Protokolümüz, seyrek, kırmızı vitesli durumlarını kullanarak süper çözünürlüklü mikroskopi için geleneksel BODIPY boyalarının kullanımını açıklamaktadır. Bu sayede canlı hücrelerdeki organeller ve biyomoleküller 30 nanometre çözünürlüğe sahip olarak çalışmamızı sağlar. Bu yöntemin avantajı, tek molekül sinyalleri uzun süreli bir kaynak sağlamak farklı mevcut BODIPY conjugates sadeliği ve çok yönlülük olduğunu.
Göstermiştirki uygulamamız, lipid damlacıkları ve yağ asidi kırınım sınırının altında çözünerek yağlı karaciğer hastalığı veya tip 2 diyabet gibi hastalıklarda bilgi edinmek için önemli hale gelebilir. Biz maya ve memeli hücrelerinde yağ asidi ve lipid damlacık biyolojisi içgörü elde. Ancak, bu teknik düşük arka plan floresan ile diğer tüm şeffaf hücre tipleri için geçerlidir.
İlk kez teknik kullanırken, parlak tek molekül sinyalleri gözlemlemek için, di konsantrasyonları ve lazer güçlerini optimize emin olun. Bu tekniğin görsel bir gösteri nasıl di konsantrasyonu ve lazer güç optimizasyonu parlak tek molekül sinyalleri sonuçları görmek için önemlidir. %10 fetal sığır serumu dört milimolar glutamin, bir milimolar sodyum pirüuvat ve bir T-25 şişesinde %1 penisilin streptomisin antibiyotikler ile floresan olmayan DMBM'deki memeli U2OS hücrelerini koruyun.
Hücreleri %70-80'lik bir arada 1'den 5'e bölün ve pipetleri sekiz kuyuluktaki tek bir kuyuda ayırın. Sekiz kuyu plakasındaki hücreleri 12 ila 24 saat değiştirin. Görüntülemeden on dakika önce, bodipy-C12 Lysotracker yeşilveya diğer BODIPY eşleği ekleyin, 100 nanomolar son konsantrasyonekleyin.
Kullanılan BODIPY emisyon rengine göre emisyon yoluna uygun filtre kümelerini monte edin. Mikroskobu aç. Mikroskop aşaması, 488 nanometre ve 561 nanometre lazerlerin yanı sıra kamera.
Mikroskop hedefi üzerinde gelişmekte olan yağ bir damla ekleyin. Parlak alan görüntüleme, lazer güçleri, lazer panjurlar ve görüntüleme için kamera ayarları için LED ışığını kontrol eden HAL4000 yazılımını açın. EMCCD kazancını 30'a, kamera sıcaklığını eksi 68 dereceye ayarlayın.
20 Hertz film kaydetmek için kamera ve ilgili yazılım hazırlayın. Mikroskop kademeli ısıtıcıyı açın ve 37 santigrat derece lik bir sıcaklığa ve yüzde beş karbondioksit seviyesine ayarlayın. Nesnel düzeltme rengini buna göre ayarlayın.
Numuneyi mikroskop aşamasına monte edin ve odaklama sistemi devreye girene kadar odaklanın. Görünüm alanında sağlıklı hücreler görünene kadar sahne denetleyicisini kullanarak sahneyi taşıyın. Tek moleküllü lokalizasyon mikroskobu için 561 nanometrelazerin lazer gücünün santimetre kare skometrebaşına 821 kilowatt'a kadar olan monumus uyarılması için lazer panjur dizilerini yükleyin, kırmızı kaydırmalı emisyon kanalında tek molekülfloresan gözenekleri tespit edilir.
488 nanometrelazer için 035 noktası ile santimetre kare başına 07 watt arasında lazer gücünü ayarlayın, böylece geleneksel floresan yeşil emisyon kanalında görünür. Filmler için bir hedef klasör seçin ve süper çözünürlüklü görüntüleri yeniden oluşturmak için yeterli yerelleştirmeleri toplamak için 5000 ile 20000 edinme çerçevelerini kaydedin. Daha fazla hücre için veri toplamak için farklı görüş alanlarına geçin ve yineleyin.
Filmi tek moleküllü lokalizasyon mikroskobu analiz yazılımına yükleyin. Filmi görsel olarak tarayanın ve kontrast ayarlarını ayarlayın, tek moleküllü floresan yanıp sönme görülebilir. 2D Gaussian, PSF'lerin montajı için tek molekül tanımlama parametrelerini ayarlamak için.
Tanımlama parametrelerini kontrol etmek için bazı örnek kareler aracılığıyla görsel olarak tarayanın ve farklı tek moleküllü floresan patlamaları güvenilir bir şekilde algıla. Tek moleküllü lokalizasyon mikroskobu gerçekleştirmek için basın analizi optimize kimlik parametreleri ile analiz düşünün. Ve sonra, her bir molekülü, algılanan fotonların ters kare köküyle genişleyen bir 2D Gaussian olarak işletin.
Verilerin kalitesini değerlendirin. Daha spesifik durumlarda ve zamanda tek molekül dağılımlarını gözlemlemek için sınırlı çerçeve aralıkları kullanın. Bu veri toplama sırasında organel hareketi için hesaplar.
Bu çalışmada BODIPY konjugatları kullanılarak tek moleküllü lokalizasyon mikroskopisi ile optimize edilmiş bir numune hazırlama, veri toplama ve analiz prosedürü sunulmuştur. Tek moleküllü lokalizasyon mikroskobu verilerinin elde edilip analiz edilebilen iş akışının bir örneğini göstermek için, mayadaki BODIPY optik kırınım sınırının altındaki lipid damlacıklarını çözmek için kullanılmıştır. GFP ve mEos2 gibi diğer problarla çekimde BODIPY'nin farklı çok renkli görüntüleme modlarına örnekler burada gösterilmiştir.
BODIPY-C12, açlık üzerine hücre çevresinde mobil lipid dışı damlacık kümelerinde oluşmuştur. BODIPY konjugates'in tek moleküllü lokalizasyon mikroskobu yeteneğini memeli hücrelerine daha da genişletmek için canlı U2OS hücrelerinde BODIPY-C12 ve Lysotracker green görüntülendi. BODIPY konsantrasyonu optimize yanı sıra heyecan verici lazer güçleri parlak tek molekül sinyalleri görselleştirmek için kritik adımlar, ve süper çözünürlüklü görüntüleri yeniden oluşturmak için.
Bu yöntem, canlı hücrelerin içindeki belirli biyo-moleküllerin özel zamansal dağılımında, yüksek çözünürlüklü içgörü elde etmek için başka bir BODIPY konjuge ile kullanılabilir. Teknikimiz, lipid damlacıklarını ve yağ asidi biyolojisini nanoskobik lens ölçeğinde daha fazla sorgulamanın yolunu açtı. Ancak, bu uygulama çeşitli fonksiyonel BODIPY konjugatların kullanılabilirliği nedeniyle belirli filopectetes çok ötesine geçer.
Lütfen biyolojik numune ve boyaların işlenmesi için standart çalışma prosedürlerini takip etmeyi ve aynı zamanda zorunlu çitlerimiz olduğundan ve lazer güvenlik prosedürlerini uyguladığımızdan emin olun.
