NgF beyne teslim zor. Burada biyoaktif proteinin güvenli ve uzun süreli salınımını sağlayan yeni bir taşıyıcı türü salıyoruz. Bu teknik, ngf'nin gözenekli silikon taşıyıcılara basit ve verimli bir şekilde yüklenmesine olanak sağlar.
Oda sıcaklığında ve güçlü organik çözücüler kullanmadan gerçekleştirilir. Gözenekli silikon taşıyıcı tasarımı mümkün olduğu için taşıyıcılar uzun süreli sürüm için NGF rezervuar implantları olarak hizmet verebilir ama aynı zamanda diğer faktörler ve ilaçlar taşımak için değiştirilebilir. Mühendisler ve kimyagerler için, üretim işlemi gerçekleştirmek daha kolay olabilir.
Yaşam bilim adamları ve klinisyenler için ise, hücre kültürü prosedürleri üremek için nispeten basit olmalıdır. Bir nokta beş bir nokta beş bir nokta beş santimetre silikon gofret bir politetetrafluro gravür hücre içine iyi karakterize direnç ile bir arka temas ve hücre mühür için bir o-halka olarak alüminyum folyo bir şerit kullanarak başlatın. Kumaş her zaman benzer direnç değerleri ile silikon gofret kullanmak için represistable olduğunu.
Elektrokimyasal olarak silikon numunesini akleus hidroflorik asit ve etanol çözeltisi halinde 20 saniye boyunca santimetre karesi 250 milimetrelik sabit bir akım yoğunluğuna eterce. Daha sonra bir azot akışı altında kurutmadan önce etanol ile ortaya çıkan gözenekli silikon filmin yüzeyini üç kez durulayın. Numune kuruduğunda, metro fırınında taze kazınan gözenekli silikon numunesini 800 santigrat derecede, ortam havasında bir saat boyunca oksitlenmiş gözenekli silikon iskelesi oluşturmak için termal olarak oksitlenir.
Numune soğuduğunda, bir doğrama testeresi kullanarak sekiz ila sekiz milimetrelik bir numuneye bölün. Numuneleri NGF ile yüklemek için, her numunenin üzerine 52 mikrolitre taze hazırlanmış NGF yükleme çözeltisi dağıtın ve numuneleri yüksek nem koşullarında kapalı bir tabakta iki saat boyunca oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın. İki saat sonra, numunelerin üzerine çözeltiyi toplayın ve NGF yükleme çözeltisini seyreltin ve toplanan yükleme sonrası çözelti numuneleri iliza kiti için uygun konsantrasyon aralığına kadar toplayın.
Tüm numuneler seyreltildiğinde, kalibrasyon eğrisi örneklerindeki seyreltilmiş numunelerin 100 mikrolitresini bir NGF'nin her kuyusu için oda sıcaklığında iki saatlik kuluçka için antikor kaplamalı 96 iyi iliza plakası ekleyin. Kuluçka sonunda, tabağı dört kez yıkayın ve oda sıcaklığında iki saatlik kuluçka için her kuyuya milimetre başına bir mikrogram lık bir mikrolitre ekleyin. Dört yıkama sonra, gösterildiği gibi her kuyuya Avidin-Horseradish Peroksidace 100 mikrolitre eklemek oda sıcaklığında 30 dakikalık kuluçka ve gösterildiği gibi yıkama tampon dört yıkar takip.
Son yıkamadan sonra, oda sıcaklığında 25 dakikalık renk geliştirme kuluçka için her kuyuya 100 mikrolitre substrat çözeltisi ekleyin. Daha sonra, dalga uzunluğu düzeltme sitriksiyonu 650 nanometre olarak ayarlanmış 405 nanometrede emiciliği ölçmek ve hem yükleme çözeltisindeki NGF konsantrasyonunu hem de kalibrasyon eğrisine dayalı olarak toplanan post loading çözeltisinde NGF konsantrasyonunu belirlemek için bir mikroplaka okuyucu kullanın. In Vitro NGF sürümü için, NGF yüklü okside gözenekli silikon taşıyıcılar sıfır noktası sıfır sıfır bir molar PBS iki mililitre içinde sıfır noktası sıfır yüzde iki sodyum azid yüzde 2 sodyum azid ile desteklenen 37 santigrat derece ve yörünge selamu dakikada 100 rotasyon.
Her aspirasyondan sonra iki mililitre taze PBS ile değiştirerek çözümü iki günde bir toplayın. Daha sonra toplanan serbest bırakma örneklerini eksi 20 santigrat derece depolama için, iliza tarafından yapılan NGF analizine kadar dondurun. Farklılaştırılmış feo cromo sitoma oluşturmak için 12 veya PC 12, hücre kültürü, sentripugation ile hücre süspansiyon toplamak ve taze temel büyüme ortamı beş mililitre hücreleri askıya.
İkinci bir sentribugation sonra, temel büyüme orta üç mililitre damak askıya ve herhangi bir hücre kümeleri ayırmak için hücreleri 10 kez aspire etmek için 23 gauge şırınga kullanın. Sayma sonra, tohum bir kez 10 dördüncü hücrelere santimetre kare çalışma alanı bir kolijen tipi bir farklılaşma ortamı varlığında bir kaplı plakalar üzerinde çalışma alanı. Tabakları kuvöze yerleştirin.
37 santigrat derecede 24 saat sonra her plakaya taze murine beta NGF veya NGF yüklü gözenekli silikon taşıyıcı ekleyin ve plakaları kuvöze geri döndürün. Hücre canlılığını değerlendirmek için, 37 santigrat derecede beş saat boyunca temsili zaman noktalarında uygun bir canlılık göstergesi çözeltisinin yüzde 10'u ile kültürleri kuluçkaya yatırın ve dalga uzunluğu düzeltmesi 630 nanometre olarak belirlenen dalga uzunluğu düzeltmesi ile 490 nanometrede bir spektropometredeki absorbansını ölçün. NGF yüklü gözenekli silikon taşıyıcıların varlığında PC 12 hücre farklılaşmasını değerlendirmek için, bir hücre kültürü kuluçka 24 saat boyunca 12 düşük kollajen kaplı plakalar PC 12 hücreleri tohum ve daha önce elde edilen In Vitro uygun deneysel kuyulara örnekler yayımladı tanıtmak.
24 saatlik bir kuluçkadan sonra, hücreleri ışık mikroskobu ile görüntüleyin ve her kuyuda alkronuritolan hücre sayısını manuel olarak sayın. Farklılaşmış PC 12 hücrelerinin morfrometrik analizi için, NGF ile tedaviden üç gün sonrasına kadar kültürlü hücrelerin faz görüntülerini elde eder ve j.Convert'deki dosyaları sekiz bit formatına dönüştürün ve pikselden mikrometre oranına kadar pikseli ölçmek için görüntü ölçeği çubuğunu kullanın. Ölçeği ayarlamak ve her neuritin uzunluğunu ölçmek için çözümleme ve ölçek ayarlama yı kullanın.
Daha sonra her hücre soma kaynaklanan dallanma noktaları ve nourites sayısını el ile sayın. Elde edilen okside gözenekli silikon filminin yüksek çözünürlüklü taramalı elektron mikroskopi görüntüleri gösterilmiştir. Filmin üst görünümü mikrograf, çapı yaklaşık 40 nanometre gözenekler ile son derece gözenekli doğasını ortaya koymaktadır.
Bir kesitmikrografı, silindirik gözeneklerin birbirine bağlanması ile karakterize edilen iki nokta dokuz mikrometrelik gözenekli bir tabaka kalınlığını ortaya çıkarır. Patlama etkisi olmadan NGF sürekli bir sürümü serbest dönemin sonraki günlerinde çok daha yavaş bir serbest bırakma oranı ile karşılaştırıldığında ilk hafta boyunca daha hızlı bir NGF sürümü ile bir ay süreyle elde edilir. NGF yüklü gözenekli silikon taşıyıcıları ile tedavi PC 12 hücre kültürlerinde karakteristik dallı nöronal ağlarda nöritlerin oluşumunu neden olur.
26 gün sonra bile, yayımlanan NGF gözenekli konak içinde NGF tuzak yaklaşık bir ay süreyle proteinin biyolojik aktivitesini korur belirten yüzde 50'nin üzerinde hücre farklılaşması neden olduğunu unutmayın. NGF yüklü gözenekli silikon tedavi hücre popülasyonlarının birinci ve üçüncü günlerinin morfometrik analizi, NGF yüklü gözenekli silikon ile tedavi edilen PC 12 hücrelerinin test edilen üç parametre için kontrollü tedavi kültürlerinde gözlenenlere benzer morfometrik değerleri sergilediğini ortaya koymaktadır. Sunulan adımların doğrulanması ve doğrulanması, nöronal hücrelerin hayatta kalmasını ve farklılaşmasını sürdürebilen avantajlı bir NGF dağıtım sistemi sağlayacaktır.
Şu anda normal koruyucu etkisini incelemek ve Alzheimer hastalığı gibi dejeneratif hastalıkları bilmek için beyinde implantlar serbest uzun vadeli olarak NGF gözenekli silikon taşıyıcıların kullanımını araştırıyoruz. Bu prosedürü takiben, NGF yüklü gözenekli silikon taşıyıcıların dosal ahşap gangren hücrelerinin normal büyümesi üzerindeki etkisi de incelenebilir. Gözenekli silikon, çok çeşitli uygulamalar için kullanılabilen umut verici bir nano malzemedir.
Biyolojik veya kimyasal sensörler, teşhis ve görüntüleme de dahil olmak üzere burada sunulan dan başka. Gözenekli silikon taşıyıcıların herhangi bir potansiyel toksisitesi ekarte etmek için, hücre hattı doğru, severability kompozisyon gerçekleştirmek ve gözenekli silikon örnekleri sterilize emin olun.
