Bu araştırma, Li Ka Shing Vakfı, Guangdong Yüksek Düzeyli Üniversite Projesi &quot;Deniz Teknolojileri için Yeşil Teknolojiler&quot;, Çin Doğa Bilimleri Vakfı (http://www.nsfc.gov.cn/ Grant No. 30971665, 81172894, 81370925) ve Guangdong Eğitim Bölümü (http://www.gdhed.edu.cn/ Grant No.cxzd1123).

8 ila 12 haftalık BALB / c fareleri Shanghai Experimental Animal Center&#39;dan (Shanghai, Çin) satın alındı ​​ve spesifik patojen içermeyen ve klimalı bir hayvan tesisinde yetiştirildi. Hayvan bakımı ve deneysel prosedürler, Shantou Üniversitesi tarafından kurulan laboratuar hayvanlarının kullanımı ve bakımına ilişkin esaslara uygundu. 1. Cihazın Montajı <ol><li> Steriliyet sağlamak için, kullanmadan önce 30 dakika boyunca bir doku kültürü kapağının UV ışığını açın. </li><li> Tek kullanımlık bir 25 mm filtre ünitesinin vidalarını sökün ve ünitenin altını ve altını 30 dakika süreyle% 75 etanol ile dolu 200 mL&#39;lik bir cam kaba batırın. Ünite tıbbi sınıf polipropilenden yapılmıştır. </li><li> Forsep kullanarak ünitenin alt kısmını ve altını kaldırın, kalan etanolü elle çalkalayın ve parçaları havalandırmanın başında 10 dakika boyunca kurumasına izin verin. </li><li> PBS&#39;de 19 mm&#39;lik bir polikarbonat zar yerleştirin ve şişenin destekleyici matrisinin üzerine dikkatlice yerleştirin.Ünitenin m. Polimer filmin pürüzsüz, düz bir yüzeyi ve iz sürüklenmiş 3 um gözenekleri vardır. </li><li> Kapağı alt tarafa sıkıca vidalayarak üniteyi yeniden monte edin. Zarın merkezden ayrılmadığından emin olun. </li><li> 1 mL&#39;lik bir insülin şırınganın iğnesini çıkarın ve 1 mL&#39;lik PBS&#39;yi çekin. Şırıngayı filtre ünitesine takın ve ardından üniteyi ıslatmak ve herhangi bir sızıntı olup olmadığını test etmek için PBS&#39;yi ünite boyunca itin. </li></ol> 2. Plazma Membran Vesiküllerinin Üretimi (PMV&#39;ler) <ol><li> Nemeth ve diğerleri tarafından bildirilen bir BMSC kültürü oluşturun . 15 ,% 15 FBS ve% 1 penisilin / streptomisin içeren DMEM kültür ortamında. Hücreleri 37 ° C&#39;de% 5 CO 2 içeren nemli bir kuluçka makinesi içinde 6 oyuklu bir plakada yetiştirin. </li><li> Hücreleri yaymak için, kültür ortamını çıkarın ve kuyu, 0.5 mL kalsiyum içermeyen PBS ile durulayın. </li><li> 0.5 mL% 0.25 tripsin-EDTA ilave edin ve hücreleri 37 ° C&#39;de inkübe edin.3 dakika boyunca. Hücrenin ayrılmasını kolaylaştırmak için plakaya birkaç kez elinizin avucuna dokunun. 1 mL kültür ortamı ekleyerek sindirimi durdurun. </li><li> 15 mL konik tüp içindeki hücreleri toplayın ve tezgah üstü santrifüjde 200 xg&#39;de 2 dakika döndürün. 4 ml kültür ortamında hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin ve 6 oyuklu bir plakanın iki kuyucuğuna bölün. NOT: Hücreler genellikle yaklaşık 24 saatte konfluansa gelirler. </li><li> PMV&#39;ler üretmek için tripsin sindirimi ile 6 oyuklu bir plakanın bir kuyudan (yaklaşık 5 x 10 5 hücre) hücreleri hasat edin ve 0.5 mL kültür ortamındaki hücreleri tek dağılım haline getirin. </li><li> Hücreleri insülin şırınga içine yükleyin, filtre ünitesine takın ve hücreleri filtre boyunca sıkıştırmak için pistonu çabucak bastırın. Sıkıştırılmış ortamı atın, çünkü içinde yalnızca birkaç PMV bulunmalıdır. </li><li> Şırınga içine 0.5 mL daha ilave edin ve çabucak filtreye itin. Içeren ikinci ekstrüzyon ortamı toplandı.Çeşitli boyutlarda PMV&#39;ler. </li><li> Toplanan aracın 150 μL&#39;sini bir 35 mm&#39;lik cam altı tabağa yükleyin ve PMV&#39;lerin yaklaşık 10 dakika boyunca tabana çökelmesine izin verin. PMX&#39;leri, 20X objektif lensi kullanarak bir CCD kamera ile donatılmış ters faz kontrast mikroskopu altında inceleyin. </li></ol> 3. Konfokal Mikroskopi Kullanılarak PMV&#39;ler İçerisinde İçerik İncelenmesi <ol><li> BMSC&#39;lerde transfeksiyon yapmak için, 50 μL serumsuz DMEM&#39;de 2 μg süper sargılı plazmid DNA ve 6 μL katyonik transfeksiyon reaktifini ( örn., PolyJet) sulandırın. Tüpün kenarlarından tüm sıvıyı toplamak için iyice karıştırmak için kısa bir süre vorteksleyin. </li><li> Seyreltilmiş çözelti damla damla DNA çözeltisine damla damla ilave edin (adım 3.1&#39;den), kuvvetli bir şekilde 1 dakika vorteksleyin, kısaca döndürün ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. </li><li> Gecelik yaklaşık% 30 birleşimde tohumlanmış olan BMSC&#39;lerdeki eski aracı maddeyi 2 mL taze kültür ortamı ile değiştirin ve DNBir transfeksiyon karışımı damla damla. </li><li> 12 saatlik transfeksiyon sonrasında 2 mL taze ortam ile değiştirin. </li><li> Sitoplazma lokalize proteinleri izlemek için hücreleri yukarıda tarif edildiği gibi bir EGFP ifade kasedi (pEGFP-N1) içeren plasmidle transfekte edin. Yukarıda tarif edildiği gibi PMV üretimi için transfeksiyondan 48 saat sonra tripsin sindirimi ile hücreleri hasat edin. </li><li> Mitokondriyeyi izlemek için, hücreleri mitokondriyal boya (1 uM, MitoTracker) ile taze kültür ortamında 37 ° C&#39;de 30 dakika boyunca lekeleyin. </li><li> Mitokondrinin zar potansiyelini saptamak için, hücreleri siyanin boyası JC-1 (5,5 &#39;, 6,6&#39;-tetrakloro-1,1&#39;, 3,3&#39;-tetraetilbenzimidazolilkarbosiyanin iyodid) (10 μg / ML) taze kültür ortamında 37 ° C&#39;de 30 dakika inkübe edin. <ol><li> Hücreleri 0.5 mL PBS ile üç kez yıkayın ve yukarıda tarif edildiği gibi PMV üretimi için tripsin sindirimiyle hücreleri hasat edin. </li><li> Toplanan tıbbi maddenin 150 μL&#39;ini yükleyin.35 mm&#39;lik bir cam altı tabağa koyun ve PMV&#39;lerin yaklaşık 10 dakika boyunca tabana oturmasına izin verin. 100X yağ objektif lens kullanarak konfokal mikroskop altında PMVs inceleyin. </li></ol></li><li> EGFP&#39;yi veya mitokondriyal boyayı algılamak için 488 nm lazeri açın ve 505-530 nm&#39;de sinyal toplayın. JC-1&#39;i saptamak için 488 nm ve 543 nm lazerleri açın ve 505-530 nm ve 560-615 nm&#39;de sinyal toplayın. İğne deliği değerini yaklaşık 1.4 yapın. </li></ol> 4. Konsantre PMV&#39;lerin Santrifüjle Hazırlanması <ol><li> Tripsin sindirimi ile hücreleri hasat edin ve yukarıda tarif edildiği gibi PMV&#39;leri 0.5 mL kültür ortamında üretin. </li><li> PMV&#39;leri oda sıcaklığında 5 dakika süreyle bir tezgah üstü santrifüjde 1200 xg&#39;de döndürün. Dikkatle süpernatantı aspire edin ve yumuşak topraklama ile kültür ortamı 100 mcL pelet tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> 35 mm&#39;lik cam alt tabağa 50 μL PMV yükleyin ve yaklaşık 10 dakika boyunca oda sıcaklığında çökelmelerine izin verin. PMV&#39;leri inceleyin40X yağ objektif lens kullanarak konfokal bir mikroskop altında. </li><li> Seyreltilmiş polietilenimin (PEI) çözeltisi serisini 1 saat süreyle BMSC kültürüne ilave edin ve sitotoksisite işaretlerini kontrol edin. NOT: Burada BMSC&#39;lerde toksisite işareti bulunmadığından 2 μg / mL PEI seçilmiştir. </li><li> Tripsin sindirimle hücreleri hasat edin ve agregasyonu önlemenin bir yolu olarak hücre zarını şarj etmek için 1 saat boyunca 2 ug / mL&#39;de PEI ilave edin. Yukarıda tarif edildiği gibi 0,5 mL kültür ortamında PMV&#39;ler üretin. PMV&#39;leri konsantre hale getirin ve yukarıda açıklandığı gibi konfokal bir mikroskop altında inceleyin. </li></ol> 5. PMV&#39;lerin Gastroknemius Kasına Enjekte Edilmesi <ol><li> Memeyi lekelenmek için, 30 dakika boyunca BMSC&#39;ye 1 mL taze kültür ortamında CM-DiI (klorometil dialkil-indokarbosiyanin) (10 uM) boya ilave edin. </li><li> Tripsin sindirimi ile hücreleri (yaklaşık 5 x 10 5 ) toplayın ve 0.5 mL kültür ortamında tekrar süspansiyon haline getirin. PEI (2 μg / mL) 1h. PMV&#39;leri, yukarıda tarif edildiği gibi, 100 uL kültür ortamında üretin ve konsantre hale getirin. </li><li> 12 saatlik aç bıraktıktan sonra sodyum barbital (10 mg / kg) enjekte ederek bir BALB / c fareyi başlatın. </li><li> Gastroknemius kasının dışını% 75 etanol ile temizleyin. 30 G&#39;lik bir insülin şırınga kullanarak yavaşça PMV&#39;leri (100 μL) gastroknemius kasına enjekte edin. </li><li> Anestezi uygulandıktan sonra, deney süresince gözlerin üzerine ıslak bir gazlı bez yerleştirin ve uyanana kadar fareyi bir akkor ışıkla ısıtın. Fare tek başına bir havalandırma kafesinde yalnız bırakın. </li><li> Ameliyattan 12 saat sonra gastroknemius kasını hasat etmek için fare servikal dislokasyonla öldürüldü. </li><li> Gastroknemius kası üzerine% 75 etanol serpiştirin, makasla deriyi açın ve her iki ucundaki tüm gastroknemius kasını kesin. </li><li> Kas PBS ile durulayın ve bir floresan mikroskop altında 20X objektif lens kullanarak inceleyin. </li><li> Kası birFloresan olmayan parçaları çıkarmak için keskin traş bıçağı. Güçlü kırmızı flüorür ile parçaları yaklaşık 9 mm 3 küp içine kesin. </li><li> Her küveti optimum kesme sıcaklığı ortamına (OCT) yerleştirin, 5 dakika süreyle sıvı nitrojene batırın ve kullanılıncaya kadar -20 ° C&#39;lik bir dondurucuda saklayın. </li><li> Dondurulmuş parçaları bir kriyostat kullanarak 20 μm kalınlığında parçalara kesin ve her bir bölüme bir cam slayta yapıştırın. Kesiti PBS ile bir kez durulayın. </li><li> Bir leke daire kalemi olan bölüm etrafında bir daire çizin ve 100 mcL DAPI (1 μg / mL) ekleyin. Karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka sonra DAPI çözüm aspire ve PBS ile üç kez yıkayın. </li><li> Örneğe monte yağı atın, bir cam kaymayla örtün ve slaytı oje ile sızdırmaz kılın. 100X yağ objektif lens kullanarak konfokal mikroskop altında bölüm inceleyin. </li><li> CM-DiI&#39;yi tespit etmek için 543 nm lazeri açın ve 560-615 nm&#39;de sinyal toplayın. DAPI algılamak için &lt;a0&gt; &lt;/ a0&gt;, 405Nm lazer ve 420-480 nm&#39;de sinyal toplayın. İğne deliği değerini yaklaşık 1.4 yapın. </li></ol>

<ol>
	<li>Abe, A., Miyanohara, A., Friedmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+gene+transfer+with+fusogenic+liposomes+containing+vesicular+stomatitis+virus+G+glycoprotein.">Enhanced gene transfer with fusogenic liposomes containing vesicular stomatitis virus G glycoprotein.</a> J Virol. 72 (7), 6159-6163 (1998).</li><li>Dolatabadi, J., Valizadeh, H., Hamishehkar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid+lipid+nanoparticles+as+efficient+drug+and+gene+delivery+systems:+recent+breakthroughs.">Solid lipid nanoparticles as efficient drug and gene delivery systems: recent breakthroughs.</a> Adv Pharm Bull. 5 (2), 151-159 (2015).</li><li>Torchilin, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional,+stimuli-sensitive+nanoparticulate+systems+for+drug+delivery.">Multifunctional, stimuli-sensitive nanoparticulate systems for drug delivery.</a> Nat Rev Drug Discov. 13 (11), 813-827 (2014).</li><li>Wolf, D. P., Mitalipov, N., Mitalipov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+replacement+therapy+in+reproductive+medicine.">Mitochondrial replacement therapy in reproductive medicine.</a> Trends Mol Med. 21 (2), 68-76 (2015).</li><li>L&#243;pez-Otin, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hallmarks+of+aging.">The hallmarks of aging.</a> Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).</li><li>Plakkal, J., Paul, A. A., Goo, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplet-associated+proteins+in+atherosclerosis.">Lipid droplet-associated proteins in atherosclerosis.</a> Mol Med Rep. 13 (6), 4527-4534 (2016).</li><li>Hoppener, J. W. M., Ahren, B., Lips, C. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+amyloid+and+type+2+diabetes+mellitus.">Islet amyloid and type 2 diabetes mellitus.</a> N Engl J Med. 343 (6), 411-419 (2000).</li><li>Jagust, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+amyloid-&#946;+harmful+to+the+brain?+Insights+from+human+imaging+studies.">Is amyloid-&#946; harmful to the brain? Insights from human imaging studies.</a> Brain. 139 (Pt 1), 23-30 (2016).</li><li>Naidoo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endoplasmic+reticulum+stress+response+and+aging.">The endoplasmic reticulum stress response and aging.</a> Rev Neurosci. 20 (1), 23-37 (2009).</li><li>Cuervo, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+and+aging:+keeping+that+old+broom+working.">Autophagy and aging: keeping that old broom working.</a> Trends Genet. 24 (12), 604-612 (2008).</li><li>Bratic, A., Larsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mitochondria+in+aging.">The role of mitochondria in aging.</a> J Clin Invest. 123 (3), 951-957 (2013).</li><li>Lin, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+VSV-G+produces+fusogenic+plasma+membrane+vesicles+capable+of+efficient+transfer+of+bioactive+macromolecules+and+mitochondria.">Incorporation of VSV-G produces fusogenic plasma membrane vesicles capable of efficient transfer of bioactive macromolecules and mitochondria.</a> Biomed Microdevices. 18 (3), 41 (2016).</li><li>Riekstina, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+marker+expression+pattern+in+human+mesenchymal+stem+cells+derived+from+bone+marrow,+adipose+tissue,+heart+and+dermis.">Embryonic stem cell marker expression pattern in human mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, heart and dermis.</a> Stem Cell Rev. 5 (4), 378-386 (2009).</li><li>Purandare, B., Teklemariam, T., Zhao, L. M., Hantash, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+HLA+profiling+and+immunomodulatory+effects+of+human+adult+bone+marrow-+and+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells.">Temporal HLA profiling and immunomodulatory effects of human adult bone marrow- and adipose-derived mesenchymal stem cells.</a> Regen Med. 9 (1), 67-79 (2014).</li><li>Nemeth, K., Mayer, B., Sworder, B. J., Kuznetsov, S. A., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+culturing+mouse+and+human+bone+marrow+stromal+cells.">A practical guide to culturing mouse and human bone marrow stromal cells.</a> Curr Protoc Immunol. 102, (2013).</li><li>Shahabipour, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+Nanoparticulate+tools+for+RNA+interference+and+drug+delivery.">Exosomes: Nanoparticulate tools for RNA interference and drug delivery.</a> J Cell Physiol. , (2017).</li><li>Lamichhane, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+roles+for+extracellular+vesicles+in+tissue+engineering+and+regenerative+medicine.">Emerging roles for extracellular vesicles in tissue engineering and regenerative medicine.</a> Tissue Eng B. 21 (1), 45-54 (2015).</li><li>Baumgart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+fluid/fluid+phase+separation+of+proteins+and+lipids+in+giant+plasma+membrane+vesicles.">Large-scale fluid/fluid phase separation of proteins and lipids in giant plasma membrane vesicles.</a> Proc Natl Acad Sci. 104 (9), 3165-3170 (2007).</li><li>Sezgin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+membrane+structure+and+protein+behavior+using+giant+plasma+membrane+vesicles.">Elucidating membrane structure and protein behavior using giant plasma membrane vesicles.</a> Nat Protoc. 7 (6), 1042-1051 (2012).</li><li>Lingwood, D., Ries, J., Schwille, P., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membranes+are+poised+for+activation+of+raft+phase+coalescence+at+physiological+temperature.">Plasma membranes are poised for activation of raft phase coalescence at physiological temperature.</a> Proc Natl Acad Sci. 105 (29), 10005-10010 (2008).</li><li>Pandey, A. P., Sawant, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimine:+A+versatile,+multifunctional+non-viral+vector+for+nucleic+acid+delivery.">Polyethylenimine: A versatile, multifunctional non-viral vector for nucleic acid delivery.</a> Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 68, 904-918 (2016).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Cytoplasm replacement therapy as proposed in this manuscript has unique advantages over other reported approaches such as gene, molecular, and cell therapy. PMVs generated from BMSCs encapsulate not only the products of stemness genes but also intact cellular organelles, which are essential to remedy the ageing phenotypes associated with senescence. When young cytoplasm is delivered to senescent cells, the malfunctioning mechanisms may gain a brief relief; at the same time, the epigenome could be reprogrammed and invigor...

<html> Gen, enzim ve hücre replasman tedavileri için yaklaşımlar oluşturmak için büyük çaba harcandı. Bu, büyük ilerlemeler ve hatta klinik uygulamalarla sonuçlandı 1 , 2 , 3 . Yakın zamanda, yaşlı kadınların veya ölümcül mitokondriyal DNA mutasyonu taşıyan in vitro döllenmeye çekirdek transfer teknolojisine dayalı tartışmalı bir mitokondria replasman tedavisi uygulanmıştır4. Ateroskleroz, tip 2 diyabet, Alzheimer hastalığı ve kanser gibi yaşla ilişkili hastalıklarda bulunan kusurlar genellikle çok yönlüdür. Lipid damlacıklarının birikiminin; Amiloid proteinin birikimi; Açılmış proteinlerin endoplazmik retikulumda tutulması; Ve arızalı proteazom, otofagozom ve mitokondri bu hastalıkların gelişimine veya şiddetlenmesine katkıda bulunur&quot;Xref&quot;&gt; 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . Halen, yaşlanmaya ve yaşlanmaya neden olan fenotiplere neden olan sitozol ve organellerde arızanın doğrudan düzeltilmesini amaçlayan herhangi bir mekanizma mevcut değildir. Daha önce, memeli hücrelerinin mekanik ekstrüzyonu yoluyla plazma zar veziküllerinin (PMV&#39;lerin) üretimini bildirdik 12 . Çekirdek dışında, PMV&#39;lerde protein ve RNA da dahil olmak üzere zar veya sitoplazmadaki bileşenlerin yanı sıra mitokondri gibi organel bileşikleri de bulundu. Esasen, bir PMV minyatür enükleated hücre olarak kabul edilebilir. Daha da önemlisi, PMV&#39;lerin mitokondriyal eksik Rho0 hücreleri ile birleşmesi, normal kültür koşulları altında mitotik aktiviteyi geri kazandırdı. Bu, establi hakkındaki ilk rapordur.Sitoplazma replasman tedavisi için potansiyel olarak verimli bir yaklaşım savunur. Kemik iliği mezenkimal kök hücreleri (BMSC&#39;ler), kemik iliğinden rutin olarak üretilen ve kültürde kolaylıkla genişleyen multipotent progenitör hücrelerdir. Embriyonik kök hücre markörleri Oct4, Nanog ve SOX2 MSC&#39;lerde düşük seviyelerde tespit edildi 13 . Telomeraz etkinliği de ölçülebilirdir. Buna ek olarak, yardımcı uyarıcı moleküller ve insan lökosit antijeni (HLA) Sınıf II moleküllerinin yanı sıra MSC&#39;lerde düşük HLA Sınıf I ifadesi bulunmadığından, bunları allojenik veya &quot;raflarda&quot; kullanım için ideal hücreler haline getirir Hem rejeneratif tıp hem de immünomodülatör uygulamalar 14 . Burada, 3-μm gözenekli bir polikarbonat zar yoluyla ekstrüzyon yoluyla fare BMSC&#39;lerden PMV&#39;lerin nasıl hazırlanacağını, PMV&#39;lerde mitokondri varlığını belirleyip, confoc kullanarak PMV&#39;lerin bakımını inceliyoruz.Konsantre fakat agregasyonsuz PMV&#39;leri santrifüjleme ile hazırlayın ve PMV&#39;lerin farelerin gastroknemius kütlesine in vivo enjeksiyonu gerçekleştirin.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>IsoporeTM membranes</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>TSTP04700</td>
			<td>3 mm pore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable filter unit</td>
			<td>Xinya, Shanghai, China</td>
			<td>25 mm</td>
			<td>Medical grade polypropylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>328446</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pN1-EGFP</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>&#160;6085-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>M7514</td>
			<td>Green FM, 1 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JC-1</td>
			<td>Beyotime, Haimen, China</td>
			<td>C2006</td>
			<td>10 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM-DiI</td>
			<td>Beyotime, Haimen, China</td>
			<td>C1036</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3143</td>
			<td>Mn = 75000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TE 2000</td>
			<td>With CCD camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocol Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>LSM 510 Meta</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolyJet</td>
			<td>SigaGen</td>
			<td>SL100688</td>
			<td>For cell transfection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of plasma membrane vesicles from bone marrow mesenchymal stem cells for potential cytoplasm replacement therapy

Daha önce, memeli hücrelerinin mekanik ekstrüzyonu yoluyla plazma zar veziküllerinin (PMV&#39;ler) üretimini bildirdik. PMV&#39;lerin mitokondriyal yetersiz Rho0 hücreleri ile birleşmesi, normal kültür koşullarında mitotik aktiviteyi geri kazandırdı. Ateroskleroz, tip 2 diyabet, Alzheimer hastalığı ve kanser, çeşitli hücre tiplerinin sitolol ve organellerinde çok sayıda mekanik ve fonksiyonel kusur ile ilişkili olduğu bildirilen yaşa bağlı hastalıklardır. Kemik iliği mezenkimal kök hücreleri (BMSC&#39;ler), kendi çoktanlıklarını korurken kendi kendini yenileme kabiliyetlerine sahip olan kemik iliğinden gelen benzersiz bir hücre popülasyonunu temsil eder. Yaşlanmayı önleyici hücrelerin, otolog BMSC&#39;lerden genç sitoplazması ile PMV&#39;lerin füzyonu yoluyla eklenmesi, yaşa bağlı fenotiplerin iyileştirilmesi veya hatta tersine çevrilmesi için umut verici bir yaklaşım sağlar. Bu protokol, 3&#39;lü polikarbonat membran içinden ekstrüzyon yoluyla BMSC&#39;lerden PMV&#39;lerin nasıl hazırlanacağını açıklamaktadır.1 gözenekleri, mitokondri varlığını belirlemek ve bir konfokal mikroskop kullanarak PMV&#39;ler içinde zar potansiyelinin bakımı incelemek, santrifüj ile PMVs konsantre ve farelerin gastroknemius kas içine PMVs in vivo enjeksiyonu gerçekleştirmek.

PMV&#39;lerin başarılı bir şekilde hazırlanmasının anahtarı, filtre ünitesinin doğru şekilde monte edilmesine ( Şekil 1 ) bağlıdır ve membrandan 1 mL PBS iterek test edilebilir. Sızıntı oluşursa, filtre ünitesini tekrar monte edin ve tekrar test edin. Bununla birlikte, sızıntı, hücreler zardan içeri itildiğinde güvenilir şekilde test edilebilir. 10X objektif kullanarak normal bir mikroskopta yalnızca birkaç PMV tespit edilirse veya PMV&#39;l...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Plasma Membrane Vesicles from Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells for Potential Cytoplasm Replacement Therapy at JoVE.com

Preparation of Plasma Membrane Vesicles from Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells for Potential Cytoplasm Replacement Therapy

Yaşa bağlı hastalıklar, sitoplazmadaki bileşenlerin birden fazla kusuru ile ilişkilidir. Burada, kemik iliği mezenkimal kök hücrelerinden plazma membran veziküller hazırlamak için bir protokol sunuyoruz. Bu teknik yaşla ilişkili fenotipleri iyileştirmek veya hatta tersine çevirmek için sitoplazma replasman tedavisi aracı olarak potansiyel olarak kullanılabilir.

Potansiyel Sitoplazma Replasman Tedavisi için Kemik İliği Mezenkimal Kök Hücrelerinden Plazma Membran Vesiküllerinin Hazırlanması

We have previously reported on the generation of plasma membrane vesicles (PMVs) through the mechanical extrusion of mammalian cells. The fusion of PMVs ...

preparation-plasma-membrane-vesicles-from-bone-marrow-mesenchymal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

7.5K Görüntüleme.  Shantou University.  Yaşa bağlı hastalıklar, sitoplazmadaki bileşenlerin birden fazla kusuru ile ilişkilidir. Burada, kemik iliği mezenkimal kök hücrelerinden plazma membran veziküller hazırlamak için bir protokol sunuyoruz. Bu teknik yaşla ilişkili fenotipleri iyileştirmek veya hatta tersine çevirmek için sitoplazma replasman tedavisi aracı olarak potansiyel olarak kullanılabilir. 

Video: Preparation of Plasma Membrane Vesicles from Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells for Potential Cytoplasm Replacement Therapy

Isolation of Human Mesenchymal Stem Cells and their Cultivation on the Porous Bone Matrix

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold. Thus, the application of MSCs in repair and tissue regeneration processes depends principally on the efficient implementation of the techniques for placing these cells in a host tissue. For this reason, the design of biomaterials and cellular scaffolds has gained importance in recent years because the topographical characteristics of the selected scaffold must ensure adhesion, proliferation and differentiation into the desired cell lineage in the microenvironment of the injured tissue. This option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) employs bovine bone matrix as a cellular scaffold and is an efficient culture technique because the cells respond to the topographic characteristics of the bovine bone matrix Nukbone (NKB), i.e., spreading on the surface, macroporous covering and colonizing the depth of the biomaterial, after the cell isolation process. We present the procedure for isolating and culturing MSCs on a bovine matrix.

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs the bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold.

İnsan Mezenkimal Kök Hücre İzolasyonu ve Gözenekli Kemik Matrix kendi Yetiştirme

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific ...

Gelişim Biyolojisi

An Enzymatic Method to Rescue Mesenchymal Stem Cells from Clotted Bone Marrow Samples

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade clots in the bone marrow and release MSCs for further use. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to bone marrow resampling. Bone marrow is a major source of MSCs, which are interesting for tissue engineering and autologous stem cell therapies. Upon withdrawal bone marrow may clot, as it comprises all of the hematopoietic system. The resulting clots contain also MSCs that are lost for expansion culture or direct stem cell therapy. We experienced that 74% of canine bone marrow samples contained clots and yielded less than half of the stem cell number expected from unclotted samples. Thus, we developed a protocol for enzymatic digestion of those clots to avoid labor-intense and costly bone marrow resampling. Urokinase - a clinically approved and readily available thrombolytic drug &#8211; clears away the bone marrow clots almost completely. As a consequence, treated bone marrow aspirates yield similar numbers of MSCs as unclotted samples. Also, after urokinase treatment the cells kept their metabolic activity and the ability to differentiate into chondrogenic, osteogenic and adipogenic lineages. Our protocol salvages clotted blood and bone marrow samples without affecting the quality of the cells. This obsoletes resampling, considerably reduces sampling costs and enables the use of clotted samples for research or therapy.

Mesenchymal stem cells are usually obtained from bone marrow and require expansion culture. When samples clot before processing, a protocol using the (enzymatic) thrombolytic drug urokinase can be applied to degrade the clot. Thus, cells are released and available for expansion culture. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to resampling.

Bir Enzimatik Yöntem Kaymaklı Kemik İliği Örneklerinden Mezenkimal Kök Hücreler Kurtarma

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.

Herein we describe methods for the dissection of fetal and maternal tissues from human term placenta, followed by isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells (MSC) from these tissues.

İnsan Plasenta Doku türetilen İzolasyon ve mezenkimal kök Genişleme / Stromal hücreler

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells (MPCs) from Human Bone Marrow

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel cell population specifically selected for growth in human serum supplemented medium. These cells are characterized by morphological, phenotypic, and molecular features distinct from MSCs and we named them Mesodermal Progenitor Cells (MPCs). MPCs are round, with a thick highly refringent core region; they show strong, trypsin resistant adherence to plastic. Failure to expand MPCs directly revealed that they are slow in cycling. This is as also suggested by Ki-67 negativity. On the other hand, culturing MPCs in standard medium designed for MSC expansion, gave rise to a population of exponentially growing MSC-like cells. Besides showing mesenchymal differentiation capacity MPCs retained angiogenic potential, confirming their multiple lineage progenitor nature. Here we describe an optimized highly reproducible protocol to isolate and characterize hBM-MPCs by flow cytometry (CD73, CD90, CD31, and CD45), nestin expression, and F-actin organization. Protocols for mesengenic and angiogenic differentiation of MPCs are also provided. Here we also suggest a more appropriate nomenclature for these cells, which has been re-named as "Mesangiogenic Progenitor Cells".

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells MPCs from Human Bone Marrow

Here we describe an optimized, highly reproducible protocol to isolate Mesodermal Progenitor Cells (MPCs) from human bone marrow (hBM). MPCs were characterized by flow cytometry and nestin expression. They showed the ability to give rise to exponentially growing MSC-like cell cultures while retaining their angiogenic potential.

İnsan Kemik İliği gelen Yalıtımlı Mesangiogenic Ata Hücreleri (MPCs)

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel ...

Temporal Ordering of Dynamic Expression Data from Detailed Spatial Expression Maps

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a strict species-specific periodicity. The periodicity of the process is regulated by a molecular oscillator, known as the "segmentation clock," acting in the PSM cells. This clock drives the oscillatory patterns of gene expression across the PSM in a posterior-anterior direction. These so-called clock genes are key components of three signaling pathways: Wnt, Notch, and fibroblast growth factor (FGF). In addition, Notch signaling is essential for synchronizing intracellular oscillations in neighboring cells. We recently gained insight into how this may be mechanistically regulated. Upon ligand activation, the Notch receptor is cleaved, releasing the intracellular domain (NICD), which moves to the nucleus and regulates gene expression. NICD is highly labile, and its phosphorylation-dependent turnover acts to restrict Notch signaling. The profile of NICD production (and degradation) in the PSM is known to be oscillatory and to resemble that of a clock gene. We recently reported that both the Notch receptor and the Delta ligand, which mediate intercellular coupling, themselves exhibit dynamic expression at both the mRNA and protein levels. In this article, we describe the sensitive detection methods and detailed image analysis tools that we used, in combination with the computational modeling that we designed, to extract and overlay expression data from distinct points in the expression cycle. This allowed us to construct a spatio-temporal picture of the dynamic expression profile for the receptor, the ligand, and the Notch target clock genes throughout an oscillation cycle. Here, we describe the protocols used to generate and culture the PSM explants, as well as the procedure to stain for the mRNA or protein. We also explain how the confocal images were subsequently analyzed and temporally ordered computationally to generate ordered sequences of clock expression snapshots, hereafter defined as "kymographs," for the visualization of the spatiotemporal expression of Delta-like1 (Dll1) and Notch1 throughout the PSM.

The segmentation clock drives oscillatory gene expression across the pre-somitic mesoderm (PSM). Dynamic Notch activity is key to this process. We use imaging and computational analyses to extract temporal dynamics from spatial expression data to demonstrate that Delta ligand and Notch receptor expression oscillate in the vertebrate PSM.

Detaylı Mekansal İfade Haritalar Dinamik İfade Verilerinin Zamansal Sipariş

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly gained attention because they do not pose any ethical or moral concerns. Current methods to isolate MSCs from UC yield low amounts of cells with variable proliferation potentials. Since UC is an anatomically-complex organ, differences in MSC properties may be due to the differences in the anatomical regions of their isolation. In this study, we first dissected the cord/placenta samples into three discrete anatomical regions: UC, cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP). Second, two distinct zones, cord lining (CL) and Wharton&#39;s jelly (WJ), were separated. The explant culture technique was then used to isolate cells from the four sources. The time required for the primary culture of cells from the explants varied depending on the source of the tissue. Outgrowth of the cells occurred within 3 - 4 days of the CPJ explants, whereas growth was observed after 7 - 10 days and 11 - 14 days from CL/WJ and FP explants, respectively. The isolated cells were adherent to plastic and displayed fibroblastoid morphology and surface markers, such as CD29, CD44, CD73, CD90, and CD105, similarly to bone marrow (BM)-derived MSCs. However, the colony-forming efficiency of the cells varied, with CPJ-MSCs and WJ-MSCs showing higher efficiency than BM-MSCs. MSCs from all four sources differentiated into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic lineages, indicating that they were multipotent. CPJ-MSCs differentiated more efficiently in comparison to other MSC sources. These results suggest that the CPJ is the most potent anatomical region and yields a higher number of cells, with greater proliferation and self-renewal capacities in vitro. In conclusion, the comparative analysis of the MSCs from the four sources indicated that CPJ is a more promising source of MSCs for cell therapy, regenerative medicine, and tissue engineering.

Here, we present a protocol for the dissection of human umbilical cord (UC) and fetal placenta sample into cord lining (CL), Wharton&#39;s jelly (WJ), cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP) for the isolation and characterization of mesenchymal stromal cells (MSCs) using the explant culture technique.

İnsan göbek bağı ve fetal plasentadan Mezenkimal Stromal Hücre İzolasyonu ve Vasıflandırılması

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

Fare Malı İnsani Kemik İliği Mikro Çevrelerinin Biyomühendisliği ve Canlı Görüntüleme ile Görselleştirilmesi

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality microscopic images is not entirely dependent upon the quality of the microscope, but also upon the methods of tissue processing, which often involve multiple critical actions or steps. Furthermore, mesenchymal cell types in the skin and other tissues represent a new challenge for tissue preparation and imaging. Here, we present a complete process, from tissue harvest to microscopy. Our technique, called &#34;horizontal whole mount,&#34; is one that novices can quickly become proficient in and that allows for antigen preservation and detection in 60-300 &#181;m-thick sections cut with a cryostat. Sections of this thickness provide enhanced visualization of tissue microarchitecture in a three-dimensional environment. In addition, the protocol preserves mesenchymal cells in a manner that enhances image quality when compared to standard cryostat or paraffin sections, thereby increasing the efficacy and reliability of immunostaining. We believe that this protocol will benefit all laboratories that visualize skin, and possibly other tissues and organs.

This work presents a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-section analysis that enables the full exploitation of confocal imaging modalities. This protocol preserves antigenicity and represents a robust system to analyze skin histology and potentially other tissue types.

Yatay Dağ Dağı: Derinin kalın, üç boyutlu doku kesitleri için yeni bir İşleme ve Görüntüleme Protokolü

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within the bone marrow cavity alongside hematopoietic stem cells (HSCs), which can give rise to red blood cells, immune progenitors, and osteoclasts. Thus, extractions of cell populations from the bone marrow results in a very heterogeneous mix of various cell populations, which can present challenges in experimental design and confound data interpretation. Several isolation and culture techniques have been developed in laboratories in order to obtain more or less homogeneous populations of BMSCs and HSCs invitro. Here, we present two methods for isolation of BMSCs and HSCs from mouse long bones: one method that yields a mixed population of BMSCs and HSCs and one method that attempts to separate the two cell populations based on adherence. Both methods provide cells suitable for osteogenic and adipogenic differentiation experiments as well as functional assays.

In this article, we present methods to isolate and differentiate bone marrow stromal cells and hematopoietic stem cells from mouse long bones. Two different protocols are presented yielding different cell populations suitable for expansion and differentiation into osteoblasts, adipocytes, and osteoclasts.

Yalıtım, kültür ve kemik iliği Stromal hücreler ve Osteoklast ataları fareler gelen farklılaşma

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

Yaşam sağlam Zebra balığı tek hücreli Photoconversion

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...