Bu, Maya MoClo kitini kullanarak çok genli plazmidlerin montajı için ayrıntılı bir protokoldür. Bu yöntem, çeşitli çok genli sınıf arkadaşlarının kolayca klonlanını sağlar. İlgili parçalardan oluşan büyük bir kütüphane oluşturmak için idealdir.
Golden Gate reaksiyon karışımını kurarak başlayın. Her PCR ürününün 20 femtomoles ve giriş vektörü, 10X T4 Ligase tampon bir mikrolitre, Esp3I 0.5 mikrolitre ve T4 ligase 0.5 mikrolitre ekleyin. Toplam hacmi 10 mikrolitreye çıkarmak için çift damıtılmış su ekleyin.
Sonra klonlama reaksiyonlarını çalıştırın. Tüm reaksiyon karışımını ısı şoku ile DH5 alfa suşuna veya eşdeğer Escherichia coli kimyasal olarak yetkin hücrelere dönüştürün. Hücreleri mililitre kloramfenikol başına 35 mikrogram olan bir lb plakasına yayın.
Sonra plakayı bir gecede 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. 16 ila 18 saat sonra, plakayı inkübatörden alın ve süper klasör yeşil floresan proteinin veya sfGFP'nin daha yoğun bir yeşil renk için gelişmesine izin vermek için yaklaşık beş saat boyunca dört santigrat derecede bırakın. Plakayı taramak için ultra mor veya mavi ışık transilluminator üzerine yerleştirin.
Kolonileri içeren sfGFP, UV ışığı altında floresan yapacaktır. Yeşil koloniler negatiftir, çünkü kesilmemiş kısım plazmid içerirler. Beyaz koloniler muhtemelen olumlu.
% 30 ila 100 beyaz koloniler varsa klonlama başarılı olur. Sol konnektör, sfGFP bırakma, sağ konektör, maya seçim işaretçisi, replikasyon maya kaynağı ve mRFP1, E.coli kökenli ve ampisiline dirençli gen ile parça plazmidi ile bir ara vektör monte edin. Metin el yazmasında açıklandığı gibi klonlama reaksiyonlarını gerçekleştirin.
Tüm reaksiyon karışımını DH5 alfa suşuna dönüştürün, ardından hücreleri mililitre karbenisilin veya ampisilin başına 50 mikrogram olan bir lb plakasına yayın. Bir gecede 37 santigrat derecede kuluçkaya yaslanın. 16 ila 18 saat sonra plakayı inkübatörden çıkar.
Plaka hem soluk kırmızı hem de soluk yeşil koloniler içerecektir. mRFP1 ve sfGFP'nin olgunlaşması için yaklaşık beş saat boyunca dört santigrat derecede tutun. Potansiyel olarak doğru ara vektörü içeren yeşil kolonileri tanımlamak için bir UV veya mavi ışık transilluminator kullanın.
Yeşil kolonileri lb karbenisilin plakasında çizin ve bir gecede 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, onları tekrar kloramfenikol plakasına koyun ve bir gecede 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Kloramfenikol plakalarında yetişen koloniler yanlış monte plazmidler içerir.
Ara vektör başarıyla monte edildikten sonra, transkripsiyon ünitelerini birleştirmeye devam edin. Bu dört parçalı montaj, ara vektör, bir promotör, bir CDS ve determinator içerir. Plazmidleri arındırın, konsantrasyonlarını kaydedin ve her plazmidi mikroliter başına 20 femtomole DNA ile seyreltin.
Klonlama reaksiyonu gerçekleştirdikten sonra, tüm klonlama reaksiyon karışımını DH5 alfa veya eşdeğer E.coli yetkin hücrelerine dönüştürün ve LBN karbenisilin üzerine plakalayın. Sonra plakayı bir gecede 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. 16 ila 18 saat sonra, plakayı inkübatörden alın ve sfGFP'nin olgunlaşması için yaklaşık beş saat boyunca dört santigrat derecede tutun.
Potansiyel olarak doğru transkripsiyon ünitelerini içeren floresan olmayan beyaz kolonileri tanımlamak için bir UV veya mavi ışık transilluminator kullanın. Metin el yazmasında açıklandığı gibi çok genli plazmidler için bir ara vektör birleştirin. Daha sonra tüm klonlama reaksiyon karışımını DH5 alfa hücrelerine dönüştürün ve mililitre kanamycin başına 50 mikrogram ile lb üzerine plakalayın.
Plakayı bir gecede 37 santigrat derecede kuluçkaya yatır. Kırmızı ve yeşil renk bazlı tarama gerçekleştirin, ardından yeşil kolonileri daha önce gösterildiği gibi yanlış montajları taramak için lb kanamycin plaka üzerinde çizgilendirin ve büyütün. Daha sonra, metin el yazmasında açıklandığı gibi bir klonlama reaksiyoni kurarak çok genli plazmidi birleştirin.
Tüm klonlama reaksiyon karışımını DH5 alfa hücrelerine dönüştürün ve lb kanamycin üzerine plakalayın. Plakayı bir gecede 37 santigrat derecede kuluçkaya yatır. Ardından daha önce açıklandığı gibi yeşil beyaz taramayı gerçekleştirin.
Bu protokol, ADE2 lokusunu bozmak için bir bütünleştirici çok genli plazmid oluşturmak için kullanıldı. Dört çoğaltıcı ve bir bütünleştirici çok genli plazmid bir araya getirildi. Ara vektör klonlama için potansiyel olarak doğru kolonilerin oranı% 1.83 idi Ara plazmid klonlandıktan sonra, aradan çok genli plazmidlerin montajının başarı oranı% 93.77 idi Pozitif beyaz kolonilerin ihmal edilebilir sayıları çok genli plazmidlerin yetersiz bir montajını göstermektedir.
Mayaya dönüştükten sonra beta karoten ve likopen üreten koloniler üçüncü günde büyüdü. Her tabaktan dört koloni taze tabaklara serilerek iki gün daha yetiştirildi. Karotenoidler UV-Vis spektrofotometrisi ile çıkarıldı ve ölçüldü.
BTS1/ERG20, sadece ERG20 ile zorlanmaya kıyasla 35 kat daha yüksek beta karoten üretimine yol açar. Aynı şekilde, likopen üretimi sadece ERG20'ye kıyasla BTS1/ERG20 ile gerinimde yaklaşık 16,5 kat daha yüksektir. Çok genli bütünleştirici plazmid, ADE2 lokusunun bozulması için, bir gRNA ve yardımcı DNA olmadan veya gRNA ve yardımcı DNA olarak çok genli bütünleştirici plazmid ile kullanıldı.
Üç ila dört gün sonra, Nourseothricin ile YPD plakasında kırmızı koloniler gözlendi ve bu da ADE2'nin başarıyla bozulduğunu gösterdi. Bu yöntemi denerken, hatırlanması gereken en önemli şey, bu reaksiyon karışımını kurarken DNA konsantrasyonlarını doğru bir şekilde ve pipeti dikkatlice ölçmektir. Bu teknik, Maya Metabolik Mühendisliği alanındaki araştırmacıların maksimum ürün verimi için çok sayıda geni ve promotörleri incelemelerini sağlar.
