Biz (JPV için) Aktarma Vakfı cömert bir hediye de dahil olmak üzere, bizim finansman kaynaklarını teşekkür etmek istiyorum, (PJS için) (PJS kadar) HealthGrant T32-CA079448 ve Ball State University başlangıç ​​fonları National Institutes of. fon çalışma dizaynı, veri toplama ve analizi, yayınlama kararı, ya da yazının hazırlanmasında hiçbir rolü vardı.

<ol><li>Qin, Y., Hurley, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures%2C+folding+patterns%2C+and+functions+of+intramolecular+DNA+G-quadruplexes+found+in+eukaryotic+promoter+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Structures, folding patterns, and functions of intramolecular DNA G-quadruplexes found in eukaryotic promoter regions.</a> Biochimie. 90 (8), 1149-1171 (2008).</li>
<li>Stegle, O., Payet, L., Mergny, J. L., MacKay, D. J., Leon, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+and+understanding+the+stability+of+G-quadruplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Predicting and understanding the stability of G-quadruplexes.</a> Bioinformatics. 25 (12), i374-i382 (2009).</li>
<li>Todd, A. K., Johnston, M., Neidle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+prevalent+putative+quadruplex+sequence+motifs+in+human+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Highly prevalent putative quadruplex sequence motifs in human DNA.</a> Nucleic Acids Res. 33 (9), 2901-2907 (2005).</li>
<li>Huppert, J. L., Balasubramanian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+quadruplexes+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Prevalence of quadruplexes in the human genome.</a> Nucleic Acids Res. 33 (9), 2908-2916 (2005).</li>
<li>Bedrat, A., Lacroix, L., Mergny, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-evaluation+of+G-quadruplex+propensity+with+G4Hunter%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Re-evaluation of G-quadruplex propensity with G4Hunter.</a> Nucleic Acids Res. 44 (4), 1746-1759 (2016).</li>
<li>Mendoza, O., Bourdoncle, A., Boule, J. B., Brosh, R. M. Jr, Mergny, J. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26883636">G-quadruplexes and helicases.</a> Nucleic Acids Res. 44 (5), 1989-2006 (2016).</li>
<li>Huppert, J. L., Balasubramanian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G-quadruplexes+in+promoters+throughout+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">G-quadruplexes in promoters throughout the human genome.</a> Nucleic Acids Res. 35 (2), 406-413 (2007).</li>
<li>Eddy, J., Maizels, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+function+correlates+with+potential+for+G4+DNA+formation+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Gene function correlates with potential for G4 DNA formation in the human genome.</a> Nucleic Acids Res. 34 (14), 3887-3896 (2006).</li>
<li>Eddy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G4+motifs+correlate+with+promoter-proximal+transcriptional+pausing+in+human+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">G4 motifs correlate with promoter-proximal transcriptional pausing in human genes.</a> Nucleic Acids Res. 39 (12), 4975-4983 (2011).</li>
<li>Vaughn, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DEXH+protein+product+of+the+DHX36+gene+is+the+major+source+of+tetramolecular+quadruplex+G4-DNA+resolving+activity+in+HeLa+cell+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The DEXH protein product of the DHX36 gene is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA resolving activity in HeLa cell lysates.</a> J Biol Chem. 280 (46), 38117-38120 (2005).</li>
<li>Booy, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+helicase+RHAU+%28DHX36%29+unwinds+a+G4-quadruplex+in+human+telomerase+RNA+and+promotes+the+formation+of+the+P1+helix+template+boundary%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The RNA helicase RHAU (DHX36) unwinds a G4-quadruplex in human telomerase RNA and promotes the formation of the P1 helix template boundary.</a> Nucleic Acids Res. 40 (9), 4110-4124 (2012).</li>
<li>Creacy, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G4+resolvase+1+binds+both+DNA+and+RNA+tetramolecular+quadruplex+with+high+affinity+and+is+the+major+source+of+tetramolecular+quadruplex+G4-DNA+and+G4-RNA+resolving+activity+in+HeLa+cell+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">G4 resolvase 1 binds both DNA and RNA tetramolecular quadruplex with high affinity and is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA and G4-RNA resolving activity in HeLa cell lysates.</a> J Biol Chem. 283 (50), 34626-34634 (2008).</li>
<li>Giri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G4+resolvase+1+tightly+binds+and+unwinds+unimolecular+G4-DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">G4 resolvase 1 tightly binds and unwinds unimolecular G4-DNA.</a> Nucleic Acids Res. 39 (16), 7161-7178 (2011).</li>
<li>Lattmann, S., Stadler, M. B., Vaughn, J. P., Akman, S. A., Nagamine, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DEAH-box+RNA+helicase+RHAU+binds+an+intramolecular+RNA+G-quadruplex+in+TERC+and+associates+with+telomerase+holoenzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The DEAH-box RNA helicase RHAU binds an intramolecular RNA G-quadruplex in TERC and associates with telomerase holoenzyme.</a> Nucleic Acids Res. 39 (21), 9390-9404 (2011).</li>
<li>Sexton, A. N., Collins, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+5%27+guanosine+tracts+of+human+telomerase+RNA+are+recognized+by+the+G-quadruplex+binding+domain+of+the+RNA+helicase+DHX36+and+function+to+increase+RNA+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The 5' guanosine tracts of human telomerase RNA are recognized by the G-quadruplex binding domain of the RNA helicase DHX36 and function to increase RNA accumulation.</a> Mol Cell Biol. 31 (4), 736-743 (2011).</li>
<li>Smaldino, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+Dissection+of+Telomeric+DNA+Binding+Requirements+of+G4+Resolvase+1+Shows+that+G4-Structure+and+Certain+3%27-Tail+Sequences+Are+Sufficient+for+Tight+and+Complete+Binding%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mutational Dissection of Telomeric DNA Binding Requirements of G4 Resolvase 1 Shows that G4-Structure and Certain 3'-Tail Sequences Are Sufficient for Tight and Complete Binding.</a> PLoS One. 10 (7), e0132668(2015).</li>
<li>Booy, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+helicase+RHAU+%28DHX36%29+suppresses+expression+of+the+transcription+factor+PITX1%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The RNA helicase RHAU (DHX36) suppresses expression of the transcription factor PITX1.</a> Nucleic Acids Res. 42 (5), 3346-3361 (2014).</li>
<li>Huang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yin+Yang+1+contains+G-quadruplex+structures+in+its+promoter+and+5%27-UTR+and+its+expression+is+modulated+by+G4+resolvase+1%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Yin Yang 1 contains G-quadruplex structures in its promoter and 5'-UTR and its expression is modulated by G4 resolvase 1.</a> Nucleic Acids Res. 40 (3), 1033-1049 (2012).</li>
<li>Tran, H., Schilling, M., Wirbelauer, C., Hess, D., Nagamine, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitation+of+mRNA+deadenylation+and+decay+by+the+exosome-bound%2C+DExH+protein+RHAU%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Facilitation of mRNA deadenylation and decay by the exosome-bound, DExH protein RHAU.</a> Mol Cell. 13 (1), 101-111 (2004).</li>
<li>Yoo, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DHX36+enhances+RIG-I+signaling+by+facilitating+PKR-mediated+antiviral+stress+granule+formation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">DHX36 enhances RIG-I signaling by facilitating PKR-mediated antiviral stress granule formation.</a> PLoS Pathog. 10 (3), e1004012(2014).</li>
<li>Lai, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DEAH-box+helicase+RHAU+is+an+essential+gene+and+critical+for+mouse+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The DEAH-box helicase RHAU is an essential gene and critical for mouse hematopoiesis.</a> Blood. 119 (18), 4291-4300 (2012).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DDX1%2C+DDX21%2C+and+DHX36+helicases+form+a+complex+with+the+adaptor+molecule+TRIF+to+sense+dsRNA+in+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">DDX1, DDX21, and DHX36 helicases form a complex with the adaptor molecule TRIF to sense dsRNA in dendritic cells.</a> Immunity. 34 (6), 866-878 (2011).</li>
<li>Kim, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspartate-glutamate-alanine-histidine+box+motif+%28DEAH%29%2FRNA+helicase+A+helicases+sense+microbial+DNA+in+human+plasmacytoid+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Aspartate-glutamate-alanine-histidine box motif (DEAH)/RNA helicase A helicases sense microbial DNA in human plasmacytoid dendritic cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (34), 15181-15186 (2010).</li>
<li>BD Biosciences. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.bd.com/ds/technicalCenter/misc/difcobblmanual_2nded_lowres.pdf">http://www.bd.com/ds/technicalCenter/misc/difcobblmanual_2nded_lowres.pdf</a> (2016).</li>
<li>Booy, E. P., McRae, E. K., McKenna, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+G4+quadruplex+telomerase+RNA+unwinding+by+the+RNA+helicase+RHAU%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of G4 quadruplex telomerase RNA unwinding by the RNA helicase RHAU.</a> Methods Mol Biol. 1259, 125-135 (2015).</li>
<li>Lattmann, S., Giri, B., Vaughn, J. P., Akman, S. A., Nagamine, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+amino+terminal+RHAU-specific+motif+in+the+recognition+and+resolution+of+guanine+quadruplex-RNA+by+the+DEAH-box+RNA+helicase+RHAU%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Role of the amino terminal RHAU-specific motif in the recognition and resolution of guanine quadruplex-RNA by the DEAH-box RNA helicase RHAU.</a> Nucleic Acids Res. 38 (18), 6219-6233 (2010).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu protokol, DHX36 gen ürününün, G4 Resolvase1 (ayrıca RHAU ve DHX36 adı G4R1) (Şekil 1) izole edilmesi için son derece etkili bir ekspresyonu, saflaştırılması, ve miktar şemasını temsil etmektedir. G4-DNA-konjuge boncuk His-tag afinite kobalt afinite boncuklar üzerinde arınma ve enzimatik saflaştırma: Bu protokol, iki arıtma adımları kullanır. İkinci adım, rG4R1 G4 yapılar için vardır sıkı afinite, yüksek özgüllük ve katalitik açma faaliyeti yararlanır olduğu benzersizdir. G4 yapılarının sıkı afinite (düşük uM aralığında Kd) büyük ölçüde spesifik olmayan proteinlerin varlığını azaltır G4 boncuklardan yüksek tuz (NaCI çözünürlük sınırına yakın) yıkama, elüsyondan önce, izin verir. G4 yapılara G4R1 katalitik aktivitesi, ATP ve MgCl2 eklenmesi üzerine, aktif rG4R1 spesifik elüsyon için izin verir. Bu, iki aşamalı bir saflaştırma şeması sürekli olarak son derece saf üretirEn biyokimyasal analizler için uygun miktarlarda rG4R1 13 katalitik olarak aktif. Birkaç önemli adımlar son derece saf, katalitik olarak aktif rG4R1 iyi bir verim sağlayacaktır. İlk bakteriyel ekspresyon suşu His-rG4R1 doğru indüksiyon koşulları sağlamaktır. Bu hücreler, indükleme için hemen önce en fazla 0.4-0.6 OD 600 yetiştirilen rekombinant proteinin iyi verimi meydana bulmuşlardır. Bu noktadan sonra hücreler artan muhtemelen gövdelerde rG4R1 dahil edilmesine protein muhtevası genel bir kayıp ile sonuçlanabilir. İkinci olarak, kobalt afinite tanelerine &quot;seri bağlayıcı&quot; lizatları tarafından saflaştırılmış proteinin daha yüksek bir konsantrasyonu elde edilmiştir. Örneğin, kobalt afinite boncuklara bağlı kültürlerin 0.5 L lizat bağlanmış ve daha sonra aynı kobalt afinite taneleri kültürün ek bir 0.5 L bir lizat bir ikinci bağlanma gerçekleştirilmiştir. Buaşama, böylece kobalt afinite taneleri tam kapasite ile boncuk belirli bir hacme bağlı rG4R1 molekülü sayısının arttırılması ile proteinin bir daha konsantre hazırlanmasını sağlar. Üçüncü olarak, G4 boncuklara kobalt afinite elüsyon bağlandıktan sonra, yüksek tuzlu yıkama tanelerine bağlama neredeyse tüm spesifik olmayan protein bertaraf edilmesi garantiye alınır. Dördüncü olarak, ATP / MgCl2 yıkama adımı boncuklardan açıklanacak rG4R1 neden katalitik tek şeritler halinde tetramolecular yapı gevşemeye G4 boncuklara bağlanan rG4R1 sağlar. Biz tamamen ATP yerine katalitik şekilde daha rekabetçi olarak rG4R1 elutes olasılığını göz ardı edemeyiz; Daha önce bir hidrolize olmayan ATP analoğu 13, 18 rekabetçi bağlama için yeterli olmadığını göstermiştir Bununla birlikte, bu durum daha az muhtemeldir. -tabaka için rG4R1 afinitesi, tek iplikli DNA az T daha büyüklük sırasıO tetramolecular G4 DNA başlayan ve dolayısıyla rG4R1 yeniden bağlama olmamalıdır tanelerine. Bu olasılığı azaltmak için ise, bu adım, 37 ° C &#39;de yapılmalıdır, ve elüsyon hacmi mümkün olduğunca hızlı bir şekilde boncuklardan ayrılmalıdır. Elüsyon adımı en iyileşme sağlamak için iki kez tekrarlanır. mansap uygulamalar DNA maddelerden arındırılmış olması için proteine ​​ihtiyaç varsa, biz arıtılmış hazırlık varsa, herhangi bir biyotinlenmiş DNA&#39;lar kaldırmak için streptavidin boncuk yeniden bağlı olduğu ek bir temizleme adımı öneriyoruz. Bu uygun koşullar protokol boyunca muhafaza takdirde rG4R1 bozunmaya duyarlı olduğunu bulduk. enzim bütünlüğü ve aktivitesi muhafaza etmek amacıyla, aşağıdaki önemli önlemler kullanır. Proteaz inhibitörleri saflaştırma prosedürü boyunca mevcut tutulur. Aksi belirtilmediği sürece, iletişim kuralı, 4 ° C&#39;de gerçekleştirilir. Protein la mevcudiyetinde saflaştırılırctalbumin ve β-mersaptoetanol eklenir. Protokol (saflaştırma için 1 gün içinde) zamanında gerçekleştirilir. Ayrıca, birden fazla donma-çözülme döngüleri olumsuz proteinin aktivitesini etkileyen bulduk, bu yüzden &quot;bir defalık kullanıma,&quot; içine protein bölmeyin 7 uL alikotları saflaştırma takip ve -80 ° C&#39;de saklayın. hazırlanmasında laktalbumin varlığı proteininin bütünlüğü ve aktivitesi korumak için gerekli olsa da, yukarıda belirtildiği gibi, bu aynı zamanda, alt uygulamaları engel bulmuşlardır. saflaştınldı rG4R1 preparatta mevcut olan diğer potansiyel hata moleküller ATP, β-merkaptoetanol ve saydı sarmallı DNA bulunmaktadır. Örneğin, bağlı tampon bileşenleri, yüksek bir zemin sinyali, BIAcore analizi ile uyumlu olması için, bu proteini müstahzarından bulduk. Ayrıca, protein hazırlık lactalbumin varlığı standart Bradford kullanımını engellerBCA Protein tayininde tahlilleri. Ancak, bu sınırlama aşmak için alternatif bir jel bazlı niceleme yöntemi geliştirdik. özellikle kendisini saflaştırmak için bir araç olarak G4R1 enzimatik aktivitesi tesisatı Bu saflaştırma işlemi, diğer yöntemlerle ayrı, bu yöntem sağlar. Örneğin, diğer gruplar böcek hücreleri 26 insan hücreleri 15, 25 ya da GST etiketli rG4R1 FLAG-etiketli rG4R1 ifade ve sırasıyla FLAG- ya da GST-afinite kromatografisi ile saflaştırılmış. Bu yöntemler, bir bakteriyel ekspresyon sistemi ile karşılaştırıldığında, bir ökariyotik sentezleme sisteminde yapılan avantajına sahiptir. G4 yapılar için elde edilen saflaştınlmış GST-G4R1 tahmini Kd değerler rapor Kd 12 değerleri daha 13 yüksek büyüklükte 14 bir düzen olduğu bulunmuştur. Biz thi özniteliği6xHis etiketi karşısında hantal GST-eklentisi ile birlikte farklılıklar Kd değerlerindeki s farklılığı, bir karşı bakteriyel edilen translasyon sonrası modifikasyonların boyutu ve türü her iki saflaştırma şemaları elde edilen saflık farklılıklar ve farklılıklar böcek ekspresyon sistemi. Bu proteinin saflaştırılması ile doğrudan enzimatik aktivitesi menteşe için Yaklaşımımız bahsedilen alternatiflerine göre belirgin bir avantajı vardır. Bu nedenle, öncelikli olarak enzimatik özelliklerini korur şekilde katlanır ve modifiye edilmiş bir enzim elde edilir. Diğer afinite etiketi ve / veya boyut dışlama teknikleri enzimatik ölü enzim aktif enzim ayırmak mümkün değildir. 15, 25, 26 (yani, insan ya da böcek hücre ifade diğer grupların arıtma metotlarının güçlü birleştirmek için gelecekteki iletişim kuralı geliştirilmesi için yararlı olabilecektirBizim protokolü (yani, katalitik tabanlı arıtma) gücü ile iyon sistemi) ayrıca bu yöntem geliştirmek için. Bu protokol, G4R1 şu anda özgü ise, kolayca dahil olmak üzere herhangi bir ATP-bağımlı, G4-çözme proteinlerin şekilde uyarlanmıştır, BLM, Uyarı, FANCJ, hnRNP proteinler, hPif1 ve / veya ChlR1 / DDX1, bunlarla sınırlı olmamak üzere olabilir. streptavidin boncuk bağlı nükleik asit sekansını değiştirerek, bu protokol, nükleik asit helikazlar de dahil olmak üzere, enzimatik reaksiyonun ürünü artık enzim için bir alt-tabaka olan diğer ATP bağımlı nükleik asit enzimleri saflaştırmak için uyarlanabilir nucleaseleri.

G4 yapılar DNA ve RNA&#39;nın guanin zengini bölgeler içinde formu son derece kararlı bir nükleik asit ikincil yapılardır. G4 yapılar Hoogsteen-bağlanma etkileşimleri yoluyla stabilize önemli ölçüde G4 yapıları 1, 2, termal stabilitesi katkı tek değerli katyonların (örneğin. K +, Na +) merkezi boşluk içinde bağlama koordinat. Erken biyoinformatik çalışmalar insan genomu&gt; 375000 &quot;potansiyel G4 oluşturan motifler&quot; 3, 4 içerdiğini ileri sürdü. Daha yakın tarihli bir çalışma tahminleri başka bir çalışma insan genomunda 6 716.310 farklı potansiyel G4 oluşturan dizileri tahmin ederken G4 motifleri sayısı 2-5 5 faktör daha yüksek olduğunu göstermektedir. G4-şekillendirme dizileri evrimsel korunmuş ve rastgele dağılmış değilGenom. G4 motifleri gen kodlama bölgelerinde zenginleştirilmiş ve tüm gen promoteri% 40 yukarı doğru G4 motifleri 7 içerir. İlginç bir şekilde, bir gen G4 motifleri takviye derecesinin genin fonksiyonunu önermek gösterilmiştir. Örneğin, gelişiminde rol oynayan proto-onkogenler ve genler tümör baskılayıcı genlerin 8, 9 den G4 yapılarının önemli ölçüde daha fazla zenginleştirme var. yüksek termal kararlılıkları sayesinde, genom boyunca neredeyse her yerde bulunması, ve önemli ölçüde büyük hücresel süreçleri etkileme potansiyeli, hücre bu yapıları yönetmek için enzimler gelişti bulmak için şaşırtıcı değildir. , Insan (HeLa) hücreleri 10 tetramolecular G4-DNA çözülmesi aktivitesi çoğunluğunun kaynağı olarak karakterize edilen Böyle bir enzim G4 Resolvase1 (ayrıca RHAU ve DHX36 adı G4R1) &#39;dir. O zamandan beri, bu gösterilmiştir that G4R1 biçimde bağlanır ve bir katalitik G4-bağlayıcı protein, 11, 12, 13 sıkı bildirilen Kd ile tetramolecular ve tek moleküllü G4 DNA ve G4 RNA unwinds. Buna ek olarak, G4R1 G4-çözme aktivitesi Telomer / telomeraz biyoloji 11, 14, 15, 16, transkripsiyon ve ekleme 17, 18, 19, 20, geliştirme 21 hematopoez içeren biyokimyasal ve hücresel süreçlerin, geniş bir yelpazede implike edilmiştir 21 ve bağışıklık düzenleme 22, 23. G4 dizilerinin bir üstünlüğü özellikle genom ve çeşitli hücresel p boyunca yer alan ileG4R1 geçenlerde ifade ve verimli bu proteinin biyokimyasal mekanizmaları ve davranışları ortaya çıkması için rG4R1 son derece önemli olacaktır son derece aktif arındırmak yeteneği ile ilgili olduğu karıştığı edildiğini rocesses. Burada, yeni bir ifade ve verimli bir şekilde aktif enzim izole etmek rG4R1 ATP&#39;ye bağımlı, G4-çözme aktivitesi yararlanır saflaştırma şeması (Şekil 1) göstermektedir. G4R1 olduğu gibi bu şema, enzimatik reaksiyonun ürünü artık bağlanması için bir substrat olan diğer ATP bağımlı nükleik asit enzimleri saflaştırmak için uyarlanabilir.

<table><tbody><tr><td>TriEx4-DHX36 plasmid</td><td>Addgene</td><td>68368</td><td></td></tr><tr><td>Rosetta2(DE3)plysS competent cells</td><td>Novagen</td><td>71403-4</td><td></td></tr><tr><td>S.O.C medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15544034&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Difco Terrific Broth</td><td>Becton Dickinson</td><td>243820</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1919</td><td>35 &amp;micro;g/mL in bacterial plates/large cultures</td></tr><tr><td>Carbenicillin (plant cell culture tested)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3416</td><td>50 &amp;micro;g/mL in bacterial plates/large cultures</td></tr><tr><td>Isopropyl &amp;beta;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme (from chicken egg white)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 8</td><td>Universal Scientific Supply Co.&amp;nbsp;</td><td>1963-B</td><td>or from standard source</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 7</td><td>Universal Scientific Supply Co.&amp;nbsp;</td><td>1966</td><td>or from standard source</td></tr><tr><td>1.5 M Tris-HCl, pH 8.8</td><td></td><td></td><td>For casting resolving gel (for protein quantitation gel); From standard source</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 6.8</td><td></td><td></td><td>For casting stacking gel (for protein quantitation gel); From standard source</td></tr><tr><td>1 M Tris-Acetate, pH 7.8</td><td>Universal Scientific Supply Co.&amp;nbsp;</td><td>1981</td><td>or from standard source</td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td></td><td></td><td>From standard source</td></tr><tr><td>Magnesium chloride (1&amp;nbsp;M solution)</td><td>Life Technologies</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Sodium acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8750</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>Universal Scientific Supply Co.&amp;nbsp;</td><td>1665</td><td>or from standard source</td></tr><tr><td>&amp;beta;-mercaptoethanol (2-BME)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63689</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8849</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin hemisulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8511</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin paramagnetic beads</td><td>Promega</td><td>Z5482</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA, pH 8&amp;nbsp;</td><td>Universal Scientific Supply Co.&amp;nbsp;</td><td>0718</td><td>or from standard source</td></tr><tr><td>0.2 M EDTA, pH 6</td><td>Universal Scientific Supply Co.&amp;nbsp;</td><td></td><td>From standard source; initially adjust pH with NaOH, then adjust pH back down with HCl.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>A-lactalbumin (Type 1 from bovine milk)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5385</td><td></td></tr><tr><td>Cobalt metal affinity beads</td><td>Clonetech</td><td>635502</td><td></td></tr><tr><td>L-Histidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8000</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid, glacial</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38-500</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5&#039;-Triphosphate (from bacterial source)</td><td>Sigma</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>40% acrylamide/Bis solution (37.5:1)</td><td>Biorad</td><td>161-0148</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50046</td><td>to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS)</td></tr><tr><td>10% Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td><td>Universal Scientific Supply Co.&amp;nbsp;</td><td>1667</td><td>to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); or from standard source</td></tr><tr><td>10x TBE&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11666703001</td><td>or from standard source</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); From standard source</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>411019</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium persulfate (APS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Broad Range Protein MW markers</td><td>Promega</td><td>V8491</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylated Z33 oligo (&quot;Z33-Bio&quot;)</td><td>Oligos Etc</td><td></td><td>5&amp;rsquo; AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-biotin 3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>TAMRA-Z33 oligo (&quot;Z33-TAM&quot;)</td><td>Oligos Etc</td><td></td><td>5&amp;rsquo; TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>Fluor-coated TLC plate</td><td>Life Technologies</td><td>AM10110</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2637</td><td>30% in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Coomassie R-250</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27816</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412</td><td></td></tr><tr><td>Multiband UV lamp</td><td></td><td></td><td>Capable of emitting UV light at 365 nm</td></tr><tr><td>Table-top centrifuge (with swinging bucket rotor)</td><td></td><td></td><td>Capable of being cooled to 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td></td><td></td><td>Capable of being cooled to 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Digital Sonfier</td><td>Branson</td><td></td><td>Or equivalent capable of delivering sonication pulses (30% amplitude, 2 s ON/2 s OFF)</td></tr><tr><td>50 &amp;deg;C water bath</td><td></td><td></td><td>For formation of Z33 into quadruplex</td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C incubator for bacteria</td><td></td><td></td><td>For bacterial transformations and initial overnight growth of large cultures of Rosetta2 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; transformed with TriEx4-DHX36</td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C/14&amp;nbsp;&amp;deg;C shaking incubator for bacteria</td><td></td><td></td><td>For growth and protein induction of large cultures of Rosetta2 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; transformed with TriEx4-DHX36</td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td></td><td></td><td>capable of reading OD600; capable of reading oligomer concentrations based on base sequence (such as Biorad SmartSpec 3000)</td></tr><tr><td>Thermometer</td><td></td><td></td><td>From standard source</td></tr><tr><td>PCR strip tubes</td><td></td><td></td><td>From standard source</td></tr><tr><td>15 and 50 mL centrifuge tubes (polypropylene)</td><td></td><td></td><td>From standard source</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes (2.0 mL)</td><td></td><td></td><td>From standard source</td></tr><tr><td>500 mL centrifuge bottles (polypropylene)</td><td>Thermo Scientific</td><td>3141-0500</td><td></td></tr><tr><td>Standard array of pipet tips and serological pipettes</td><td></td><td></td><td>From standard source</td></tr><tr><td>Gel-loading tips</td><td></td><td></td><td>From standard source</td></tr><tr><td>Automatic repeating pipette</td><td></td><td></td><td>For quick aliquoting of rG4R1; From standard source</td></tr><tr><td>Thermal cycler</td><td></td><td></td><td>From standard source</td></tr><tr><td>Liquid Nitrogen</td><td></td><td></td><td>From standard source</td></tr><tr><td>Dry ice</td><td></td><td></td><td>From standard source</td></tr><tr><td>Laemlli sample buffer&amp;nbsp;</td><td>Biorad</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>Apparatus for running large slab gels</td><td>Biorad</td><td></td><td>We have used the Protean II xi cell apparatus from Biorad</td></tr><tr><td>Magnet</td><td>Life Technologies</td><td>12301D</td><td>We use a magnet from One Lambda (Now a Thermo Fisher Scientific brand); and Life is also a subsidiary of Thermo, and thus the magnet listed here should be a suitable replacement</td></tr><tr><td>Razor blades</td><td></td><td></td><td>From standard source</td></tr><tr><td>Filter paper and funnel</td><td></td><td></td><td>From standard source</td></tr><tr><td>Glass casserole dish</td><td></td><td></td><td>From standard source</td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td></td><td></td><td>From standard source</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td></td><td></td><td>From standard source</td></tr><tr><td>Clear sheet protectors</td><td></td><td></td><td>From standard source</td></tr><tr><td>Scanner and associated TWAIN software</td><td></td><td></td><td>From standard source</td></tr><tr><td>Image analysis software</td><td></td><td></td><td>Such as Fuji Multiguage, or equivalent</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td></td><td></td><td>Or equivalent&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

a g-quadruplex dna-affinity approach for purification of enzymatically active g4 resolvase1

Yüksek mertebeden DNA&#39;nın yapısı hem DNA ve RNA guanin zengini bölgelerde oluşabilir G-quadruplexes (G4s, G4 yapılar) olarak adlandırılan ve son derece termal stabildir. Orada, insan genomunda&gt; 375.000 putatif G4-oluşturucu dizileri vardır ve bunlar promoter bölümleri, çevrilmemiş bölgeleri (UTRs) &#39;de zenginleştirilmiştir ve telomerik tekrarlama olan. Nedeniyle bu yapıları replikasyon ve transkripsiyon gibi hücresel süreçleri etkileyecek potansiyeli, hücre onları yönetmek için enzimler gelişti. Böyle bir enzim, biyokimyasal ve laboratuar Nagamine ve arkadaşları tarafından ortaklaşa karakterize G4 resolvaz 1 (G4R1) &#39;dir. ve son derece sıkı bir şekilde (düşük uM aralığında Kd) her iki G4 DNA ve G4-RNA bağlanma bulundu. G4R1 HeLa hücre lizatlarında G4 çözme aktivitesinin çoğunun nedeni bu yana telomer metabolizması, lenf geliştirme, gen transkripsiyonu, hematopoiezin ve bağışıklık takibinde rol oynadığı işaret edilmiştir. ef becerisificiently ifade ve katalitik olarak aktif G4R1 G4 yapıları ve G4-çözme enzimlerin kinetik etkileşim içine daha fazla anlamada ilgilenen laboratuarlar için önem taşımaktadır arındırmak. Burada, rekombinant G4R1 (rG4R1) saflaştırılması için ayrıntılı bir yöntemi açıklanmaktadır. anlatılan prosedür, bir C-terminali histidin etiketli enzim geleneksel afinite bazlı saflaştırma bağlanan ve bir ATP son derece aktif enzim saflaştırmak için G4 DNA gevşemeye rG4R1 yeteneğinin kullanımı ile insan kodon optimize bakterilerde ifade kapsar bağımlı elüsyon adımı. protokol, rG4R1 enzimatik aktivitesi G4 DNA gevşemeye saflaştınlmış enzim yeteneği incelenerek ölçüldüğü bir kalite kontrol adımı içerir. Bir yöntem olup saflaştırılmış rG4R1 ölçümü sağlar tanımlanmaktadır. Bu protokolün alternatif uyarlamaları tartışılır.

Bu protokol, (Şekil 1) düzenli olarak hemen hemen saf, katalitik olarak aktif rG4R1 verir. RG4R1 0.013 uL aralığında (Şekil yukarıda belirtilen G4 aktivitesi deneyi ile analiz edilmiş olarak, - TAMRA etiketli tetramolecular G4-DNA, 0.2 pmol 50% 0.2 olan monomerlere dönüştürülür enzim etkinliğinin bir ölçüsü olarak, tipik olarak görülmektedir 2). Saflaştırılmış rG4R1 Coomassie boyama G4 DNA boncukları bağlamak ve bir ATP-bağımlı elüte kabiliyetini muhafaza ettiği rG4R1 kesilebilir temsil edebilir 75 kDa, bir küçük kirletici bant, beklenen 120 kDa boyutunda bir tek bandı göstermektedir şekilde (Şekil 3). ilgi grubu, bir protein, standart bir eğriye karşı ölçülür ve bu protokol, tipik olarak bakteri kültürü 20-100 nM saflaştırılmış enzim, 1 &#39;e göre L 200 uL alır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55496/55496fig1.jpg" /> Şekil 1: G4R1 bir iki-aşamalı saflaştırma şematik. Bir 6xHis-etiketli rG4R1 toplu saflaştınldı ilk bağlanabilen ve Co + 2 boncuk ile konjüge edilmiş gelen elüsyon E. coli lizatları. G4-DNA-konjuge manyetik boncuk bağlayıcı bir adım izler. Son olarak, bir ATP-bağımlı elüsyon aşaması, nispeten saf ve enzimatik olarak aktif rG4R1 elde etmek için gereklidir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55496/55496fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55496/55496fig2.jpg" /> Şekil 2: Kalite kontrol G4-DNA Çözücü Deneyi. Şerit 1-6: TAMRA etiketli tetramolecular G4 DNA sabit bir konsantrasyonu 3.9 uL, 0.83 uL, 0.2 uL, 0.05 uL, 0.013 uL temsil saflaştınlmış rG4R1 4x seri seyreltiler varlığında 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edildi ve 0<html> sırasıyla, .003 mL,. Şerit 7: rG4R1 yokluğunda tetramolecular G4-DNA. Şerit 8: rG4R1 yokluğunda monomerlere G4 yapısı azaltmak için kaynatılmış tetramolecular G4-DNA. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55496/55496fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/55496/55496fig3.jpg" /> Şekil 3: Arıtılmış rG4R1 Konsantrasyon miktarının belirlenmesi. 6, sırası ile, ve protein konsantrasyonları, bir standart eğri oluşturmak için kullanılmıştır - kuşak 1 500, 250, 125, 62.5, 31.3 ve 15.7 ng: geniş aralıklı MW proteini markeri, aşağıdaki miktarlarda yüklendi. Şerit 7 rG4R1 35 uL temsil eder. Bu özel jeli 62 ± 22 nm, standart sapma, ortalama protein konsantrasyonu ile sonuçlanan, jeller bir üç kopya kümesinin bir parçası olarak, nicelleştirilmiştir (SD n = 9)..com / files / ftp_upload / 55496 / 55496fig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Watch this Scientific Journal Video about A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1 at JoVE.com

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

G4 Resolvase1 G4-bağlama proteini için dar bildirilen afinite ile G-dörtlüsü (G4) yapılara bağlanan ve HeLa hücreleri G4-DNA ayırma aktivitesinin çoğunluğunu temsil eder. Biz özellikle, katalitik olarak aktif yeniden birleştirici G4R1 saflaştırmak için afinite ve G4 Resolvase1 ATP&#39;ye bağımlı açma aktivitesi koşum yeni bir protokol açıklar.

Enzimatik olarak aktif G4 Resolvase1 saflaştırılması için bir G-dörtlüsü DNA eğilim yaklaşım

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

a-g-quadruplex-dna-affinity-approach-for-purification-enzymatically

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

9.6K Görüntüleme.  Wake Forest School of Medicine.  G4 Resolvase1 G4-bağlama proteini için dar bildirilen afinite ile G-dörtlüsü (G4) yapılara bağlanan ve HeLa hücreleri G4-DNA ayırma aktivitesinin çoğunluğunu temsil eder. Biz özellikle, katalitik olarak aktif yeniden birleştirici G4R1 saflaştırmak için afinite ve G4 Resolvase1 ATP'ye bağımlı açma aktivitesi koşum yeni bir protokol açıklar. 

Video: A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique applications for OMV where traditional nanoparticles are proving too difficult to synthesize. To date, all Gram-negative bacteria have been shown to produce OMV demonstrating packaging of a variety of cargo that includes small molecules, peptides, proteins and genetic material. Based on their diverse cargo, OMV are implicated in many biological processes ranging from cell-cell communication to gene transfer and delivery of virulence factors depending upon which bacteria are producing the OMV. Only recently have bacterial OMV become accessible for use across a wide range of applications through the development of techniques to control and direct packaging of recombinant proteins into OMV. This protocol describes a method for the production, purification, and use of enzyme packaged OMV providing for improved overall production of recombinant enzyme, increased vesiculation, and enhanced enzyme stability. Successful utilization of this protocol will result in the creation of a bacterial strain that simultaneously produces a recombinant protein and directs it for OMV encapsulation through creating a synthetic linkage between the recombinant protein and an outer membrane anchor protein. This protocol also details methods for isolating OMV from bacterial cultures as well as proper handling techniques and things to consider when adapting this protocol for use for other unique applications such as: pharmaceutical drug delivery, medical diagnostics, and environmental remediation.

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented.

Outer zar vezikülleri içinde Yönetmen Protein Paketleme<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Tasarım, Üretim ve Arıtma

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Biyokimya

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 replisome is one of the simplest replication systems known, composed of only four proteins, which is an attractive feature for biochemical experiments. Special emphasis is placed on the synthesis of ribonucleotide primers by the T7 primase-helicase, which are used by DNA polymerase to initiate DNA synthesis. Because the mechanisms of DNA replication are conserved across evolution, these protocols should be applicable, or useful as a conceptual springboard, to investigators using other model systems. The protocols described here are highly sensitive and an experienced investigator can perform these experiments and obtain data for analysis in about a day. The only specialized piece of equipment required is a rapid-quench flow instrument, but this piece of equipment is relatively common and available from various commercial sources. The major drawbacks of these assays, however, include the use of radioactivity and the relative low throughput.

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

We describe sensitive, gel-based discontinuous assays to examine the kinetics of lagging-strand initiation using the replication proteins of bacteriophage T7.

Kaplama DNA sentezinin kinetiği<em&gt; İn Vitro</em&gt; Bakteriyofaj T7 çoğaltma Proteinler tarafından

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 ...

Genetik

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some S100 proteins have the capacity to bind transition metals with high affinity and effectively sequester them away from invading microbial pathogens in a process that is termed "nutritional immunity". S100A12 (EN-RAGE) binds both zinc and copper and is highly abundant in innate immune cells such as macrophages and neutrophils. We report a refined method for the expression, enrichment and purification of S100A12 in its active, metal-binding configuration. Utilization of this protein in bacterial growth and viability analyses reveals that S100A12 has antimicrobial activity against the bacterial pathogen, Helicobacter pylori. The antimicrobial activity is predicated on the zinc-binding activity of S100A12, which chelates nutrient zinc, thereby starving H. pylori which requires zinc for growth and proliferation.

Here, we present a method to express and purify S100A12 (calgranulin C). We describe a protocol to measure its antimicrobial activity against the human pathogen H. pylori.

S100A12&#39;nin Ekspresyon, Saflaştırma ve Antimikrobiyal Aktivitesi

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the abundances of key metabolites to which regulatory factors respond, adjusting cellular metabolism. In recent years, a number of proteins and RNA have emerged as important regulators of virulence gene expression. For example, the CodY protein responds to levels of branched-chain amino acids and GTP and is widely conserved in low G+C Gram-positive bacteria. As a global regulator in Staphylococcus aureus, CodY controls the expression of dozens of virulence and metabolic genes. We hypothesize that S. aureus uses CodY, in part, to alter its metabolic state in an effort to adapt to nutrient-limiting conditions potentially encountered in the host environment. This manuscript describes a method for extracting and analyzing metabolites from S. aureus using liquid chromatography coupled with mass spectrometry, a protocol that was developed to test this hypothesis. The method also highlights best practices that will ensure rigor and reproducibility, such as maintaining biological steady state and constant aeration without the use of continuous chemostat cultures. Relative to the USA200 methicillin-susceptible S. aureus isolate UAMS-1 parental strain, the isogenic codY mutant exhibited significant increases in amino acids derived from aspartate (e.g., threonine and isoleucine) and decreases in their precursors (e.g., aspartate and O-acetylhomoserine). These findings correlate well with transcriptional data obtained with RNA-seq analysis: genes in these pathways were up-regulated between 10- and 800-fold in the codY null mutant. Coupling global analyses of the transcriptome and the metabolome can reveal how bacteria alter their metabolism when faced with environmental or nutritional stress, providing potential insight into the physiological changes associated with nutrient depletion experienced during infection. Such discoveries may pave the way for the development of novel anti-infectives and therapeutics.

Here we describe a protocol for the extraction of metabolites from Staphylococcus aureus and their subsequent analysis via liquid chromatography and mass spectrometry.

metabolit analizi için bir Tandem Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi tabanlı yaklaşım<em&gt; Stafilokok aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA processing, and telomere elongation. During these processes, various proteins bind and resolve G4 structures to perform their function. As the function of G4 often depends on the stability of its folded structure, it is important to investigate how G4 binding proteins regulate the stability of G4. This work presents a method to manipulate single G4 molecules using magnetic tweezers, which enables studies of the regulation of G4 binding proteins on a single G4 molecule in real time. In general, this method is suitable for a wide scope of applications in studies for proteins/ligands interactions and regulations on various DNA or RNA secondary structures.

A single-molecule magnetic tweezers platform to manipulate G-quadruplexes is reported, which allows for the study of G4 stability and regulation by various proteins.

G-quadruplexes manyetik cımbız tarafından manipülasyon tek molekül

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Kimyasal Haritalama Kullanarak Bir DNA Şablonundaki G-Dörtlülerini Tanımlama

In Vitro Chemical Mapping of G-Quadruplex DNA Structures by Bis-3-Chloropiperidines

G-quadruplexes (G4s) are biologically relevant, non-canonical DNA structures that play an important role in gene expression and diseases, representing significant therapeutic targets. Accessible methods are required for the in vitro characterization of DNA within potential G-quadruplex-forming sequences (PQSs). B-CePs are a class of alkylating agents that have proven to be useful chemical probes for investigation of the higher-order structure of nucleic acids. This paper describes a new chemical mapping assay exploiting the specific reactivity of B-CePs with the N7 of guanines, followed by direct strand cleavage at the alkylated Gs. 
Namely, to distinguish G4 folds from unfolded DNA forms, we use B-CeP 1 to probe the thrombin-binding aptamer (TBA), a 15-mer DNA able to assume the G4 arrangement. Reaction of B-CeP-responding guanines with B-CeP 1 yields products that can be resolved by high-resolution polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) at a single-nucleotide level by locating individual alkylation adducts and DNA strand cleavage at the alkylated guanines. Mapping using B-CePs is a simple and powerful tool for the in vitro characterization of G-quadruplex-forming DNA sequences, enabling the precise location of guanines involved in the formation of G-tetrads.

Yazar Spot Işığı: Bis-3-Kloropiperidin Bazlı Kimyasal Haritalama ile DNA G-Quadruplex'in Karakterize Edilmesi 

Bis-3-chloropiperidines (B-CePs) are useful chemical probes to identify and characterize G-quadruplex structures in DNA templates in vitro. This protocol details the procedure to perform probing reactions with B-CePs and to resolve reaction products by high-resolution polyacrylamide gel electrophoresis.

In Vitro G-Quadruplex DNA Yapılarının Bis-3-Kloropiperidinler ile Kimyasal Haritalanması

G-quadruplexes (G4s) are biologically relevant, non-canonical DNA structures that play an important role in gene expression and diseases, representing ...

<meta charset="utf8"></head><body>ssDNA-RPA Yolu Büyümesi ile Gözlenen CMG Aracılı DNA Çözülmesi

Single-Molecule Real-Time Visualization of DNA Unwinding by CMG Helicase

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a dynamic complex of proteins termed the replisome. At the heart of the replisome is the&#160;CDC45-MCM2-7-GINS (CMG) helicase, which separates the two strands of the DNA double helix such that DNA polymerases can copy each strand. During genome duplication, replisomes must overcome a plethora of obstacles and challenges. Each of these threatens genome stability, as failure to replicate DNA completely and accurately can lead to mutations, diseases, or cell death. Therefore, it is of great interest to understand how CMG functions in the replisome during both normal replication and replication stress. Here, we describe a total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy assay using recombinant purified proteins, which allows for real-time visualization of surface-tethered stretched DNA molecules by individual CMG complexes. This assay provides a powerful platform to investigate CMG behavior at the single-molecule level, allowing helicase dynamics to be directly observed with real-time control over reaction conditions.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: Tek Moleküllü Görselleştirme Yoluyla Ökaryotik DNA Replikasyonunun Dinamiklerini Çözme

This protocol demonstrates performing a single-molecule assay for live visualization of DNA unwinding by CMG helicase. It describes (1) preparing a DNA substrate, (2) purifying fluorescently labeled Drosophila melanogaster CMG helicase, (3) preparing a microfluidic flow cell for total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy, and (4) the single-molecule DNA unwinding assay.

CMG Helikaz ile DNA Çözmenin Tek Moleküllü Gerçek Zamanlı Görselleştirilmesi

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a ...

Enzimatik olarak aktif G4 Resolvase1 saflaştırılması için bir G-dörtlüsü DNA eğilim yaklaşım

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Outer zar vezikülleri içinde Yönetmen Protein Paketleme

Kaplama DNA sentezinin kinetiği

S100A12'nin Ekspresyon, Saflaştırma ve Antimikrobiyal Aktivitesi

metabolit analizi için bir Tandem Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi tabanlı yaklaşım

G-quadruplexes manyetik cımbız tarafından manipülasyon tek molekül

In Vitro G-Quadruplex DNA Yapılarının Bis-3-Kloropiperidinler ile Kimyasal Haritalanması

In Vitro G-Quadruplex DNA Yapılarının Bis-3-Kloropiperidinler ile Kimyasal Haritalanması

In Vitro G-Quadruplex DNA Yapılarının Bis-3-Kloropiperidinler ile Kimyasal Haritalanması

CMG Helikaz ile DNA Çözmenin Tek Moleküllü Gerçek Zamanlı Görselleştirilmesi

CMG Helikaz ile DNA Çözmenin Tek Moleküllü Gerçek Zamanlı Görselleştirilmesi