Yazarlar Meng Pan el yazması proofreading için teşekkür ederiz. Bu eser tarafından Singapur Bakanlığı, eğitim akademik araştırma fonu Tier 3 (MOE2012-T3-1-001) J.Y. için desteklenir; J.Y. Mechanobiology Enstitüsü Singapur'a aracılığıyla Ulusal Araştırma Vakfı; Ulusal Araştırma Vakfı, Başbakan'ın Office, Singapur, onun NMG Investigatorship programı (NMK Investigatorship Ödülü No altında NATO Mukabele Gücü-NRFI2016-03 J.Y. için; Temel Araştırma Fonu (2017KFYXJJ153) Merkez üniversitelere H. Y için.

1. hazırlık G4 DNA tek molekül Stretching için <ol><li>hazırla 5 &#39;-etiketli thiol ve 5 &#39;-dsDNA kolları tarafından PCR DDNA polimeraz 5 kullanarak lambda fajının DNA şablonunda kullanarak etiketli biotin &#39;-thiol ve 5 &#39;-biotin astar 14 ( şekil 1). Her iki dsDNA kolları yüksek GC içeriğe sahip (&#62; % 60'ı) DNA önlemek için erime DNA yüksek güçler veya DNA esneme sırasında tutulduğu zaman geçiş 15.</li>
	<li>Arındırmak PCR ürünleri üretici göre BstXI restriksiyon enzimi ile ticari arıtma kit ve Özet kullanarak &#39; s protokolü.</li>
	<li>Ligate G4 şekillendirme ssDNA ve yan ssDNA ve dsDNA tutamaçları T4 DNA ligaz üreticiye göre kullanarak &#39; s protokolü. Üreticiye göre ticari arıtma seti kullanarak jel çıkarma tarafından ve birleştirilmiş ürün arındırmak &#39; s protokolü.</li>
</ol> 2. Akış kanal hazırlanması <ol><li>Coverslip temizlik ve yüzey functionalization <ol><li>yer Cam Kavanoz (her kavanoz tutabilir coverslips, 7 adet boyama alt coverslips (#1.5, 22 mm × 32 mm) ve en iyi coverslips (#1.5, 20 x 20 mm) birim ~ 20 mL). Coverslips 2 - 5 kez kavanoz distile su ile durulama.</li>
		<li>Ekle ~ 20 mL % 5-40 deterjan solüsyonu her kavanoz ve bir ultrasonik Temizleme banyo 30 dk. sonra yerde durulama için distile su ile &#62; deterjan kaldırmak için 10 kez.</li>
		<li>Kuru kavanozlara fırında coverslips (~ 150 ° C; Dikkat, sıcak), veya N 2 gaz tarafından. Kurutulmuş en iyi coverslips kuru bir dolapta saklamak.</li>
		<li>Coverslips 10 dk için kavanoza temizlemek için kullanım plazma (O 2 gaz). 10 dk 20 mL metanol içinde %1 (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) çözeltisi hazırlamak (dikkat, toksik/yanıcı). APTES metanol içinde çözülmeye kimyasal duman başlığı kullan. 
		Not: APTES çözüm saklarken nem kaçının. Eski APTES kez neden olan sorun yüzey coverslips functionalizing içinde.</li>
		<li>Sonra hemen plazma temizlik, tüm % 1 APTES çözüm kavanoz eklemek ve 1 h. dökmek için % 1 APTES metanol için belirli atık şişe içine atık kuluçkaya. Yanıcı kimyasallar için duman başlıklı metanol ile ilgili adımları gerçekleştirin.</li>
		<li>Kavanoz metanol ile durulayın ve &#62; 10 kat ile distile su ve sonra kuru tarafından fırın (~ 150 ° C; Dikkat, sıcak). Kuru bir kabine değilse kullanım için ilâ iki hafta APTES kaplı alt coverslips mağaza. 
		Not: her alt adımından sonra 2.1.1 2.1.4 için temizleme işlemi Sonraki adımdan önce duraklatılmış.</li>
	</ol></li> <li>Araya akışı kanal <ol><li>iki hazırlamak &#34; çubukları &#34;, Yani, parafilm ya da çift taraflı bant (~ 4 mm × 20 mm) her kanal için. Bir alt coverslip uzun kenarı boyunca uzanan çubukları iki adet yerleştirin. En iyi coverslip arasında bir akış hücre şekillendirme spacer üzerinde yer (~ 10 mm × 20 mm alan, şekil 2A , B).</li>
		Parafilm bir yer açıcı kullanılır, <li>akışı kanal bir ısıtıcı (60-120 ° C; koyun. Dikkat, sıcak) iki coverslips birbirine parafilm tarafından destek için en iyi coverslip kenarlarına hafifçe basarken 5-10 s. Elde edilen akışı kanal yüksekliği vardır ~ 100 µm, ve böylece kanal birimdir ~ 20 µL.</li>
		<li>Kaçağı önlemek için silikon yapıştırıcı ile kanal uzun kenarını kapatın. Bir giriş ve bir çıkış çözüm hizmet akışı kanal açık her kenarında küçük bir lavabo gibi yapı yapmak için silikon yapıştırıcı kullanın. 
		Not: Giriş ve çıkış da diğer yolları tarafından örneğin, tarafından yapışan küçük plastik halkalar balmumu kullanarak yapılabilir.</li>
		<li>4 hafta kadar kuru bir dolapta saklamak kanalları.</li>
	</ol></li> <li>Urgan DNA akışı Kanal alt yüzeyinin <ol><li>amino-kaplı polistren boncuk seyreltik (çapı: 3 µm) 200 X distile 1 X tarafından serum fizyolojik (PBS) arabellek fosfat tamponlu. Girdap boncuk çözüm ve sonra akış kanalları içine. Kanallar için boncuk çözümde kuluçkaya ~ 30 dk. kaldırmak herhangi bir ipin ucundaki boncuk 1 X PBS arabellek 200 µL ile yıkayarak.</li>
		<li>Ayarla (artış/50 x 50 mm alan başına 1-5 boncuk yüzey yoğunluğu elde etmek için kuluçka süresi azaltma). Başvuru boncuk ile 3 gün için yatırılır kanalları saklar.</li>
		<li>Dilute sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) Siklokekzan-1-karboksilat (Sulfo-SMCC) toz haline 1 X PBS çözüm (~ 0,5 mg/mL). Girdap çözüm ve sonra kanal akışına. 
		Not: kullanmadan önce taze Sulfo SMCC çözüm hazırlamak ve hemen SMCC hydrolyzation önlemek için kanala ekle.</li>
		<li>Incubate 30 dakika süreyle kanaldaki SMCC çözüm SMCC çözüm büyük bir miktar ile yıkayarak kaldırmak (1 mL, ~ 50 kanal birim X) 1 X PBS çözüm. 
		Not: aşırı SMCC dikkatli yıkayın. DNA bağlama üzerinde coverslip için çok önemli bir adımdır.</li>
		<li><ol><li>DNA hayvan zinciri seyreltik bir elde edilen DNA konsantrasyon ile 1 X PBS içine DNA etiketli thiol biotin ~ 0,3 nM. Yavaşça çözüm mix, DNA çözüm SMCC kaplı kanal içine akışı ve oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya pipet (~ 23 ° C).</li>
		</ol></li> <li>Yavaşça ücretsiz DNA ile 10 mg/mL sığır serum albumin (BSA) ve %0.01 2-Mercaptoethanol ile 1 X PBS içeren çözüm engelleme 200 µL silsin.</li>
		<li>Blok kanal yüzey çözüm (10 mg/mL BSA, %0.01 2-Mercaptoethanol) kapatmaktır kanal kuluçka için &#62; 2 s; Bu adım sonra kanal deneyler için hazır. Hazır kanal-ebilmek saklanmak için 4 ° c ~ 1 gün. 
		Not: Engelleme non-spesifik bağlama DNA ve coverslips için manyetik boncuklar azaltmak için önemli bir adımdır.</li>
	</ol></li></ol> 3. Manyetik cımbız kurulum ve tek kimlik dsDNA urgan <ol><li>manyetik cımbız kurulum <ol><li>Başlangıç manyetik cımbız kontrol programı. Burada, manyetik cımbız bir all-in house yazılı LabVIEW program tarafından kontrol.</li>
		<li>Kanal montaj önce mıknatıs merkezleri hizalayın. X - ve y - ekseni mikroskop optik eksenindeki mıknatıslar ayarlamak için bir 4 X objektif lens kullanın.</li>
		<li>Z-yön ( şekil 2A) boyunca mıknatıslar hareket ve mesafe d ayarlamak için bir bilgisayar kontrollü motorlu manipülatör kullanın = 0 (d: mıknatıslar ve coverslip arasındaki mesafe) ne zaman mıknatıslar eklemek için mikroskop üzerinde bir coverslip.</li>
		<li>Program aracılığıyla kontrol gücünün sabit kuvvet (Yani, sabit d) dahil olmak üzere elde etmek için manipülatör mıknatıslar hareket ve zaman değişen kuvvet F (t) (Yani, zaman değişen d(t )).</li>
		<li>Parlak boncuk amacı ile geri dağınık aydınlatma için bir ışık yayan diyot (LED) ışık kaynağı kullanın. 100 Hz örnekleme hızında boncuk görüntüleri şarj kuplajlı cihaz (CCD) kamera. tarafından toplamak < / lBen ></ol></li> <li>tek dsDNA urgan tanımlamak ve kurulum örnek <ol><li>urgan oluşumu <ol><li>yavaşça 200 X akışında M-280, paramagnetic boncuk tahlil çözüm (100 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 10 mM Tris-pH 7.4 içinde seyreltilmiş ) bir kanal içine. Biotin etiketli DNA molekülleri thiol etiketli sonuna SMCC kaplı yüzeyinde immobilize bağlamak boncuk izin vermek 10 min için kuluçkaya. Hafifçe un gergin boncuk 200 µL standart reaksiyon çözüm kullanarak silsin. 
			Not: M-280 boncuk alt non-spesifik bağlama diğer ticari manyetik boncuklar gibi M-270 göre yüzeye göster.</li>
		</ol></li> <li>Kanal mikroskop Sahne Alanı'na bağlayın. Arama 100 X yağı daldırma amacı istimal alt yüzeyinde boncuk için.</li>
		<li>Bir başvuru boncuk yüzeyi ve hareketli bir hayvan zinciri boncuk seçin. Başvuru boncuk ve farklı odak uçaklar, hayvan zinciri boncuk ilk görüntü kütüphaneler derlenir.</li>
		<li>Boncuk görüntü kalibrasyonu <ol><li>deneyler, daha önce başvuru ve iki ayrı boncuk görüntüsü olarak saklanan 20-50 nm tarafından aralıklı farklı odak uçaklar, hayvan zinciri boncuk görüntüleri elde etmek için bir objektif piezo aktüatör kullanın kütüphaneler ve are sırasıyla odak uzaklığı ( şekil 2B) ile dizine.</li>
		</ol></li> <li>x, y, z konumunu belirleme <ol><li>deneyler sırasında x-y uçak boncuk konumunu tarafından boncuk centroid belirlemek. Hayvan zinciri boncuk yükseklik değişikliği bu kitaplıkta depolanan geçerli boncuk görüntü karşılaştırarak belirle. Fourier dönüşümü boncuk görüntüleri 16 güç spektrumu auto-korelasyon işlevi analizini kullanın.</li>
		</ol></li> <li>Anti-drift geribildirim başvuru boncuk kullanarak <ol><li>deneyler sırasında kullanmak için piezo &#34; kilit &#34; amaç ve düşük frekans üzerinden kitaplığında depolanan belirli boncuk resmin arasındaki mesafe geribildirim kontrol, böylece sıkışmış boncuk görüntü ( 2D rakam) kitaplığında depolanan belirli bir görüntü ile en iyi korelasyon vardır.</li>
		</ol></li> <li>Uygulayarak urgan bir tek dsDNA molekül olup olmadığını belirlemek ~ 65 pN kuvvet belirlemek bir tek dsDNA molekül urgan geçiş 17 , esneme karakteristik DNA geçer 18 , 19. bir tek dsDNA urgan bulunana kadar bu işlemi yineleyin. (Lütfen güç kalibrasyon ve geçiş esneme DNA için sonraki bölüme bakın).</li>
	</ol></li></ol> 4. Manyetik cımbız kalibrasyon zorla <ol><li>doğrudan boncuk dalgalanma ile kullanarak uzun DNA (48,502 bp λ-DNA) molekülleri için kuvvet (ilâ 100 pN) belirler: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56328/56328eq1.jpg" /> , Boltzmann sabiti k B nerede T sıcaklığı Kelvin ölçekte, δ 2 y boncuk dalgalanma manyetik alan ve kuvvet dik yönde varyansını yön. Bu yönde hareket boncuk l + nerede l uçtan uca mesafe boyunca DNA kuvvet yönünü (uzantısı) ve r 0 r 0, uzunluğu ile bir sarkaç dalgalanması olarak tanımlanabilir boncuk 10 ( şekil 3A) RADIUS.</li>
	<li>Karar vermek için kuvvet F boncuk mesafe mıknatıslar bir fonksiyonu olarak kalibrasyon eğrisi d ve F (d) için farklı boncuk uzun λ-DNA kullanarak. Genellikle, DNA urgan uzunluğu göz ardı edilemez mıknatıs ve coverslip arasındaki mesafe kullanılır. Uygun F-d eğri çift-üstel çürüme işlevi tarafından: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56328/56328eq2.jpg" /> , nerede uygun parametreleri α1, α2, γ1, γ2 göre belirlenir Manyetik cımbız ve parametre C manyetik boncuklar türdeş olmayan özelliği tarafından belirlenir. C, F değişen tarafından-d eğri farklı boncuk elde-ebilmek var olmak örtüşen 10 ( şekil 3B).</li>
	<li>Kısa DNA için parametre C bireysel manyetik boncuklar için kalibrasyon deneyler.
	<ol><li>Üzerinde dalgalanma temel kuvvet belirleme gerektirir köşe sıklığı yüksek bir frekansta boncuk pozisyon kayıt: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56328/56328eq3.jpg" /> , γ sürükle nerede boncuk katsayısı. Yüksek güç kısa DNA, 100 Hz daha hızlı kayıt frekans gerektirir, bu nedenle, kuvvet doğrudan fotoğraf makinesi ile dalgalanma üzerinde göre ölçülen olamaz. Ancak, C belirlenen bir düşük güç ölçerek parametre zorla aralığı (&#60; 15 pN) dalgalanma kullanarak ve kalibre edilmiş F verilerle montaj-parametre C 20 elde etmek için d eğri.</li>
		<li>Alternatif olarak, dsDNA ile deneyler için belirlemek parametre C geçiş bir kuvvet, esneme DNA'yı kullanarak ~ 65 pN ( şekil 3 c) 21 , 22 , hangi dsDNA gösterdi uzantısı atlama (kontur uzunluğu uzunluğu artış X 0,6) d konumunda kaydederek, 23. C parametresi belirledikten sonra gergin boncuk için güç hesaplamak.</li>
	</ol></li> <li>Yükleme hızı ters fonksiyon F (d) aracılığıyla mıknatıslar hareket programlama tarafından kontrol. Mıknatıs örnek Çift Kişilik katlanarak erişmeniz gerekir. 
	Not: Böyle bir ekstrapolasyon yöntemi tarafından belirlenen kuvvet göreli hatadır ~ % 10 ve esas olarak boncuk RADIUS heterojenite 20 tarafından neden olur.</li>
</ol> 5. Tek molekül manipülasyon G4 varlığı ve yokluğu bağlayıcı proteinler <ol><li>0.2 pN/s ve ardından yükleme hızında bir kuvvet-artış tarama gerçekleştirmek dsDNA urgan tanımlayan sonra kuvvet rampa deneyler <ol><li>bir -0.2 kuvvet-vefat tarama pN/s. Germe her döngüsü sonra DNA molekülünün 30 1 pN tutmak için G4 refold ssDNA izin vermek için s.</li>
	</ol></li> <li>Kuvvet-atlama deneyler <ol><li>30 54 pN arasında güç döngüsü s altında bir katlanmış G4 gelişeceğini olabilir ve 60s, altında bir katlanmış G4-15T refold için 1 pN.</li>
	</ol></li> <li>Flowing protein çözüm <ol><li>protein çözüm akış yönü ne zaman ~ 20 pN kuvvet coverslip boncuk eki önlemek için. G4 yapısı yüksek özgüllük gösterdi, DEAH-box RHAU helikaz kullanılan 24 oldu. Rekombinant Drosophila melanogaster RHAU (DmRHAU) helikaz Escherichia coli ifade edilen ve daha önce 25 açıklandığı gibi saf. DmRHAU besleyicisini etkinliği bir tetramolecular G4 DNA substrat 13 denetlesinler G4.</li>
	</ol></li> <li>Bir in-house kullanarak unfolding kuvvet Matlab programı 14 yazılı analiz.</li></ol>

<ol>
	<li>Rhodes, D., Lipps, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-quadruplexes+and+their+regulatory+roles+in+biology.">G-quadruplexes and their regulatory roles in biology.</a> Nucleic Acids Res. 43 (18), 8627-8637 (2015).</li><li>Brazda, V., Haronikova, L., Liao, J. C., Fojta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+and+RNA+quadruplex-binding+proteins.">DNA and RNA quadruplex-binding proteins.</a> Int J Mol Sci. 15 (10), 17493-17517 (2014).</li><li>Gonzalez, V., Hurley, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C-terminus+of+nucleolin+promotes+the+formation+of+the+c-MYC+G-quadruplex+and+inhibits+c-MYC+promoter+activity.">The C-terminus of nucleolin promotes the formation of the c-MYC G-quadruplex and inhibits c-MYC promoter activity.</a> Biochemistry. 49 (45), 9706-9714 (2010).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=telomerase-interacting+protein+that+unfolds+telomere+G-quadruplex+and+promotes+telomere+extension+in+mammalian+cells.">telomerase-interacting protein that unfolds telomere G-quadruplex and promotes telomere extension in mammalian cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (50), 20413-20418 (2012).</li><li>Mendoza, O., Bourdoncle, A., Boule, J. B., Brosh, R. M., Mergny, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-quadruplexes+and+helicases.">G-quadruplexes and helicases.</a> Nucleic Acids Res. 44 (5), 1989-2006 (2016).</li><li>Schiavone, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PrimPol+Is+Required+for+Replicative+Tolerance+of+G+Quadruplexes+in+Vertebrate+Cells.">PrimPol Is Required for Replicative Tolerance of G Quadruplexes in Vertebrate Cells.</a> Mol Cell. 61 (1), 161-169 (2016).</li><li>Lane, A. N., Chaires, J. B., Gray, R. D., Trent, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+and+kinetics+of+G-quadruplex+structures.">Stability and kinetics of G-quadruplex structures.</a> Nucleic Acids Res. 36 (17), 5482-5515 (2008).</li><li>Woodside, M. T., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstructing+folding+energy+landscapes+by+single-molecule+force+spectroscopy.">Reconstructing folding energy landscapes by single-molecule force spectroscopy.</a> Annu Rev Biophys. 43, 19-39 (2014).</li><li>Neuman, K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+force+spectroscopy:+optical+tweezers,+magnetic+tweezers+and+atomic+force+microscopy.">Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.</a> Nat Methods. 5 (6), 491-505 (2008).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+high-force+magnetic+tweezers+for+stretching+and+refolding+of+proteins+and+short+DNA.">Improved high-force magnetic tweezers for stretching and refolding of proteins and short DNA.</a> Biophys J. 100 (2), 517-523 (2011).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+equilibrium+folding+and+unfolding+transitions+of+titin+immunoglobulin+domain+under+constant+forces.">Dynamics of equilibrium folding and unfolding transitions of titin immunoglobulin domain under constant forces.</a> J Am Chem Soc. 137 (10), 3540-3546 (2015).</li><li>You, H., Wu, J., Shao, F., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+and+kinetics+of+c-MYC+promoter+G-quadruplexes+studied+by+single-molecule+manipulation.">Stability and kinetics of c-MYC promoter G-quadruplexes studied by single-molecule manipulation.</a> J Am Chem Soc. 137 (7), 2424-2427 (2015).</li><li>You, H., Lattmann, S., Rhodes, D., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RHAU+helicase+stabilizes+G4+in+its+nucleotide-free+state+and+destabilizes+G4+upon+ATP+hydrolysis.">RHAU helicase stabilizes G4 in its nucleotide-free state and destabilizes G4 upon ATP hydrolysis.</a> Nucleic Acids Res. 45 (1), 206-214 (2017).</li><li>You, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+stability+of+polymorphic+human+telomeric+G-quadruplex+under+tension.">Dynamics and stability of polymorphic human telomeric G-quadruplex under tension.</a> Nucleic Acids Res. 42 (13), 8789-8795 (2014).</li><li>Fu, H., Chen, H., Marko, J. F., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+overstretched+DNA+states.">Two distinct overstretched DNA states.</a> Nucleic Acids Res. 38 (16), 5594-5600 (2010).</li><li>Gosse, C., Croquette, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+tweezers:+micromanipulation+and+force+measurement+at+the+molecular+level.">Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level.</a> Biophys. J. 82 (6), 3314-3329 (2002).</li><li>Fu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transition+dynamics+and+selection+of+the+distinct+S-DNA+and+strand+unpeeling+modes+of+double+helix+overstretching.">Transition dynamics and selection of the distinct S-DNA and strand unpeeling modes of double helix overstretching.</a> Nucleic Acids Res. 39 (8), 3473-3481 (2011).</li><li>Zhang, X., Chen, H., Fu, H., Doyle, P. S., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+overstretched+DNA+structures+revealed+by+single-molecule+thermodynamics+measurements.">Two distinct overstretched DNA structures revealed by single-molecule thermodynamics measurements.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8103-8108 (2012).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+the+competition+between+peeled+ssDNA,+melting+bubbles,+and+S-DNA+during+DNA+overstretching+by+single-molecule+calorimetry.">Revealing the competition between peeled ssDNA, melting bubbles, and S-DNA during DNA overstretching by single-molecule calorimetry.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3865-3870 (2013).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+High-Force+Magnetic+Tweezers+for+Stretching+and+Refolding+of+Proteins+and+Short+DNA.">Improved High-Force Magnetic Tweezers for Stretching and Refolding of Proteins and Short DNA.</a> Biophys. J. 100 (2), 517-523 (2011).</li><li>Fu, H. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transition+dynamics+and+selection+of+the+distinct+S-DNA+and+strand+unpeeling+modes+of+double+helix+overstretching.">Transition dynamics and selection of the distinct S-DNA and strand unpeeling modes of double helix overstretching.</a> Nucleic Acids Res. 39 (8), 3473-3481 (2011).</li><li>Zhang, X., Chen, H., Fu, H., Doyle, P. S., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+overstretched+DNA+structures+revealed+by+single-molecule+thermodynamics+measurements.">Two distinct overstretched DNA structures revealed by single-molecule thermodynamics measurements.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (21), 8103-8108 (2012).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+the+competition+between+peeled+ssDNA,+melting+bubbles,+and+S-DNA+during+DNA+overstretching+by+single-molecule+calorimetry.">Revealing the competition between peeled ssDNA, melting bubbles, and S-DNA during DNA overstretching by single-molecule calorimetry.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (10), 3865-3870 (2013).</li><li>Vaughn, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DEXH+protein+product+of+the+DHX36+gene+is+the+major+source+of+tetramolecular+quadruplex+G4-DNA+resolving+activity+in+HeLa+cell+lysates.">The DEXH protein product of the DHX36 gene is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA resolving activity in HeLa cell lysates.</a> J Biol Chem. 280 (46), 38117-38120 (2005).</li><li>Giri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G4+resolvase+1+tightly+binds+and+unwinds+unimolecular+G4-DNA.">G4 resolvase 1 tightly binds and unwinds unimolecular G4-DNA.</a> Nucleic Acids Res. 39 (16), 7161-7178 (2011).</li><li>De Vlaminck, I., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+magnetic+tweezers.">Recent advances in magnetic tweezers.</a> Annu Rev Biophys. 41, 453-472 (2012).</li><li>Yan, J., Skoko, D., Marko, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-field-magnetic-tweezer+manipulation+of+single+DNA+molecules.">Near-field-magnetic-tweezer manipulation of single DNA molecules.</a> Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 70 (1 Pt 1), 011905 (2004).</li><li>Le, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disturbance-free+rapid+solution+exchange+for+magnetic+tweezers+single-molecule+studies.">Disturbance-free rapid solution exchange for magnetic tweezers single-molecule studies.</a> Nucleic Acids Res. 43 (17), e113 (2015).</li><li>Neidle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quadruplex+Nucleic+Acids+as+Novel+Therapeutic+Targets.">Quadruplex Nucleic Acids as Novel Therapeutic Targets.</a> J Med Chem. 59 (13), 5987-6011 (2016).</li><li>Simone, R., Fratta, P., Neidle, S., Parkinson, G. N., Isaacs, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-quadruplexes:+Emerging+roles+in+neurodegenerative+diseases+and+the+non-coding+transcriptome.">G-quadruplexes: Emerging roles in neurodegenerative diseases and the non-coding transcriptome.</a> FEBS Lett. 589 (14), 1653-1668 (2015).</li><li>Balasubramanian, S., Hurley, L. H., Neidle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+G-quadruplexes+in+gene+promoters:+a+novel+anticancer+strategy?.">Targeting G-quadruplexes in gene promoters: a novel anticancer strategy?.</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (4), 261-275 (2011).</li><li>Amato, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+Development+of+Specific+G-Quadruplex+Binders:+Synthesis,+Biophysical,+and+Biological+Studies+of+New+Hydrazone+Derivatives.">Toward the Development of Specific G-Quadruplex Binders: Synthesis, Biophysical, and Biological Studies of New Hydrazone Derivatives.</a> J Med Chem. 59 (12), 5706-5720 (2016).</li><li>Wells, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-B+DNA+conformations,+mutagenesis+and+disease.">Non-B DNA conformations, mutagenesis and disease.</a> Trends Biochem Sci. 32 (6), 271-278 (2007).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Yukarıda, bir platform G4 DNA'ın mekanik sağlamlık ve G4 kullanarak için protein etkileşimleri çalışmak için açıklandığı gibi tek molekül manyetik cımbız bildirilmektedir. Platform refakat, G4 DNA urgan ve ölçüm katlama-unfolding dinamikler ve istikrar nanometre özel çözünürlük ile G4 yapısının bulma yüksek verimli iletişim kuralları geliştirilmiştir. Odak düzlemi kilitleme küçük yapı geçiş G4 gibi algılamak için önemlidir son derece kararlı Anti-drift denetim sağlar (adım ...

4 iplikçikli DNA veya RNA G4 yapıları birçok önemli biyolojik süreçlerin1' kritik rol oynarlar. Çoğu protein G4 bağlama ve yönetmelik, telomer proteinler (Revers, POT1, RPA, TEBPs, TRF2) dahil olmak üzere dahil olan1,2, transkripsiyon faktörleri (nucleolin, PARP1)3, RNA proteinleri (hnRNP A1, işleme hnRNP A2)4, helikazlar (BLM, FANCJ, RHAU, UYR, Dna2, Pif1)5ve DNA ikileşmesi proteinleri (Rif1, Değişiklik1, PrimPolymerase)6ile ilgili. Protein bağlayıcı stabilize veya G4 yapıları istikrarsızlaştırmak; Böylece sonraki Biyolojik işlevleri düzenleyen. G4 kararlılığını ultraviyole (UV) veya dairesel dichroism (CD) yöntemleri7kullanarak erime termal tarafından ölçüldü. Ancak, bu koşullar fizyolojik değildir ilgili ve proteinler7bağlama etkilerini eğitim için uygulamak zordur.
Tek molekül işleme teknolojilerinde hızlı geliştirme çalışmaları katlama ve DNA veya nanometre çözünürlük gerçek zamanlı8ile tek molekül düzeyinde bir protein gibi bir biomolecule, elinde tutmasına sağlamıştır. Atomik Kuvvet Mikroskobu (AFM), optik cımbız ve manyetik cımbız en yaygın olarak kullanılan tek molekül manipülasyon yöntemleri vardır. AFM ve optik cımbız9ile karşılaştırıldığında, manyetik cımbız katlama-unfolding dinamikleri tek bir molekül istikrarlı ölçümleri gün içinde bir anti-drift tekniği10,11kullanarak izin.
Burada, bir tek molekül manipülasyon platform G4 istikrar Yönetmeliği proteinler bağlayarak çalışmaya manyetik cımbız kullanarak bildirilen12,13. Bu eser örnek ve akışı kanal hazırlanması, manyetik cımbız kurulum ve güç kalibrasyon dahil olmak üzere temel yaklaşımlar özetliyor. Kuvvet kontrolü ve anti-drift protokolleri açıklandığı adım 3 olarak uzun zaman ölçümleri sürekli gücü (kuvvet kelepçe) gibi çeşitli güç kontrolleri altında izin verir ve sabit yükleme (kuvvet-rampa) oranı ve kuvvet-ölçüm atlama. 4. adımda açıklanan güç kalibrasyon Protokolü güç kalibrasyonu sağlayan &#60; 1 µm kısa bağları üzerinde geniş bir güç aralığı 100 pN, % 10 içinde göreli bir hata ile. RNA helikaz kararlılığını düzenlenmesi örneği RNA G4 bu platform13uygulamaları göstermek için kullanılan çözümlenmesinde temel rol oynar AU-zengini eleman (RHAU) helikaz (diğer adı DHX36, G4R1) ile ilişkili.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DNA PCR primers</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>DNA preparations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA PCR chemicals</td>
			<td>NEB</td>
			<td></td>
			<td>DNA preparations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>restriction enzyme BstXI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0113S</td>
			<td>DNA preparations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coverslips (#1.5, 22*32 mm, and 20*20 mm)</td>
			<td>BMH.BIOMEDIA</td>
			<td>72204</td>
			<td>flow channel preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decon90</td>
			<td>Decon Laboratories Limited</td>
			<td></td>
			<td>flow channel preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APTES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>440140-500ML</td>
			<td>flow channel preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SMCC</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>22322</td>
			<td>flow channel preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-280, paramganetic beads,streptavidin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11205D</td>
			<td>flow channel preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybead Amino Microspheres 3.00 &#956;m</td>
			<td>Polysciences, Inc</td>
			<td>17145-5</td>
			<td>flow channel preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250-250ML</td>
			<td>flow channel preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Microscopes IX71</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71</td>
			<td>Magnetic tweezers setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezo-Z Stages P-721</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>P-721</td>
			<td>Magnetic tweezers setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Objective lense MPLAPON-Oil 100X</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MPLAPON-Oil 100X</td>
			<td>Magnetic tweezers setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD/CMOS camera</td>
			<td>AVT</td>
			<td>Pike F-032B</td>
			<td>Magnetic tweezers setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translation linear stage</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>MoCo DC</td>
			<td>Magnetic tweezers setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MCWHL</td>
			<td>Magnetic tweezers setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cubic Magnets</td>
			<td>Supermagnete</td>
			<td></td>
			<td>Magnetic tweezers setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labview</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Magnetic tweezers setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro/Matlab</td>
			<td>OriginLab/MathWorks</td>
			<td></td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-molecule manipulation of g-quadruplexes by magnetic tweezers

Sigara-kurallı nükleik asit ikincil yapı G-quadruplexes (G4) DNA ikileşmesi, transkripsiyon, RNA işlenmesi ve telomer uzama gibi çeşitli hücresel süreçler söz konusu. Bu işlemler sırasında çeşitli proteinlerin bağlamak ve onların işlevi gerçekleştirmek için G4 yapıları gidermek. G4 fonksiyonu kez katlanmış yapısını istikrar üzerinde bağlı olarak, nasıl G4 proteinler G4 kararlılığını düzenleyen araştırmak önemlidir. Bu çalışma tek G4 molekülleri G4 proteinler G4 molekülünü gerçek zamanlı olarak düzenlenmesi çalışmaları sağlayan manyetik cımbız kullanarak işlemek için bir yöntem sunar. Genel olarak, bu yöntem çalışmaları uygulamalarında geniş bir kapsamı proteinler/ligandlar etkileşimleri ve çeşitli DNA veya RNA ikincil yapılar üzerinde düzenlemeler için uygundur.

Deneme kurulumu G4 molekülünü germe için şekil 4' te gösterilmiştir. Bir tek iplikçikli G4 şekillendirme sıra iki dsDNA kolları arasında yayılmış bir coverslip ve bir paramagnetic boncuk arasında gergin. Bir tek dsDNA gergin boncuk bulmak için overstretching bir tahlil kuvvet sabit yükleme hesaplı artırarak gerçekleştirildi. Ölçümleri üç tür katlama okuyan ve biomolecules unfolding için kez kullanılmıştır: (i) sabit kuvvet öl...

Watch this Scientific Journal Video about Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers at JoVE.com

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

G-quadruplexes manyetik cımbız tarafından manipülasyon tek molekül

G-quadruplexes işlemek için bir tek molekül manyetik cımbız platform, G4 istikrar ve yönetmelik çalışması için izin veren çeşitli proteinler tarafından bildirilmektedir.

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

single-molecule-manipulation-of-g-quadruplexes-by-magnetic-tweezers

Research

JoVE Journal

Biochemistry

7.9K Görüntüleme.  Huazhong University of Science and Technology. G-quadruplexes işlemek için bir tek molekül manyetik cımbız platform, G4 istikrar ve yönetmelik çalışması için izin veren çeşitli proteinler tarafından bildirilmektedir.

Video: Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule level in multiparameter fluorescence detection (MFD) mode is presented here. MFD maximizes the usage of all &#34;dimensions&#34; of fluorescence to reduce photophysical and experimental artifacts and allows for the measurement of interdye distance with an accuracy up to ~1 &#197; in rigid biomolecules. This method was used to identify three conformational states of the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor to explain the activation of the receptor upon ligand binding. When comparing the known crystallographic structures with experimental measurements, they agreed within less than 3 &#197; for more dynamic biomolecules. Gathering a set of distance restraints that covers the entire dimensionality of the biomolecules would make it possible to provide a structural model of dynamic biomolecules.

A protocol for high-precision FRET experiments at the single molecule level is presented here. Additionally, this methodology can be used to identify three conformational states in the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor. Determining precise distances is the first step towards building structural models based on FRET experiments.

Biyomolekül Yapısının Belirlenmesi İçin Tek Molekül Seviyesinde Yüksek Hassasiyetteki FRET

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Biyokimya

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and functions. It gave us the opportunity to explore a multiplicity of biophysical mechanisms, e.g., how bacterial adhesins bind to host surface receptors in more detail. Among other factors, the success of SMFS experiments depends on the functional and native immobilization of the biomolecules of interest on solid surfaces and AFM tips. Here, we describe a straightforward protocol for the covalent coupling of proteins to silicon surfaces using silane-PEG-carboxyls and the well-established N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (EDC/NHS) chemistry in order to explore the interaction of pilus-1 adhesin RrgA from the Gram-positive bacterium Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) with the extracellular matrix protein fibronectin (Fn). Our results show that the surface functionalization leads to a homogenous distribution of Fn on the glass surface and to an appropriate concentration of RrgA on the AFM cantilever tip, apparent by the target value of up to 20% of interaction events during SMFS measurements and revealed that RrgA binds to Fn with a mean force of 52 pN. The protocol can be adjusted to couple via site specific free thiol groups. This results in a predefined protein or molecule orientation and is suitable for other biophysical applications besides the SMFS.

This protocol describes the covalent immobilization of proteins with a heterobifunctional silane coupling agent to silicon-oxide surfaces designed for the atomic force microscopy based single molecule force spectroscopy which is exemplified by the interaction of RrgA (pilus-1 tip adhesin of S. pneumoniae) with fibronectin.

Proteinler kovalent immobilizasyon için tek molekül kuvvet spektroskopisi

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a fluorescent dye and are spotted by a photodetector following their separation. Single molecule fluorescence imaging can provide ultrasensitive protein detection with its ability for visualizing individual fluorescent molecules. However, the application of this powerful imaging method to electrophoresis assays is hampered by the lack of ways to characterize the homogeneity of fluorescent labeling of each protein species across the proteome. Here, we developed a method to evaluate the labeling homogeneity across the proteome based on a single molecule fluorescence imaging assay. In our measurement using a HeLa cell sample, the proportion of proteins labeled with at least one dye, which we termed &#8216;labeling occupancy&#8217; (LO), was determined to range from 50% to 90%, supporting the high potential of the application of single molecule imaging to sensitive and precise proteome analysis.

Here, we present a protocol to assess the labeling homogeneity for each protein species in a complex protein sample at the single molecule level.

Proteom çapında Quantification maddelerinin homojenliği tek molekül düzeyinde etiketlenmesi

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk population methods (Northern blot, PCR, and RNAseq) that measure mRNA levels lack the ability to provide information on cell-to-cell variation in responses. Precise single cell and allelic visualization and quantification is possible via single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH). RNA-FISH is performed by hybridizing target RNAs with labeled oligonucleotide probes. These can be imaged in medium/high throughput modalities, and, through image analysis pipelines, provide quantitative data on both mature and nascent RNAs, all at the single cell level. The fixation, permeabilization, hybridization and imaging steps have been optimized in the lab over many years using the model system described herein, which results in successful and robust single cell analysis of smFISH labeling. The main goal with sample preparation and processing is to produce high quality images characterized by a high signal-to-noise ratio to reduce false positives and provide data that are more accurate. Here, we present a protocol describing the pipeline from sample preparation to data analysis in conjunction with suggestions and optimization steps to tailor to specific samples.&#160;

Single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a method to accurately quantify levels and localization of specific RNAs at the single cell level. Here, we report our validated lab protocols for wet-bench processing, imaging and image analysis for single cell quantification of specific RNAs.

Transkripsiyonel Aktif Alellerin Tek Molekül FISH ile Tek Hücre Analizi

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Single-Molecule Dwell-Time Analysis of Restriction Endonuclease-Mediated DNA Cleavage

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for hundreds of individual restriction endonuclease (REase) molecules in one experiment. This assay does not require protein labeling and can be carried out with a single imaging channel. In addition, the results of multiple individual experiments can be pooled to generate well-populated dwell-time distributions. Analysis of the resulting dwell-time distributions can help elucidate the DNA cleavage mechanism by revealing the presence of kinetic steps that cannot be directly observed. Example data collected using this assay with the well-studied REase, EcoRV - a dimeric Type IIP restriction endonuclease that cleaves the palindromic sequence GAT&#8595;ATC (where &#8595; is the cut site) - are in agreement with prior studies. These results suggest that there are at least three steps in the pathway to DNA cleavage that is initiated by introducing magnesium after EcoRV binds DNA in its absence, with an average rate of 0.17 s-1 for each step.

Using quantum-dot-labeled DNA and total internal reflection fluorescence microscopy, we can investigate the reaction mechanism of restriction endonucleases while using unlabeled protein. This single-molecule technique allows for massively multiplexed observation of individual protein-DNA interactions, and data can be pooled to generate well-populated dwell-time distributions.

Restriksiyon endonükleaz aracılı DNA bölünmesinin tek moleküllü bekleme süresi analizi

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately 20 nm to accommodate large tRNA substrates at the A-, P- and E-sites. Consequently, the ribosome dynamics are naturally de-phased quickly. Single molecule method can detect each ribosome separately and distinguish inhomogeneous populations, which is essential to reveal the complicated mechanisms of multi-component systems. We report the details of a smFRET method based on the Nikon Ti2 inverted microscope to probe the ribosome dynamics between the ribosomal protein L27 and tRNAs. The L27 is labeled at its unique Cys 53 position and reconstituted into a ribosome that is engineered to lack L27. The tRNA is labeled at its elbow region. As the tRNA moves to different locations inside the ribosome during the elongation cycle, such as pre- and post- translocation, the FRET efficiencies and dynamics exhibit differences, which have suggested multiple subpopulations. These subpopulations are not detectable by ensemble methods. The TIRF-based smFRET microscope is built on a manual or motorized inverted microscope, with home-built laser illumination. The ribosome samples are purified by ultracentrifugation, loaded into a home-built multi-channel sample cell and then illuminated via an evanescent laser field. The reflection laser spot can be used to achieve feedback control of perfect focus. The fluorescence signals are separated by a motorized filter-turret and collected by two digital CMOS cameras. The intensities are retrieved via the NIS-Elements software.

Single molecule fluorescence energy transfer is a method that tracks the tRNA dynamics during ribosomal protein synthesis. By tracking individual ribosomes, inhomogeneous populations are identified, which shed light on mechanisms. This method can be used to track biological conformational changes in general to reveal dynamic-function relationships in many other complexed biosystems. Single molecule methods can observe non-rate limiting steps and low-populated key intermediates, which are not accessible by conventional ensemble methods due to the average effect.

Ribozom Protein Sentezinin Tek Molekül floresan Enerji Transferi Çalışması

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 (FET) family of fusion oncoproteins, is one of the most frequently involved fusion genes in Ewing sarcoma. These FET family fusion proteins typically harbor a low-complexity domain (LCD) of FET protein at their N-terminus and a DNA-binding domain (DBD) at their C-terminus. EWS-FLI1 has been confirmed to form biomolecular condensates at its target binding loci due to LCD-LCD and LCD-DBD interactions, and these condensates can recruit RNA polymerase II to enhance gene transcription. However, how these condensates are assembled at their binding sites remains unclear. Recently, a single-molecule biophysics method-DNA Curtains-was applied to visualize these assembling processes of EWS-FLI1 condensates. Here, the detailed experimental protocol and data analysis approaches are discussed for the application of DNA Curtains in studying the biomolecular condensates assembling on target DNA.

Here, we describe the use of the single-molecule imaging method, DNA Curtains, to study the biophysical mechanism of EWS-FLI1 condensates assembling on DNA.

DNA Üzerine Birleştirilen EWS-FLI1 Kondensatlarının Tek Moleküllü Görüntülenmesi

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to measure protein phosphorylation cannot preserve the heterogeneity in phosphorylation across individual proteins. The single-molecule pull-down (SiMPull) assay was developed to investigate the composition of macromolecular complexes via immunoprecipitation of proteins on a glass coverslip followed by single-molecule imaging. The current technique is an adaptation of SiMPull that provides robust quantification of the phosphorylation state of full-length membrane receptors at the single-molecule level. Imaging thousands of individual receptors in this way allows for quantifying protein phosphorylation patterns. The present protocol details the optimized SiMPull procedure, from sample preparation to imaging. Optimization of glass preparation and antibody fixation protocols further enhances data quality. The current protocol provides code for the single-molecule data analysis that calculates the fraction of receptors phosphorylated within a sample. While this work focuses on phosphorylation of the epidermal growth factor receptor (EGFR), the protocol can be generalized to other membrane receptors and cytosolic signaling molecules.

The present protocol describes sample preparation and data analysis to quantify protein phosphorylation using an improved single-molecule pull-down (SiMPull) assay.

Protein Fosforilasyonunun Miktarının Belirlenmesi için Optimize Edilmiş Tek Moleküllü Bir Pull-Down Testi

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to ...

Single-Molecule Analysis of Sf9 Purified Superprocessive Kinesin-3 Family Motors

A complex cellular environment poses challenges for single-molecule motility analysis. However, advancement in imaging techniques have improved single-molecule studies and has gained immense popularity in detecting and understanding the dynamic behavior of fluorescent-tagged molecules. Here, we describe a detailed method for&#160;in vitro single-molecule studies of kinesin-3 family motors using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy. Kinesin-3 is a large family that plays critical roles in cellular and physiological functions ranging from intracellular cargo transport to cell division to development. We have shown previously that constitutively active dimeric kinesin-3 motors exhibit fast and superprocessive motility with high microtubule affinity at the single-molecule level using cell lysates prepared by expressing motor in mammalian cells. Our lab studies kinesin-3 motors and their regulatory mechanisms using cellular, biochemical and biophysical approaches, and such studies demand purified proteins at a large scale. Expression and purification of these motors using mammalian cells would be expensive and time-consuming, whereas expression in a prokaryotic expression system resulted in significantly aggregated and&#160;inactive protein. To overcome the limitations posed by bacterial purification systems and mammalian cell lysate, we have established a robust Sf9-baculovirus expression system to express and purify these motors. The kinesin-3 motors are C-terminally tagged with 3-tandem fluorescent proteins (3xmCitirine or 3xmCit) that provide enhanced signals and decreased photobleaching. In vitro single-molecule and multi-motor gliding analysis of Sf9 purified proteins demonstrate that kinesin-3 motors are fast and superprocessive akin to our previous studies using mammalian cell lysates. Other applications using these assays include detailed knowledge of oligomer conditions of motors, specific binding partners paralleling biochemical studies, and their kinetic state.

This study details purification of KIF1A(1-393LZ), a member of kinesin-3 family, using Sf9-baculovirus expression system. In vitro single-molecule and multi-motor gliding analysis of these purified motors exhibited robust motility properties comparable to motors from mammalian cell lysate. Thus, Sf9-baculovirus system is amenable to express and purify motor protein of interest.

Sf9 Saflaştırılmış Süperprosesif Kinesin-3 Ailesi Motorlarının Tek Moleküllü Analizi

A complex cellular environment poses challenges for single-molecule motility analysis. However, advancement in imaging techniques have improved ...

Single-Molecule Diffusion and Assembly on Polymer-Crowded Lipid Membranes

Cellular membranes are highly crowded environments for biomolecular reactions and signaling. Yet, most in vitro experiments probing protein interaction with lipids employ naked bilayer membranes. Such systems lack the complexities of crowding by membrane-embedded proteins and glycans and exclude the associated volume effects encountered on cellular membrane surfaces. Also, the negatively charged glass surface onto which the lipid bilayers are formed prevents the free diffusion of transmembrane biomolecules. Here, we present a well-characterized polymer-lipid membrane as a mimic for crowded lipid membranes. This protocol utilizes polyethylene glycol (PEG)-conjugated lipids as a generalized approach for incorporating crowders into the supported lipid bilayer&#160;(SLB). First, a cleaning procedure of the microscopic slides and coverslips for performing single-molecule experiments is presented. Next, methods for characterizing the PEG-SLBs and performing single-molecule experiments of the binding, diffusion, and assembly of biomolecules using single-molecule tracking and photobleaching are discussed. Finally, this protocol demonstrates how to monitor the nanopore assembly of bacterial pore-forming toxin Cytolysin A (ClyA) on crowded lipid membranes with single-molecule photobleaching analysis. MATLAB codes with example datasets are also included to perform some of the common analyses such as particle tracking, extracting diffusive behavior, and subunit counting.

Here, a protocol to perform and analyze the binding, mobility, and assembly of single molecules on artificial crowded lipid membranes using single-molecule total internal reflection fluorescence (smTIRF) microscopy is presented.

Tek Moleküllü Difüzyon ve Polimer Kalabalık Lipid Membranlara Montaj

Cellular membranes are highly crowded environments for biomolecular reactions and signaling. Yet, most in vitro experiments probing protein interaction ...