This publication is funded through Cure CMD, an Association Contre Les Myopathies (AFM) grant (project 16297), and the National Institutes of Health (grant numbers K08 AR059750 and L40 AR057721). We would also like to thank Dr. Julie Tetzlaff for her assistance in revising this manuscript.

Hasat edilmiş hayvan ve kas için uygun tanımlayıcıları ile kas depolama için kullanılacak kaplar etiketleyin. Ilave edildiğinde torba / kaplar ve aletler doku dondurma / çözülme önlemek için önceden soğutmak. Kas Doku Koleksiyonu için 1. Çalışma-tasarım Hususlar <ol><li> Küçük hayvan modelleri genellikle patolojik çalışmalar için yeterli miyofiberde oluşan örnekleme sağlamak için bütün bir kas değerlendirme gerektiren beri küçük hayvan için kas hastalığı (fare) modelleri, çalışma için bütün bir kas kullanın. Büyük bir hayvan için, kas hastalığı (köpek) modelleri, çapraz (enine kesit) yönü içinde, en azından 0.3 x 0.3 cm veya daha büyük olan kas bölümlerini kullanır. Not: Çekirdek biyopsileri de kullanılabilir, ancak örnekleme sorunları nedeniyle birinci karakterizasyon çalışmalar için optimum altı olabilir. </li><li> Sarkomerinde içeren çalışmalar için, sarkomer uzunluğu ultrastrüktürel ölçümü kritik bir bitiş noktası içerebilir ve requ olabilirire işleme uzman. Bu genellikle hastalıklarda sadece ilgili olduğu nemaline miyopati bazı nedenleri olarak sarkomer gösteri uygunsuz uzunlukları elemanları,. Bazı laboratuvarlar yerine non-gerilmiş veya non-gergin kas bu ölçümler gerçekleştirirken daha, onun olmayan sözleşmeli veya gerilmiş durumda kas düzeltmek için tercih. <ol><li> Sarkomer uzunluğu ölçülür olmayacak eğer, (Reaktifler bakınız) istenilen EM fiksatif içine doğrudan yerleştirerek kas ön-germe olmadan kas dokusunu düzeltmek. </li><li> Sarkomer uzunlukları ölçülür edilecek olursa, (Tartışma) kas ön germek için çeşitli teknikler kullanılabilir: <ol><li> Bu hayvan hala iken dinlenme gerilimde kas tutmak için bir sıkıştırma aygıtını kullanarak, kelepçenin dış çevresinde kas tüketim ve (Reaktifler bakınız) istenen EM sabitleyici doğrudan yerleştirin. </li><li> Stretch ve gözlemlenmiştir benzer bir uzunlukta (örneğin mantar bir parçası olarak), bir yüzeye kas pin <ebu hayvandan ekstre edilmiş, in vivo olarak, m&gt; sonra. </li></ol></li></ol></li></ol> 2.. İstenilen Çalışmalar için uygun olan Fragments içine İzole İskelet kas Sub-bölmek (Şekil 1) <ol><li> Dondurulmuş kas histoloji için: <ol><li> Örnekleme verevi en aza indirmek (adım 1.1), ancak örnekler &lt;eserler donmaması için 1.5 cm olmalıdır mümkün belirli bir kas kadar içerir. </li><li> Nedeniyle işleme farklılıklara fiber boyutunda farklılıklar suni önlemek için benzer şekilde aynı çalışma her tedavi kas. </li></ol></li><li> Elektron mikroskobu (EM) için: <ol><li> Orijinal kas uzunlamasına eksenine paralel örnek uzunlamasına ekseni ile, örnek bir kas ~ 0.5 x 0.2 x 0.2 cm şerit kesin. NOT: sabitleştirci yeterli yani 2 mm veya daha az numune kalınlığı muhafaza, doku kalın parçalar nüfuz olmayacaktır uygun sonuçlar elde etmek çok önemlidir. Ek olarak,kas gibi küçük parçaları yönlendirme genellikle zordur gibi, kas için, asıl yönü (yani, sabit numunenin uzun yönü, kas / myofibers uzunlamasına yönlendirmesidir) taklit eden bir doku parçasının kullanılması tavsiye edilir EM işleme sırasında tutuşu ve karışıklığı en aza indirmek. </li></ol></li><li> Hücre kültürü için: <ol><li> İstenilen hücre verimi hücre kültürü kurulması için gerekli kas miktarını etkileyebilir. Tek kaslar (veya kas kısımları) küçük hayvanların hücre kültürleri kurmak için yeterli hücre sayıları sağlamak, böylece olabilir gerekirse, birden fazla kas gelen havuz doku. </li></ol></li></ol> Elektron Mikroskopi (EM) 3. Doku Fixation ve İşleme <ol><li> (Reaktifler bakınız) istenen EM sabitleyici içine doğrudan ince boyutta 2 mm&#39;den daha büyük bir kas fragmanı yerleştirin. </li><li> Fixati arasında 2-48 saat sonra (Reaktifler bakınız) EM sabitleyici tampon maddesi içinde kas yerleştirinüzerinde. (Haftalarca veya aylarca) Uzun süreli sabitleme EM çalışmalar ultrastrüktürel ayrıntı kaybına neden olabilir. </li><li> Işlenmesi için bir EM çekirdek tesisine gönderin. </li></ol> Histolojik, Biyokimyasal ve Moleküler Çalışmalar 4. Kas Donma <ol><li> Doku havlu hafif yapışkan olana kadar iyice bir kağıt havlu ile numune blot ile numune aşırı nemi. Aşırı nem, kas önemli donma eserler üretecek. Not: Doku ayrıca bebek toz yuvarlayarak kurutulabilir. Bu aşırı nemli ortamda olmuştur sürece, bu adım, genel olarak kaslar için gerekli değildir. </li><li> Yönlendirilmiş kas (Şekil 2C) için bir zemin temin etmek üzere, sadece yeterli Ekim olan, sığ cryomold dibinde veya mantardan Ekim üzerinde (veya kitre gibi benzer bir yapışkan) yerleştirin. Donma önce mantar veya cryomold etiketleme numune takibi için yararlı olabilir. </li><li> Carefully kesitsel kas Ekim (Şekil 2C) ile temas halinde değildir, böylece Ekim çıkıntılı kas çoğunluğu ile, istenen şekilde kalıp içine kas yerleştirin. </li><li> Yaklaşık 3-4 cm derinliğe ulaşıncaya kadar metal bir fincan izopentanın ekleyin. </li><li> Termal emniyet eldiven giyin ve Dewar kapağını kaldırın. </li><li> Bardağın dış sıvı azot seviyesi fincanın iç izopentan seviyesinin üstünde olacak şekilde, sıvı azot ile temas halinde olan metal kabı yerleştirin veya tutun. Bu kaplar düzenlemek için stratejiler, Şekil 2 &#39;de gösterilmiştir. <ol><li> Onunla çalışmak hantal olabilir köpüren köpük üreten (ve dondurma için de yeterince soğuk) gibi, sıvı nitrojen, metal bardak girmesine izin vermeyin. </li></ol></li><li> Bu uygun sıcaklığa ulaştığını belirlemek için izopentanın gözlemlemek. Uygun bir sıcaklıkta (optimal arasında -140 -149 ° C), bu yüzdendondurulmuş izopentanın kapak beyaz çakıl taşları (bir kaç dakika sonra, ve ilk sis izopentanın yukarıdaki kayboldu sonra) oluşturacak fincan alt veya çözüm genelde pekmez kıvamına kalınlaştırmak olacak. Önce bu aşamaya dondurma dondurma atifacts verecektir. <ol><li> Isopentan tamamen katı donarsa, çözülme ve sonraki kullanımdan önce tekrar dondurucu soğuklar için o soğuk. </li></ol></li><li> Önceden soğutulmuş forseps kullanılarak, yaklaşık 10-20 saniye boyunca izopentan içine numune ve mantar / alt kalıp. </li><li> Önceden soğutulmuş bir kaba donmuş numune yerleştirin. </li><li> -80 ° C dondurucu transferine kadar her zaman kuru buz üzerinde numune ve muhafaza edin. </li></ol> Donma Artifact Zaten Frozen Doku mevcut ise 5., Bu Prosedür izlenerek kullanılması Donma Artifacti derecesi geliştirin &quot;Yumuşama ve tekrar dondurmayın&quot; Olası bir <ol><li> Bir anda dondurucu, biri dışında blok almak, Ve kuru buz üzerinde saklayın. Bu protokolün zamanlaması önemlidir. Sadece çözülme ve her seferinde bir blok dondurursam. </li><li> Kuru buz oda sıcaklığına örnek taşıyın. </li><li> Örnek Ekim gömülü ise, bir neşter kullanarak mümkün olduğunca tamamen çevreleyen Ekim çıkarın. </li><li> Örnek değil, bunun kurumasını olduğu noktaya, tamamen çözülmüş noktaya OS&#39;nda erimesine izin verin. <ol><li> Yavaşça numune tamamen sonraki adıma ilerleyen önce çözülmüş olduğundan emin olmak için bir forseps ile numune eşya. </li></ol></li><li> Adımlarla 4,1-4,10 belirtilen kas dondurun. </li></ol> Skinned Tek Fiber Fonksiyonel Test Kası 6. Hazırlanması <ol><li> Kas için depolama prosedürü kas / lif deneyleri için kullanılan zaman bağlıdır. <ol><li> Bir kaç hafta içinde kullanım için, -20 ° C &#39;de (Reaktifler bakınız) çözeltisi rahatlatıcı% 50 glycerol/50% çözeltisi içinde kas yerleştirin ve mağaza </li><li> Kullanım aft içinBirkaç hafta er, -80 ° C&#39;de (Reaktifler bakınız) çözeltisi rahatlatıcı% 75 glycerol/25% çözeltisi içinde kas yerleştirmek ve depolamak </li><li> Alternatif olarak, -80 ° C&#39;de silis granülleri kas kuru, iğne mantar için, ve mağaza izin Bu susuz kaslar yıl için de kullanılabilir. </li></ol></li></ol> Dış Laboratuvarları Hücre Kültürü nakliyesine için Taze Kas 7. Hazırlanması Hücre kültürlerinin kurulması için başka protokoller 4-7 de tarif edilmiştir. <ol><li> Steril tam büyüme ortamı ile bir 50 ml&#39;lik steril bir konik tüp doldurun. </li><li> Tam ortam içinde daldırılması doku, steril bir forseps kullanılarak tüp kas dokusu ekleyin. <ol><li> Nakliye sırasında kurumasını önlemek için ortam ile tüp kalan doldurun. </li></ol></li><li> Strafor kutu buz paketleri ekleyin ve birkaç buz paketleri yakın konik tüp yerleştirin. <ol><li> Sadece buz paketleri (ve kuru buz) kullanılması gerektiğini unutmayınsıvı ve doku dondan zarar görmesini önlemek için. </li></ol></li><li> Gemi paketleri O / N, fakat dokuların bu şartlar altında 2 gün sürebilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Dubowitz, V., Sewry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Muscle Biopsy: A Practical Approach. 15, 407-442 (2007).</li><li>Lawlor, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+replacement+therapy+rescues+weakness+and+improves+muscle+pathology+in+mice+with+X-linked+myotubular+myopathy.">Enzyme replacement therapy rescues weakness and improves muscle pathology in mice with X-linked myotubular myopathy.</a> Hum Mol Genet. 22, 1525-1538 (2013).</li><li>Talmadge, R. J., Roy, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+separation+of+rat+skeletal+muscle+myosin+heavy-chain+isoforms.">Electrophoretic separation of rat skeletal muscle myosin heavy-chain isoforms.</a> J Appl Physiol. 75, 2337-2340 (1993).</li><li>Blau, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+properties+of+pure+populations+of+human+dystrophic+muscle+cells.">Differentiation properties of pure populations of human dystrophic muscle cells.</a> Exp Cell Res. 144, 495-503 (1983).</li><li>Lawlor, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myotubularin-deficient+myoblasts+display+increased+apoptosis,+delayed+proliferation,+and+poor+cell+engraftment.">Myotubularin-deficient myoblasts display increased apoptosis, delayed proliferation, and poor cell engraftment.</a> Am J Pathol. 181, 961-968 (2012).</li><li>Pavlath, G. K., Gussoni, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+myoblasts+and+muscle-derived+SP+cells.">Human myoblasts and muscle-derived SP cells.</a> Methods Mol Med. 107, 97-110 (2005).</li><li>Webster, C., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+age-related+decline+in+replicative+life-span+of+Duchenne+muscular+dystrophy+myoblasts:+implications+for+cell+and+gene+therapy.">Accelerated age-related decline in replicative life-span of Duchenne muscular dystrophy myoblasts: implications for cell and gene therapy.</a> Somat Cell Mol Genet. 16, 557-565 (1990).</li><li>Ottenheijm, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin+filament+length+dysregulation+contributes+to+muscle+weakness+in+nemaline+myopathy+patients+with+nebulin+deficiency.">Thin filament length dysregulation contributes to muscle weakness in nemaline myopathy patients with nebulin deficiency.</a> Hum Mol Genet. 18, 2359-2369 (2009).</li><li>Witt, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nebulin+regulates+thin+filament+length,+contractility,+and+Z-disk+structure+in+vivo.">Nebulin regulates thin filament length, contractility, and Z-disk structure in vivo.</a> EMBO J. 25, 3843-3855 (2006).</li><li>Garton, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+an+automated+computational+method+for+skeletal+muscle+fibre+morphometry+analysis.">Validation of an automated computational method for skeletal muscle fibre morphometry analysis.</a> Neuromuscul Disord. 20, 540-547 (2010).</li><li>Kim, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+segmentation+and+morphometrical+analysis+of+muscle+fiber+images.">Fully automated segmentation and morphometrical analysis of muscle fiber images.</a> Cytometry A. 71, 8-15 (2007).</li><li>Lawlor, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+activin+receptor+type+IIb+increases+strength+and+lifespan+in+myotubularin-deficient+mice.">Inhibition of activin receptor type IIb increases strength and lifespan in myotubularin-deficient mice.</a> Am J Pathol. 178, 784-793 (2011).</li><li>Mula, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+image+analysis+of+skeletal+muscle+fiber+cross-sectional+area.">Automated image analysis of skeletal muscle fiber cross-sectional area.</a> J Appl Physiol. 114, 148-155 (2013).</li><li>Dubowitz, V., Sewry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Muscle Biopsy: A Practical Approach. , 407-442 (2007).</li><li>Nance, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+myopathies:+an+update.">Congenital myopathies: an update.</a> Curr Neurol Neurosci Rep. 12, 165-174 (2012).</li><li>Clarke, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+TPM3+are+a+common+cause+of+congenital+fiber+type+disproportion.">Mutations in TPM3 are a common cause of congenital fiber type disproportion.</a> Ann Neurol. 63, 329-337 (2008).</li><li>Lawlor, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+tropomyosin+3+(TPM3)+are+common+and+associated+with+type+1+myofiber+hypotrophy+in+congenital+fiber+type+disproportion.">Mutations of tropomyosin 3 (TPM3) are common and associated with type 1 myofiber hypotrophy in congenital fiber type disproportion.</a> Hum Mutat. 31, 176-183 (2010).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

İskelet kası bir yapısal ve işlevsel benzersiz dokusu ve özel hazırlık prosedürleri yapısal ve fonksiyonel parametrelerin optimum değerlendirmesini sağlamak için gereklidir. Dokuların çeşitli yaygın klinik ve araştırma bağlamlarda patolojik çalışmalar için dondurulur birlikte, non-kas dokuları için donma protokoller genellikle dondurma işleminden önce Ekim dokusunun toplam daldırma içerir. Şekil 3&#39;te gösterildiği gibi, bu tür bir protokol iskelet kası patolojik değerlendirilmesi için uygun olan ve yine de bu sık karşılaşılan hata olduğu burada tarif edilen protokol için yeterince benzer. Bu yazının amacı bu gibi sorunları önlemek için kas doğru kullanımı için basit bir protokol sağlamaktır. Önerileri de durumlarda çekirdeği dışında laboratuvarlar tarafından yüksek kaliteli veri kazanımını kolaylaştırmak amacıyla off-site fizyolojik ve hücresel çalışmalar için kas doğru kullanımı üzerinde derlenmiştir where yerinde çalışmalar tercih veya mümkün değildir. Bu protokolde belirtildiği gibi, patolojik çalışmalar için kas uygun işlem kesinlikle gerekli olan elemanları, doku su içeriği minimize kas dondurulur sıcaklığın azaltılması ve dondurma elde edilir hızını artırarak içerir. Doku veya (sıvı azot ile karşılaşıldığında yetersiz sıcaklıkları ile ya da dondurma maddesi ve doku arasında doğrudan bir temas olmaması, tarafından üretilmiş) dondurma işleminin aşırı yavaşlık olan aşırı nem patolojik analizi bozabilir eserler dondurma yol açacaktır. Ekim doku nem ek bir kaynak sağlar gibi, birçok laboratuvarda bir gömme alt tabaka olarak kitre zamkı gibi diğer yapıştırıcılar kullanın. Hatta donma uygun gerçekleştirilir durumlarda, bakım RT konteynerler veya aletlerle temas yoluyla sonradan yanlışlıkla çözülme örnekleri önlemek için alınmalıdır.Bu nedenle, bir dondurma işleminin başarılı kullanılacak tüm aletler ve konteynerlerin bir ön soğutma içeren planlama derecesi gerektirir. Dondurma eserler karşılaşılan zaman, çoğu patolojik değerlendirme için yeterli olan doku kurtarma için burada tarif edilen bir yöntem yoktur. Bununla birlikte, bu dondurma / çözme döngüsü mükemmel histoloji sunmak ve (yeniden dondurma doku için gerekli olan zaman ek olarak) doku diğer moleküler ya da enzimatik çalışmaları zarar potansiyeline sahip, çok uygun başlangıç ​​donma uygulamaları kullanarak çok tercih edilir etmez . Donma artefakt, önceden dondurulmuş dokuda karşılaşılan durumlarda, ancak burada tarif edilen teknik, son derece yararlı olabilir. EM önce doku toplama planlama gerektiren özel teknik zorlukları sunabilir için doku tespiti ve işlenmesi. EM için numune toplama En sık karşılaşılan hata glutaraldehyd için çok kalındır doku parçalarının kullanımını gerektirire nüfuz. Glutaraldehit, sadece belirli bir yüzey, bakım kas dokusu içine, yaklaşık 0.1 cm nüfuz olarak EM örneklerinin bir boyuta kalın 0.2 &#39;den cm olduğundan emin olmak için dikkat edilmelidir. EM doğrudan kasılma cihazı değerlendirerek mükemmel bir araçtır Buna ek olarak, bazı araştırmacılar stratejiler geliştirdik kas öncesinde tespit öncesi gerginlik veya önceden streç fizyolojik ilgili bir gerilimde kontraktil elemanların ölçümü izin için. Orada ön-germe için standart bir protokoldür, ancak iki strateji kısaca bu protokolü tarif edilmiştir. Onlar çok özel bir şekilde yapılır ve bir standart dışı ile sarkomer uzunluğu artifaktüel değişiklikleri önlemek için gevşek devlet kasları düzeltmek için tercih edilebilir sürece kas öngörülemeyen sonuçlar üretebilir ön-germe girişimleri dikkat edilmelidir Önceden germe işlemi 8,9. Bu tür özel ölçümler de dahil olmak üzere pek çok b (gerekli değildir olduğu için, kaslarınklinik amaçlar için gerçekleştirilen iopsies), kas-geriliminin önceden harcanan çabalar genellikle yapılmaz, ve kas morfolojisi üzerinde temel etkisi kas sarkomerlerin düzgün olmayan bir aralıklarıdır. Bu yazıda konjenital kas hastalıkları alanında testlerin performansı için SOP sağlamak için bir dizi ilk temsil eder ve rutin hücresel, moleküler, fonksiyonel, fizyolojik gerçekleştirmek doğuştan kas hastalığı alanında 20 yılı uzmanların çabalarını temsil eder ve patolojik araştırma. Yayınlanan SOP&#39;ların bir dizi önümüzdeki yıl hazır olacak ve her biri için gerekli protokoller ve uygun yayın formatları bu SOP çabanın amacı sağlamaktır Washington DC 2013 yılının Nisan ayında düzenlenen bir Konjenital Kası Hastalıkları Konsorsiyumu Çalıştayı ele alındı 1) m olarak alanında kullanılan uygulamaları ve uç noktaları standardize doğuştan kas hastalığı alanında gerekli test ve numunelerin analizi için bir yol haritasımümkün gibi uch 2) bizim alanda yeni araştırmacılar için standart uygulamaları eğitimi sağlamak. Biz bu kaynaklar bizim altında çalışılan alana yeni araştırmacıların girişini kolaylaştırmak ve böylece yapılabilir araştırmanın kapsamını artıracak inanıyoruz. Ayrıca, uygulamaların bir standardizasyon çalışmalar arasında verileri karşılaştırmak ve klinik öncesi ve klinik denemeler planlarken ve gerçekleştirirken, son noktaları tanımlamak için son derece yararlı olacaktır. Bu makalenin ana odak çalışmaları çeşitli için uygun donma ve doku hazırlanması ile ilgili iken, bizim işbirlikçi grup da kas örneklerinin patolojik inceleme için yararlı bitiş noktaları tartışıldı. Şu anda, orada patolojik analizi yaparken almaya yaklaşımı hiçbir resmi uzlaşma olduğunu ve farklı çalışmalar çeşitli ilgili her hastalık için önceki yayınlarda yeni bulgular ilişki yapılmaktadır. Böylece, biz yararlı olacağını düşündümkas patoloji karakterizasyonu patolojik uç noktalarının planlanması için bazı genel kurallar öneriyoruz. Önceki bir çalışmada, patoloji miktarının için, önemli bir düşünce) 1&#39;e fiber boyutu ölçüm yöntemi konulmalıdır, 2) lif türüne özgü anormalliklerin ya da tedavi etkilerinin olasılığı, 3) anormallikleri veya etkilerinin olasılığı sınırlıdır ki Bireysel kaslara ve 4) çalışma altındaki hastalık için karakteristik olan patolojik bulgular miktarının belirlenmesi için bir stratejidir. Fiber boy en çalışmaları için gerekli bir uç nokta olduğunu, ve ne yazık ki sayısal nasıl geniş bir varyasyon vardır. Birçok çalışma, özel görüntüleme yazılımı tarafından sağlanan otomatik ölçümü yöntemleri kullanarak bu sonuçları rapor, ancak bu programların çok bu otomatik ölçümler hatalı hale getirebilir (örneğin lifler daire veya elips olduğunu varsayarak gibi) kısayolları alın. Bu otomatik programlar kendi ölçümleri b yapmak nasıl anlamak için gerekliefore ölçümlerde güven sahip ve biz kağıt yöntemleri bu bilgileri içerecek şekilde araştırmacıları teşvik ediyoruz. Ayrıca, fiber boyutu belirtmek için kullanılan özel ölçüm son derece değişkendir, ve bazı ölçümler diğerleri 10,11 tercih edilir. Fiber ebadı genel olarak kullanılan bir ölçüm fizyolojik çalışmalar yapmak araştırmacılar aletleri kullanılarak elde CSA ölçümlerine sonuçları standart oldukları için, bir elyaf kesit alanı (CSA) &#39;dir. CSA ölçümler doğru mükemmel enine kesitlerinde fiber boyutunu yansıtmak iken, ne yazık ki, onlar (boyuna veya eğimli-kesitli lifler yapay yüksek CSA ölçümler olacak ölçüde) lif yönelim yoğun bağımlı olan ve fiber boyutu dolayısıyla ideal değildir ölçümlerdir. Lif kesit alanının daha az bağımlıdır fiber ebadı tercih edilen bir ölçüm th ölçümüdür minimum Feret çapı (MinFeret çap), olduğukas hücresi 12 e küçük çapı. Bu ölçüm lif yönelim sadece biraz bağlıdır ve genellikle lif ölçümü için klinik altın standart olduğunu ve araştırmacılar bu tekniğin kullanılması doğru hareket için teşvik edilir. Bu ölçümler genellikle CSA ölçümleri 13 üretir aynı yazılımı kullanılarak yapılacaktır ve ayrıca elle ölçmek için basit olabilir. Lif tipi, belirli kas, ve belirli bir hastalığa bağlı patolojik bulgular bağlamında göre patolojik verileri değerlendirerek göre, bu sadece bir çalışma, planlama aşamasında dikkate alınmalıdır az tartışmalı konulardır. Fiber tipi immünohistokimyasal veya ATPaz boyama kullanılarak değerlendirilebilir, ama belli kasları ve hayvan türlerinin bu fiber tiplerinin özel karışımlar (böylece farklı beklentileri gerektiren ve stratejileri test) olduğunu dikkate almak yararlı olur. Kas spesifik patolojik tutulum veya tedavi etkinliğiortaya çıkar ve toplam kas ağırlığı kontrol grubu ile karşılaştırıldığında patolojik değerlendirmek için kas karar vermeden önce hastalığın heterojenlik derecesini belirlemek için kullanılabilir olabilir. Son olarak, bu da birçok kas hastalıkları (örneğin, nemaline miyopati nemaline çubuklar gibi) belirli bir patolojik anormallikler 14,15 ile ilişkili olduğu bilinmektedir ve bu yüzden, bu anormallikler, bir elyaf tipi ya da kas bulunan olmadığını dikkate almak da yararlıdır özgü dağılım analizi 16,17 gerçekleştirilmesi. Biz kas değerlendirilmesi için standartların esnek olmayan bir dizi teklif yok ederken Genel olarak, biz bu konuları önceden herhangi bir iskelet kası hastalığı patolojik çalışmaların performansının kabul edilmesi gerektiğine inanıyorum.

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which can present a number of challenges when evaluating its pathology. While it is sufficient, and often even optimal, to evaluate most tissues following formalin fixation and paraffin embedding, this process leads to the production of cell shrinkage artifacts that impair the evaluation of critical phenotypes in congenital muscle disease (including myofiber size and shape). Additionally, frozen muscle is required when performing many histochemical stains (including the reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH), cytochrome oxidase (COX), succinate dehyrogenase (SDH), adenosine triphosphatase (ATPase), and Oil Red O stains) that are essential for the detection of specific pathological abnormalities required to diagnose a variety of congenital myopathies, mitochondrial myopathies, and storage diseases. Many antibodies and molecular tools used to characterize muscle morphology and function have consequently been developed and optimized only for frozen tissue, which further limits the usefulness of fixed tissue preparations in studies of skeletal muscle biology. As a result, it has become standard practice to freeze skeletal muscle specimens for most clinical and research indications in the field of congenital muscle disease, despite the technical challenges that appropriate freezing might pose.
The freezing of skeletal muscle can be technically challenging due to the high likelihood of ice crystal formation within myofibers when an inappropriate freezing protocol is followed1. In most cases, freezing artifacts are encountered when the water content of the tissue is too high or when the freezing process is too slow. The water content of tissue can be accidentally increased by immersion in fluid, such as transport of the muscle in saline; or freezing can be compromised if the tissue has been entirely immersed in OCT. Both of these procedures can lead to catastrophic freezing artifacts in muscle tissue. Additionally, a number of small missteps in the freezing process may cause slow freezing or accidental thawing of samples after appropriate freezing, and these issues can similarly complicate pathological evaluation. 
As new models and treatments for skeletal muscle disease are developed, it will become increasingly useful to use standard operating procedures (SOPs) to evaluate skeletal muscle phenotypes and treatment efficacy. This is particularly important for the pathological evaluation of congenital muscle diseases, as the recognition of subtle phenotypes seen in many of these disorders can be impaired by improper tissue preparation. This report represents an effort by a Congenital Muscle Disease Consortium to establish a skeletal muscle freezing SOP for the study of congenital muscle disease models. 
The protocol presented here describes a strategy used in our clinical and research labs to optimize assessment of frozen muscle pathology, while also being suitable for a variety of protein-based and genetic studies. Specific strategies to prepare skeletal muscle specimens for electron microscopy are also presented. Additionally, as single fiber functional testing of frozen tissue is possible2,3, experts in these techniques have provided details on optimal tissue handling protocols. Unfortunately, the isolation of myoblast cell lines cannot be effectively performed on pre-frozen tissue, so a strategy is presented herein for the short-term storage and transport of muscle tissue for myoblast culture establishment at outside laboratories. Overall, the methods described here provide guidelines for the appropriate processing of muscle tissue for a variety of pathological, functional, molecular and cellular studies, regardless of the on-site capabilities of a given laboratory.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1111">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">For tissue freezing</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:369px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:523px;">Liquid nitrogen Dewar with a liquid withdrawal device</td>
			<td style="width:107px;">Custom Biogenic Systems</td>
			<td style="width:115px;">Lab-5 Series</td>
			<td>Any other liquid nitrogen dewar could substitute.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Cold-conductive container</td>
			<td style="width:107px;">Fisher</td>
			<td style="width:115px;">02-583A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Wide insulated container capable of holding liquid nitrogen</td>
			<td style="width:107px;">Nalgene</td>
			<td style="width:115px;">4150-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Oakton Temp 10 Thermocouple Thermometer</td>
			<td style="width:107px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:115px;">1228Y01</td>
			<td>Optional, but can be very useful in identifying the point at which isopentane is freezing.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">For single fiber functional testing</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Petri dish</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:115px;">08-757-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Sylgard coating</td>
			<td style="width:107px;">Ellsworth Adhesives</td>
			<td style="width:115px;">&#160;3-6636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Dissection stereomicroscope</td>
			<td style="width:107px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:115px;">693101</td>
			<td>Any other dissection microscope could substitute.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">For cell culture</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Sterile laminar flow hood</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:115px;">51022485</td>
			<td>Any other cell culture hood could substitute.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:523px;">Materials</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:523px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">For tissue freezing</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Plastic bags/containers</td>
			<td style="width:107px;">Nasco</td>
			<td style="width:115px;">B01009WA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Thermal safety gloves</td>
			<td style="width:107px;">Denville</td>
			<td style="width:115px;">G4162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Face shield</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:115px;">S47640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Long forceps</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:115px;">&#160;12-460-807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Marker</td>
			<td style="width:107px;">Staples</td>
			<td style="width:115px;">125328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">For cell culture</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Sterile 50 mL conical tubes</td>
			<td style="width:107px;">Denville</td>
			<td style="width:115px;">C1060-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">PES filter unit, 500 mL, 0.22 &#181;m</td>
			<td style="width:107px;">Denville</td>
			<td style="width:115px;">F5227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Sterile forceps</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:115px;">644320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Ice packs</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:115px;">NC9909223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Insulated Styrofoam box</td>
			<td style="width:107px;">Polar Tech</td>
			<td style="width:115px;">207F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Packing tape</td>
			<td style="width:107px;">Staples</td>
			<td align="right" style="width:115px;">795570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:523px;">Reagents</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Tissue Freezing</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Liquid nitrogen</td>
			<td style="width:107px;">Airgas</td>
			<td style="width:115px;">NI NF160LT350</td>
			<td>Store liquid nitrogen in containers designed for low-temperature liquids</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Isopentane (2-methylbutane)</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">M32631-4L</td>
			<td>Store Isopentane&#160; in a flammable materials cabinet.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:523px;">EM fixative (choose one)</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:369px;">The buffers without fixative should also be available, as EM-fixed tissues should be transferred from fixative to buffer after several hours or days if they are not immediately processed for EM.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:523px;">2.5% glutaraldehyde in 0.1M cacodylate buffer</td>
			<td style="width:107px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:115px;">16537-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:523px;">Karnovsky&#39;s fixative (3% glutaraldehyde + 2% paraformaldehyde in 0.1M phosphate buffer)</td>
			<td style="width:107px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:115px;">15732-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">For functional studies (if desired)&#160;</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Relaxing solution, containing (in mmol/L)</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 40 BES</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">B9879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 10 EGTA</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 6.56 MgCl2</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 5.88 Na-ATP</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">A3377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 1.0 DTT</td>
			<td style="width:107px;">RPI</td>
			<td style="width:115px;">D11000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 46.35 K-propionate</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td>Make a solution by mixing proprionic acid (Sigma P1386) and KOH (Fisher P250) 1:1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 15 creatine phosphate, pH 7.0</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">P7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 0.4 leupeptin</td>
			<td style="width:107px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:115px;">10895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 0.1 PMSF</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">P7676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Skinning solution, containing&#160;</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Relaxing solution (See Above)</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 0.5% Triton X-100</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Indicating silica granules</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">Flat pieces of cork (1 x 1 inch)</td>
			<td style="width:107px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:115px;">63305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">For cell culture (if desired)</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Complete Growth Medium, containing (for 500 mL)</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td>Sterilize by filtering the solution through a 500 mL 0.22 &#181;m PES filter unit.&#160; Store at 4&#176;C and use within 1 month.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 395 mL of high glucose Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 100 mL of fetal bovine serum (FBS)&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">F6178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 5 mL of 100X Penicillin-Streptomycin-Glutamine (PSG)</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">G1146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Storage requriements</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="3" height="20" style="height:20px;">See the materials safety data sheet (MSDS) for all other reagents for storage specifications</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease

İskelet kası, çünkü işlevsel hücresel, moleküler ve patolojik değerlendirme en iyi sonuçları elde etmek için doku toplama için özel protokoller gerektirir yapısı ve işlevi, eşsiz bir dokudur. Doğuştan kas hastalığı iskelet kas değerlendirirken nedeniyle doğuştan kas hastalıkları ve bu özelliklerin tanınması ile müdahale tespit için potansiyel görülen bazı patolojik anormalliklerin incelik için, dondurulmuş kas patolojik değerlendirilmesi sabit kas tercih edilir. Diğer dokular dondurulurken, yaygın olarak kullanılmaz, histolojik inceleme için iskelet kas dondurma ek olarak, kas ağır dondurma eserler üretilmesi için muhtemel özel önlemleri gerektirir. Bu makale uygun iskelet kası morfolojisi korumak için sıvı nitrojen ile soğutulur izopentan (2-metilbütan) kullanılarak iskelet kası hızlı dondurulması için bir protokol açıklamaktadır. Bu işlem aynı zamanda f etkilidirgenetik ve protein ifade çalışmaları için tasarlanmıştır doku reezing. Ayrıca, biz toplamak için gerekli minimum çaba odaklanarak da (1) Tek lif fonksiyonel çalışmalar ve (2) myoblast hücre kültürü için doku kısa vadeli triajın için tercih edilen yöntemleri açıklayan geniş bir prosedür, içine bizim dondurma protokolü entegre etmiş doku ve bu çalışmaları tamamlamak için özel bir araştırma veya referans laboratuarları nakleder. Genel olarak, bu el yazması taze doku etkili fenotipik çalışmalar çeşitli dağıtılmış olabilir nasıl bir taslağını sağlayan ve böylece doğuştan kas hastalığı ile ilgili patolojik çalışmalar için standart işletim prosedürleri (SOP) sağlar.

Uygunsuz dondurma ile görülen eserler örnekler sağlamak için, birçok fare kuadriseps kaslar sık karşılaşılan hataları çoğaltmak için farklı teknikler (Şekil 3) kullanılarak dondurulmuştur. Şekil 3A&#39;da görüldüğü gibi, uygun bir şekilde dondurulmuş iskelet kası çevreleyen doku (genellikle diğer kas lifleri, ama bazen myofibers arasındaki boşluk endomisyal hastalık veya yaralanma süreçlerin çeşitli fibrozu ya da enflamatuar hücre ile doldurulur) için myofibers sıkı bir appozisyon gösterir ve açıkça görülebilen bir sitoplazmik bölmesi. Açıkça bu dejeneratif değişiklikler, rejeneratif değişiklikler veya diğer patognomonik bulgular (merkez çekirdekleri, hücre içi inklüzyonlar) varlığını tespit etmek genellikle kritik olarak patolojik inceleme için, hücre içi alanı görüntülemek için yeteneği, sık sık endomisyal bölmesine daha önemlidir alanı. Bu nedenle, hücre içi bölmesindeki buz kristallerinin mevcudiyeti am temsil ederkas patolojik değerlendirmesinde ajor sorun. Kas dokusunun uygun dondurucu hem de yeterince soğuk sıcaklıklar ve buz kristallerinin oluşmasını önlemek için yeterli bir donma hızı gerektirir. Her iki faktör için muhasebe bile, ciddi donma eserdir hala kas dokusu içinde aşırı nem nedeniyle oluşabilir. Bu sorun, en sık önceden tuzlu batırılır ve yetersiz kurutulmuş veya kas Ekim (Şekil 3B, 3E) Kesit yerinde montaj medya ile doğrudan temas içinde olmuştur zaman olmuştu kas dokusunda karşılaştı. Ekim bazı iletişim montaj işleminin bir sonucu olarak genellikle kaçınılmazdır birlikte, nitelikli histolojik olarak değerlendirildi ve Ekim monte etmek için kullanılacak alanlar arasında teması önlemek için yapılmalıdır. Buna karşılık, bir -80 ° C dondurucu (Şekil 3C) ve sıvı azot (Şekil 3D) kullanılarak dondurulmuş numuneleri örnek teşkildonma suboptimal sıcaklık veya hız tarafından üretilen dondurma dışlayıcı s. -80 ° C derin dondurucuda doku yerleştirerek karşılaştığı yavaş dondurma işlemi objeyi donma aşırı bir örnek sağlar. Sıvı azot kullanılarak, ana problem, sıvı nitrojen ile doku arasında iletişim doku-sıvı arayüzünde oluşturmak üzere gaz halinde bir azot kılıf neden olur ve bu gaz arayüzü 1 dondurma hızlı kas üretmek için yeterince soğuk olmasıdır. Bu, numunenin yüzeyine yakın önemli dondurma objeyi üretebilir, ancak numunenin iç alanları uygun bir hızda flaş-dondurularak olasılığı daha yüksektir ve tamamen objeyi dondurma korunmuş olabilir. Sıvı azot içinde kas dokusunun basit daldırma izopentan dondurma işlemi olarak faydalıdır yakın yerde iken, izopentan gibi kurumlarda klinik otopsi numuneler olarak (kullanılamaz ile olduğu durumlarda büyük bir kas numunelerin dondurma için yararlı olabilirÇıkış klinik kas patoloji laboratuarları). (Çeşitli ebatlarda&gt; 2 cm) doku büyük miktarlar kullanılarak, bu strateji kullanılarak sonuçlar genellikle daha iyidir. Dondurma dışlayıcı kaçınma uygun histolojik sonuçlar sağlamakla birlikte, esas itibarıyla düzgün bir teknik dondurulmuş doku değerlendirilmesini sağlamak için eserler dondurma tersine bu da geliştirilmiştir (ve bu tarifnamede anlatıldığı gibi) vardır. Doğru bir biçimde (Şekil 3E) dondurulur Doku çözülmüş ve liflerin içinde suyun dağıtılması izin vermek için sıkı bir şekilde kontrol edilen şartlar (Şekil 3F) altında refrozen ve elde edilebilir morfolojik koruma derecesi mükemmel olabilir edilebilir. Deneyimlerimize göre, bu işlem, dikkate değer bir ölçüde doku hücre morfolojisini koruyan, ancak genellikle endomisyal alanı içinde liflerin bir suni ayrılmasını üretir. Birçok patolojik uç noktalar, hücre içi alan ve bu olarak bulunurlarendomisyal uzay iyi (fibrozis vurgulamak için ya da diğer hücre tiplerini belirlemek ya) özel boyalar kullanılarak görüntülenebilir, bu suni değişiklikler gerçekten kas patolojik değerlendirme zarar vermemektedirler. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51586/51586fig1highres.jpg" width="500" /> Iskelet kası, yapısal, işlevsel ve hücresel çalışmalar için doku Şekil 1.. Triage. Istenilen çalışmalar türüne bağlı olarak toplandı, iskelet kası dokusu en iyi sonuçlar için çeşitli şekillerde işlenebilir. Bu yazıda belirtilen protokoller uzman çekirdek tesislerinden elde sonuçları optimize etmek için off-site çalışmaları için iskelet kası örnekleri triaging veya işleme yöntemleri açıklanmaktadır. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51586/51586fig2highres.jpg" wiDTH = &quot;500&quot; /&gt; Şekil 2,. Kas dondurma için kullanılan aparatların örnekleri. Protokolde tarif edildiği gibi, uygun, kas donma donma sıcaklıktadır izopentan içinde kas dokusunun daldırma gerektirir. Buzla soğutulmuş izopentan elde edilmesi için güvenli ve etkili bir araç, sıvı azot içeren bir Dewar çevreleyen soğutulur izopentan için bir metal kap kullanımını gerektirir. Her iki eller serbest olması da uygun olduğu için, bu iki sıvıların karışımını önlerken, sıvı azot içinde izopentan kabı tutmak için örneğin (A) bir halka stand olarak bir kuşak kullanmak mümkündür. Seçenek olarak ise, kabın el ile de sıvı azot ile (B) &#39;de tutulabilir. Her iki durumda da, doku izopentan gözle görülür bir kap (genellikle opak, beyaz çakıl) altındaki dondurma, ve daha sonra tam dondurma izin vermek için, 10-20 saniye için daldırılmış olmalıdır kadar izopentan yerleştirilir olmamalıdır. Isopedonma sıcaklığında ntane minimal &quot;sis&quot;, (önemli bir sis varsa, yani, sıcaklık yetersiz olduğu) üretir. Doku dondurulmuş sonra, dondurma işleminin yanlışlıkla çözülme önlemek için (bir soğutucu veya dondurucu doğrudan ve daha sonra) daha önceden soğutulmuş kaplar içine doğrudan yerleştirin. (C) Doğru monte edilmiş dondurulmuş kas dondurulmuş OCT bir tabanından çıkıntı yapan kas dokusunun çoğunluğu olmalıdır. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51586/51586fig3highres.jpg" width="500" /> Ekim montaj ortamı ile temas durumunda, (C) kas donmuş durumda, (A) uygun bir izopentan dondurulmuş kas Şekil 3. Objeyi dondurma, ve etkili bir eritme / tekrar soğutulmasından ve örnekler. Örnek görsel (B) kas izopentan içinde uygun bir dondurulmuş, ama Bir -80 ° C dondurucu, ve (D </strong&gt;) kas objeyi donma değişen derecelerde ekran, her biri, sıvı nitrojen içerisinde donduruldu. (B) &#39;de gösterildiği gibi, Ekim yüksek sıvı içeriği onunla temas halinde olan kas önemli donma objeyi, montaj için gerekli Ekim dolayısıyla sadece minimum miktarda kullanılmalıdır üretir ve histolojik değerlendirme için kas &quot;ayakta olmalıdır yüzeyinden &quot;dışarı. Bir (C) -80 ° C dondurucu ya da (D) sıvı azot (buz gibi soğuk izopentan içinde donma hızına göre) kullanılarak dondurma işleminin yavaş olması önemli dondurma dışlayıcı üretimine yol açabilir. (Nedeniyle, Ekim ile fazla temas için) ilk olarak ideal olarak dondurulmuş (E) ve daha sonra (F) çözündürüldü ve burada tarif edilen teknik kullanılarak refrozen aynı örnekten Paneller E ve F göstermek kas. Bir refrozen numunedeki liflerin arasında bir suni ayırma gözlemlemek mümkün olmakla birlikte, gelişme in kas liflerinin hücre morfolojisi kolayca görülür. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51586/51586fig3highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease at JoVE.com

Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

The analysis of skeletal muscle tissues to determine structural, functional, and biochemical properties is greatly facilitated by appropriate preparation. This protocol describes appropriate methods to prepare skeletal muscle tissue for a broad range of phenotyping studies.

Doku Triyaj ve İskelet Kası Hastalıkları Modeller için Donma

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal ...

tissue-triage-and-freezing-for-models-of-skeletal-muscle-disease

Research

JoVE Journal

Biology

39.8K Görüntüleme.  Medical College of Wisconsin. The analysis of skeletal muscle tissues to determine structural, functional, and biochemical properties is greatly facilitated by appropriate preparation. This protocol describes appropriate methods to prepare skeletal muscle tissue for a broad range of phenotyping studies.

Video: Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

Yetişkin ve Embriyonik İskelet, Kas Microexplant Kültür ve İskelet Kası Kök Hücre İzolasyonu

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Biyoloji

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, fatigability, and recovery after fatigue can be obtained to assess specific aspects of the excitation-contraction coupling (ECC) process such as excitability, contractile machinery and Ca2+ handling ability. This method removes the nerve and blood supply and focuses on the isolated skeletal muscle itself. We routinely use this method to identify genetic components that alter the contractile property of skeletal muscle though modulating Ca2+ signaling pathways. Here, we describe a newly identified skeletal muscle phenotype, i.e., mechanic alternans, as an example of the various and rich information that can be obtained using the in vitro muscle contractility assay. Combination of this assay with single cell assays, genetic approaches and biochemistry assays can provide important insights into the mechanisms of ECC in skeletal muscle.

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

We describe a method to directly measure muscle force, muscle power, contractile kinetics and fatigability of isolated skeletal muscles in an in vitro system using field stimulation. Valuable information on Ca2+ handling properties and contractile machinery of the muscle can be obtained using different stimulating protocols.

İzole İskelet Kaslar Kasılma, çabuk yorulma ve Alternans Ex Vivo Değerlendirilmesi

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections (bupivacaine, cardiotoxin or notexin), muscle transplantations (denervation-devascularization induced regeneration), intensive exercise, but also murine muscular dystrophy models such as the mdx mouse (for a review of these approaches see 1). In zebrafish, genetic approaches include mutants that exhibit muscular dystrophy phenotypes (such as runzel2 or sapje3) and antisense oligonucleotide morpholinos that block the expression of dystrophy-associated genes4. Besides, chemical approaches are also possible, e.g. with Galanthamine, a chemical compound inhibiting acetylcholinesterase, thereby resulting in hypercontraction, which eventually leads to muscular dystrophy5. However, genetic and pharmacological approaches generally affect all muscles within an individual, whereas the extent of physically inflicted injuries are more easily controlled spatially and temporally1. Localized physical injury allows the assessment of contralateral muscle as an internal control. Indeed, we recently used laser-mediated cell ablation to study skeletal muscle regeneration in the zebrafish embryo6, while another group recently reported the use of a two-photon laser (822 nm) to damage very locally the plasma membrane of individual embryonic zebrafish muscle cells7.
Here, we report a method for using the micropoint laser (Andor Technology) for skeletal muscle cell injury in the zebrafish embryo. The micropoint laser is a high energy laser which is suitable for targeted cell ablation at a wavelength of 435 nm. The laser is connected to a microscope (in our setup, an optical microscope from Zeiss) in such a way that the microscope can be used at the same time for focusing the laser light onto the sample and for visualizing the effects of the wounding (brightfield or fluorescence). The parameters for controlling laser pulses include wavelength, intensity, and number of pulses.
Due to its transparency and external embryonic development, the zebrafish embryo is highly amenable for both laser-induced injury and for studying the subsequent recovery. Between 1 and 2 days post-fertilization, somitic skeletal muscle cells progressively undergo maturation from anterior to posterior due to the progression of somitogenesis from the trunk to the tail8, 9. At these stages, embryos spontaneously twitch and initiate swimming. The zebrafish has recently been recognized as an important vertebrate model organism for the study of tissue regeneration, as many types of tissues (cardiac, neuronal, vascular etc.) can be regenerated after injury in the adult zebrafish10, 11.

The method presented here comprises the precise injury of live zebrafish embryos with high-energy laser pulses and the subsequent analysis of these injuries and their recovery with time. We also show how genetically labeled single or groups of skeletal muscle cells can be tracked during and after laser light induced damage.

Zebra balığı Embriyonik İskelet Kası Lazer-yaralama

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

Yetişkin İskelet Kası gelen bireysel Myofibers ve Uydu Hücre İzolasyonu ve Kültür

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular dystrophies1-3, congenital myopathies4,5, and disruptions in sarcomeric assembly6,7, due to high genomic and structural conservation with mammals8. Muscular disorganization and locomotive impairment can be quickly assessed in the zebrafish over the first few days post-fertilization. Two assays to help characterize skeletal muscle defects in zebrafish are birefringence (structural) and touch-evoked escape response (behavioral).
Birefringence is a physical property in which light is rotated as it passes through ordered matter, such as the pseudo-crystalline array of muscle sarcomeres9. It is a simple, noninvasive approach to assess muscle integrity in translucent zebrafish larvae early in development. Wild-type zebrafish with highly organized skeletal muscle appear very bright amidst a dark background when visualized between two polarized light filters, whereas muscle mutants have birefringence patterns specific to the primary muscular disorder they model. Zebrafish modeling muscular dystrophies, diseases characterized by myofiber degeneration followed by repeated rounds of regeneration, exhibit degenerative dark patches in skeletal muscle under polarized light. Nondystrophic myopathies are not associated with necrosis or regenerative changes, but result in disorganized myofibers and skeletal muscle weakness. Myopathic zebrafish typically show an overall reduction in birefringence, reflecting the disorganization of sarcomeres.
The touch-evoked escape assay involves observing an embryo&#39;s swimming behavior in response to tactile stimulation10-12. In comparison to wild-type larvae, mutant larvae frequently display a weak escape contraction, followed by slow swimming or other type of impaired motion that fails to propel the larvae more than a short distance12. The advantage of these assays is that disease progression in the same fish type can be monitored in vivo for several days, and that large numbers of fish can be analyzed in a short time relative to higher vertebrates.

The zebrafish is now an established and powerful tool for modeling muscular dystrophies, congenital myopathies, and related neuromuscular diseases. Birefringence and touch-evoked escape behavior are two common noninvasive assays used to determine the degree of muscular disorganization and locomotive impairment of zebrafish embryos during early development.

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective isolation in culture. Recently, using fluorescence-activated cell sorting (FACS), we and other researchers prospectively identified and purified three subpopulations of multipotent precursor cells associated with the vasculature of human skeletal muscle. These three cell populations: myogenic endothelial cells (MECs), pericytes (PCs), and adventitial cells (ACs), are localized respectively to the three structural layers of blood vessels: intima, media, and adventitia. All of these human blood-vessel-derived stem cell (hBVSC) populations not only express classic MSC markers but also possess mesodermal developmental potentials similar to typical MSCs. Previously, MECs, PCs, and ACs have been isolated through distinct protocols and subsequently characterized in separate studies. The current isolation protocol, through modifications to the isolation process and adjustments in the selective cell surface markers, allows us to simultaneously purify all three hBVSC subpopulations by FACS from a single human muscle biopsy. This new method will not only streamline the isolation of multiple BVSC subpopulations but also facilitate future clinical applications of hBVSCs for distinct therapeutic purposes.

Blood vessels within human skeletal muscle harbor several multi-lineage precursor populations that are ideal for regenerative applications. This isolation method allows simultaneous purification of three multipotent precursor cell populations respectively from three structural layers of blood vessels: myogenic endothelial cells from intima, pericytes from media, and adventitial cells from adventitia.

İnsan İskelet Kası Kan-damar-türevli Multipotent Öncüleri İzolasyonu

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the isolation of these vesicles, including ultracentrifugation, ultrafiltration, and size exclusion chromatography. However, not all are suitable for large scale exosome purification and characterization. Outlined here is a protocol for establishing cultures of primary fibroblasts isolated from adult mouse skeletal muscles, followed by purification and characterization of exosomes from the culture media of these cells. The method is based on the use of sequential centrifugation steps followed by sucrose density gradients. Purity of the exosomal preparations is then validated by western blot analyses using a battery of canonical markers (i.e., Alix, CD9, and CD81). The protocol describes how to isolate and concentrate bioactive exosomes for electron microscopy, mass spectrometry, and uptake experiments for functional studies. It can easily be scaled up or down and adapted for exosome isolation from different cell types, tissues, and biological fluids.

This protocol illustrates the 1) the isolation and culture of primary fibroblasts from the adult mouse gastrocnemius muscle as well as 2) purification and characterization of exosomes using a differential ultracentrifugation method combined with sucrose density gradients followed by western blot analyses.

İskelet Kası Fibroblastlarından Eksozomların İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Preparation of Rat Skeletal Muscle Homogenates for Nitrate and Nitrite Measurements

Nitrate ions (NO3-) were once thought to be inert end products of nitric oxide (NO) metabolism. However, previous studies demonstrated that nitrate ions can be converted back to NO in mammals through a two-step reduction mechanism: nitrate being reduced to nitrite (NO2-) mostly by oral commensal bacteria, then nitrite being reduced to NO by several mechanisms including via heme- or molybdenum-containing proteins. This reductive nitrate pathway contributes to enhancing NO-mediated signaling pathways, particularly in the cardiovascular system and during muscular exercise. The levels of nitrate in the body before such utilization are determined by two different sources: endogenous NO oxidation and dietary nitrate intake, principally from plants. To elucidate the complex NO cycle in physiological circumstances, we have examined further the dynamics of its metabolites, nitrate and nitrite ions, which are relatively stable compared to NO. In previous studies skeletal muscle was identified as a major storage organ for nitrate ions in mammals, as well as a direct source of NO during exercise. Therefore, establishing a reliable methodology to measure nitrate and nitrite levels in skeletal muscle is important and should be helpful in extending its application to other tissue samples. This paper explains in detail the preparation of skeletal muscle samples, using three different homogenization methods, for nitrate and nitrite measurements and discusses important issues related to homogenization processes, including the size of the samples. Nitrate and nitrite concentrations have also been compared across four different muscle groups.

We present protocols for three different methods for the homogenization of four different muscle groups of rat skeletal muscle tissue to measure and compare the levels of nitrate and nitrite. Furthermore, we compare different sample weights to investigate whether tissue sample size affects the results of homogenization.

Nitrat ve Nitrit Ölçümleri için Sıçan İskelet Kas Homojenatlarının Hazırlanması

Nitrate ions (NO3-) were once thought to be inert end products of nitric oxide (NO) metabolism. However, previous studies demonstrated that nitrate ions ...

Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological physiology. Overexpression or knockdown of target genes enables investigators to manipulate individual molecular events and, thus, better understand the mechanisms that impact muscle mass, muscle metabolism, and contractility. In addition, electroporation of DNA plasmids that encode fluorescent tags allows investigators to measure changes in subcellular localization of proteins in skeletal muscle in vivo. A key functional assessment of skeletal muscle includes the measurement of muscle contractility. In this protocol, we demonstrate that whole muscle contractility studies are still possible after plasmid DNA injection, electroporation, and gene expression modulation. The goal of this instructional procedure is to demonstrate the step-by-step method of DNA plasmid electroporation into mouse skeletal muscle to facilitate uptake and expression in the myofibers of the tibialis anterior and extensor digitorum longus muscles, as well as to demonstrate that skeletal muscle contractility is not compromised by injection and electroporation.

Electroporation of plasmid DNA into skeletal muscle is a viable method to modulate gene expression without compromising muscle contractility in mice.

Plazmid DNA'sının Fare İskelet Kasına Elektroporasyonu

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological ...

Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome

The composition of the gut microbiome can have a dramatic impact on host physiology throughout the development and the life of the animal. Measuring compositional changes in the microbiome is crucial in identifying the functional relationships between these physiological changes. Caenorhabditis elegans has emerged as a powerful host system to examine the molecular drivers of host-microbiome interactions. With its transparent body plan and fluorescent-tagged natural microbes, the relative levels of microbes within the gut microbiome of an individual C. elegans animal can be easily quantified using a large particle sorter. Here we describe the procedures for the experimental setup of a microbiome, collection, and analysis of C. elegans populations in the desired life stage, operation, and maintenance of the sorter, and statistical analyses of the resulting datasets. We also discuss considerations for optimizing sorter settings based on the microbes of interest, the development of effective gating strategies for C. elegans life stages, and how to utilize sorter capabilities to enrich animal populations based on gut microbiome composition. Examples of potential applications will be presented as part of the protocol, including the potential for scalability to high-throughput applications.

Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome

Caenorhabditis elegans is a powerful model to examine the molecular determinants driving host-microbiome interactions. We present a high throughput pipeline profiling the single animal levels of gut microbiome colonization together with key aspects of the C. elegans physiology.

Caenorhabditis elegans Bağırsak Mikrobiyomunun Miktar Tayini ve Analizi için Akış Vermimetrisinin Uygulanması

The composition of the gut microbiome can have a dramatic impact on host physiology throughout the development and the life of the animal. Measuring ...