Bu çalışma Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, CONACYT, Meksika (hibe numarası 154833) ve Universidad Nacional Autónoma de Mexico tarafından desteklendi. Yazarlar, Víctor González, Rosa I. Santamaría, Patricia Bustos ve Soledad Juarez&#39;e idari ve teknik tavsiyeler için teşekkür etmek istiyorlar.

1. CAPRRESI Protokolü NOT: Şekil 1 , genel CAPRRESI protokolünü gösterir. Bu teknik, siliko tasarıma ve arzulanan kimeraların oluşturulmasına dayanır. <ol><li> Klonlama plasmidinin seçimi, pUC18 veya pUC19. <ol><li> Teknik taleplere en iyi uyan pUC vektörünü seçin. NOT: Her iki vektör birden fazla klonlama alanının yönlendirilmesi haricinde aynı sıraya sahiptir. Bu, oligonükleotidlerin tasarımı ve PCR plazmiti parçalanması için önemlidir. </li></ol></li><li> Vahşi tipli genlerin ve pUC18 / 19 dizilerinin in silico analizi. <ol><li> Vahşi tipli genlerin DNA dizilerini elde edin ve bir FASTA format dosyasına kaydedin ( ör . Genes.fas). NOT: pUC18 / 19 vektörlerinin sekansları pUC.fas dosyasında bulunur ( Şekil 1 , adım 1). </li><li> Hangi kısıtlama enzimini belirleyinYmes, REsearch.pl komut dosyasını çalıştırarak vahşi tipli genleri ve pUC18 / 19 dizilerini kesmeyin. Alternatif olarak, bir çevrimiçi araç ile bir kısıtlama enzim bölgesi araştırması yapın ( Şekil 1 , adım 2). <ol><li> Bir terminalin içine aşağıdakileri yazın: Perl REsearch.pl genes.fas Perl REsearch.pl pUC.fas NOT: Bu komutlar aşağıdaki çıktı dosyalarını oluşturur: genes_lin.fas, genes_re.fas, pUC_lin.fas ve pUC_re.fas. </li><li> Yabanıl tip genleri, genes_re.fas ve pUC.fas dosyalarını karşılaştırarak seçilen pUC18 / 19 vektörünün çoklu klonlama alanına klonlamak için uygun kısıtlama enzimlerini seçin. Ekin pUC18 / 19 vektörünün ampisilin direnç genine ( ampR ) göre yönünü seçin. </li></ol></li><li> Vahşi tip genlerin kodlama bölgesini (dış oligonükleotidler) büyütmek için ileri ve ters oligonükleotitler tasarlayın. Her 5 &#39;ucuna uygun kısıtlama enzimi bölgesi dahil edinOligonükleotitlerin; Bu insert yönünü belirleyecektir. <ol><li> İleri oligonükleotidlerde fonksiyonel bir ribozom bağlama sitesi ekleyin. </li><li> Her iki vahşi türevi geni de vektörün içine aynı yönde yerleştirin. </li></ol></li></ol></li><li> Kimera montajı ve plazmid bozulması için kırılma bölgelerinin seçimi. <ol><li> Translate.pl komut dosyasını çalıştırarak vahşi ve ampR genlerinin amino asit dizisini elde edin ( Şekil 1 , adım 3). <ol><li> Bir terminalin içine aşağıdakileri yazın: Perl translate.pl genes.fas Perl translate.pl ampr.fas NOT: Bu betik aşağıdaki çıktı dosyalarını oluşturacaktır: genes_aa.fas ve ampR_aa.fas. </li></ol></li><li> İki vahşi amino asit sekansını uygun bir yazılımla ( örn . KASÇI) küresel olarak hizalayın 9 . </li><li> Kimera asse için istenen kırılma bölgelerini seçin (3-6 amino asit)Sıralı hizalamaya dayalı olarak mbly. Onları FASTA formatındaki bir dosyaya kaydedin ( ör . , Regions.fas). </li><li> Seçilen amino asit uzayı kodlayan DNA sekanslarını her iki yabanıl tip gen üzerinde bulun. </li></ol></li><li> Restriksiyon enzimi alanlarını içeren eşanlamlı DNA sekanslarının üretimi. <ol><li> Kırma bölgeleri olarak seçilen her bir amino asit sekansı gerginliği için kodlayan tüm eş anlamlı DNA dizilerini elde edin ( Şekil 1 , adım 4); Bu sekanslar regions.fas dosyasında saklandı. <ol><li> Bir terminalin içine aşağıdakileri yazın: Perl synonym.pl regions.fas NOT: Bu betik regions_syn.fas çıktı dosyasını oluşturacaktır. </li></ol></li><li> Sinonim DNA dizileri üzerinde bulunan kısıtlama enzim sitelerini arayın. <ol><li> Bir terminal içine aşağıdakileri yazın: perl REsynonym.pl regions_syn.fas NOT: Bu betik, regions_syn-re.fas çıktı dosyasını oluşturacaktır. </li></ol></li><li> Her iki vahşi tipli genin eşanlamlı sekansları arasında paylaşılan bir kısıtlama enzimi seçin; Bu site kısıtlama enzimi sindirimi yoluyla kimeraları bir araya getirmek için kullanılacaktır. Seçilen kısıtlama enziminin, ne vahşi tip genleri ne de pUC18 / 19 vektör sekanslarını kesmediğini doğrulayın. <ol><li> Genes_re.fas, pUC_re.fas ve regions_syn-re.fas dosyalarında bulunan kısıtlama enzimlerini karşılaştırın. </li></ol></li><li> Silikonun orijinallerini, eşanlamlı DNA dizileri için, her iki vahşi türe ait genin karşılık gelen lokuslarında değiştirin. Eşanlamlı DNA dizilerini vahşi dizi dosyasına (genes.fas) ekleyin. </li><li> Genes.fas dosyasında bulunan genlerin amino asit dizisini elde edin ( perl translate.pl genes.fas ). </li><li> Vahşi ve eş anlamlı DNA dizilerinden çevrilen amino asit dizilerini hizalayın. Her iki dizinin de aynı olduğunu doğrulayın. </li><li> PU üzerinde bulunan ampR geni ile bu bölümün tüm adımlarını tekrarlayınC18 / 19 vektör. NOT: Amaç, ampR genini (dosya ampr.fas) iki tamamlayıcı parçaya bölmektir. AmpR genini bozmak için seçilen kısıtlama enzimi, kimera montajı için kullanılanlardan farklı olmalıdır. </li></ol></li><li> İki vahşi türe ait genin seçilen pUC18 / 19 vektörüne bağımsız olarak klonlanması (Şekil 1, adım 3). <ol><li> Seçilen pUC18 / 19 plasmid DNA&#39;sını bir plazmid DNA saflaştırma kiti kullanarak saflaştırın. <ol><li> Örneğin E. coli DH5α&#39;nın pUC18 plazmid ile transforme edilmesi ve transformantların 37 ° C&#39;de katı LB-0.3 mg / mL ampisilin (Amp) üzerinde büyümesini sağlayın. Bir transformant koloni seçin, yeni bir LB-0.3 mg / mL Amp plakası inoküle edin ve gece boyunca 37 ° C&#39;de büyütün. </li><li> Önceki kültürden bir miktar alın ve 6-8 saat boyunca 37 ° C&#39;de sıvı LB-0.3 mg / mL Amp içinde büyütün. Plazmid DNA&#39;sını bir kit kullanarak çıkarın. </li></ol></li><li> PCR kullanılarak, toplam genomik DNA&#39;dan vahşi tip genler yükseltilirHarici oligonükleotidleri saflaştır. Mümkünse yüksek kaliteli DNA polimeraz kullanın. Verimi en üst düzeye çıkaran DNA polimerazını seçin. PCR, üreticinin talimatlarına ve oligonükleotidlerin erime sıcaklığına göre gerçekleştirilir. <ol><li> Kullanılan DNA polimeraz, amplikon boyutu, şablonu ve oligonükleotitlere bağlı olarak PCR döngülerini çalıştırın. Örneğin, rpoD DNA&#39;sını çoğaltmak için, 50 μL reaksiyon hazırlayın: 5 uL 10x tampon, 2 μL 50 mM MgSO 4 , 10 mM dNTP karışımı 1 uL, her 10-μM oligonükleotidin 2 μL (Tablo 2), 2 Şablon DNA&#39;sı ( E. coli DH5α toplam DNA), 35.8 μL ultra saf su ve 0.2 μL yüksek doğrulukta DNA polimeraz. Aşağıdaki PCR döngülerini çalıştırın: İlk denatürasyon için 1 dakika, ardından 30 çevrim amplifikatörü (denatürasyon için 94 ° C&#39;de 30 saniye, oligonükleotidlerin tavlanması için 60 ° C&#39;de 30 saniye ve 68 ° C&#39;de 2 dakika) genişletmek). </li><li> 1.2 g çözünürAgaroz, mikrodalga fırında ısıtılarak 100 mL&#39;lik iki damıtılmış suda yıkanır. Bir jel tepsi ve tarağı toplayın ve yatay jel şist içine koyun. Jel tepsisini eritilmiş agaroz çözeltisi ile doldurun ve katılaşmasına izin verin. Tarağı çıkarın. </li><li> Jel elektroforez odasına yerleştirilir. Odaya 1x Tris-asetat-EDTA tamponu doldurun. Jel kuyularına 50 μL PCR ürünü yükleyin. Örnekleri elektroforez ( örn . 110 V&#39;de 1 saat boyunca). </li><li> Elektroforezden sonra, jel yavaşça çalkalanarak 10 dakika boyunca 100 mg&#39;lık 1 mg / mL etidyum bromür çözeltisi içeren 100 ml&#39;lik çift damıtılmış suyla lekelenir. Jeli yavaşça sallayarak iki kez damıtılmış suda 10 dakika daha yıkayın; Yatay bir çalkalayıcı kullanın. Dikkat: Etidyum bromür toksik bir bileşiktir; Koruyucu eldiven ve pamuklu bir laboratuar önlüğü giyin. </li><li> Bir kit kullanarak jelin ilgili bantlarından vahşi tipli gen DNA&#39;yı saflaştırın. Boyanmış jelin bir UV odacığa yerleştirilmesi ile bantları görselleştirin (Önerilen dalga boyu: 300 nm). Jelin maruziyetini asgari seviyede tutun. Bir DNA saflaştırma kiti kullanın ve üreticinin talimatlarını izleyin. Dikkat: UV radyasyonu tehlikelidir; Koruyucu bir kalkan, bardak ve pamuk laboratuar ceketi takın. </li></ol></li><li> Üreticinin talimatlarına göre kısıtlama enzimleri ile saflaştırılmış vahşi tipli genleri ve pUC18 / 19 plasmid DNA&#39;yı özümleyin. Mümkünse hızlı sindirim enzimlerini kullanın. Örneğin, ultrafure su 10 uL, 10X tampon 2 mcL, Kpn I kısıtlama enzimi 1 uL ve Xba I kısıtlama enzimi 1 mcL pUC18 DNA (300 ng / μL) sindirmek 6 mcL. Reaksiyonu 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de bırakın. <ol><li> Restriksiyon enzimlerini üreticinin talimatlarına göre etkisiz hale getirin. Örneğin, çift sindirim reaksiyonunu Kpn I- Xba I&#39;i 80 ° C&#39;de 5 dakika boyunca etkisiz hale getirin. </li></ol></li><li> Karışım ekleme: hacimsel bir rasattaki vektör DNAO 3: 1. Ligasyon reaksiyonu için üreticinin talimatlarını izleyin. Mümkünse hızlı ligasyon enzimlerini kullanın (reaksiyonu 10 dakika boyunca 25 ° C&#39;de bırakın). NOT: Tipik olarak, kitleri kullanarak saflaştırma sonrası DNA konsantrasyonu, sindirim ve ligasyon reaksiyonları için yeterlidir. Örneğin, 6 μL rpoD DNA ( Kpn I- Xba I, 150 ng / μL), 3 μL pUC18 DNA ( Kpn I- Xba I, 150 ng / μL), 10 uL 2x tampon, 1 μL ultra safi ilave edin Su ve 1 uL T4 DNA ligazı. Ligasyon reaksiyonu 25 ° C&#39;de 10 dakika bekletilir. </li><li> Yardımcı Materyaller&#39;de açıklandığı üzere E. coli DH5α&#39;yı ligasyon reaksiyonundan 2-4 uL ile değiştirin. Dönüştürülen hücreleri katı LB / Amp / X-gal / IPTG plakalarına yerleştirin. Plakaları gece boyunca 37 ° C&#39;de bırakın. </li><li> Beyaz renkli transformant E. coli kolonilerini seçin ve yeni bir LB / Amp plakası üzerine çizin. Plakaları gece boyunca 37 ° C&#39;de bırakın &lt;/ Li&gt; <li> Ek Malzemelerde açıklandığı gibi, reaksiyonun dizilimi için adayları seçmek için bir koloni PCR yapın. Adalardan plazmid DNA&#39;yı çıkarın. Alternatif olarak, insertleri klonlamak için kullanılan aynı restriksiyon enzimleriyle aday plasmid DNA&#39;yı sindirin. </li><li> Sıralı servis sağlayıcı ile sıra adayı yapılandırmaları 10 . Bir DNA birleştirici 11 ( Şekil 1 , adım 5) kullanarak diziyi siliko olarak toplayın . </li></ol></li><li> PCR ile plazma bozunumu, ardından kısıtlama enzimi sindirimi. <ol><li> Sırasıyla vahşi tip ve ampR genleri için kırılma bölgelerindeki silico ileri ve ters oligonükleotidlerde tasarım. Eşdeğer DNA sekansı için vahşi tip fragmanı (adım 1.4&#39;te elde edilen) siliko olarak değiştirin. NOT: Bu eşanlamlı DNA sekansı bir sınır enzim bölgesi içerir. İleri ve geri oligonükleotidler tO kısıtlama enzimi sitesi. Oligonükleotidler 21-27 nükleotid arasında değişmeli ve bir sitozin veya guanin ile sonuçlanmalı ve bir kısıtlama enzimi bölgesi içermelidir. Bir ileri oligonükleotit, şablon DNA üzerindeki hedef bölgesi ile aynı sekansa sahiptir. Bir ters oligonükleotit, şablon DNA üzerindeki hedef bölgenin ters tamamlayıcı dizisidir. </li><li> PCR reaksiyonları için DNA şablonu olarak iki vahşi tipli gen yapısını kullanın ( örn., PUC18 rpoD ve pUC18 sigA ). Her bir yapının iki tamamlayıcı parçası elde edin (pUC18 rpoD σ1-σ2, pUC18 rpoD σ3-σ4, pUC18 sigA σ1-σ2 ve pUC18 sigAσ3-σ4) ( Şekil 1 , adım 6). </li><li> DNA örneklerini agaroz jel içine% 1-1.2 [w / v] yükleyin. PCR ürünlerini DNA şablondan elektroforez ile ayırın ( örn . 1 saat boyunca 110 V). Alternatif olarak, DNA şablonunu kırmak için Dpn I ile PCR reaksiyonlarını sindirin . NOT: DpnBen enzim sadece metillenmiş DNA dizilerini tanır (5&#39;-GATC-3 &#39;). <ol><li> Bir DNA saflaştırma kiti kullanarak numuneleri saflaştırın. Üreticinin yönergelerini izleyin. </li></ol></li><li> Üreticinin talimatlarına göre tüm tamamlayıcı DNA parçalarını uygun kısıtlama enzimleri ile iki kez sindirin. Mümkünse hızlı özüt restriksiyon enzimlerini kullanın. Örneğin, pUC18rpoDσ1-σ2 DNA fragmanını Afl II ve Spe I ile üreticinin protokolünü kullanarak çift-sindirin. Sindirim reaksiyonunu 37 ° C&#39;de 15 dakika bekletin. </li><li> Restriksiyon enzimlerini üreticinin talimatlarına göre etkisiz hale getirin. Örneğin, Afl II- Spe I&#39;i 80 ° C&#39;de 20 dakika boyunca etkisiz hale getirin. </li></ol></li><li> DNA ligasyonu ve bakteriyel transformasyon kullanılarak plazma geri kazanım. <ol><li> İstenilen kimerik geni birleştirmek için uygun DNA fragmanlarını hacimsel 1: 1 oranında karıştırın ( Şekil 31, adım 7). NOT: Bu yolla ampR geninin bütünlüğü restore edilerek işlevsel bir protein üretilir. <ol><li> Örneğin, 4 μL pUC18 rpoD σ1-σ2 DNA ( Afl II- Spe I ile sindirim, 150 ng / μL), 4 uL pUC18 sigA σ3-σ4 DNA&#39;sı ( Afl II- Spe I, 150 ng / μL) 10 uL 2x tampon, 2 uL ultra saf su ve 1 uL T4 DNA ligaz; Kitin arındırılmasından sonraki DNA konsantrasyonu, sindirim ve daha sonra ligasyon için yeterlidir. Ligasyon reaksiyonu 25 ° C&#39;de 10 dakika bekletilir. </li></ol></li><li> E. coli DH5α&#39;yı 3-5 μL&#39;lik kinera montaj ligasyon reaksiyonu ile (Takviye Malzemeleri) değiştirin. Gece boyunca 37 ° C&#39;de gece boyunca LB / Amp / X-gal / IPTG plakalardaki transformant hücreleri büyütün. </li><li> Beyaz renkli transformant E. coli kolonilerini seçin ve yeni bir LB / Amp plakası üzerine çizin. Plakaları gece 37&#39;de bırakın° C. </li><li> Tamamlayıcı Materyaller&#39;de açıklandığı gibi, bir sekanslama reaksiyonu için aday seçmek için bir koloni PCR yapın. % 1-1.2 (w / v) agaroz jelinde bantları elektroforez yaparak gözlemleyin (adım 2.3.2.1&#39;de açıklanmıştır). </li><li> Olumlu adaylardan kültürler kazanın. Plazmid DNA saflaştırma kiti kullanarak onlardan plazmid DNA&#39;yı çıkarın. </li></ol></li></ol> 2. Sıra Adayı Şimerik Yapılar <ol><li> Sekans servis sağlayıcısının yönergelerini izleyerek, plasmid DNA&#39;nın kalitesinin sıralama reaksiyonu için yeterince iyi olduğundan emin olun. DNA&#39;yı arıtma kitleri kullanarak çıkarın. Örneğin, sekans hizmet sağlayıcısının İnternet sayfasında, numuneler için önerilen DNA konsantrasyonuna özel dikkat gösterin. Bir DNA kantifikasyon cihazı kullanarak numunelerin konsantrasyonunu elde edin. </li><li> Sıralı aday kimerik yapılar ile sıralama servis sağlayıcı 10 . </li><li> Birleştirin se<html> In silico DNA assembler ile okuma okuma 11 . </li><li> Sıralı hizalama takımları 9 , 12 kullanarak toplayılmış karşı silico- tasarlanmış kimerik sekansları hizalayın. Kimerik genin başarıyla kaynaştığını doğrulayın. </li></ol> 3. Hazırlıklar Yapmak NOT: Canlı hücreleri içeren tüm basamaklar, Bunsen brülörü açıkken temiz bir lamine akış kaputunda yapılmalıdır. <ol><li> E. coli DH5α-yetkili hücreleri üretmek. <ol><li> E. coli-uyumlu hücreleri üretmek için, yayınlanmış protokolleri izleyin veya Ek Malzemelere bakın . Alternatif olarak, piyasada bulunan yetkili hücreleri kullanın. </li></ol></li><li> Dönüşen E. coli DH5α-yetkili hücreler. <ol><li> E. coli kültürlerinin kimyasal transformasyonu için, yayınlanan protokolleri takip edinClass = &quot;xref&quot;&gt; 13 veya Ek Malzemelere bakın . Alternatif olarak bakteriyel transformasyon için elektroporasyon kullanın. Piyasada bulunan yetkili hücreler kullanılıyorsa, üreticinin yönergelerini izleyin. </li></ol></li><li> E. coli DH5α&#39;dan genomik ve plasmid DNA&#39;yı saflaştırma. <ol><li> Ek Malzemelerde belirtildiği gibi, piyasada bulunan kitleri kullanarak veya yayınlanan protokolleri takip eden nükleik asit ekstraksiyonu gerçekleştirin 13 . </li></ol></li><li> Koloni PCR yapın. <ol><li> Sonradan sıralama reaksiyonu için aday transformant kolonileri tanımlamak için bu tekniği kullanın. NOT: Bu yöntem, dizilerin bütünlüğünün son bir doğrulamasını temsil etmez. Bu tekniğin ayrıntılı bir açıklaması Yardımcı Materyaller&#39;de mevcuttur . </li></ol></li><li> Çözümlerin hazırlanması. <ol><li> Görmek <sTrong&gt; çözüm hazırlama hakkında daha fazla bilgi için Tablo 1&#39;e bakınız. </li></ol></li><li> CAPRRESI protokolü için gereken komut dosyalarını ve sıra dosyalarını indirin. <ol><li> İstenen türlerin tüm genom dizisini içeren gen bank dosyalarını indirin, bir genom tarayıcı kullanarak seçilen genin DNA dizisini çıkarın ve fasta dosya biçiminde kaydedin. CAPRRESI protokolü için gerekli olan Perl komut dosyalarını indirin. Komut dizilerini ve sıra dosyalarını aynı dizinde saklayın. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+hybrid+genes+without+the+use+of+restriction+enzymes:+gene+splicing+by+overlap+extension.">Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension.</a> Gene. 77 (1), 61-68 (1989).</li><li>Vos, M. J., Kampinga, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PCR+amplification+strategy+for+unrestricted+generation+of+chimeric+genes.">A PCR amplification strategy for unrestricted generation of chimeric genes.</a> Anal. Biochem. 380 (2), 338-340 (2008).</li><li>Hawkins, N. C., Garriga, G., Beh, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+Precise+GFP+Fusions+in+Plasmids+Using+Yeast+Homologous+Recombination.">Creating Precise GFP Fusions in Plasmids Using Yeast Homologous Recombination.</a> Biotechniques. 34 (1), 1-5 (2003).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).</li><li>Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+recombinase:+The+universal+reagent+for+genome+tailoring.">Cre recombinase: The universal reagent for genome tailoring.</a> Genesis. 26 (2), 99-109 (2000).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Norrander, J., Kempe, T., Messing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+improved+M13+vectors+using+oligodeoxynucleotide-directed+mutagenesis.">Construction of improved M13 vectors using oligodeoxynucleotide-directed mutagenesis.</a> Gene. 26 (1), 101-106 (1983).</li><li>Gruber, T. M., Gross, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sigma+subunits+and+the+partitioning+of+bacterial+transcription+space.">Multiple sigma subunits and the partitioning of bacterial transcription space.</a> Annu Rev Microbiol. 57, 441-466 (2003).</li><li>Edgar, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MUSCLE:+multiple+sequence+alignment+with+high+accuracy+and+high+throughput.">MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput.</a> Nucleic Acids Res. 32 (5), 1792-1797 (2004).</li><li>Thompson, J. D., Gibson, T. J., Higgins, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sequence+alignment+using+ClustalW+and+ClustalX.">Multiple sequence alignment using ClustalW and ClustalX.</a> Curr Protoc Bioinformatics. , 1-22 (2002).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Cloning:+A+laboratory+manual.">Molecular Cloning: A laboratory manual.</a> CSHLP. , (2001).</li><li>Rutherford, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artemis:+sequence+visualization+and+annotation.">Artemis: sequence visualization and annotation.</a> Bioinformatics. 16 (10), 944-945 (2000).</li></ol>

Yazarlar rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ettiler.

CAPRRESI, PRM 2&#39;ye alternatif olarak tasarlandı. Orijinal PRM güçlü bir tekniktir; Seçilen genlerin herhangi bir kısmı boyunca DNA sekanslarının kaynaşmasına izin verir. PRM için, vahşi tipli genler aynı plazmid içine klonlanmalıdır. Bundan sonra, oligonükleotidler, plasmidde bulunan vahşi tip ve antibiyotik direnç genleri içinde tasarlanır. Plazmid parçalanması, künt uçlu, yüksek doğrulukta DNA polimerazları ve önceden tasarlanmış oligonükleotitler kullanıla...

Kimerik gen montajı, protein fonksiyonunu ve / veya biyoteknolojik amaçları aydınlatmak için moleküler biyolojide yaygın şekilde kullanılmaktadır. Çakışan PCR ürün amplifikasyonu 1 , plasmid geri kazanım 2 , homolog rekombinasyon 3 , CRISPR-Cas9 sistemleri 4 , bölgeye yönelik rekombinasyon 5 ve Gibson topluluğu 6 gibi genleri kaynaştırmak için farklı yöntemler mevcuttur. Bunların her biri farklı teknik avantajlar sunmaktadır; Örtüşen PCR tasarımının esnekliği, plazmid geri kazanım sırasında yapıların in vivo seçimi veya CRISPR-Cas9 ve Gibson sistemlerinin yüksek etkinliği. Öte yandan, bu yöntemlerin bazılarını yerine getirirken bazı zorluklar ortaya çıkabilir; Örneğin, ilk iki yaklaşım kör uçlu DNA fragmanlarına dayanır ve bu tür ürünlerin ligasyonu stik ile karşılaştırıldığında teknik açıdan zor olabilirKy-bitişli ligasyon. Site yönlendirmeli rekombinasyon, CreoLuxP sisteminde olduğu gibi, orijinal üzerinde fazladan DNA dizileri izi bırakabilir ( 5) . CRISPR-Cas9 bazen hedef bölgeye ek olarak diğer genom bölgelerini de değiştirebilir 4 . Burada, plasmid geri kazanım yöntemini (PRM) eşanlamlı DNA dizileri üzerindeki kısıtlama enzimi alanlarının eklenmesi ile birleştiren protein kodlayıcı genlerin kaynaştırılması için bir protokol olan plazmid kurtarma ve restriksiyon enzim bölgesi ekleme (CAPRRESI) ile kinera montajı başlattığımızdan, ligasyon verimliliğini arttırıyoruz . Amino asit dizilimi bütünlüğünü sağlamak için, sınırlama enzimi sahaları, eş anlamlı DNA sekansı uzantılarına eklenir. CAPPRESI&#39;nin yararları sıradan laboratuar reaktifleri / araçları ( örneğin enzimler, yetkili hücreler, çözeltiler ve termosikleler) kullanılarak gerçekleştirilebilmesi ve hızlı enzim (uygun enzim kullanıldığında) hızlı sonuçlar verebilmesidir. Kısıtlamaya güvenmekEş anlamlı DNA sekanslarından çıkan enzim siteleri, ilgi proteinleri içindeki tam füzyon noktalarının seçimini sınırlayabilir. Bu gibi durumlarda, hedef genler örtüşen oligonükleotidler kullanılarak kaynaştırılmalı ve sınır enzimi alanları vektörün direnç geni üzerine eklenmelidir. CAPRRESI yedi basit adımdan oluşur ( Şekil 1 ): 1) klonlama vektörü, pUC18 veya pUC196&#39;nın seçilmesi; 2) kaynaştırılacak olan vahşi tipli dizilerin in silico analizinde; 3) kimera montajı ve plasmid bozulması için kırılma bölgelerinin seçilmesi; 4) sınırlama enzimi alanlarını içeren eşanlamlı DNA sekanslarının üretilmesi; 5) vahşi tiplendirilmiş genlerin seçilen plazmite bağımsız olarak klonlanması; 6) PCR ile plasmid parçalanması, ardından kısıtlama enzimi sindirimi; Ve 7) DNA ligasyonu ve bakteri dönüşümü kullanılarak plazmid geri kazanım. Bu teknikle üretilen kimerik genler,Sıralama. PUC18 / 19 vektörleri, küçük boy ( yani 2,686 baz çiftleri), yüksek kopya sayısı, avantajlı sıralama reaksiyon özellikleri ve ticari kullanılabilirlik 7 gibi klonlama ve kimera montajı için teknik avantajlar sunar. Burada, kimera bir araya getirmek ve işlemek için bir Escherichia coli ana ürünü kullanıldı, çünkü bakteri kültürleri ucuzdur ve hızlı büyürler. Bu durumda, füzyon fragmanlarının nihai hedef plasmidlere daha sonra klonlanması gerekecektir ( örn., Bakterilerde pRK415 veya memeli hücrelerinde pCMV gibi ifade vektörleri). CAPRRESI, iki primer sigma faktörü geninin füzyonu için test edildi: E. colirpoD ve Rhizobium etlisigA . Birincil sigma faktörleri, transkripsiyonun başlatılmasından sorumlu RNA polimeraz altbirimleridir ve bunlar dört alan ( yani, σ1, σ2, σ3 ve σ4) 8&#39;den oluşur . Amino asit dizisi lengtRpoD ve sigA tarafından kodlanan proteinlerin sırasıyla sırasıyla 613 ve 685&#39;dir . RpoD ve SigA% 48 kimliğe sahiptir (% 98 kapsama alanı). Bu primer sigma faktörleri, bölgeler σ2 ve σ3 arasında iki tamamlayıcı parçaya ayrıldı. Bu tasarıma göre iki şimerik gen toplandı: chimera 01 (RpoDσ1-σ2 + SigAσ3-σ4) ve kimerik 02 (SigAσ1-σ2 + RpoDσ3-σ4). DNA füzyon ürünleri sıralamayla doğrulanmıştır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="756">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:115px;">11304011</td>
			<td style="width:355px;">Produces a mix of blunt/3&#8217;-A overhang ended PCR products</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">High pure plasmid isolation kit</td>
			<td style="width:71px;">Roche</td>
			<td style="width:115px;">11754785001</td>
			<td>Used for all plasmid purification reactions</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">High pure PCR product purification kit</td>
			<td style="width:71px;">Roche</td>
			<td style="width:115px;">11732676001</td>
			<td>Used for all PCR purification reactions from agarose gels</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">AflII restriction enzyme</td>
			<td style="width:71px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:115px;">R0520L</td>
			<td>Recognizes sequence 5&#8217;-CTTAAG-3&#8217; and cuts at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">KpnI-HF restriction enzyme</td>
			<td style="width:71px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:115px;">R3142L</td>
			<td>Recognizes sequence 5&#8217;-GGTACC-3&#8217; and cuts at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">SpeI-HF restriction enzyme</td>
			<td style="width:71px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:115px;">R3133L</td>
			<td>Recognizes sequence 5&#8217;-ACTAGT-3&#8217; and cuts at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">XbaI restriction enzyme</td>
			<td style="width:71px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:115px;">R0145L</td>
			<td>Recognizes sequence 5&#8217;-TCTAGA-3&#8217; and cuts at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ampicillin sodium salt</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">A0166-5G</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nalidixic acid</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">N8878-5G</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">Y1625-1KG</td>
			<td>Bacterial cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Casein peptone</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">70171-500G</td>
			<td>Bacterial cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">S9888-1KG</td>
			<td>Sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Agar</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">05040-1KG</td>
			<td>Bacterial cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">XbaI restriction enzyme</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:115px;">FD0684</td>
			<td>Fast digest XbaI enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">KpnI restriction enzyme</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:115px;">FD0524</td>
			<td>Fast digest KpnI enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Quick Ligation Kit</td>
			<td style="width:71px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:115px;">M2200S</td>
			<td>Fast DNA ligation kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">AflII restriction enzyme</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:115px;">FD0834</td>
			<td>Fast digest AflII enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SpeI restriction enzyme</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:115px;">FD1253</td>
			<td>Fast digest SpeI enzyme</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

caprresi: chimera assembly by plasmid recovery and restriction enzyme site insertion

Burada, plazmid geri kazanım ve kısıtlama enzim bölgesi ekleme (CAPRRESI) ile kinera montajını sunuyoruz. CAPRRESI orijinal plazmid geri kazanım yönteminin pek çok avantajından yararlanır ve DNA ligasyon reaksiyonlarını kolaylaştırmak için kısıtlama enzimi sindirimini sağlar (kimera montajı için gerekli). Bu protokol için, kullanıcılar aynı plazmite vahşi tip genleri klonlamışlardır (pUC18 veya pUC19). Kimeraların birleştirilmesi gereken amino asit dizisi bölgelerinin in silico seçiminden sonra, kullanıcılar şifreleyen tüm eşanlamlı DNA dizilerini elde eder. Geçici Perl betiği, kullanıcıların tüm eş anlamlı DNA dizilerini belirlemelerini sağlar. Bu adımdan sonra, başka bir Perl betiği tüm eş anlamlı DNA dizileri üzerinde kısıtlama enzim siteleri arar. Bu siliko analiz de pUC18 / 19 plazmidlerinde bulunan ampisilin direnç genini ( ampR ) kullanarak gerçekleştirilir. Kullanıcılar, PCR ile wildfit ve ampR genlerini parçalamak için eşanlamlı bölgeler içerisindeki oligonükleotidleri tasarlarlar . Obt&#39;dan sonraTamamlayıcı DNA fragmanlarını arındırma ve saflaştırma, kısıtlama enzimi sindirimi gerçekleştirilir. Şimera montajı, uygun tamamlayıcı DNA fragmanlarının bağlanmasıyla gerçekleştirilir. Küçük ebat (2.686 baz çifti), yüksek kopya sayısı, avantajlı sıralama reaksiyon özellikleri ve ticari kullanılabilirlik gibi teknik avantajlar sundukları için CAPRRESI için pUC18 / 19 vektörleri seçilmiştir. Kimera montajı için restriksiyon enzimlerinin kullanımı, künt uçlu ürünler üreten DNA polimerazlarına olan ihtiyacı ortadan kaldırır. CAPRRESI, protein kodlayan genlerin eritilmesi için hızlı ve düşük maliyetli bir yöntemdir.

Şekil 1 , CAPRRESI&#39;yi tasvir etmektedir. Bu yöntemi kullanarak, iki kimerik gen, iki bakteriyel primer sigma faktörünün alanlarını değiştirerek ( yani, E. coli RpoD ve R. etli SigA) toplandı. RpoD ve sigA genlerinin DNA dizileri sırasıyla GenBank genom dosyalarından Artemis Genome Browser 14 kullanılarak NC_000913 ve NC_007761&#39;den elde edildi. PUC18 vektörünün DNA sekan...

Watch this Scientific Journal Video about CAPRRESI: Chimera Assembly by Plasmid Recovery and Restriction Enzyme Site Insertion at JoVE.com

CAPRRESI: Plazmid Geri Kazanımı ve Kısıtlama Enzim Sitesinin Eklenmesiyle Kimera Düzeneği | Biyoloji | Video

CAPRRESI: Chimera Assembly by Plasmid Recovery and Restriction Enzyme Site Insertion

Burada, sinomi DNA sekanslarına restriksiyon enzim sahalarının yerleştirilmesi ve fonksiyonel plazmid geri kazanımına dayanan bir protokol olan plazmit geri kazanım ve restriksiyon enzim yeri ekleme (CAPRRESI) ile kinera montajını sunuyoruz. Bu protokol protein kodlayan genlerin eritilmesi için hızlı ve düşük maliyetli bir yöntemdir.

CAPRRESI: Plazmid Geri Kazanım ve Kısıtlama Enzim Yerinin Eklenmesi ile Chimera Meclisi

Here, we present chimera assembly by plasmid recovery and restriction enzyme site insertion (CAPRRESI). CAPRRESI benefits from many strengths of the ...

caprresi-chimera-assembly-plasmid-recovery-restriction-enzyme-site

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Genetics

Biotechnology

SCIENTISTS IN ACTION

11.5K Görüntüleme.  Universidad Nacional Autónoma de México.  Burada, sinomi DNA sekanslarına restriksiyon enzim sahalarının yerleştirilmesi ve fonksiyonel plazmid geri kazanımına dayanan bir protokol olan plazmit geri kazanım ve restriksiyon enzim yeri ekleme (CAPRRESI) ile kinera montajını sunuyoruz. Bu protokol protein kodlayan genlerin eritilmesi için hızlı ve düşük maliyetli bir yöntemdir. 

Video: CAPRRESI: Chimera Assembly by Plasmid Recovery and Restriction Enzyme Site Insertion

Principles of Site-Specific Recombinase (SSR) Technology

Site-specific recombinase (SSR) technology allows the manipulation of gene structure to explore gene function and has become an integral tool of molecular biology. Site-specific recombinases are proteins that bind to distinct DNA target sequences. The Cre/lox system was first described in bacteriophages during the 1980's. Cre recombinase is a Type I topoisomerase that catalyzes site-specific recombination of DNA between two loxP (locus of X-over P1) sites. The Cre/lox system does not require any cofactors. LoxP sequences contain distinct binding sites for Cre recombinases that surround a directional core sequence where recombination and rearrangement takes place. When cells contain loxP sites and express the Cre recombinase, a recombination event occurs. Double-stranded DNA is cut at both loxP sites by the Cre recombinase, rearranged, and ligated ("scissors and glue"). Products of the recombination event depend on the relative orientation of the asymmetric sequences.
SSR technology is frequently used as a tool to explore gene function. Here the gene of interest is flanked with Cre target sites loxP ("floxed"). Animals are then crossed with animals expressing the Cre recombinase under the control of a tissue-specific promoter. In tissues that express the Cre recombinase it binds to target sequences and excises the floxed gene. Controlled gene deletion allows the investigation of gene function in specific tissues and at distinct time points. Analysis of gene function employing SSR technology --- conditional mutagenesis -- has significant advantages over traditional knock-outs where gene deletion is frequently lethal.

Principles of Site-Specific Recombinase SSR Technology

The advent of site-specific recombinase (SSR) technology and the Cre/lox system has led to numerous advances in molecular biology, and has proven itself as a valuable tool for assessing gene function in transgenic animals. This interview discusses the mechanism of site specific recombination by Cyclization recombinase (Cre) and how the use of this enzyme has led to the development of conditional mutagenesis, which has significant advantages over traditional knock out strategies.

Site Özel Recombinase (SSR) Teknoloji İlkeleri

Site-specific recombinase (SSR) technology allows the manipulation of gene structure to explore gene function and has become an integral tool of molecular ...

Biyoloji

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed centrifugation. When properly planned and executed, an AUC sedimentation velocity or sedimentation equilibrium experiment can reveal a great deal about a protein in regards to size and shape, sample purity, sedimentation coefficient, oligomerization states and protein-protein interactions.
This technique, however, requires a rigorous level of technical attention. Sample cells hold a sectored center piece sandwiched between two window assemblies. They are sealed with a torque pressure of around 120-140 in/lbs. Reference buffer and sample are loaded into the centerpiece sectors and then after sealing, the cells are precisely aligned into a titanium rotor so that the optical detection systems scan both sample and reference buffer in the same radial path midline through each centerpiece sector while rotating at speeds of up to 60, 000 rpm and under very high vacuum
Not only is proper sample cell assembly critical, sample cell components are very expensive and must be properly cared for to ensure they are in optimum working condition in order to avoid leaks and breakage during experiments. Handle windows carefully, for even the slightest crack or scratch can lead to breakage in the centrifuge. The contact between centerpiece and windows must be as tight as possible; i.e. no Newton s rings should be visible after torque pressure is applied. Dust, lint, scratches and oils on either the windows or the centerpiece all compromise this contact and can very easily lead to leaking of solutions from one sector to another or leaking out of the centerpiece all together. Not only are precious samples lost, leaking of solutions during an experiment will cause an imbalance of pressure in the cell that often leads to broken windows and centerpieces. In addition, plug gaskets and housing plugs must be securely in place to avoid solutions being pulled out of the centerpiece sector through the loading holes by the high vacuum in the centrifuge chamber. Window liners and gaskets must be free of breaks and cracks that could cause movement resulting in broken windows.
This video will demonstrate our procedures of sample cell assembly, torque, loading and rotor alignment to help minimize component damage, solution leaking and breakage during the perfect AUC experiment.

The analytical ultracentrifuge (AUC) sample cell holds sample and reference buffer and during experiments and is exposed to high vacuum and rotor speeds up to 60,000 rpm. This video will demonstrate the rigorous attention to detail necessary for assembly, loading and alignment of this very important component of an AUC experiment.

Kurul, Yükleme ve Analitik ultrasantrifüjdeki Örnek Hücre Hizalama

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the inner ear (fig 1). Hair cells in the developing cochlea, which are the mechanosensory cells of the auditory system, are aligned in one row of inner hair cells and three (in the base and mid-turns) to four (in the apical turn) rows of outer hair cells that span the length of the organ of Corti. Hair cells transduce sound-induced mechanical vibrations of the basilar membrane into neural impulses that the brain can interpret. Most cases of sensorineural hearing loss are caused by death or dysfunction of cochlear hair cells.
An increasingly essential tool in auditory research is the isolation and in vitro culture of the organ explant 1,2,9. Once isolated, the explants may be utilized in several ways to provide information regarding normative, anomalous, or therapeutic physiology. Gene expression, stereocilia motility, cell and molecular biology, as well as biological approaches for hair cell regeneration are examples of experimental applications of organ of Corti explants.
This protocol describes a method for the isolation and culture of the organ of Corti from neonatal mice. The accompanying video includes stepwise directions for the isolation of the temporal bone from mouse pups, and subsequent isolation of the cochlea, spiral ligament, and organ of Corti. Once isolated, the sensory epithelium can be plated and cultured in vitro in its entirety, or as a further dissected micro-isolate that lacks the spiral limbus and spiral ganglion neurons. Using this method, primary explants can be maintained for 7-10 days. As an example of the utility of this procedure, organ of Corti explants will be electroporated with an exogenous DsRed reporter gene. This method provides an improvement over other published methods because it provides reproducible, unambiguous, and stepwise directions for the isolation, microdissection, and primary culture of the organ of Corti.

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

This procedure describes a method for the isolation and culture of the murine organ of Corti with or without the spiral limbus and spiral ganglion neurons. We also demonstrate a method for the expression of an exogenous reporter gene in the organ of Corti explant by electroporation.

İlköğretim Kültür ve Corti murin Organ Plazmid Elektroporasyon.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later stages of embryonic development, and to define how enhancers and promoters regulate gene expression within the embryo. The protocol demonstrated here can be used to efficiently produce transgenic Xenopus laevis embryos. This transgenesis approach involves three parts: 1. Sperm nuclei are isolated from adult X. laevis testis by treatment with lysolecithin, which permeabilizes the sperm plasma membrane. 2. Egg extract is prepared by low speed centrifugation, addition of calcium to cause the extract to progress to interphase of the cell cycle, and a high-speed centrifugation to isolate interphase cytosol. 3. Nuclear transplantation: the nuclei and extract are combined with the linearized plasmid DNA to be introduced as the transgene and a small amount of restriction enzyme. During a short reaction, egg extract partially decondenses the sperm chromatin and the restriction enzyme generates chromosomal breaks that promote recombination of the transgene into the genome. The treated sperm nuclei are then transplanted into unfertilized eggs. Integration of the transgene usually occurs prior to the first embryonic cleavage such that the resulting embryos are not chimeric. These embryos can be analyzed without any need to breed to the next generation, allowing for efficient and rapid generation of transgenic embryos for analyses of promoter and gene function. Adult X. laevis resulting from this procedure also propagate the transgene through the germline and can be used to generate lines of transgenic animals for multiple purposes.

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

This video protocol demonstrates a method for generating transgenic Xenopus laevis by introduction of transgenes into sperm nuclei followed by nuclear transplantation into unfertilized eggs.

Transgenik, üretimi Xenopus laevis Kısıtlama Enzim aracılığı ile Entegrasyon ve Nükleer Nakli

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide range of species, including mammals. It also causes a decrease in body weight and fertility, as well as lower levels of plasma glucose, insulin, and IGF-1 in these animals. This treatment is often referred to as dietary restriction (DR) or caloric restriction (CR). The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as an important model organism for studying the biology of aging. Both environmental and genetic manipulations have been used to model DR and have shown to extend lifespan in C. elegans. However, many of the reported DR studies in C. elegans were done by propagating animals in liquid media, while most of the genetic studies in the aging field were done on the standard solid agar in petri plates. Here we present a DR protocol using standard solid NGM agar-based plate with killed bacteria.

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Here we present a protocol for performing solid plate-based dietary restriction in C. elegans with killed bacteria.

Katı Plaka tabanlı Diyet Kısıtlama Caenorhabditis elegans</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

Yüksek verim Maya Plazmid overekspresyonu Ekran

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells. Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus (EBV) and Kaposi's Sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), which cause multiple human malignancies 1-3. These two genomes are replicated in a licensed manner, each using a single viral protein and cellular replication machinery, and are passed to daughter cells during cell division despite their lacking traditional centromeres 4-8.
Much work has been done to characterize the replications of these plasmid genomes using methods such as Southern blotting and fluorescence in situ hybridization (FISH). These methods are limited, though. Quantitative PCR and Southern blots provide information about the average number of plasmids per cell in a population of cells. FISH is a single-cell assay that reveals both the average number and the distribution of plasmids per cell in the population of cells but is static, allowing no information about the parent or progeny of the examined cell.
Here, we describe a method for visualizing plasmids in live cells. This method is based on the binding of a fluorescently tagged lactose repressor protein to multiple sites in the plasmid of interest 9. The DNA of interest is engineered to include approximately 250 tandem repeats of the lactose operator (LacO) sequence. LacO is specifically bound by the lactose repressor protein (LacI), which can be fused to a fluorescent protein. The fusion protein can either be expressed from the engineered plasmid or introduced by a retroviral vector. In this way, the DNA molecules are fluorescently tagged and therefore become visible via fluorescence microscopy. The fusion protein is blocked from binding the plasmid DNA by culturing cells in the presence of IPTG until the plasmids are ready to be viewed.
This system allows the plasmids to be monitored in living cells through several generations, revealing properties of their synthesis and partitioning to daughter cells. Ideal cells are adherent, easily transfected, and have large nuclei. This technique has been used to determine that 84% of EBV-derived plasmids are synthesized each generation and 88% of the newly synthesized plasmids partition faithfully to daughter cells in HeLa cells. Pairs of these EBV plasmids were seen to be tethered to or associated with sister chromatids after their synthesis in S-phase until they were seen to separate as the sister chromatids separated in Anaphase10. The method is currently being used to study replication of KSHV genomes in HeLa cells and SLK cells. HeLa cells are immortalized human epithelial cells, and SLK cells are immortalized human endothelial cells. Though SLK cells were originally derived from a KSHV lesion, neither the HeLa nor SLK cell line naturally harbors KSHV genomes11. In addition to studying viral replication, this visualization technique can be used to investigate the effects of the addition, removal, or mutation of various DNA sequence elements on synthesis, localization, and partitioning of other recombinant plasmid DNAs.

A method of observing individual DNA molecules in live cells is described. The technique is based on the binding of a fluorescently tagged lac repressor protein to binding sites engineered into the DNA of interest. This method can be adapted to follow many recombinant DNAs in live cells over time.

Floresan Mikroskobu ile Çoklu Nesiller boyunca Canlı Memeli Hücrelerinde Plazmid Çoğaltma İzlenmesi

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells.  Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus  (EBV) ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

Yetişkin Fare Kalvaryal Kemik İliği içinde Hematopoietik kök hücrelerin Vivo 4-Boyutlu Takip

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1&#945; Promoter Using Gibson Assembly

Gibson assembly (GA) cloning offers a rapid, reliable, and flexible alternative to conventional DNA cloning methods. We used GA to create customized plasmids for expression of exogenous genes in mouse embryonic stem cells (mESCs). Expression of exogenous genes under the control of the SV40 or human cytomegalovirus promoters diminishes quickly after transfection into mESCs. A remedy for this diminished expression is to use the human elongation factor-1 alpha (hEF1&#945;) promoter to drive gene expression. Plasmid vectors containing hEF1&#945; are not as widely available as SV40- or CMV-containing plasmids, especially those also containing N-terminal 3xFLAG-tags. The protocol described here is a rapid method to create plasmids expressing FLAG-tagged CstF-64 and CstF-64 mutant under the expressional regulation of the hEF1&#945; promoter. GA uses a blend of DNA exonuclease, DNA polymerase and DNA ligase to make cloning of overlapping ends of DNA fragments possible. Based on the template DNAs we had available, we designed our constructs to be assembled into a single sequence. Our design used four DNA fragments: pcDNA 3.1 vector backbone, hEF1&#945; promoter part 1, hEF1&#945; promoter part 2 (which contained 3xFLAG-tag purchased as a double-stranded synthetic DNA fragment), and either CstF-64 or specific CstF-64 mutant. The sequences of these fragments were uploaded to a primer generation tool to design appropriate PCR primers for generating the DNA fragments. After PCR, DNA fragments were mixed with the vector containing the selective marker and the GA cloning reaction was assembled. Plasmids from individual transformed bacterial colonies were isolated. Initial screen of the plasmids was done by restriction digestion, followed by sequencing. In conclusion, GA allowed us to create customized plasmids for gene expression in 5 days, including construct screens and verification.

Synthesis of custom plasmids is labor and time consuming. This protocol describes the use of Gibson assembly cloning to reduce the work and duration of custom DNA cloning procedure. The protocol described also produces reliable tagged protein constructs for mammalian expression at similar cost to the traditional cut-and-paste DNA cloning.

Plazmid vektörler oluşturulması Gibson tertibatı kullanılarak insan uzama faktör-1α bir promotörün regülasyonu altında FLAG-etiketli Proteinlerinin İfade

Gibson assembly (GA) cloning offers a rapid, reliable, and flexible alternative to conventional DNA cloning methods. We used GA to create customized ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Fekal Glukokortikoid Analizi: Tek tırnaklılarda in Non-invaziv Adrenal İzleme

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...