Bu araştırma, Gaziler İşleri Kariyer Geliştirme Ödülü 1IK2BX001701, Ulusal Bilimsel Araştırma Vakfı İleri Düzeyde Ulusal Merkezi&#39;nden CTSA ödülü UL1TR000445, Ulusal Bilim Kurumu Ödül Numaraları 1547757 ve 1400969 ve NIH hibe GM05551 tarafından desteklendi. İçeriği yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Transaksiyonel Bilimler Geliştirme Ulusal Merkezi veya Ulusal Sağlık Enstitüleri&#39;nin resmi görüşlerini temsil etmemektedir.

1. S100A12&#39;nin ifadesi <ol><li> Yetkili BL21 DE3 hücrelerini standart bir ısı şok protokolü kullanarak pGEMEX-S100a12 plazmid ile değiştirin 18 . Buz üzerinde bir mikrosantrifüj tüpünde bakteri 50 mcL plazmid 1 ila 5 mcL ekleyin. 20 dakika inkübe edin. </li><li> Isı hücreleri 42 ° C&#39;de 30 saniye boyunca şoklanır. </li><li> Hücreleri 2 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. </li><li> Hücrelere 500 μL SOC ortamı ekleyin. 1 saat boyunca bir orbital çalkalayıcıda 250 dev / dak&#39;da çalkalayarak 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> LB-agar ortamında (100 ug / mL ampisilin ile takviye edilmiş) 150 μL transformasyon reaksiyonu plakası. 12-16 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Bir koloni seç. 2 mL LB (100 μg / mL ampisilin takviyeli) aşılayın. </li><li> Orbital çalkalayıcıda (300 dev / dak.) 37 ° C&#39;de 4-6 saat inkübe edin. OD 600 , 1-3 absorbans birimi arasında okunmalıdır. </li><li> 50 mL ZYM-5052 autoindu&#39;ya başlangıç ​​kültürü 500 mcL ekleyinCtion media 26 , 100 μg / mL ampisilin ile takviye edilmiştir. En iyi havalandırma ve maksimum ekspresyon için, 250 mL&#39;lik şaşkın bir Erlenmeyer şişeyi kullanın. 37 ° C&#39;de 24 saat boyunca çalkalayın (300 rpm). </li><li> Bakteri süspansiyonunu bir santrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri 4 ° C&#39;de santrifüj (4,000 xg, 10 dakika) ile peletleyin. </li><li> Ortamı süzün, numuneyi alın ve -80 ° C&#39;de hücre pastasını saklayın. Numune yıllarca istikrarlıdır. </li></ol> 2. Düşük Basınçlı Kromatografi Kullanılarak S100A12&#39;nin Saflaştırılması <ol><li> 30 mL 20 mM Tris, pH 8.0 içinde süspansiyon hücreleri. </li><li> Hücreleri lize etmek için süspansiyonu son haline getirin. ~ 20 W çıkış, 5 sn açık ve 5 sn kapalı 5 sn kapalı kullanın. </li><li> Çözümü yüksek hızlı santrifüj tüplerine aktarın. Hücre lisatını 4 ° C&#39;de 30 dakika süreyle 20,000 xg santrifüjle açıklayın. </li><li> Yüzey maddeyi boşaltın ve temiz bir 100 mL polipropilen beherine aktarın. Çözeltiyi buz üzerinde bırakarak soğutun. Bir karıştırma ba ekleyinR karıştırın ve yavaş yavaş 11.20 g amonyum sülfat ekleyin. Çözeltinin buz üzerinde bir saat daha karıştırmasına izin verin. Bu,% 60 amonyum sülfat solüsyonu oluşturacak ve E. coli endojen proteinlerinin çoğunu çöktürecektir. S100A12 çözünebilir durumda kalır. </li><li> Çözeltiyi 4 ° C&#39;de, 20.000 xg&#39;de 20 dakika boyunca santrifüjden geçirerek çöktürülmüş proteinin pelet haline getirin. </li><li> Süpernatantı boşaltın ve diyaliz borusuna aktarın (MWCO 3,500 kDa). 4 ° C&#39;de 1 L 20 mM Tris, pH 8.0 karşısında dialize edin. Diyaliz tamponunu iki kez değiştir. Değişiklikler arasında 4 saat izin ver. </li><li> Anyon değişim kromatografisi <ol><li> Düşük basınçlı bir sistemde kromatografi uygulayın. Tipik akış hızı 1 mL / dak&#39;dır. </li><li> 5 mL Sepharose sütununu 10 mL 20 mM Tris, pH 8.0 ile dengeleyin. </li><li> ~ 40 mL S100A12 çözeltisini örnek pompayı kullanarak yükleyin (akışı toplayın). </li><li> Kolonu 10 mL 20 mM Tris, pH 8 ile yıkayın. </li><li> Sütunu% 0-30 gradyan ile geliştirin (BuFfer B, 20 mM Tris, pH 8.0, 1 M NaCI&#39;dir) 19 sütun hacmi (CV, 95 mL) üzerinde. 5 mL&#39;lik fraksiyonları toplayın. </li><li> Her fraksiyonun 10 mcL kısımlarını alın ve Coomassie boyası ile MES SDS PAGE kullanarak analiz edin. 30 dakika süreyle sabit voltaj (20 V / cm) kullanarak jel çalıştırın. </li><li> S100A12 içeren havuz fraksiyonları. S100A12, bir denatüre edici jel üzerinde ~ 10 kDa protein ile çalışır. </li><li> Bir ultrafiltrasyon cihazı (MWCO 10 kDa) kullanarak fraksiyonları 5 mL&#39;ye konsantre edin. ~ 8 dakika boyunca 3000 xg&#39;de santrifüjleyin. En üstteki kesimi alın. </li></ol></li><li> Ebat-eksklüzyon kromatografisi <ol><li> S75 sütununu 1 CV (120 mL) 20 mM Tris pH 8, 100 mM NaCl ile dengeleyin. </li><li> &lt;5 mL konsantre S100A12 fraksiyonlarını enjekte edin (iyon değişim kromatografisinden). </li><li> Kolonu, 120 mL üzerinde 1 mL / m&#39;lik bir akış hızında geliştirin. 5 mL&#39;lik fraksiyonları toplayın. </li><li> Her fraksiyonun 10 uL&#39;lik bir alikotu alın ve Coomassie boyası ile SDS PAGE kullanarak analiz edin. Kullanarak protein kimliğini doğrulayınBatı leke veya kütle spektrometresi (10.575.0 Da monomerik alt biriminin hesaplanmış moleküler kütlesi, 10575.4 Da ölçülmüştür). </li></ol></li><li> Havuz fraksiyonları <ol><li> Bir spektrofotometre kullanarak A 280 proteininin absorbansını ölçün. SEC tamponunu boş olarak kullanın. S100A12 homodimeri için hesaplanan sönüm katsayısı 5960 M -1 cm &quot; 1&#39;dir. NOT: Tipik verim 50 mL kültür başına 35-45 mg S100A12&#39;dir. </li><li> Parçacık S100A12 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine (1 mg / tüp) aktarılır, sıvı nitrojende flash dondurulur ve -80 ° C&#39;de saklanır. </li></ol></li></ol> 3. Antimikrobiyal Aktivite Testleri <ol><li> % 5 koyun kanı (kan agar plakaları) ile takviye edilmiş tamponlu soya agar plakalarına H. pylori suşu çizdirin. Oda havasındaki 37 ° C&#39;de% 5 karbon dioksit ile desteklenmiş 2-3 gün büyütün. </li><li> H. pylori&#39;yi 1x kolestrol ile desteklenmiş Brucella suyu içine aşılayın. Üzerinde kültürOda havasında 37 ° C sıcaklıkta gece sallayarak (250 dev / dak.)% 5 karbon dioksit ile takviye edilmiştir. </li><li> H. pylori 1: 10&#39;u% 50 Brucella suyu,% 50 kalprotein tamponu artı 1x kolesterol ve kültür ortamında tek başına veya 100 uM çinko klorür artı 0, 100 veya 1000 μg / mL arıtılmış S100A12 ile takviye haline getirin. Kültür oda sıcaklığında gece boyunca 37 ° C&#39;de çalkalanarak (250 rpm)% 5 karbon dioksit ile takviye edildi. </li><li> Ertesi gün, seri seyreltmeler yapın ve kan agar plakalarına koyun. Bakteri kolonilerinin oda havasında 37 ° C&#39;de 2-3 gün boyunca% 5 karbon dioksit ile takviye edilmesine izin verin. S100A12 ve / veya eksojen çinko varlığında veya yokluğunda bakteri üremesini hesaplamak için koloni oluşum birimlerini numaralandırın. </li></ol>

<ol>
	<li>Schiopu, A., Cotoi, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S100A8+and+S100A9:+DAMPs+at+the+crossroads+between+innate+immunity,+traditional+risk+factors,+and+cardiovascular+disease.">S100A8 and S100A9: DAMPs at the crossroads between innate immunity, traditional risk factors, and cardiovascular disease.</a> Mediators Inflamm. 2013, 828354 (2013).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S100A9+induced+inflammatory+responses+are+mediated+by+distinct+damage+associated+molecular+patterns+(DAMP)+receptors+in+vitro+and+in+vivo.">S100A9 induced inflammatory responses are mediated by distinct damage associated molecular patterns (DAMP) receptors in vitro and in vivo.</a> PLoS One. 10 (2), e0115828 (2015).</li><li>Chernov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+calcium-binding+proteins+S100A8+and+S100A9+initiate+the+early+inflammatory+program+in+injured+peripheral+nerves.">The calcium-binding proteins S100A8 and S100A9 initiate the early inflammatory program in injured peripheral nerves.</a> J Biol Chem. 290 (18), 11771-11784 (2015).</li><li>Fanjul, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+MRP8+and+MRP14+in+pancreatic+cell+lines:+differential+expression+and+localization+in+CFPAC-1+cells.">Presence of MRP8 and MRP14 in pancreatic cell lines: differential expression and localization in CFPAC-1 cells.</a> Am J Physiol. 268 (5 Pt 1), C1241-C1251 (1995).</li><li>Vogl, T., Gharibyan, A. L., Morozova-Roche, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-inflammatory+S100A8+and+S100A9+proteins:+self-assembly+into+multifunctional+native+and+amyloid+complexes.">Pro-inflammatory S100A8 and S100A9 proteins: self-assembly into multifunctional native and amyloid complexes.</a> Int J Mol Sci. 13 (3), 2893-2917 (2012).</li><li>Smith, S. P., Shaw, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+change-in-hand+mechanism+for+S100+signalling.">A change-in-hand mechanism for S100 signalling.</a> Biochem Cell Biol. 76 (2-3), 324-333 (1998).</li><li>Bresnick, A. R., Weber, D. J., Zimmer, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S100+proteins+in+cancer.">S100 proteins in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 15 (2), 96-109 (2015).</li><li>Leclerc, E., Heizmann, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+Ca2+/Zn2++signaling+S100+proteins+and+RAGE+in+translational+medicine.">The importance of Ca2+/Zn2+ signaling S100 proteins and RAGE in translational medicine.</a> Front Biosci (Schol Ed). 3, 1232-1262 (2011).</li><li>Goyette, J., Geczy, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation-associated+S100+proteins:+new+mechanisms+that+regulate+function.">Inflammation-associated S100 proteins: new mechanisms that regulate function.</a> Amino Acids. 41 (4), 821-842 (2011).</li><li>Kehl-Fie, T. E., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+immunity+beyond+iron:+a+role+for+manganese+and+zinc.">Nutritional immunity beyond iron: a role for manganese and zinc.</a> Curr Opin Chem Biol. 14 (2), 218-224 (2010).</li><li>Zackular, J. P., Chazin, W. J., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+Immunity:+S100+Proteins+at+the+Host-Pathogen+Interface.">Nutritional Immunity: S100 Proteins at the Host-Pathogen Interface.</a> J Biol Chem. 290 (31), 18991-18998 (2015).</li><li>Realegeno, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S100A12+Is+Part+of+the+Antimicrobial+Network+against+Mycobacterium+leprae+in+Human+Macrophages.">S100A12 Is Part of the Antimicrobial Network against Mycobacterium leprae in Human Macrophages.</a> PLoS Pathog. 12 (6), e1005705 (2016).</li><li>Perera, C., McNeil, H. P., Geczy, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S100+Calgranulins+in+inflammatory+arthritis.">S100 Calgranulins in inflammatory arthritis.</a> Immunol Cell Biol. 88 (1), 41-49 (2010).</li><li>Moroz, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+S100A12-copper+complex:+implications+for+host-parasite+defence.">Structure of the human S100A12-copper complex: implications for host-parasite defence.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 5), 859-867 (2003).</li><li>Moroz, O. V., Blagova, E. V., Wilkinson, A. J., Wilson, K. S., Bronstein, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structures+of+human+S100A12+in+apo+form+and+in+complex+with+zinc:+new+insights+into+S100A12+oligomerisation.">The crystal structures of human S100A12 in apo form and in complex with zinc: new insights into S100A12 oligomerisation.</a> J Mol Biol. 391 (3), 536-551 (2009).</li><li>Moroz, O. V., Dodson, G. G., Wilson, K. S., Lukanidin, E., Bronstein, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+structural+states+of+S100A12:+A+key+to+its+functional+diversity.">Multiple structural states of S100A12: A key to its functional diversity.</a> Microsc Res Tech. 60 (6), 581-592 (2003).</li><li>Cunden, L. S., Gaillard, A., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Ions+Tune+the+Zinc-Sequestering+Properties+and+Antimicrobial+Activity+of+Human+S100A12.">Calcium Ions Tune the Zinc-Sequestering Properties and Antimicrobial Activity of Human S100A12.</a> Chem Sci. 7 (2), 1338-1348 (2016).</li><li>Haley, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Antimicrobial+Protein+Calgranulin+C+Participates+in+Control+of+Helicobacter+pylori+Growth+and+Regulation+of+Virulence.">The Human Antimicrobial Protein Calgranulin C Participates in Control of Helicobacter pylori Growth and Regulation of Virulence.</a> Infect Immun. 83 (7), 2944-2956 (2015).</li><li>Cover, T. L., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+in+health+and+disease.">Helicobacter pylori in health and disease.</a> Gastroenterology. 136 (6), 1863-1873 (2009).</li><li>Tham, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+genotypes,+host+factors,+and+gastric+mucosal+histopathology+in+peptic+ulcer+disease.">Helicobacter pylori genotypes, host factors, and gastric mucosal histopathology in peptic ulcer disease.</a> Hum Pathol. 32 (3), 264-273 (2001).</li><li>Wotherspoon, A. C., Ortiz-Hidalgo, C., Falzon, M. R., Isaacson, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori-associated+gastritis+and+primary+B-cell+gastric+lymphoma.">Helicobacter pylori-associated gastritis and primary B-cell gastric lymphoma.</a> Lancet. 338 (8776), 1175-1176 (1991).</li><li>Correa, P., Piazuelo, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gastric+precancerous+cascade.">The gastric precancerous cascade.</a> J Dig Dis. 13 (1), 2-9 (2012).</li><li>de Martel, C., Forman, D., Plummer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastric+cancer:+epidemiology+and+risk+factors.">Gastric cancer: epidemiology and risk factors.</a> Gastroenterol Clin North Am. 42 (2), 219-240 (2013).</li><li>Algood, H. M., Gallo-Romero, J., Wilson, K. T., Peek, R. M., Cover, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+response+to+Helicobacter+pylori+infection+before+initiation+of+the+adaptive+immune+response.">Host response to Helicobacter pylori infection before initiation of the adaptive immune response.</a> FEMS Immunol Med Microbiol. 51 (3), 577-586 (2007).</li><li>Gaddy, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host+protein+calprotectin+modulates+the+Helicobacter+pylori+cag+type+IV+secretion+system+via+zinc+sequestration.">The host protein calprotectin modulates the Helicobacter pylori cag type IV secretion system via zinc sequestration.</a> PLoS Pathog. 10 (10), e1004450 (2014).</li><li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+expression+clones+and+auto-induction+for+protein+production+in+E.+coli.">Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli.</a> Methods Mol Biol. 1091, 17-32 (2014).</li><li>Gilston, B. A., Skaar, E. P., Chazin, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+transition+metals+to+S100+proteins.">Binding of transition metals to S100 proteins.</a> Sci China Life Sci. 59 (8), 792-801 (2016).</li><li>Corbin, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+chelation+and+inhibition+of+bacterial+growth+in+tissue+abscesses.">Metal chelation and inhibition of bacterial growth in tissue abscesses.</a> Science. 319 (5865), 962-965 (2008).</li><li>Kehl-Fie, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutrient+metal+sequestration+by+calprotectin+inhibits+bacterial+superoxide+defense,+enhancing+neutrophil+killing+of+Staphylococcus+aureus.">Nutrient metal sequestration by calprotectin inhibits bacterial superoxide defense, enhancing neutrophil killing of Staphylococcus aureus.</a> Cell Host Microbe. 10 (2), 158-164 (2011).</li><li>Liu, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+sequestration+by+the+neutrophil+protein+calprotectin+enhances+Salmonella+growth+in+the+inflamed+gut.">Zinc sequestration by the neutrophil protein calprotectin enhances Salmonella growth in the inflamed gut.</a> Cell Host Microbe. 11 (3), 227-239 (2012).</li><li>Damo, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+for+manganese+sequestration+by+calprotectin+and+roles+in+the+innate+immune+response+to+invading+bacterial+pathogens.">Molecular basis for manganese sequestration by calprotectin and roles in the innate immune response to invading bacterial pathogens.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3841-3846 (2013).</li><li>Nakashige, T. G., Zhang, B., Krebs, C., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+calprotectin+is+an+iron-sequestering+host-defense+protein.">Human calprotectin is an iron-sequestering host-defense protein.</a> Nat Chem Biol. 11 (10), 765-771 (2015).</li><li>Gaddy, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+Resists+the+Antimicrobial+Activity+of+Calprotectin+via+Lipid+A+Modification+and+Associated+Biofilm+Formation.">Helicobacter pylori Resists the Antimicrobial Activity of Calprotectin via Lipid A Modification and Associated Biofilm Formation.</a> MBio. 6 (6), e01349-e01315 (2015).</li><li>Testerman, T. L., Conn, P. B., Mobley, H. L., McGee, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+requirements+and+antibiotic+resistance+patterns+of+Helicobacter+species+in+chemically+defined+media.">Nutritional requirements and antibiotic resistance patterns of Helicobacter species in chemically defined media.</a> J Clin Microbiol. 44 (5), 1650-1658 (2006).</li><li>Leach, S. T., Mitchell, H. M., Geczy, C. L., Sherman, P. M., Day, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S100+calgranulin+proteins+S100A8,+S100A9+and+S100A12+are+expressed+in+the+inflamed+gastric+mucosa+of+Helicobacter+pylori-infected+children.">S100 calgranulin proteins S100A8, S100A9 and S100A12 are expressed in the inflamed gastric mucosa of Helicobacter pylori-infected children.</a> Can J Gastroenterol. 22 (5), 461-464 (2008).</li><li>Wilkie-Grantham, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloperoxidase-dependent+lipid+peroxidation+promotes+the+oxidative+modification+of+cytosolic+proteins+in+phagocytic+neutrophils.">Myeloperoxidase-dependent lipid peroxidation promotes the oxidative modification of cytosolic proteins in phagocytic neutrophils.</a> J Biol Chem. 290 (15), 9896-9905 (2015).</li></ol>

Yazarlar, rekabet eden mali çıkarlarının olmadığını beyan ettiler.

İnsan S100A12&#39;nin ekspresyonu ve saflaştırılması için etkili bir protokol sunulmuştur. E. coli ekspresyon sistemi, özellikle biyokimyasal ve biyofiziksel çalışmalar için mg miktarları gerektiğinde rekombinant proteinlerin üretimi için kullanılan en yaygın araçtır. Burada tarif edilen prosedürün anahtar geliştirilmesi, standart Luria besiyeri ortamı 18 ile ekspresyona kıyasla saflaştırılmış proteinin verimini neredeyse otuz kadar arttıran otomatik endük...

S100 proteinleri, çeşitli fonksiyon dizisine sahip 1 EF-el ailesi kalsiyum bağlayıcı proteinlerin bir sınıfıdır. Bunlar doku ve hücreye spesifik bir şekilde ifade edilir ve geniş bir hücre fonksiyonları yelpazesini 2 , 3 düzenler. Kalsiyum bağlayıcı proteinlere özgü olan S100 proteinleri hem hücre içi hem de hücre dışı işlevleri gösterirler 4 , 5 . Hücre içinde, Ca 2 + bağlanması özellikle protein bağlama ortakları 6 hedefleyen bir hidrofobik yüzey ortaya bir yapısal değişiklik indüklenir. Bu hücre içi mekanizma hücre proliferasyonu, farklılaşma ve enerji metabolizması gibi önemli süreçleri düzenler. Ekstraselüler çevrede, S100 proteinleri iki işlev sergilemektedir 7 . Birinde, moleküler model (DAMP) proteinlerine hasar gibi davranırlar ve bir pro-inflammayı başlatırlarKalıp tanıma reseptörleri 8 , 9 ile etkileşim yoluyla bağışıklık cevabını ileri sürmek. Ek olarak, S100 protein sınıfının birkaç üyesi, geçiş metallerini, besleyici bağışıklık 10 , 11 olarak adlandırılan bir süreçte mikrobik patojenlere aç bırakmaya hizmet eden bir işlevi saklar. S100A12 (aynı zamanda calgranulin C ve EN-RAGE olarak da bilinir), makrofajlar ve nötrofillerde yüksek oranda eksprese edilir ve inflamatuar hastalıklar için potansiyel bir biyolojik belirteç olarak tanımlanmıştır 12,13. EF-Hand bölgelerinde kalsiyumu bağlamaya ek olarak, S100A12 dimer arayüzünün 14 , 15 karşı uçlarında bulunan iki yüksek afiniteli geçiş metali bağlama mevkisine sahiptir. Her bir bağlanma yeri, üç histidin kalıntısı ve bir aspartik asit kalıntısı içerir ve çinko veya bakır &lt;Sup class = &quot;xref&quot;&gt; 16 , 17 . Yakın zamanda, S100A12&#39;ye bağımlı çinko açlığın, Helicobacter pylori büyümesini ve pro-inflamatuar virulans faktörlerinin aktivitesini düzenleyen önemli olduğunu bildirdik. H. pylori , dünyadaki insan nüfusunun yaklaşık yarısının karnını enfekte eder; Bunu en başarılı bakteriyel patojenlerden biri haline getirir 19 . H. pylori ile enfeksiyon gastrit, peptik ve duodenal ülser, mukoza ilişkili lenfoid doku (MALT) lenfoma ve invaziv gastrik adenokarsinoma (mide kanseri) gibi önemli gastrik hastalık sonuçlarına yol açabilir. Karaciğer kanseri, dünyada kardiyovasküler kansere bağlı ölümlerin önde gelen sebebidir ve mide kanseri için tek büyük ilişkili risk faktörü H. pylori ile enfeksidir. H. pylori , gevrek olmasına rağmen mide nişinde devam ederBu bakteriyel enfeksiyonu kontrol altına almak için bağışıklık mekanizmalarının daha iyi anlaşılmasına ihtiyaç olduğunu vurguladı. H. pylori&#39;ye bağlı inflamasyon, enfeksiyon yeri 18 , 24 , 25&#39;de S100A12 de dahil olmak üzere antimikrobiyal proteinlerin bir repertuarını depolayan polimorfonükleer hücrelerin veya nötrofillerin derin infiltrasyonu ile karakterizedir. Ev sahibi ve patojen arasındaki karmaşık diyalogu anlamak için, S100A12&#39;yi saflaştırma tekniğini hassaslaştırmaya ve bu tıbbi açıdan ilgili patojene uyguladığı antimikrobiyal etkiyi incelemek için kullanmaya çalıştık. Aşağıdaki protokol, biyolojik açıdan aktif durumda S100A12 saflaştırması için geliştirilmiş bir tekniğin özetini vermektedir; Besleyici metalleri yüksek oranda bağlayabilenBunları işgal altındaki mikroorganizmalara toplayıp onları şelale haline getirin. Ayrıca, aşağıdaki yöntemler, bu proteinin, doğuştan gelen antimikrobiyal moleküllerin bakteriyel patojenlerin büyümesini sınırlandırdığı mekanizmayı incelemek için kritik bir reaktif olarak kullanılmasını vurgulamaktadır. S100A ailesindeki proteinler, konak savunmasının yanı sıra bağışıklık sinyalizasyonuna katılan doğal bir bağışıklık sistemi molekülünün önemli bir parçası olarak takdir kazanmışlardır. Bunların en iyi çalışılanı kalprotektindir (MRP-8/14, calgranulin A / B, S100A8 / A9) 28 , 29 , 30 . Calprotectin, dimer ara yüz 31&#39;de geçiş metallerini bağlayan S100A8 ve S100A9 alt birimlerinin bir heterodimeri oluşturan nötrofile bağlı bir proteindir. Calprotectin&#39;in iki metal bağlama sahasına sahip olduğu gösterilmiştir: Site 1, Zn 2+ , Mn 2+ veya Fe 2+ &#39;yi bağlayabilir ve Site 2,<html> Zn 2+ 31 , 32&#39;yi bağlayın . Calprotectinin, Staphylococcus aureus , Candida albicans , Acinetobacter baumannii , Klebsiella pneumoniae , Escherichia coli ve H. pylori gibi çeşitli patojenlere karşı antimikrobiyal etkinlik gösterdiğini ve önleyici etkilerin calprotectin 25 , 28&#39;in metal şelasyon aktivitesinden kaynaklandığını gösteren çok sayıda rapor var. , 29 . Calprotectin, dış membrandaki lipit A yapısının değiştirilmesi, cag -Type IV salgılama sisteminin ( H. pylori içinde önemli bir proenflamatuar virulans faktörüdür) bastırılması, biyofilm oluşumuna neden olması ve bastırılması da dahil olmak üzere H. pylori üzerinde çok sayıda etkinlik sergilediğini gösterdi H. pylori büyümesi ve canlı dozu doza bağımlı bir şekildeClass = &quot;xref&quot;&gt; 25 , 33 . Dahası, genetik ve biyokimyasal analizler, H. pylori&#39;ye karşı calprotectin&#39;in antibakteriyel etkisinin büyük oranda besleyici çinkoyu 25 bağlama yeteneğinden kaynaklandığını ortaya koymuştur. H. pylori , bu patojenin büyümesi ve çoğalması için mikrobesin gereksinimlerini belirlemek için kimyasal olarak tanımlanmış bir ortam kullanan önceki araştırmalar tarafından belirlendiği üzere çinko gerektirir 34 . Buna ek olarak, kalprote- tein, H. pylori ile enfekte dokular içinde oldukça miktarda bulunur ve nötrofilik infiltratlarla ilişkili olup, konakçıya enfeksiyondan sonra inflamasyon sırasında kalprotektini antimikrobiyal bir strateji olarak kul- lanılabilir. Yansız proteomik tarama tekniklerinden elde edilen son bulgular, reaktif oksijen türlerinin bol olduğu koşullar altında, kalprotecKalay, hekza-histidin bağlanma yerini değiştiren, dolayısıyla proteinin metal bağlanma aktivitesini inhibe eden translasyon sonrası modifikasyonları gerçekleştirir 36 . Bu nedenle, bu moleküllerin geniş repertuarındaki diğer S100A ailesindeki proteinlerin potansiyel olarak yardımcı metal-kıskaçlayıcılar olarak işlev görebileceğini varsaydık. Daha sonraki çalışma için S100A12&#39;yi seçtik çünkü söz konusu translasyon sonrası modifikasyon ekranı üzerinde tanımlanmadı, çinkoyu bağlama kapasitesine sahipti ve H. pylori ile enfekte olmuş kişilerden türetilen insan dokularında oldukça bol miktarda bulunur. Çalışmalarımız, S100A12&#39;nin, H. pylori&#39;nin G27 suşunda H. pylori büyümesini ve yaşayabilirliğini doza bağımlı bir şekilde inhibe edebildiğini ve bu proteinin antimikrobiyal aktivitesinin fazla besleyici çinko ilavesiyle tersine çevrilebileceğini gösteriyor. Bu çalışma, S100A12&#39;nin PMSS1 ve 7.1&#39;e karşı antimikrobiyal etkinlik gösterdiğini gösteren önceki çalışmamızı tamamlamaktadır3 suşu H. pylori , sayısız klinik izolelere ve laboratuara uyarlanmış H. pylori suşlarına karşı geniş antibakteriyel etkisini göstermektedir. Birlikte, bu sonuçlar S100A12&#39;nin besleyici bağışıklık yoluyla bakteri gelişimini ve proliferasyonunu kontrol eden bir mekanizma olarak önemini teyit eder. Bu önemli konak-bakteriyel etkileşimin gelecekteki çalışmaları arasında, konukçu dokulardaki bakteri yükünü azaltmak veya H. pylori enfeksiyonu bağlamında bu proteinin bağışıklık sinyalizasyonuna katkısını belirlemek için S100A12 aktivitesini kullanmak yer alabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>S100A12 Expression</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expression cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL 21 (DE3) competent cells</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C25271</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoinduction medium components</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>Y20020-250.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>S23020-500.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>T60060-250.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2877</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>M65240-100.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>S23100-500.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>P41200-500.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>A20424-500.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2SO4</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>S25150-500.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>G22020-1.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>G32040-500.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lactose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2643</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selection agent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ampicillin</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>A40040-5.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S100A12 Purification</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA Start Chromatography System</td>
			<td>GE</td>
			<td>29-220-94</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Q Sepharaose Fast Flow</td>
			<td>GE</td>
			<td>17-5156-01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiPrep 16/60 S-200 HR</td>
			<td>GE</td>
			<td>17-1166-01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop lite spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-LITE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>T60040-1000.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H. pylori Culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood agar plates</td>
			<td>Lab Supply Company</td>
			<td>BBL221261</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brucella broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B3051</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol (250X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12531018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>793566</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>229997</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression, purification, and antimicrobial activity of s100a12

Calgranulin proteinleri doğal bağışıklığın önemli aracılarıdır ve EF el ailesinin kalsiyum bağlayıcı proteinlerin S100 sınıfının üyesidir. Bazı S100 proteinleri, geçiş metallerini yüksek afinite ile bağlama kapasitesine sahiptir ve bunları, &quot;beslenme bağışıklığı&quot; olarak adlandırılan bir süreçte mikrobiyal patojenlere işgal etmekten alıkoyar. S100A12 (EN-RAGE), hem çinko hem de bakırı bağlar ve makrofajlar ve nötrofiller gibi doğal immün hücrelerde oldukça bol miktarda bulunur. S100A12&#39;nin aktif, metal bağlayıcı konfigürasyonunda ekspresyon, zenginleştirme ve saflaştırma için rafine edilmiş bir metodu sunuyoruz. Bakteriyel büyüme ve canlılık analizlerinde bu proteinin kullanılması, S100A12&#39;nin bakteri patojeni Helicobacter pylori&#39;ye karşı antimikrobiyal etkinliğe sahip olduğunu ortaya koymaktadır . Antimikrobiyal aktivite, besleyici çinkoyu kenetleyen S100A12&#39;nin çinko bağlanma aktivitesine dayandığından, büyüme için çinko gerektiren H.pylori&#39;yi açlıktan besler ve proliferation.

S100A12 ifade ve saflaştırma Üç aşamalı bir saflaştırma 50 mL bakteri kültüründen ~ 40 mg rekombinant S100A12 üretti. İlk adım, endojen E. coli proteinlerinin amonyum sülfat çökeltilmesiydi. Bu aşamayı anyon değişim kromatografisi izledi ( Şekil 1A ). Protein, Coomassie Brilliant Blue ile boyanan bir SDS-PAGE ile izlenir ( Şekil 1B ). Saflaştırma...

Watch this Scientific Journal Video about Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12 at JoVE.com

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Burada, S100A12&#39;yi (calgranulin C) ifade etmek ve saflaştırmak için bir yöntem sunuyoruz. İnsan patojen H. pylori&#39;ye karşı antimikrobiyal aktivitesini ölçmek için bir protokolü açıklıyoruz.

S100A12&#39;nin Ekspresyon, Saflaştırma ve Antimikrobiyal Aktivitesi

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

expression-purification-and-antimicrobial-activity-of-s100a12

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Biochemistry

Unit 1

Drugs for Peptic Ulcer Disease

SCIENTISTS IN ACTION

8.3K Görüntüleme.  Fisk University.  Burada, S100A12'yi (calgranulin C) ifade etmek ve saflaştırmak için bir yöntem sunuyoruz. İnsan patojen H. pylori'ye karşı antimikrobiyal aktivitesini ölçmek için bir protokolü açıklıyoruz. 

Video: Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug used to treat depression and anxiety by binding to the serotonin transporter with high-affinity, blocking serotonin reuptake. Here we report an efficient procedure and a set of tools to stabilize, express, purify, and crystallize serotonin transporter-antibody complexes bound to S-citalopram and other antidepressants. Mutations which stabilize the serotonin transporter were identified using an S-citalopram binding assay. Serotonin transporter expressed in baculovirus-transduced HEK293S GnTI- cells, was reconstituted into proteoliposomes and used to raise high-affinity antibodies. We have developed a strategy to discover antibodies that are useful for structural studies. A straightforward approach for the expression of antibody fragments in Sf9 cells has also been established. Transporter-antibody complexes purified using this procedure are well-behaved and readily crystallize, producing complexes with S-citalopram that diffract X-rays to 3-4 &#197; resolution. The strategies developed here can be utilized to determine the structure of other challenging membrane proteins.

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

This manuscript describes how to screen for thermostabilizing mutations, purify the human serotonin transporter, generate high affinity antibodies, and crystallize the serotonin transporter-antibody complex bound to the antidepressant drug S-citalopram. This protocol can be adapted to the study of other challenging membrane transporters, receptors, and channels.

Termo, İfade, saflaştırılması, ve İnsan serotonin Transporter Kristalizasyon Bound<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Biyokimya

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- channel (CaCC) predominantly expressed in retinal pigment epithelium (RPE). The physiological and pathological significance of BEST1 is highlighted by the fact that over 200 distinct mutations in the BEST1 gene have been genetically linked to a spectrum of at least five retinal degenerative disorders, such as Best vitelliform macular dystrophy (Best disease). Therefore, understanding the biophysics of bestrophin channels at the single-molecule level holds tremendous significance. However, obtaining purified mammalian ion channels is often a challenging task. Here, we report a protocol for the expression of mammalian bestrophin proteins with the BacMam baculovirus gene transfer system and their purification by affinity and size-exclusion chromatography. The purified proteins have the potential to be utilized in subsequent functional and structural analyses, such as electrophysiological recording in lipid bilayers and crystallography. Importantly, this pipeline can be adapted to study the functions and structures of other ion channels.

The purification of ion channels is often challenging, but once achieved, it can potentially allow in vitro investigations of the functions and structures of the channels. Here, we describe the stepwise procedures for the expression and purification of mammalian bestrophin proteins, a family of Ca2+-activated Cl- channels.

İfade ve arıtma memeli Bestrophin iyon kanalları

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a chemical defense because it has antimicrobial activity and is considered a natural insecticide. Caffeine can also produce negative allelopathic effects that prevent the growth of surrounding plants. In addition, people around the world consume caffeine for its analgesic and stimulatory effects. Due to interest in the technological applications of caffeine, research on the biosynthetic pathway of this compound has grown. These studies have primarily focused on understanding the biochemical and molecular mechanisms that regulate the biosynthesis of caffeine. In vitro tissue culture has become a useful system for studying this biosynthetic pathway. This article will describe a step-by-step protocol for the quantification of caffeine and for measuring the transcript levels of the gene (CCS1) encoding caffeine synthase (CS) in cell suspensions of C. arabica L. as well as its activity.

This protocol describes an efficient methodology for the extraction and quantification of caffeine in cell suspensions of C. arabica L. and an experimental process for evaluating the enzymatic activity of caffeine synthase with the expression level of the gene that encodes this enzyme.

Kafein ayıklama, enzimatik aktivite ve kafein Synthase bitki hücre kullanılamaz hale gelen gen ifadesi

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic purification methods. This manuscript illustrates the technical details involved in the anaerobic purification process, including the preparation of buffers and reagents, the methods for column chromatography in a glove box, and the desalting of the protein prior to kinetics. Also described are the methods for preparing and using an oxygen electrode to perform kinetic characterization of an oxygen-utilizing enzyme. These methods are illustrated using the dioxygenase enzyme DesB, a gallate dioxygenase from the bacterium Sphingobium sp. strain SYK-6.

Here we present a protocol for anaerobic protein purification, anaerobic protein concentration, and subsequent kinetic characterization using an oxygen electrode system. The method is illustrated using the enzyme DesB, a dioxygenase enzyme which is more stable and active when purified and stored in an anaerobic environment.

Anaerobik Protein Saflaştırma ve DesB Dioxygenase etkinliği ve inhibisyon çalışmak için oksijen elektrodu ile kinetik Analizi

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium homeostasis, particularly store-operated calcium entry, which is critical to maintaining proper function of synaptic vesicle release and intracellular signaling pathways. Accordingly, TRPC channels have been implicated in a variety of human diseases including cardiovascular disorders such as cardiac hypertrophy, neurodegenerative disorders such as Parkinson&#39;s disease, and neurologic disorders such as spinocerebellar ataxia. Therefore, TRPC channels represent a potential pharmacologic target in human diseases. However, the molecular mechanisms of gating in these channels are still unclear. The difficulty in obtaining large quantities of stable, homogeneous, and purified protein has been a limiting factor in structure determination studies, particularly for mammalian membrane proteins such as the TRPC ion channels. Here, we present a protocol for the large-scale expression of mammalian ion channel membrane proteins using a modified baculovirus gene transfer system and the purification of these proteins by affinity and size-exclusion chromatography. We further present a protocol to collect single-particle cryo-electron microscopy images from purified protein and to use these images to determine the protein structure. Structure determination is a powerful method for understanding the mechanisms of gating and function in ion channels.

This protocol describes techniques used to determine ion channel structures by cryo-electron microscopy, including a baculovirus system used to efficiently express genes in mammalian cells with minimum effort and toxicity, protein extraction, purification, and quality checking, sample grid preparation and screening, as well as data collection and processing.

İfade ve insan Lipid duyarlı ba * kanal TRPC3 arınma için tek-parçacık Cryo-elektron mikroskobu ile yapısal kararlılık

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also known as Band 3), the most abundant membrane protein in the red blood cells. The SLC4 family is homologous with borate transporters, which have been characterized in plants and fungi. It remains a significant technical challenge to express and purify membrane transport proteins to homogeneity in quantities suitable for&#160;structural or functional studies. Here we describe detailed procedures for the overexpression of borate transporters in Saccharomyces cerevisiae, isolation of yeast membranes, solubilization of protein by detergent, and purification of borate transporter homologs from S. cerevisiae, Arabidopsis thaliana, and Oryza sativa. We also detail a glutaraldehyde cross-linking experiment to assay multimerization of homomeric transporters. Our generalized procedures can be applied to all three proteins and have been optimized for efficacy. Many of the strategies developed here can be utilized for the study of other challenging membrane proteins.

Here we present a protocol to express, solubilize, and purify several eukaryotic borate transporters with homology to the SLC4 transporter family using yeast. We also describe a chemical cross-linking assay to assess the purified homomeric proteins for multimeric assembly. These protocols can be adapted for other challenging membrane proteins.

İfade, Solubilization ve ökaryotik Bor taşıyıcılar arıtma

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, fluorophores are prone to loss of signal via photobleaching by dissolved oxygen (O2). To prevent photobleaching and extend the fluorophore lifetime, oxygen scavenging systems (OSS) are employed to reduce O2. Commercially available OSS may be contaminated by nucleases that damage or degrade nucleic acids, confounding interpretation of experimental results. Here we detail a protocol for the expression and purification of highly active Pseudomonas putida protocatechuate-3,4-dioxygenase (PCD) with no detectable nuclease contamination. PCD can efficiently remove reactive O2 species by conversion of the substrate protocatechuic acid (PCA) to 3-carboxy-cis,cis-muconic acid. This method can be used in any aqueous system where O2 plays a detrimental role in data acquisition. This method is effective in producing highly active, nuclease free PCD in comparison with commercially available PCD.

Protocatechuate 3,4-dioxygenase (PCD) can enzymatically remove free diatomic oxygen from an aqueous system using its substrate protocatechuic acid (PCA). This protocol describes the expression, purification, and activity analysis of this oxygen scavenging enzyme.

Nükleazsız Oksijen Çöpçü Protocatechuate 3,4-Dioksijenaz İfadesi ve Saflaştırma

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this superfamily generally display multi-functionality, involving mainly hydrolase and decarboxylase mechanisms. This article presents a series of consecutive methods for the expression and purification of FAHD proteins, mainly FAHD protein 1 (FAHD1) orthologues among species (human, mouse, nematodes, plants, etc.). Covered methods are protein expression in E. coli, affinity chromatography, ion exchange chromatography, preparative and analytical gel filtration, crystallization, X-ray diffraction, and photometric assays. Concentrated protein of high levels of purity (&#62;98%) may be employed for crystallization or antibody production. Proteins of similar or lower quality may be employed in enzyme assays or used as antigens in detection systems (Western-Blot, ELISA). In the discussion of this work, the identified enzymatic mechanisms of FAHD1 are outlined to describe its hydrolase and decarboxylase bi-functionality in more detail.

Expression and purification of fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing proteins is described with examples (expression in E. coli, FPLC). Purified proteins are used for crystallization and antibody production and employed for enzyme assays. Selected photometric assays are presented to display the multi-functionality of FAHD1 as oxaloacetate decarboxylase and acylpyruvate hydrolase.

Fumarylacetoasetat Hydrolase etki alanı Içeren proteinleri ifade, arıtma, kristalizasyon ve enzim Asdimleri

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand its catalytic mechanism, allosteric behavior, and details of the enzymatic transformation of substrate to product in PLP-dependent enzymes. In this work, a novel expression system to produce the isolated &#945;- and isolated &#946;-subunit allowed the purification of high amounts of pure subunits and &#945;2&#946;2 StTS complex from the isolated subunits within 2 days. Purification was carried out by affinity chromatography followed by cleavage of the affinity tag, ammonium sulfate precipitation, and size exclusion chromatography (SEC). To better understand the role of key residues at the enzyme &#946;-site, site-direct mutagenesis was performed in prior structural studies. Another protocol was created to purify the wild type and mutant &#945;2&#946;2 StTS complexes. A simple, fast and efficient protocol using ammonium sulfate fractionation and SEC allowed purification of &#945;2&#946;2 StTS complex in a single day. Both purification protocols described in this work have considerable advantages when compared with previous protocols to purify the same complex using PEG 8000 and spermine to crystalize the &#945;2&#946;2 StTS complex along the purification protocol. Crystallization of wild type and some mutant forms occurs under slightly different conditions, impairing the purification of some mutants using PEG 8000 and spermine. To prepare crystals suitable for x-ray crystallographic studies several efforts were made to optimize crystallization, crystal quality and cryoprotection. The methods presented here should be generally applicable for purification of tryptophan synthase subunits and wild type and mutant &#945;2&#946;2 StTS complexes.

This article presents a series of consecutive methods for the expression and purification of Salmonella typhimurium tryptophan synthase comp this protocol a rapid system to purify the protein complex in a day. Covered methods are site-directed mutagenesis, protein expression in Escherichia coli, affinity chromatography, gel filtration chromatography, and crystallization.

PCR Mutagenezi, Klonlama, İfade, Hızlı Protein Saflaştırma Protokolleri ve Triptofan Synthase'in Vahşi Tipinin ve Mutant Formlarının Kristalizasyonu

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...

Ganglioside Extraction, Purification and Profiling

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially abundant in the brain. Expressed primarily on the outer leaflet of the plasma membranes of cells, they modulate the activities of cell surface proteins via lateral association, act as receptors in cell-cell interactions and are targets for pathogens and toxins. Genetic dysregulation of ganglioside biosynthesis in humans results in severe congenital nervous system disorders. Because of their amphipathic nature, extraction, purification, and analysis of gangliosides require techniques that have been optimized by many investigators in the 80 years since their discovery. Here, we describe bench-level methods for the extraction, purification, and preliminary qualitative and quantitative analyses of major gangliosides from tissues and cells that can be completed in a few hours. We also describe methods for larger scale isolation and purification of major ganglioside species from brain. Together, these methods provide analytical and preparative scale access to this class of bioactive molecules.

Gangliosides are sialic acid-bearing glycosphingolipids that are particularly abundant in the brain. Their amphipathic nature requires organic/aqueous extraction and purification techniques to ensure optimal recovery and accurate analyses. This article provides overviews of analytic and preparative scale ganglioside extraction, purification, and thin layer chromatography analysis.

Ganglioside Ekstraksiyonu, Saflaştırma ve Profilleme

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially ...