viral entry, particularly in the case of HIV-1. While time-lapse live-cell imaging has yielded a great deal of information about many aspects of the life cycle of HIV-13-7, the resolution afforded by live-cell microscopy is limited (~ 200 nm). Our work was aimed at developing a correlation method that permits direct visualization of early events of HIV-1 infection by combining live-cell fluorescent light microscopy, cryo-fluorescent microscopy, and cryoET. In this manner, live-cell and cryo-fluorescent signals can be used to accurately guide the sampling in cryoET. Furthermore, structural information obtained from cryoET can be complemented with the dynamic functional data gained through live-cell imaging of fluorescent labeled target.
In this video article, we provide detailed methods and protocols for structural investigation of HIV-1 and host-cell interactions using 3D correlative high-speed live-cell imaging and high-resolution cryoET structural analysis. HeLa cells infected with HIV-1 particles were characterized first by confocal live-cell microscopy, and the region containing the same viral particle was then analyzed by cryo-electron tomography for 3D structural details. The correlation between two sets of imaging data, optical imaging and electron imaging, was achieved using a home-built cryo-fluorescence light microscopy stage. The approach detailed here will be valuable, not only for study of virus-host cell interactions, but also for broader applications in cell biology, such as cell signaling, membrane receptor trafficking, and many other dynamic cellular processes.

We describe a correlative microscopy method that combines high-speed 3D live-cell fluorescent light microscopy and high-resolution cryo-electron tomography. We demonstrate the capability of the correlative method by imaging dynamic, small HIV-1 particles interacting with host HeLa cells.

Dinamik Etkileşimler 3D Yapısal Analiz için karşılıklı Mikroskopi

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

Biyomühendislik

Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which are ubiquitous and the most numerous entities on our planet 4 and important in all environments 5, have yet to be revealed via similar approaches. Here we describe an approach for isolating and characterizing the genomes of single virions called 'Single Virus Genomics' (SVG). SVG utilizes flow cytometry to isolate individual viruses and whole genome amplification to obtain high molecular weight genomic DNA (gDNA) that can be used in subsequent sequencing reactions.

Single Virus Genomics (SVG) is a method to isolate and amplify the genomes of single virons. Viral suspensions of a mixed assemblage are sorted using flow cytometry onto a microscope slide with discrete wells containing agarose, thereby capturing the virion and reducing genome shearing during downstream processing. Whole genome amplification is achieved using multiple displacement amplification (MDA) resulting in genomic material that is suitable for sequencing.

&#39;Tek Virüs Genomik&#39; kullanarak Tek viryonlar İzolasyonu ve Genom Analizi

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

Tek molekül Floresan Mikroskopi Reseptör Dinamiği Yüksek çözünürlüklü Spatiotemporal Analizi

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve intracellular structures and the dynamics of biomolecules with ~20 nm precision. A prerequisite for SMLM are fluorophores that transition from a dark to a fluorescent state in order to avoid spatio-temporal overlap of their point spread functions in each of the thousands of data acquisition frames. BODIPYs are well-established dyes with numerous conjugates used in conventional microscopy. The transient formation of red-shifted BODIPY ground-state dimers (DII) results in bright single molecule emission enabling single molecule localization microscopy (SMLM). Here we present a simple but versatile protocol for SMLM with conventional BODIPY conjugates in living yeast and mammalian cells. This procedure can be used to acquire super-resolution images and to track single BODIPY-DII states to extract spatio-temporal information of BODIPY conjugates. We apply this procedure to resolve lipid droplets (LDs), fatty acids, and lysosomes in living yeast and mammalian cells at the nanoscopic length scale. Furthermore, we demonstrate the multi-color imaging capability with BODIPY dyes when used in conjunction with other fluorescent&#160;probes. Our representative results show the differential spatial distribution and mobility of BODIPY-fatty acids and neutral lipids in yeast under fed and fasted conditions. This optimized protocol for SMLM can be used with hundreds of commercially available BODIPY conjugates and is a useful resource to study biological processes at the nanoscale far beyond the applications of this work.&#160;

Conventional BODIPY conjugates can be used for live-cell single-molecule localization microscopy (SMLM) through exploitation of their transiently forming, red-shifted ground state dimers. We present an optimized SMLM protocol to track and resolve subcellular neutral lipids and fatty acids in living mammalian and yeast cells at the nanoscopic length scale.

Canlı Hücresüper çözünürlüklü mikroskopi ve Tek Moleküllü İzleme için Konvansiyonel BODIPY Konjugeleri

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve ...

Biyokimya

Averaging of Viral Envelope Glycoprotein Spikes from Electron Cryotomography Reconstructions using Jsubtomo

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these glycoprotein &#8216;spikes&#8217; is often technically challenging but important for understanding viral pathogenesis and in drug design. Here, a protocol is presented for viral spike structure determination through computational averaging of electron cryo-tomography data. Electron cryo-tomography is a technique in electron microscopy used to derive three-dimensional tomographic volume reconstructions, or tomograms, of pleomorphic biological specimens such as membrane viruses in a near-native, frozen-hydrated state. These tomograms reveal structures of interest in three dimensions, albeit at low resolution. Computational averaging of sub-volumes, or sub-tomograms, is necessary to obtain higher resolution detail of repeating structural motifs, such as viral glycoprotein spikes. A detailed computational approach for aligning and averaging sub-tomograms using the Jsubtomo software package is outlined. This approach enables visualization of the structure of viral glycoprotein spikes to a resolution in the range of 20-40 &#197; and study of the study of higher order spike-to-spike interactions on the virion membrane. Typical results are presented for Bunyamwera virus, an enveloped virus from the family Bunyaviridae. This family is a structurally diverse group of pathogens posing a threat to human and animal health.

An approach is presented for determining structures of viral membrane glycoprotein complexes using a combination of electron cryo-tomography and sub-tomogram averaging with the computational package Jsubtomo.

Jsubtomo kullanılarak Elektron Cryotomography Rekonstrüksiyonunda ikinci viral zarf glikoproteini Spikes ortalamasını

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method for structural biologists to determine high-resolution structures of a wide variety of macromolecules. Multiple software suites are available to new and expert users for image processing and structure calculation, which streamline the same basic workflow: movies acquired by the microscope detectors undergo correction for beam-induced motion and contrast transfer function (CTF) estimation. Next, particle images are selected and extracted from averaged movie frames for iterative 2D and 3D classification, followed by 3D reconstruction, refinement, and validation. Because various software packages employ different algorithms and require varying levels of expertise to operate, the 3D maps they generate often differ in quality and resolution. Thus, users regularly transfer data between a variety of programs for optimal results. This paper provides a guide for users to navigate a workflow across the popular software packages: cryoSPARC v3, RELION-3, and Scipion 3 to obtain a near-atomic resolution structure of the adeno-associated virus (AAV). We first detail an image processing pipeline with cryoSPARC v3, as its efficient algorithms and easy-to-use GUI allow users to quickly arrive at a 3D map. In the next step, we use PyEM and in-house scripts to convert and transfer particle coordinates from the best quality 3D reconstruction obtained in cryoSPARC v3 to RELION-3 and Scipion 3 and recalculate 3D maps. Finally, we outline steps for further refinement and validation of the resultant structures by integrating algorithms from RELION-3 and Scipion 3. In this article, we describe how to effectively utilize three processing platforms to create a single and robust workflow applicable to a variety of data sets for high-resolution structure determination.

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

This article describes how to effectively utilize three cryo-EM processing platforms, i.e., cryoSPARC v3, RELION-3, and Scipion 3, to create a single and robust workflow applicable to a variety of single-particle data sets for high-resolution structure determination.

CryoSPARC, RELION ve Scipion ile Sağlam Tek Parçacıklı Kriyo-Elektron Mikroskobu (cryo-EM) İşleme İş Akışı

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice

Interest in liquid-electron microscopy (liquid-EM) has skyrocketed in recent years as scientists can now observe real-time processes at the nanoscale. It is extremely desirable to pair high-resolution cryo-EM information with dynamic observations as many events occur at rapid timescales - in the millisecond range or faster. Improved knowledge of flexible structures can also assist in the design of novel reagents to combat emerging pathogens, such as SARS-CoV-2. More importantly, viewing biological materials in a fluid environment provides a unique glimpse of their performance in the human body. Presented here are newly developed methods to investigate the nanoscale properties of virus assemblies in liquid and vitreous ice. To accomplish this goal, well-defined samples were used as model systems. Side-by-side comparisons of sample preparation methods and representative structural information are presented. Sub-nanometer features are shown for structures resolved in the range of ~3.5-&#197;-10 &#197;. Other recent results that support this complementary framework include dynamic insights of vaccine candidates and antibody-based therapies imaged in liquid. Overall, these correlative applications advance our ability to visualize molecular dynamics, providing a unique context for their use in human health and disease.

Here protocols are described to prepare virus assemblies suitable for liquid-EM and cryo-EM analysis at the nanoscale using transmission electron microscopy.

Sıvı ve Buzdaki Virüs Düzeneklerinin Yüksek Çözünürlüklü Görüntülenmesinin İlerlemesi

Interest in liquid-electron microscopy (liquid-EM) has skyrocketed in recent years as scientists can now observe real-time processes at the nanoscale. It ...

Using Nanoplasmon-Enhanced Scattering and Low-Magnification Microscope Imaging to Quantify Tumor-Derived Exosomes

Infected or malignant cells frequently secrete more exosomes, leading to elevated levels of disease-associated exosomes in the circulation. These exosomes have the potential to serve as biomarkers for disease diagnosis and to monitor disease progression and treatment response. However, most exosome analysis procedures require exosome isolation and purification steps, which are usually time-consuming and labor-intensive, and thus of limited utility in clinical settings. This report describes a rapid procedure to analyze specific biomarkers on the outer membrane of exosomes without requiring separate isolation and purification steps. In this method, exosomes are captured on the surface of a slide by exosome-specific antibodies and then hybridized with nanoparticle-conjugated antibody probes specific to a disease. After hybridization, the abundance of the target exosome population is determined by analyzing low-magnification dark-field microscope (LMDFM) images of the bound nanoparticles. This approach can be easily adopted for research and clinical use to analyze membrane-associated exosome biomarkers linked to disease.

Clinical translation of exosome-derived biomarkers for diseased and malignant cells is hindered by the lack of rapid and accurate quantification methods. This report describes the use of low-magnification dark-field microscope images to quantify specific exosome subtypes in small volume serum or plasma samples.

Tümör türevi Exosomes ölçmek için Nanoplasmon-gelişmiş saçılma ve düşük büyütme mikroskop görüntüleme kullanma

Infected or malignant cells frequently secrete more exosomes, leading to elevated levels of disease-associated exosomes in the circulation. These exosomes ...

Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. Imaging studies are widely used to investigate their function and plasticity in physiological and pathological conditions. Because of their size and structure, localization studies of proteins require high-resolution imaging techniques. In this protocol, we describe a procedure to study in primary neurons the co-localization of target proteins with synaptic markers at a super-resolution level using structured illumination microscopy (SIM). SIM is a patterned-light illumination technique that doubles the spatial resolution of wide-field microscopy, reaching a detail of around 100 nm. The protocol indicates the required controls and settings for robust co-localization studies and an overview of the statistical methods to analyze the imaging data properly.

This protocol shows how to employ super-resolution microscopy to study protein co-localization in primary neuronal cultures.

Primer Nöronlarda Proteinlerin ve Sinaptik Belirteçlerin Eş Lokalizasyonunun İncelenmesinde Süper Çözünürlüklü Görüntüleme

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. ...

Nörobilim

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

Tek Virion Atomik Kuvvet Mikroskopisi ve Süper Çözünürlüklü Floresan Görüntüleme için Numune Hazırlama

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...