Bu proje Çin Ulusal Doğa Bilim Vakfı (NSFC) tarafından desteklenmiştir: 31301950 ve 31671288.

Geçerli yöntem kurulmuş ve hasat ve laboratuvarımızda histolojik boyama için 1.000 &#39;den fazla kas örnekleri saklamak için valide edilmiştir. Hayvan bakım ve kullanımını içeren tüm uygulamalar Çin Tarım Bakanlığı tarafından kurulan yönergelere izledi. Örnek Toplama 1. Ekipmanları <ol><li> Her bir kriyojenik şişe ile ilgili örnek bir kimlik etiketleyin. Not: Derin dondurucudaki şişe özel cryosection prosedür (Şekil 1A) taze doku numuneleri dondurma için tasarlanmıştır. Deney şişeleri, bir kalıp fabrikası (Şekil 1C) polipropilen imal edilmektedir. </li><li> uygun bir sıvı azot tankında sıvı azot, gözlükler veya bir yüz kalkanı, derin dondurucu eldiven, 10 cm forseps, 25 cm cımbız, plastik bir soğutucu (iç boyutları: 20 cm uzunluk x 12 cm genişlik x 13.5 cm yüksekliğinde, aşağıdaki malzemelerin temin ; dış boyutları: genişlik x 15 cm yükseklik, 24 cm uzunluk x 16 cm), bir plastik filmin (genişlik x 0.1 mm kalınlığında 2.5 cm uzunluğunda x 0.8 cm),bir bisturi ve A4 PVC bağlayıcı kapaklar (21 cm x 29.5 cm) (Şekil 1B). </li></ol> Kas Örneklerinde 2. Hazırlık <ol><li> önde numune ile birlikte, sıvı azot, 5 dakika ile köpük soğutucu doldurun. Not: sıvı azot parçası edn ve yeni hazırlanmış numunelerin, dokunma zaman gaz haline geçer, çünkü sıvı azotun büyük bir kolon gerekmektedir. kaybını önlemek için sıvı azot devri sıklığını azaltmak için, uygun boyutta bir köpük soğutucu numune sayısına göre önceden kazanılmış olması gerekir. </li><li> Bir örnek alındığında, nazikçe A4 PVC bağlayıcı kapağın bir parçasına koyun ve kas liflerinin yönüne dikkat. NOT: Burada, domuzlarda son bel omur birinciden longissimus Doris kasının kesiti kullanılır. Numuneler yaklaşık 12 cm uzunluğunda, 8 cm genişliğinde ve 5 cm yüksekliğinde bulunmaktadır. </li><li> numune i ile iki paralel kesiler yapmak için bir neşter kullanınn, kas liflerinin doğrultusu, uzunluk olarak yaklaşık 3 cm, birbirinden 0.6 cm. Yaklaşık 0.6 cm genişliğinde x 0.6 cm x 1.5 x yükseklik cm uzunluğunda bir dikdörtgen kazınmış kas kesin. Not: kas liflerinin enine kesit alanı ölçülerek güvenilirliği çok kazıma kas lif oryantasyonuna bağlıdır. </li><li> Yavaşça film (Şekil 2A) uzun kenarına kazıma kas paralel uzunlamasına ekseni ile, plastik film bir parça örneği koymak için, 10 cm forseps kullanın. Not: kas liflerinin yönelim ve nedeniyle hızlı dondurma numunedeki çatlaklar engelleyen bir yapışma işlevi sabitleme yardımcı olan bir tutma işlevi: plastik film iki işlevi vardır. </li><li> Forseps kullanarak, sadece giriş delikleri arasında, etiketlenmiş bir kriyojenik şişe alt ortasına kas dokusunu yerleştirin ve ampul sıkıca (Şekil 2B) kap. </li></ol> 3. Dondurma ve Depolama kas Örneks <ol><li> 25 cm cımbız kullanarak, hızlı bir şekilde sıvı azot (yaklaşık 10-20 s) kaynatın etmez bekleyerek, önceden soğutulmuş köpük soğutucu sıvı azot içinde bütün kriyojenik şişe daldırın. Not: sıvı azot kaynama zaman dondurarak saklamaya uygun vialler dikkatli bir şekilde 10-20 saniye kaynatılarak sıvı azot içinde şişe sokmak, yüzer. </li><li> bir sıvı azot depolama tankı ya da uzun süreli depolama için bir -80 ° C dondurucu kas örnekleri aktarın. </li></ol> 4. Slayt Hazırlama <ol><li> -20 ° C ve -22 ° C arasında bir kriyostat ön soğutma. </li><li> Çıkarın ve eski mikrotom bıçak atmak kriyostat bıçak tutucusu ve devrilme önleyici levha aşağı silin, kriyostat, yeni bir mikrotom bıçağı yükleme ve 8 um kesme kalınlığını ayarlamak. </li><li> Sıvı azot depolama tankı kriyojenik şişede kas örnek aktarın veya -80 ° C sıcaklıkta dondurucuya kriostada, sıvı azot içinde veya kuru buz üzerinde taşınması. </li&gt; <li> örnek kriyostatının sıcaklığına dengelenmeye için 30 dakika bekleyin. NOT: Bir yüksek sıcaklık numunede buz kristallerinin oluşmasını neden olabilir çünkü örnek dokunmatik olabilecek herhangi ekipman, önceden soğutulması gerekir. </li><li> suda çözünür glikoller ve reçineler (OCT) optimum kesme ısısı formülasyon altında numune tutucu örnek monte edin. 8-mikron bölümleri kesilir. Not: ÇSAF kas liflerinin kesit alanı olduğu için, kas liflerinin yönelimine dik bir kesme açısı ayarlayın. </li><li> Bir oda sıcaklık mikroslayd merkezine doğru bölümlerini monte edin. Derhal bir -80 ° C dondurucu içinde bir slayt kutusu içine slayt yerleştirin. slayt RT&#39;de kurumasına izin vermeyin. </li></ol>

<ol><li>Joo, S. T., Kim, G. D., Hwang, Y. H., Ryu, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+fresh+meat+quality+through+manipulation+of+muscle+fiber+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Meat+Sci%22%5BJournal%5D)">Control of fresh meat quality through manipulation of muscle fiber characteristics.</a> Meat Sci. 95 (4), 828-836 (2013).</li>
<li>Lefaucheur, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+second+look+into+fibre+typing--relation+to+meat+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Meat+Sci%22%5BJournal%5D)">A second look into fibre typing--relation to meat quality.</a> Meat Sci. 84 (2), 257-270 (2010).</li>
<li>Fiems, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+Muscling+in+Cattle%3A+Genes%2C+Husbandry%2C+Carcasses+and+Meat%5BTitle%5D)+AND+%22Animals+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Double Muscling in Cattle: Genes, Husbandry, Carcasses and Meat.</a> Animals (Basel). 2 (3), 472-506 (2012).</li>
<li>Cockett, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+callipyge+mutation+and+other+genes+that+affect+muscle+hypertrophy+in+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22Genet+Sel+Evol%22%5BJournal%5D)">The callipyge mutation and other genes that affect muscle hypertrophy in sheep.</a> Genet Sel Evol. 37, Suppl 1 65-81 (2005).</li>
<li>Stinckens, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RYR1+g.1843C%3ET+mutation+is+associated+with+the+effect+of+the+IGF2+intron3-g.3072G%3EA+mutation+on+muscle+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Anim+Genet%22%5BJournal%5D)">The RYR1 g.1843C>T mutation is associated with the effect of the IGF2 intron3-g.3072G>A mutation on muscle hypertrophy.</a> Anim Genet. 38 (1), 67-71 (2007).</li>
<li>Brameld, J. M., Buttery, P. J., Dawson, J. M., Harper, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+and+hormonal+control+of+skeletal-muscle+cell+growth+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nutr+Soc%22%5BJournal%5D)">Nutritional and hormonal control of skeletal-muscle cell growth and differentiation.</a> Proc Nutr Soc. 57 (2), 207-217 (1998).</li>
<li>Reinoso, R. F., Telfer, B. A., Rowland, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+water+content+in+rats+measured+by+desiccation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Tissue water content in rats measured by desiccation.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 38 (2), 87-92 (1997).</li>
<li>Meng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+triage+and+freezing+for+models+of+skeletal+muscle+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease.</a> J Vis Exp. (89), (2014).</li>
<li>Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do%27s+and+don%27ts+in+the+preparation+of+muscle+cryosections+for+histological+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis.</a> J Vis Exp. (99), e52793(2015).</li>
<li>Meijer, A. E., Vloedman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histochemical+characterization+of+the+coupling+state+of+skeletal+muscle+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">The histochemical characterization of the coupling state of skeletal muscle mitochondria.</a> Histochemistry. 69 (3), 217-232 (1980).</li>
<li>Harnkarnsujarit, N., Kawai, K., Suzuki, T. <a target="_blank" href="http://agris.fao.org/agris-search/search.do?recordID=US201500156343">Effects of Freezing Temperature and Water Activity on Microstructure, Color, and Protein Conformation of Freeze-Dried Bluefin Tuna (Thunnus orientalis).</a> Food Bioprocess Technol. 8 (4), 916-925 (2015).</li>
<li>Dubowitz, V., Sewry, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDubowitz%2C+V+%22Muscle+Biopsy%3A+A+Practical+Approach%22">Muscle Biopsy: A Practical Approach</a>. , Elsevier. Ch. 15 407-422 (2007).</li>
<li>Suvarna, S. K., Layton, C., Bancroft, J. D. <a target="_blank" href="http://www.elsevier.ca/ISBN/9780702042263/Bancrofts-Theory-and-Practice-of-Histological-Techniques">Bancroft's Theory and Practice of Histological Techniques: Expert Consult: Online and Print, 7e</a>. , Elsevier. (2008).</li>
<li>Sulaiman, S. A., Kamarudin, N. A. Z. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/222964817_Bubble_Size_in_Coalescence_Dominant_Regime_of_Turbulent_Air-Water_Flow_Through_Horizontal_Pipes">Bubbles Size Estimation in Liquid Flow Through a Vertical Pipe.</a> J Appl Sci. 12 (23), 2464-2468 (2012).</li>
<li>Fukutomi, K., et al. <a target="_blank" href="https://www.jstage.jst.go.jp/article/kikaib1979/53/496/53_496_3516/_article">A Study of A Flow through Small Apertures : 2nd Report, Experiments on The Velocity Field.</a> Nihon Kikai Gakkai Ronbunshu B Hen/transactions of the Japan Society of Mechanical Engineers Part B. 53 (496), 3516-3521 (1987).</li>
<li>Shah, M. S., Joshi, J. B., Kalsi, A. S., Prasad, C. S. R., Shukla, D. S. <a target="_blank" href="http://agris.fao.org/agris-search/search.do?recordID=US201500029141">Analysis of flow through an orifice meter: CFD simulation.</a> Chem Eng Sci. 71 (9), 300-309 (2012).</li>
</ol>

Çıkar çatışması, mali veya başka türlü, yazarlar tarafından bildirilmiştir.

Burada, dondurma ve kas fonksiyonunun histolojik ölçümler yapmak kas dokuları depolamak için yeni, çok delikli cryovial tarif eder. Bu protokol kritik modifiye bir çok delikli cryovial örnek, doğrudan sıvı azot içine daldırılmış olmasıdır. Bildiğimiz kadarıyla, bu mevcut dondurma yöntemleri arasında kas cryosectioning mükemmel donmuş örnekleri (temsili sonuçları görmek) elde etmek için en basit ve rapidest yoludur. kas araştırmacılar karşılaştığı teknik ...

İskelet kası bakış beslenme ve işleme noktasından bir et üreten hayvan en değerli bileşenidir. kas büyümesi verimliliği ve ortaya çıkan etin kalitesi: Et endüstrisinde, iki özellikle kritik yönleri vardır. Kas ana bileşen olarak, kas lifleri büyüme performansı ve hayvanlarda 1 taze et kalitesini doğrudan ilişkilidir. Örneğin, Liflerin toplam sayısı (TNF) ve Liflerin çapraz kesit alanı (ÇSAF) daha çok kas kitlesi ve et kalitesini belirler; Ayrıca, Elyaf Tipi Kompozisyon (FTC) kuvvetle taze et kalitesini 2. etkiler. Bu nedenle, hayvanlarda kas lifi özelliklerinin manipülasyon çekirdek karlılık ve çiftliklerin 1 rekabet gücünü artırmak için son derece etkili bir yöntemdir. Bugüne kadar birçok içsel ve dışsal faktörler kas lifi characterist manipüle etmek tespit edilmiştirICS 1. Bu manipülasyon, domuzlar 5 sığırlarda 3 Miyostatin gen, koyun 4 Callipyge geni ve RyR1&#39;in ve IGF2 genleri gibi spesifik genleri, hayvanların hedef seçimi ile elde edilebilir. Ayrıca, diyet kontrolü ve spesifik hormonlarla tedaviler kas lifi özelliklerine 6 önemli rol oynamaktadır. Böylece, genetik ve beslenme faktörleri birleştiren bir yaklaşım yağsız et içeriğini ve et kalitesini arttırmak mümkün olabilir. kas liflerinin yapısının aydınlatılması hala bir sorun olduğundan, ancak kas liflerinde çalışmalar et endüstrisinde sınırlıdır. Kas lifi özellikleri, bu miyozin adenosin trifosfat (ATP) deneyi gibi histokimyasal yöntemler kullanılarak tespit edilir. Bu yöntem, dondurulmuş (6-8 um) ince bölümleri içinde yer enzimler gerçeğine dayanırkas lifleri kimyasal bazı ürünleri ile reaksiyona sokulabilir. Bununla birlikte, kas su içeriği ne olursa olsun, bir konumda (yani, sırt, karın veya arka bacak) 7, domuzlar, tavşanlar, fareler ve insanlarda% 75&#39;den daha büyük olduğunu. Daha önce 8, 9 tarif edildiği gibi, cryosections hazırlanması sırasında - eserler dondurma - kas içinde bu ölçüde yüksek nem içeriği, sık görülen bir sorun neden olur. Çoğu durumda, uygun deneyimlerimizi göre, bir mezbaha üretim hattında kas dokularını dondurmak için neredeyse imkansızdır. Burada sunulan protokol, yüksek verimli bir şekilde cryosectioning için kas dokularını dondurmak için laboratuvarda kullanılan basit ve etkili bir yöntem tarif etmektedir. Bu yöntemin vurgulamak sıvı azot içinde hızlı dondurma kas dokuları için tasarlanmış yeni bir gelmekteydi olup. mevcut iş akışı eşzamanlı olarak doku kolaylaştırabiliraçıkça görülebilir bir sitoplazmik bölüm ve çevredeki dokuya kas liflerine sıkı appozisyon ile mükemmel bir kas cryosection donma ve işlenmesi. Sıvı azot dokularıyla karışmaz Buna ek olarak, bu protokol, doku analizi için geniş bir seçenek dizisine uygulanabilir.

<table><tbody><tr><td>Cryostat Microtome</td><td>&amp;nbsp;Leica</td><td>Leica CM1950</td><td></td></tr><tr><td>Digital Microscope&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>Nikon DS-U3</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Cryogenic Vial&amp;nbsp;&amp;nbsp; Plastic film</td><td></td><td></td><td>Designed by ourself</td></tr><tr><td>Liquid Nitrogen</td><td></td><td></td><td>Commomly-used</td></tr><tr><td>Scalpel</td><td></td><td></td><td>Commomly-used</td></tr><tr><td>10 cm forceps</td><td></td><td></td><td>Commomly-used</td></tr><tr><td>25 cm tweezer</td><td></td><td></td><td>Commomly-used</td></tr><tr><td>Safety glass</td><td></td><td></td><td>Commomly-used</td></tr><tr><td>Freezer gloves</td><td></td><td></td><td>Commomly-used</td></tr></tbody></table>

a multi-hole cryovial eliminates freezing artifacts when muscle tissues are directly immersed in liquid nitrogen

iskelet kası fizyolojisi üzerinde çalışmalar uygun şekilde açıkça görünür sitoplazmik bölmelerle bölümleri elde etmek için numuneler işleme teknik sorunuyla karşı karşıya. Başka engel çevreleyen dokulara miyofiberlerindeki sıkı appozisyon olduğunu. doku fiksasyon ve parafine işlemidir kas lifleri büzülme yol açtığı için, donma kesit için kas dokusu sertleştirme optimal bir araçtır. Bununla birlikte, sık karşılaşılan bir sorun, buz kristallerinin oluşumu nedeniyle kas yüksek su içeriği Dondurulmuş kesitlerin hazırlanması sırasında meydana gelir. Burada sunulan protokol önce sıvı azot içine daldırılarak, kas dokuları dondurulması için basit ve etkili bir yöntem tarif etmektedir. tek başına sıvı azot kullanılarak sorun, aşağıdaki bir yalıtıcı olarak hareket eder ve dokuların soğutma inhibe doku, bir nitrojen gaz bariyeri oluşumuna neden olmasıdır. Bir NE bu &quot;buğu örtüsü&quot; etkisini önlemek içinw dondurarak saklamaya uygun vialler doku yüzeyi çevresinde, sıvı akış hızını arttırmak için tasarlanmıştır. Bu şişe duvarında 14 giriş deliklerinin toplam delme ile elde edilmiştir. Kabarcık dinamiklerine göre, küçük kabarcıklar ve daha az şansa sıvı akış sonuçlarının daha yüksek bir oranı, bir gaz bariyeri oluşturulur. Sıvı azot giriş deliklerinden dondurarak saklama viali içine aktığında, doku etrafında akış hızlı gaz bariyeri ortadan kaldırmak için yeterince hızlıdır. Önceden soğutulmuş izopentan kullanılarak, kas dokuları dondurma yöntemiyle karşılaştırıldığında, bu protokol daha basit ve daha etkili ve bir verimli bir şekilde kas dondurmak için kullanılabilir. Dahası, bu yöntem oda sıcaklığında son derece yanıcı olan izopentan, erişimi yok kurumlar için en uygunudur.

Dondurarak saklamaya uygun vialler örnekleme ve dondurulmuş bölümleri hazırlanması sırasında kas dondurma için ortak laboratuar ekipmanları, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. cryovials bir kalıp fabrikasında polipropilenden yapılmıştır. Her şişe, 14, giriş delikleri toplam vardır: bir açık olduğunu göstermektedir; Başka bir alt olduğu; ve geri kalan 12 formu, dört paralel hat, birbirine 90 ° &#39;de dört delik her biri. Bu giriş delikleri z...

Watch this Scientific Journal Video about A Multi-hole Cryovial Eliminates Freezing Artifacts when Muscle Tissues are Directly Immersed in Liquid Nitrogen at JoVE.com

A Multi-hole Cryovial Eliminates Freezing Artifacts when Muscle Tissues are Directly Immersed in Liquid Nitrogen

Bu protokol, doğrudan sıvı azot içine sokulup çıkartılarak kas dokuları dondurarak için bir prosedür tarif eder. Bu protokol, aynı zamanda, azot gazı &quot;battaniye etkisi&quot; önlemek yeni cryovial vurguladığında sıvı azot temas bir numunenin doku yüzeyi.

Kas Dokular doğrudan sıvı azot içine girdikleri zaman Artifacts Donma bir çoklu-delikli dondurarak saklamaya uygun vialler ortadan kaldırır

Studies on skeletal muscle physiology face the technical challenge of appropriately processing the specimens to obtain sections with clearly visible ...

a-multi-hole-cryovial-eliminates-freezing-artifacts-when-muscle

Research

JoVE Journal

Biology

11.3K Görüntüleme.  Jiangxi Agricultural University.  Bu protokol, doğrudan sıvı azot içine sokulup çıkartılarak kas dokuları dondurarak için bir prosedür tarif eder. Bu protokol, aynı zamanda, azot gazı "battaniye etkisi" önlemek yeni cryovial vurguladığında sıvı azot temas bir numunenin doku yüzeyi. 

Video: A Multi-hole Cryovial Eliminates Freezing Artifacts when Muscle Tissues are Directly Immersed in Liquid Nitrogen

Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires a thin layer of vitreous ice containing the biomolecules of interest. Despite numerous technological advances in recent years that have propelled single-particle cryoEM to the forefront of structural biology, the methods by which specimens are vitrified for high-resolution imaging often remain the rate-limiting step. Although numerous recent efforts have provided means to overcome hurdles frequently encountered during specimen vitrification, including the development of novel sample supports and innovative vitrification instrumentation, the traditional manually operated plunger remains a staple in the cryoEM community due to the low cost to purchase and ease of operation. Here, we provide detailed methods for using a standard, guillotine-style manually operated blot-and-plunge device for the vitrification of biological specimens for high-resolution imaging by single-particle cryoEM. Additionally, commonly encountered issues and troubleshooting recommendations for when a standard preparation fails to yield a suitable specimen are also described.

This manuscript outlines the blot-and-plunge method to manually freeze biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy.

Tek Parçacıklı Kriyojenik Elektron Mikroskopisi için Biyolojik Örneklerin Manuel Blot ve Dalma Dondurması

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

Biyokimya

Preparation of the Rat Vocal Fold for Neuromuscular Analyses

The purpose of this tutorial is to describe the preparation of the rat vocal fold for histochemical neuromuscular study. This protocol outlines procedures for rat laryngeal dissection, flash-freezing, and cryosectioning of the vocal folds. This study describes how to cryosection vocal folds in both longitudinal and cross-sectional planes. A novelty of this protocol is the laryngeal tracking during cryosectioning that ensures accurate identification of the intrinsic laryngeal muscles and reduces the chance of tissue loss. Figures demonstrate the progressive cryosectioning in both planes. Twenty-nine rat hemi-larynges were cryosectioned and tracked from the emergence of the thyroid cartilage to the appearance of the first section that included the full vocal fold. The full vocal fold was visualized for all animals in both planes. There was high variability in the distance from the appearance of the thyroid cartilage to the appearance of the full vocal fold in both planes. Weight was not correlated to depth of laryngeal landmarks, suggesting individual variability and other factors related to tissue preparation may be responsible for the high variability in the appearance of landmarks during sectioning. This study details a methodology and presents morphological data for preparing the rat vocal fold for histochemical neuromuscular investigation. Due to high individual variability, laryngeal landmarks should be closely tracked during cryosectioning to prevent oversectioning tissue and tissue loss. The use of a consistent methodology, including adequate tissue preparation and awareness of landmarks within the rat larynx, will assist with consistent results across studies and aid new researchers interested in using the rat vocal fold as a model to investigate laryngeal neuromuscular mechanisms.

This protocol describes methods used to prepare rat vocal folds for histochemical neuromuscular study.

Nöromüsküler Analizler için Sıçan Vokal Kıvrımının Hazırlanması

The purpose of this tutorial is to describe the preparation of the rat vocal fold for histochemical neuromuscular study. This protocol outlines procedures ...

Nörobilim

Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal results from functional, cellular, molecular, and pathological evaluations. Due to the subtlety of some pathological abnormalities seen in congenital muscle disorders and the potential for fixation to interfere with the recognition of these features, pathological evaluation of frozen muscle is preferable to fixed muscle when evaluating skeletal muscle for congenital muscle disease. Additionally, the potential to produce severe freezing artifacts in muscle requires specific precautions when freezing skeletal muscle for histological examination that are not commonly used when freezing other tissues. This manuscript describes a protocol for rapid freezing of skeletal muscle using isopentane (2-methylbutane) cooled with liquid nitrogen to preserve optimal skeletal muscle morphology. This procedure is also effective for freezing tissue intended for genetic or protein expression studies. Furthermore, we have integrated our freezing protocol into a broader procedure that also describes preferred methods for the short term triage of tissue for (1) single fiber functional studies and (2) myoblast cell culture, with a focus on the minimum effort necessary to collect tissue and transport it to specialized research or reference labs to complete these studies. Overall, this manuscript provides an outline of how fresh tissue can be effectively distributed for a variety of phenotypic studies and thereby provides standard operating procedures (SOPs) for pathological studies related to congenital muscle disease.

The analysis of skeletal muscle tissues to determine structural, functional, and biochemical properties is greatly facilitated by appropriate preparation. This protocol describes appropriate methods to prepare skeletal muscle tissue for a broad range of phenotyping studies.

Doku Triyaj ve İskelet Kası Hastalıkları Modeller için Donma

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal ...

Biyoloji

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, because of laborious and time-consuming protocols that also demand experience in preparation of artifact-free samples, TEM is not considered a user-friendly technique. Traditional sample preparation for TEM used chemical fixatives to preserve cellular structures. High-pressure freezing is the cryofixation of biological samples under high pressures to produce very fast cooling rates, thereby restricting ice formation, which is detrimental to the integrity of cellular ultrastructure. High-pressure freezing and freeze substitution are currently the methods of choice for producing the highest quality morphology in resin sections for TEM. These methods minimize the artifacts normally associated with conventional processing for TEM of thin sections. After cryofixation the frozen water in the sample is replaced with liquid organic solvent at low temperatures, a process called freeze substitution. Freeze substitution is typically carried out over several days in dedicated, costly equipment. A recent innovation allows the process to be completed in three hours, instead of the usual two days. This is typically followed by several more days of sample preparation that includes infiltration and embedding in epoxy resins before sectioning. Here we present a protocol combining high-pressure freezing and quick freeze substitution that enables plant sample fixation to be accomplished within hours. The protocol can readily be adapted for working with other tissues or organisms. Plant tissues are of special concern because of the presence of aerated spaces and water-filled vacuoles that impede ice-free freezing of water. In addition, the process of chemical fixation is especially long in plants due to cell walls impeding the penetration of the chemicals to deep within the tissues. Plant tissues are therefore particularly challenging, but this protocol is reliable and produces samples of the highest quality.

Obtaining high-quality transmission electron microscopy images is challenging, especially in the case of plant cells, which have abundant large water-filled vacuoles and aerated spaces. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution greatly reduce preparation time of plant samples for TEM while producing samples with excellent ultrastructural preservation.

Tandem Yüksek basınçlı Donma ve Transmisyon Elektron Mikroskobu için Bitki Doku Hızlı Dondurma Değişiklik

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Fiber Type and Subcellular-Specific Analysis of Lipid Droplet Content in Skeletal Muscle

Skeletal muscle lipid infiltration, known as myosteatosis, increases with obesity and ageing. Myosteatosis has also recently been discovered as a negative prognostic factor for several other disorders such as cardiovascular disease and cancer. Excessive lipid infiltration decreases muscle mass and strength. It also results in lipotoxicity and insulin resistance depending on total intramyocellular lipid content, lipid droplet (LD) morphology, and subcellular distribution. Fiber type (oxidative vs glycolytic) is also important, since oxidative fibers have a greater capacity to utilize lipids. Because of their crucial implications in pathophysiology, in-depth studies on LD dynamics and function in a fiber type-specific manner are warranted.
Herein, a complete protocol is presented for the quantification of intramyocellular lipid content and analysis of LD morphology and subcellular distribution in a fiber type-specific manner. To this end, serial muscle cryosections were stained with the fluorescent dye Bodipy and antibodies against myosin heavy chain isoforms. This protocol enables the simultaneous processing of different muscles, saving time and avoiding possible artifacts and, thanks to a personalized macro created in Fiji, the automatization of LD analysis is also possible.

Increasing evidence indicates that excessive infiltration of lipids inside skeletal muscle results in lipotoxicity and diabetes. Here, we present a complete protocol, including tissue processing, staining with Bodipy, image acquisition, and analysis, to quantify the size, density, and subcellular distribution of lipid droplets in a fiber-type specific manner.

İskelet Kasında Lipid Damlacık İçeriğinin Lif Tipi ve Subhücresel-Spesifik Analizi

Skeletal muscle lipid infiltration, known as myosteatosis, increases with obesity and ageing. Myosteatosis has also recently been discovered as a negative ...

Tıp

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize macromolecular complexes at very high resolution. However, to get as close as possible to the native state, perfect sample preservation is required. Conventional electron microscopy (EM) fixation with aldehydes, for instance, does not provide good ultrastructural preservation. The slow penetration of fixatives induces cell reorganization and loss of various cell components. Therefore, conventional EM fixation does not allow for an instantaneous stabilization and preservation of structures and antigenicity. The best choice for examining intracellular events is to use cryofixation followed by the freeze-substitution fixation method that keeps cells in their native state. High-pressure freezing/freeze-substitution, which preserves the integrity of cellular ultrastructure, is the most commonly used method, but requires expensive equipment. Here, an easy-to-use and low-cost freeze fixation method followed by freeze-substitution for suspension cell cultures is presented.

This manuscript describes an easy-to-use and low-cost cryofixation method for visualizing suspension cells by transmission electron microscopy.

Dalma Donma: Transmisyon Elektron Mikroskobu içinde Süspansiyon Hücrelerinin ultrastrüktürel ve immünolokalizasyonu Çalışmaları için Aracı

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

Cryosectioning of Contiguous Regions of a Single Mouse Skeletal Muscle for Gene Expression and Histological Analyses

With this method, consecutive cryosections are collected to enable both microscopy applications for tissue histology and enrichment of RNA for gene expression using adjacent regions from a single mouse skeletal muscle. Typically, it is challenging to achieve adequate homogenization of small skeletal muscle samples because buffer volumes may be too low for efficient grinding applications, yet without sufficient mechanical disruption, the dense tissue architecture of muscle limits penetration of buffer reagents, ultimately causing low RNA yield. By following the protocol reported here, 30 &#956;m sections are collected and pooled allowing cryosectioning and subsequent needle homogenization to mechanically disrupt the muscle, increasing the surface area exposed for buffer penetration. The primary limitations of the technique are that it requires a cryostat, and it is relatively low throughput. However, high-quality RNA can be obtained from small samples of pooled muscle cryosections, making this method accessible for many different skeletal muscles and other tissues. Furthermore, this technique enables matched analyses (e.g., tissue histopathology and gene expression) from adjacent regions of a single skeletal muscle so that measurements can be directly compared across applications to reduce experimental uncertainty and to reduce replicative animal experiments necessary to source a small tissue for multiple applications.

Consecutive cryo-sections are collected to enable histological applications and enrichment of RNA for gene expression measurements using adjacent regions from a single mouse skeletal muscle. High-quality RNA is obtained from 20 - 30 mg of pooled cryosections and measurements are directly compared across applications.

Gen İfade ve histolojik Analizler Tek Fare İskelet Kası bitişik Bölgeler Cryosectioning

With this method, consecutive cryosections are collected to enable both microscopy applications for tissue histology and enrichment of RNA for gene ...

Cryogenic Sample Loading into a Magic Angle Spinning Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer that Preserves Cellular Viability

Dynamic nuclear polarization (DNP) can dramatically increase the sensitivity of magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. These sensitivity gains increase as temperatures decrease and are large enough to enable the study of molecules at very low concentrations at the operating temperatures (~100 K) of most commercial DNP-equipped NMR spectrometers. This leads to the possibility of in-cell structural biology on cryopreserved cells for macromolecules at their endogenous levels in their native environments. However, the freezing rates required for cellular cryopreservation are exceeded during typical sample handling for DNP MAS NMR and this results in loss of cellular integrity and viability. This article describes a detailed protocol for the preparation and cryogenic transfer of a frozen sample of mammalian cells into a MAS NMR spectrometer.

Presented here is a protocol for cryogenic transfer of frozen samples into the dynamic nuclear polarization (DNP) magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) probe. The protocol includes directions for rotor storage prior to the experiment and directions for viability measurements before and after the experiment.

Hücresel Canlılığı Koruyan Sihirli Açı Dönen Nükleer Manyetik Rezonans Spektrometresine Kriyojenik Örnek Yükleme

Dynamic nuclear polarization (DNP) can dramatically increase the sensitivity of magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. ...

Regulating Temperature in the Lab: Preserving Samples Using Cold

Preservation of laboratory samples, specimens, and reagents using extreme cold is routinely performed in biomedical research labs. This video will discuss some of the methods for keeping laboratory samples cold and will explain the correct cooling method to use for each experimental requirement.
For example, cooling agents, such as ice and dry ice, are typically used when keeping samples cold during experiments. This video discusses the physical properties of the most commonly used cooling agents, as well as safety precautions for working with them.
When it comes to keeping samples cold in between experiments, cooling equipment, including laboratory grade refrigerators and freezers can be used to preserve samples for extended period of time. Also discussed in this video are types of samples and reagents that can be stored in the commonly-available laboratory cooling equipment.
Finally, the concept of cryopreservation is introduced as a process through which tissues, cells, and biomolecules are cooled to sub-zero temperatures, thereby effectively stopping all sample-degrading biological activity. Several methods of cryopreservation are discussed that minimize or eliminate the formation of damaging ice crystals.

Preserving Samples Using Cold: Cooling Agents and Instruments, and Cryopreservation

Preservation of laboratory samples, specimens, and reagents using extreme cold is routinely performed in biomedical research labs.  This video will ...

Education

JoVE Science Education

Temel Biyoloji

Genel Laboratuvar Teknikleri

Snap Freezing of Muscle Tissue for Sectioning: A Protocol to Obtain Ultrathin Sections of Rapidly Frozen Murine Muscle Tissue

Source: Bonetto, A. et al. <a href="https://www.jove.com/video/54893" target="_blank">The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia.</a> J. Vis. Exp. (2016)
This video describes the procedure for snap freezing muscle tissue and obtaining its thin sections. The technique can help study cancer-related cachexia in colon cancer mouse models.