Kimeras oluşturmak için yapısal olarak benzer proteinlerin bölgeleri değişimi bize molekülün biyolojik işlevlerinden sorumlu bölgelerin önemini araştırmak için izin verir incelenecek. Bölge değişimleri proteinin genel ikincil yapısını önceden algılar, böylece bölgenin genel yapısı için önemli olan biyolojik fonksiyonlara doğrudan aracılık edenlerden ayırt edilebilir. Değiştirilecek tam bölgelerin seçilebileceği ne olabilir.
Daha büyük değişimlerile başlayarak genellikle proteinin temel işlevselliğini belirlemek için yararlıdır. İşleme başlamak için, metin protokolünde ayrıntılı olarak belirtildiği gibi ilgi proteini ile bölgeleri değiştirmek için donör olarak uygun bir protein seçin. Daha sonra, ref seq web sayfasındaki gen bölümüne ilk olarak erişerek alıcı ve donör proteinlerinin protein amino asit dizilerini referans sıra veritabanından elde edin.
Arama kutusuna ilgi çeken proteinin adını yazın ve arama'ya tıklayın. Açılan listede istenilen türiçin gen adını tıklayın. Belgelenmiş tüm isoformları görmek için ref seq bölümüne gidin.
İlgi nin izoform için sıra tanımlayıcısını tıklatın. Aşağı kaydırın ve genin protein kodlama bölgesini vurgulamak için cd'lere tıklayın. Ekranın sağ alt kısmında FAFSDA'ya tıklayın ve gen dizisini kopyalayın.
Uygun bir DNA düzenleme yazılımı kullanarak DNA dizisini kaydedin. Serbestçe kullanılabilir APE kullanırken, programı açın, boş kutuya kopyalanan sırayı yapıştırın, sıra adını seçin ve kaydet'i tıklatın. Şimdi, ilk farklı yapısal bölgelerde ilgi protein dizisi bölerek farklı kimeric yapılaryerine protein bölgeleri seçin.
Bunu yapmak için, PDBe web sitesinden ilgi protein yapısal verileri indirin. Protein için PDBe sayfasına erişin ve ekranın sağ tarafındaki karşıdan yükleme'ye tıklayarak PDBe dosyasını indirin. PDBe dosyasını Pymol gibi moleküler bir görselleştirme sisteminde açın.
Pymol'da, nükleotit dizisini görüntüleyin, varsayılan yapısal verileri gizleyin ve proteinin yapısal özelliklerini net bir şekilde görselleştirmek için çizgi film görünümünü seçin. Molekülün farklı bölümlerini vurgulamak için ekranın üst kısmındaki nükleotid dizisini tıklatın ve her bir farklı yapısal özelliğe karşılık gelen amino asitleri belirtin. Şimdi, DNA dizisini açarak, seçerek ve ÇEVIRI'ye tıklayarak APE'deki DNA dizisindeki farklı yapısal bölgelere açıklama getirin, sonra ilk bölgenin son amino asitini tıklayarak DNA dizisindeki konumunu vurgulayın ve o bölge için nükleotitin kodlamasını seçin.
Seçime sağ tıklayın ve bir ad ve renk vermek için yeni bir özellik seçin. Önceki adımda tanımlanan her yapısal bölge için işlemi yineleyin. İki proteinin kalıntı dizilerini hizalamak için, ilk olarak, APE donör ve reseptör proteinlerinin tam amino asit dizilerini elde edin.
Daha önce olduğu gibi, donör DNA sırasını açın, seçin ve ORFs translate'e tıklayın. Sonra, Clustal Omega web sayfasına erişin ve sonra iki proteinin amino asit dizilerini koyun. Her dizi düzgün tanımlanabilecek protein adı içeren bir metin satırı ile devam edilmelidir.
Aşağı kaydırın ve gönder'e tıklayın. İndirme hizalama dosyası sekmesini tıklatarak hizalama dosyasını alın ve kaydedin. Bu dosya herhangi bir metin düzenleme programı tarafından açılabilir.
Bir referans olarak hizalama dosyasını kullanarak, dna dizisinde donör proteinin ilgili yapısal bölgelerine açıklama. Reseptör proteininin açıklamalı DNA dizisinin bir kopyasını oluşturun ve kimerik protein olarak yeniden adlandırın. APE'de yeniden adlandırılmış DNA dizisini açın.
Donör proteinin değiş tokuş edilecek bölgeyi seçin, ardından yeniden adlandırılmış reseptör proteinindeki ilgili bölgeyi seçin. Donör protein DNA dizisini yapıştırın ve değişiklikleri kaydedin. APE gibi bir DNA düzenleyicisi kullanarak terminal astarlarını tasarla.
Yeni bir DNA dosyası oluşturun, son terminal astarını lider sırasıyla başlatın. Vektörmcs MCS ve ilgi geninin ilk 18-27 baz çiftleri isteğe bağlı spacer seçilen ilk kısıtlama sitesi izledi. Yeni DNA dosyasında, C terminali astar sırasını, isteğe bağlı bir spacer, seçilen ikinci kısıtlama alanı ve lider dizisi nin ardından ilgi geninin son 18 ila 27 baz çiftiyle başlamak üzere tasarla.
Tüm sırayı vurgulayın, sağ tıklatın ve ters astarı elde etmek için ters tümsegi seçin. Şimdi, kimeric yapılarda sınır bölgelerin her biri için tasarım astarları. Kimera'nın DNA dizisinde, orijinal ve eklenen dizilerin temas ettiği bölgede 30 baz çifti bölgesini vurgulayın.
Bu, her dizide 15 baz çiftinden oluşur. Bölgeyi kopyalayın ve yeni bir DNA dosyasına yapıştırın. Bu sekans ileri astar olacak.
Önceki adımda oluşturulan ileri astarın bir kopyasını yapın ve ters astar olarak yeniden adlandırın. Astar sırasını vurgulayın, sağ tıklatın ve ters astar sırasını oluşturmak için ters tümevarseçeneğini seçin. Kimeric DNA dizisindeki her temas bölgesi için bu adımları tekrarlayın.
Genellikle, değiştirme N terminali veya C terminal bölgelerinde gerçekleşmediği sürece, bir kimera oluşturmak için iki ileri geri astar kümesi gereklidir. Kimerik proteini oluşturan parçaların her biri için ayrı bir PCR reaksiyon karışımı hazırlayın. Önce bir nokta beş mililitrelik mikrofuse tüp buz ve metin protokolü listelenen sırada PCR karışımları farklı reaktifler pipet ayarlayın.
Her PCR reaksiyonu için doğru astarların ve şablonların kullanıldığından emin olun. Her reaksiyon için iki ince duvarlı sıfır noktası iki mililitre PCR tüp etiketlayın ve her tüpte ilgili PCR karışımının 20 mikrolitresini aktarın. PCR tüplerini bir PCR termocycler'a aktarın ve metin protokolünde ayrıntılı olarak belirtildiği gibi protokolü başlatın.
PCR reaksiyonu tamamlandıktan sonra, her tüpe altı x DNA yükleme tamponunun dört mikrolitresini ekleyin. Bir elektroforez ünitesine yüzde bir agaross jeli yerleştirin ve TAE tampon ile kaplayın. Dikkatle bir molekül ağırlığı ikinci ile birlikte jel içine örnekleri yükleyin.
20 ila 45 dakika boyunca 80-120 volt jel çalıştırdıktan sonra, elektroforez ünitesikapatın ve agoross jel çıkarın. UV ışığı altında güçlendirilmiş DNA bantlarını görselleştirin. Jilet kullanarak, jelden tek tek DNA parçalarını kesip iki mililitrelik mikrofit tüpüne aktarın.
DNA parçalarını arındırmak için pcr temizleme kiti ni kullandıktan sonra, numunelerin emiciliğini 260 nanometre ve 340 nanometrede bir spektrofetometrede ölçerek elde edilen DNA miktarını ölçün. Şimdi, kimeric DNA dizisi oluşturmak için PCR amplifikasyon gerçekleştirin. İlk olarak, kimeranın ayrı bileşenlerini daha önce olduğu gibi kaynaştırmak için 50 mikrolitre PCR reaksiyonu ayarlayın.
N terminali ve C terminal astarlarını, güçlendirilmiş DNA parçalarının her birinin 10 nanogramı ile birlikte çalıştırın. 30 mikrolitre çekirdeğin serbest suyunda saflaştırılmış DNA parçasını kurtarın ve ölçün. Bu parça, terminal astarlarında bulunan kısıtlama bölgeleri yle çevrili kimerik DNA dizisini içerir.
Kimerik protein üretimi inter luke ve altı sytokine ailesinin iki üyesi ile örneklenir. Oncostaten M lösemi inhibitör faktörü. OSM asansör ütyük, OSM'nin BC döngü bölgesini ilgili asansör sırası ile değiş tokuş etmekle sonuçlanır.
İlk PCR amplifikasyon adımı üç ayrı reaksiyondan oluşuyordu. N-terminal OSM ileri ve BC başlatmak ters astarlar gerekli N-terminal OSM parçası şablon olarak OSM kullanılır. LIF BC döngüsü, ŞABLON olarak LIF kullanılarak BC start forward ve BC N ters astarları ile elde edilmiştir.
C-terminal OSM parçası bc end forward ve C terminal OSM ters astarlar yanı sıra OSM şablon olarak kullanılır. Bu saflaştırılmış parçalar daha sonra ilgili OSM LIF BC döngü gen dizisini yükseltmek için N-terminal OSM ileri ve C-terminal OSM ters astarları ile birlikte ikinci PCR reaksiyonunda şablon olarak kullanılmıştır. Saflaştırma ve e-coli'ye dönüşmesinin ardından, bireysel plazmidler izole edildi ve DNA parçasının düzgün takılması için restriksiyon enzimsi sindirimi ile tarandı.
Jel elektroforezi daha sonra sıra doğrulama için gönderilen pozitif isabet ler ortaya çıkardı. Kimerik proteinler üretilmelidir ve aktivite mükemmel bir hizipçilik sistemlerinde ölçüldü. Değiştirilen bölgelerin o grup için önemini belirlemek için.
Bu teknik çok yararlı ve sık uygulanan, sinyal reseptörlerinin müdahale amacıyla anahtar fonksiyon etki alanları ve reseptör tanıma siteleri belirlemek için. DNA elektroforezi için kullandığım numara tek kullanımlık eldivenler, laboratuvar paltosu ve koruyucu gözlükler kullanılarak ele alınmalıdır.
