Whitehall Vakfı&#39;ndan maddi destek için minnettarız. Değerli yorumları için Samuel T. Kissinger&#39;e teşekkür etmek istiyoruz.

1. Sistem Kurulumu <ol><li> Basınç kontrol ünitesini oluşturun. <ol><li> Basınç kontrol ünitesini devre haritasına göre monte edin ( Şekil 1 ). Gerekli parçaları, elektrik devre şemasına göre üretilen Baskılı Devre Kartı (PCB) üzerine lehimleyin ( Şekil 1b ). Standart rezistörler, LED&#39;ler, Metal Oksit Yarıiletken Alan Efekti Transistörleri (MOSFET&#39;ler), kondansatörler ve konektörleri kullanın ( Malzeme Tablosuna bakın). PCB üzerine lehim solenoid valfleri. Hava pompası ve hava basınç sensörünü elektrik kablosuyla PCB&#39;ye bağlayın. NOT: Basýnç kontrol ünitesini oluþturmak için gerekli bütün parçalarýn hazýrlanmasý yaklaýk 2 saat sürecektir. </li></ol></li><li> İkincil veri toplama (DAQ) kartını bağlayın. <ol><li> Tablo 1&#39;den sonra baskılı devre kartındaki veri çıkışlarını DAQ kartına bağlayın. NOT: DAQ panosu&quot;Tek uçlu mod&quot; ta çalışıyordum. Bağlantı noktası haritasını kullanım kılavuzunda bulabilirsiniz (bkz . Malzeme Tablosu ). </li><li> &quot;AIn Pr S&quot; yi analog giriş (AI) kanallarından birine ve &quot;R-Gr&quot; yi sekonder DAQ panosundaki analog zeminlerden birine bağlayın. </li><li> Amplifikatörden birincil çıkışı AI kanallarından birine ve toprağa sekonder DAQ kartının analog topraklarına bağlayın. NOT: Amplifikatörden birincil çıkışı bağlamak için standart bir BNC kablosu kullanılabilir. </li><li> Diğer ucunu soyun ve pozitif sinyali ( yani bakır damar) AI kanalına ve toprağa ( yani , damar etrafındaki ince tel) analog toprağa bağlayın. Birden fazla yama kanalı kullanılıyorsa, bu adımı ikinci bir kanal için tekrarlayın. NOT: DAQ kartına analog giriş sonraki adımlarda yapılandırılacaktır. </li><li> Gücü, ikincil DAQ kartının güç çıkışına bağlayın. Ayrı bir 12 V güç kullanın;Pompa için teşvik edin. </li></ol></li><li> Boruyu bağlayın. <ol><li> Hava pompasını ve iki valfı Tablo 2&#39;ye göre bağlayın. Son adımda valf 2 üstteki port, basınç sensörü ve pipet tutucusundan yumuşak boruyu bağlamak için 3 yönlü bir konnektör kullanın. </li><li> İki pipet kullanılıyorsa, pipet tutucusuna bağlanan boruya başka bir 3-yollu konektör ekleyin. Yama yaparken kullandığınız valfleri ve pipetleri manuel olarak değiştirin. </li></ol></li><li> Autopatcher IG&#39;yi yükleyin. NOT: Sistem gereksinimi: Autopatcher IG yalnızca Windows 7 çalıştıran bir bilgisayarda test edilmiştir. Diğer işletim sistemleri için onaylanmamıştır. Açıklanan prosedür, özellikle Malzeme Masasında listelenen donanım için geçerlidir. <ol><li> Autopatcher-IG&#39;yi GitHub&#39;dan indirin (https://github.com/chubykin/AutoPatcher_IG). </li><li> Python&#39;u kurun (sürüm ve karşıdan yükleme adresi için Malzeme Tablosuna bakın). </li><li> PyQt4&#39;ü kaldırKomut satırı terminalinde &quot;pip kaldırma PyQt4&quot; yazarak bir arşiv. Not: Sistem Qwt ve Opencv kitaplıkları ile uyumluluk sağlamak için PyQt4 kitaplığının daha eski bir sürümünü kullanır. </li><li> Tarihi tekerlek dosyalarından Python kütüphanelerini yükleyin (http://www.lfd.uci.edu/~gohlke/pythonlibs/). Aşağıdaki dosyaları bulun: Numpy (pymc-2.3.6-cp27-cp27m-win32.whl), Opencv (opencv_python-2.4.13.2-cp27-cp27m-win32.whl), Pyqt (PyQt4-4.11.4-cp27-none -win32.whl) ve Qwt (PyQwt-5.2.1-cp27-none-win32.whl). <ol><li> Tekerlek dosyalarını yüklemek için, dosyaların kaydedildiği dizine gidin ve &quot;pip install *** wheelfilename ***. Whl&quot; yazın. &quot;*** wheelfilename ***&quot; dosyasını dosyanın gerçek adıyla değiştirin. NOT: tekerlek dosya adındaki &quot;cp27&quot;, Python 2.7&#39;yi ve &quot;win32&quot; Windows 32-biti belirtmektedir. &quot;Win32&quot; çalışmazsa, &quot;win64&quot; i deneyin. </li></ol></li><li> CCD kamerayı kontrol etmek için yükleyiciyi indirin ve yükleyin64-bit (https://www.qimaging.com/support/software/). Ardından kamerayı Python&#39;da kontrol etmek için MicroManager for 64-bit&#39;i indirin (https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release). </li><li> Manipülatörleri ve mikroskop sahnesini kontrol etmek için, üretici tarafından sağlanan kontrol yazılımını yükleyin. NOT: Bunu yaparak, manipülatörleri kontrol etmek için gerekli olan sürücü de yüklenir. Yükleme paketi genelde bir CD-ROM&#39;da sağlanır. </li><li> İkincil DAQ kartını kontrol etmek için Evrensel Kitaplığı DAQ kartının satın alınmasıyla birlikte verilen CD-ROM&#39;dan yükleyin. </li></ol></li><li> Autopatcher IG için donanımı yapılandırın. <ol><li> Mikroskop sahne ve manipülatör kontrolörlerini USB bağlantı noktaları üzerinden bilgisayara bağlayın. </li><li> &quot;Yapılandırma&quot; klasöründeki &quot;ports.csv&quot; yapılandırma dosyasında COM port numaralarını ünite 0: mikroskop sahne, ünite 1: sol manipülatör ve ünite 2: sağ manipülatör sırasına atayın. LPorts.csv dosyasındaki diğer parametreleri ( yani &quot;SCI&quot; ​​ve &quot;1&quot;) değiştirmeden bırakın. NOT: COM bağlantı noktası numarası bilgileri, üretici tarafından sağlanan manipülatör yapılandırma yazılımını çalıştırarak bulunabilir. &quot;Ayarlar&quot; sekmesine gidin, &quot;ayarlar&quot; ı ve &quot;Hareket&quot; sayfasını seçin ve üstteki her sekmenin etiketlerini okuyun. Alternatif olarak, bu bilgi PC Aygıt Yöneticisi&#39;nde bulunabilir. </li><li> Bir basınç sensörü ve patch kanalı 1 ve 2 (ünite 1 ve 2&#39;ye karşılık gelir) için analog giriş kanalı numaralarını DAQ kartına atayın. &quot;Configuration&quot; klasöründeki &quot;DAQchannels.csv&quot; dosyasına kanal numarasını girin. NOT: Değişiklikleri kaydederken bilgileri değiştirebileceğinden, .csv dosyalarını bir elektronik tablo yerine Not Defteri uygulamasıyla açmanız önerilir. </li></ol></li><li> Autopatcher IG&#39;yi çalıştırın. <ol><li> Amfi, mikroskop kontrol cihazı ve manipülatör kontrol cihazını açın. ensuAmplifikatör yazılımının çalışıyor olması. </li><li> Autopatcher IG&#39;yi Python ile bir komut satırı terminalinden aşağıdaki gibi çalıştırın: önce, Autopatcher IG&#39;nin kurulu bulunduğu dizini değiştirin (komut &quot;cd&quot;), komut satırı terminalinde &quot;python Autopatcher_IG.pyw&quot; yazın ve &quot;Giriş anahtarı. NOT: Autopatcher IG&#39;yi çalıştırmadan önce manipülatör kontrol yazılımını çalıştırmayın; çünkü Autopatcher IG&#39;nin donanım bulamamasına neden olan mikroskop sahne ve manipülatörü işgal edecektir. Manipülatör kontrol yazılımı, kontrol edilmesi gereken ilave modüller ( örn. Hat içi ısıtıcı) varsa, Autopatcher IG tamamen başlatıldıktan sonra çalıştırılabilir. </li></ol></li><li> Birincil pipeti kalibre edin. <ol><li> Daha önce açıklandığı gibi yama pipetleri çekin 9 . Çekilmiş bir cam pipeti iç çözeltiyle doldurun ve kafa aşamasına yükleyin. NOT: Boş cam pipetlerin altında farklı kontrastlar vardır.Ve mikroskopta hatalı kalibrasyona neden olabilir. </li><li> Mikroskop görüntü alanına pipet ucu taşıyın ve odak haline getirmek. Tuş takımı manipüle edicileri ve / veya mikroskop sahnesini hareket ettirmek için kullanılıyorsa, klavyedeki &quot;z&quot; ye basarak koordinatlarını güncelleyin. NOT: Bu işlem, klavye (mikroskop kademesi: A / D - x ekseni, W / S - y ekseni, R / F - z ekseni; manipülatörler: H / K - x ekseni, U / J - y ekseni, O / L - z ekseni, 1/2 birim numarası) hareketleri kontrol etmek için kullanılır, çünkü koordinatlar gerçek zamanlı olarak güncellenecektir. </li><li> Peteğin yüklendiği ilgili birim için ana Grafik Kullanıcı Arayüzü (GUI) üzerindeki &quot;Kalibrasyona Başla&quot; düğmesine tıklayın ( Şekil 2 ). NOT: Kalibrasyon tamamlandığında bir pop-up pencere açılacaktır. NOT: Kalibrasyon otomatik olarak gerçekleştirilecektir; yaklaşık 3,5 dakika sürecektir. Aynı düğmeyi tıklamak (şu an &quot;kalibrasyonu iptal et&quot; afTer başlatma kalibrasyonu) kalibrasyon denemesini iptal edecektir. </li><li> Ana GUI&#39;nin alt kısmındaki &quot;kalibrasyonu kaydet&quot; i (mevcut kalibrasyonu hem manipülatörler için kaydeder hem de gelecekte yüklenebilir) tıklayarak kalibrasyonu kaydedin. NOT: Düzgün çalışabilmesi için, düşük (4 veya 10X) ve yüksek (40X) büyütme alanı, ikincil kalibrasyon için hizalanmalıdır. Lütfen hizalama prosedürleri için kullanılan optik sistemin kullanım kılavuzuna bakın. </li></ol></li></ol> 2. Otomatik Yama Sıkıştırma Prosedürü <ol><li> Daha önce tarif edildiği gibi akut beyin dilimleri hazırlayın 10 . </li><li> Düzeltme kelepçesi için cam pipet hazırlayın. </li><li> Bir beyin dilimini kayıt odasının merkezine yerleştirin. Dilimi bir dilim tutma veya &quot;arp&quot; ile dengeleyin. </li><li> Floresan hücresi tespit edin. <ol><li> 4X lens altında ilgi alanını bulun. Cli&#39;yi açarak mikroskop sahnesini hareket ettirinCk-to-move (&quot;CTM&quot;) modunda gezinin ve ilgilenilen bölgenin merkezine tıklayın. Alternatif olarak, mikroskop aşamasını (A / D - x ekseni, W / S - y ekseni, R / F - z ekseni) taşımak için tuş takımını kullanın. </li><li> Yüksek büyütme lensine geçin ve tuş takımındaki R / F tuşunu kullanarak mikroskopu z ekseninde hareket ettirerek odaklamayı ayarlayın. NOT: Düşük ve yüksek büyütmeli merceklerin altındaki odak düzleminin z ekseni ile aynı veya benzer olacağı şekilde su banyosu seviyesini ayarlaması önerilir. </li><li> Ana GUI sütununda &quot;Birim 0&quot; adresindeki &quot;Hücre Algıla&quot; düğmesini tıklayın. Kurulumun LED veya lazer ışığı kaynağı TTL sinyaliyle kontrol edilemiyorsa, LED / lazeri elle açın; Hücre tespiti tamamlandığında bir pop-up penceresi belirecektir. <ol><li> Gerekirse LED / lazeri kapatın; &quot;Bellek konumları&quot; GUI&#39;sinde hücre koordinatlarının bir listesi görünür. Koordinatların yanındaki &quot;X&quot; düğmesini tıklatarak listeden istenmeyen hücreleri kaldırın. </li><li>Alternatif olarak, hedef hücreler flüoresan etiketli değilse, ana GUI&#39;de &quot;Fare modu&quot; nu tıklayın. İlgilenilen hücrenin üzerine tıklayın; Bir sayı olan sarı bir nokta hücrede görünür ve hücrenin koordinatları &quot;Bellek konumları&quot; GUI&#39;sinde görünür. </li></ol></li></ol></li><li> İkincil pipeti ayarla. <ol><li> İç çözeltiyle 1/3 cam pipet doldurun. Pipeti kafa aşamasına bağlı pipet tutucusuna yerleştirin. </li><li> Düşük büyütmeli mercek kullanın. Peti görsel alana getirin ve tuş takımını kullanarak odağı ayarlayın (H / K - x ekseni, U / J - y ekseni, O / L - z ekseni). Ünite 1 ile ünite 2 arasında geçiş yapmak için &quot;1&quot; ve &quot;2&quot; kullanın. </li><li> &quot;Kalibrasyonu yükle&quot; yi tıklayarak birincil kalibrasyonu yükleyin. Kullanılan birim altındaki ana GUI&#39;de &quot;İkincil kalibrasyon&quot; düğmesini tıklayın. Örneğin, ünite 2 kullanılırsa, &quot;Ünite 2&quot; bölümündeki &quot;İkincil kalibrasyon&quot; düğmesine tıklayınlumn. Yüksek büyütme lensine geçmek için açılır pencere yönergelerini izleyin. </li></ol></li><li> Hedefi hücreleyin. <ol><li> &quot;MultiClamp&quot; ( yani amplifikatör) yazılımının çalıştığından emin olun. &quot;Patch control&quot; GUI&#39;sini açmak için &quot;Patch control&quot; düğmesine tıklayın; Bu GUI&#39;yi açmak birkaç dakikanızı alabilir. </li><li> Ana GUI &quot;Birim 0&quot; sütununda &quot;40X&quot; işaretleyerek 40X büyütme lensini kullanın. &quot;Bellek konumu&quot; GUI&#39;sindeki koordinat listesindeki ilgi hücresinin yanındaki &quot;git&quot; düğmesine tıklayın; Mikroskop hücreye geçecektir. </li><li> Bir fare tıklamasını takiben hareketi etkinleştirmek için ana GUI&#39;de kullanılan ünitenin CTM düğmesine tıklayın. İlgilenilen hücrenin üzerine tıklayın; Pipet ucu hücrenin hareket edecektir. </li><li> &quot;Patch control&quot; GUI&#39;sindeki &quot;Patch&quot; düğmesine tıklayın. NOT: Otomatik yama başlayacak ve basınç ve direnç üzerinde izlenebilecektir.&quot;Patch control&quot; GUI. <ol><li> Giriş sinyalini iki ünite arasında değiştirmek için &quot;Birim 1 seçildi&quot; düğmesini kullanın. NOT: Sistem hedef hücreye yaklaşır, negatif basınç uygular, hücre zarı potansiyeliyle eşleşir ve basınç ve direnç eşikleri ve mantığı serisine dayanan gigaseal oluşumunu tespit eder. </li><li> &quot;Yama kontrolü&quot; GUI&#39;sindeki ilgili düğmelere tıklayarak otomatik işlemi her noktada yönetin. Örneğin, düzeltme denemesini iptal etmek için tekrar &quot;Düzeltme&quot; düğmesine tıklayın ve eşiğe bakılmaksızın, yama sürecini bir sonraki aşamaya ilerletmek için &quot;Sonraki aşamaya&quot; tıklayın. NOT: Bir gigazal oluştuğunda bir pop-up pencere kullanıcıyı bilgilendirir ve zap&#39;ı büyük negatif basınç ile birlikte uygulama seçeneği sunulur. </li></ol></li><li> Birleştirilen zap ve emme ile içeri girmek için &quot;Evet&quot; i seçin. Alternatif olarak, yalnızca emme ile girmek için &quot;Hayır&quot; ı seçin. <br/&gt; NOT: Başarılı bir tüm hücre yaması tamamlandığında, kullanıcıya deneme düzeltme günlüğünü kaydetmek için bir pop-up pencere hatırlatacaktır. </li><li> Deneme düzeltme günlüğünü kaydedin. NOT: Bir yama denemesi başarısız olursa, kullanıcıya bir açılır pencere bildirilir ve yama işlemi sıfırlanır. </li><li> Adım 2.4&#39;e dönün ve adımları farklı bir hücreyle tekrarlayın. </li></ol></li><li> Düzeltme eşikleri (isteğe bağlı). NOT: İlk pipet direnç aralığı, pozitif ve negatif basınç, devasa direnç vs için eşik değerler. Bir yapılandırma dosyasından değiştirilebilir. <ol><li> Sistemin kurulduğu yerde &quot;Configuration&quot; klasöründeki &quot;PatchControlConfiguration.csv&quot; dosyasını açın. Her bir eşik değerine karşılık gelen sayıları değiştirin. Değerlerin adlarını değiştirmeyin; Bu, sistemde tanınmayan girdilere neden olacaktır. </li><li> Yeni eşik değerlerini hemen &quot;Ct&#39;ye basarak uygulayınRl + L &quot;olarak ayarlandığında, programın yeniden başlatılması dosyadaki en yeni eşik değerini uygulayacaktır. </li></ol></li></ol> 3. Kayıt Yapma NOT: Bilgisayar kontrollü mikroelektrod amplifikatöründeki mod otomatik patcher yazılımı ile başarılı bir yama sağlandıktan sonra Current Clamp (&quot;IC&quot;) konumuna getirilir. Tam hücre yama kelepçesi kayıtları, seçilen kayıt yazılımı kullanılarak yapılabilir (bu sistem bir kayıt fonksiyonu içermez). Birden fazla hedef hücre tanımlandıysa, bir kayıt bittikten sonra adım 2.4&#39;e gidin ve başka bir hücre deneyin. <ol><li> Bir picospritzer (isteğe bağlı) kullanarak otomatik lokal ilaç uygulama deneyleri yapın. NOT: Burada, TTL sinyalleriyle harici donanımı kontrol etmek için ek &quot;Komut Sıra&quot; fonksiyonunun nasıl kullanılacağını açıklamak için bir örnek olarak bir yerel ilaç uygulaması denemesi kullanılır. <ol><li> Bağlantı noktası A cha0 ve sekonder DAQ kartı üzerindeki zemini, basamaksız bir BNC kablosu kullanarak basamaklayıcı üzerindeki başlatma tetik girişine (adım 1.2.3&#39;te açıklandığı gibi) kesin. Sayısallaştırıcıdaki bir dijital çıkış kanalını pikspiztör üzerindeki harici tetikleyiciye bağlayın. </li><li> Kullanıcı el kitabına göre pikspit yazıcının hazırlanması. Bir mikromanipülatöre bağlı olan ilaç püskürtmeli pipet tutacağı pikspritzer hava çıkışını bağlayın. </li><li> Seçilen bir ilaçla dolu bir pipet yükleyin. Pipet tutucusuna takın. Adım 1.7&#39;de açıklandığı gibi pipeti kalibre edin. </li><li> Adım 2.6&#39;da açıklandığı gibi bir hücrenin eklenmesinden sonra, &quot;fare modu&quot; altında kamera görünümü GUI&#39;sini (ana GUI&#39;den anahtarlamalı olarak) fare ile tıklayarak ilaç dağıtımında istediğiniz yeri seçin. Alternatif olarak, ızgaradaki her piksel hedef konumlardan biri olarak bir ızgarayı tasarlamak için &quot;Izgara&quot; GUI&#39;yi kullanın. NOT: Izgara, fare ile sürükleyerek kamera görüntüsü GUI&#39;de manipüle edilebilir. </li><li> &quot;Komuta Sırası&quot; ndaEnce &quot;GUI&#39;de, ilaç pipetinin takılı olduğu manipülatör birimini seçin. İlaç dağıtımı için tüm koordinatları içe aktarmak için&quot; fare noktalarını yükle &quot;veya&quot; şebeke noktalarını yükle &quot;yi tıklayın. <ol><li> Sağ sütundaki belirli komut TTL sinyalini düzenlemek için her koordinat girişini tıklayın. İlk komut girdisinde, en sağdaki basamağı tıklayarak &quot;0&quot; dan &quot;1&quot; e çevirin ve + 5 V TTL sinyal gönderin. Saati (T) istediğiniz TTL sinyal süresine, ms cinsinden ayarlayın. </li><li> İkinci komut girişinde, tüm basamakları &quot;0&quot; olarak ayarlayın ve T&#39;yi denemenin kayıt uzunluğunun süresine ayarlayın. Tüm koordinat girdileri için komutları düzenleyin. Birden fazla TTL sinyali gerekiyorsa &quot;+&quot; işaretini tıklatarak komut girdileri ekleyin. NOT: 8 basamaklı bitler, gerekirse, ikincil DAQ&#39;da (portlar 1 - 3 pompayla ve iki valf tarafından işgal edilir) 0 - 7 numaralı A kanallarını gösterir. </li></ol></li><li> Veri toplama modülünde bir kayıt protokolü oluşturun böyleceBir taramanın başlangıcı harici başlatma tetikleyicisi tarafından tetiklenir. İlacın istenilen zamanda verilmesi için protokolü düzenleyin. </li><li> &quot;Komut Dizisi&quot; GUI&#39;sinde, tüm koordinatları çalıştırmak için soldaki &quot;Çalıştır&quot; ı tıklayın. Alternatif olarak, yalnızca seçilen diziyi çalıştırmak için sağdaki &quot;Çalıştır&quot; ı tıklayın. NOT: Pipet, her bir koordinatta hareket edecek ve kayıt süpürme işlemini başlatmak için TTL sinyalini tanımlandığı şekilde yürütülecektir. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes.">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).</li><li>Collins, M. D., Gordon, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+liposome+preparation+for+imaging+and+patch-clamp+electrophysiology.">Giant liposome preparation for imaging and patch-clamp electrophysiology.</a> J Vis Exp. (76), (2013).</li><li>Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+whole-cell+patch-clamp+electrophysiology+of+neurons+in+vivo.">Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo.</a> Nat Methods. 9 (6), 585-587 (2012).</li><li>Desai, N. S., Siegel, J. J., Taylor, W., Chitwood, R. A., Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MATLAB-based+automated+patch-clamp+system+for+awake+behaving+mice.">MATLAB-based automated patch-clamp system for awake behaving mice.</a> J Neurophysiol. 114 (2), 1331-1345 (2015).</li><li>Kodandaramaiah, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+operation+of+the+autopatcher+for+automated+intracellular+neural+recording+in+vivo.">Assembly and operation of the autopatcher for automated intracellular neural recording in vivo.</a> Nat Protocols. 11 (4), 634-654 (2016).</li><li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+autopatching+with+automated+pipette+and+cell+detection+in+vitro.">Integration of autopatching with automated pipette and cell detection in vitro.</a> J Neurophysiol. 116 (4), 1564-1578 (2016).</li><li>Perin, R., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computer-assisted+multi-electrode+patch-clamp+system.">A computer-assisted multi-electrode patch-clamp system.</a> J Vis Exp. (80), e50630 (2013).</li><li>Fertig, N., Blick, R. H., Behrends, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+cell+patch+clamp+recording+performed+on+a+planar+glass+chip.">Whole cell patch clamp recording performed on a planar glass chip.</a> Biophys J. 82 (6), 3056-3062 (2002).</li><li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+patch-pipettes+and+sharp+electrodes+with+a+programmable+puller.">Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller.</a> J Vis Exp. (20), (2008).</li><li>Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+Patch-clamp+Recordings+in+Brain+Slices.">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a> J Vis Exp. (112), (2016).</li><li>Campagnola, L., Kratz, M. B., Manis, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACQ4:+an+open-source+software+platform+for+data+acquisition+and+analysis+in+neurophysiology+research.">ACQ4: an open-source software platform for data acquisition and analysis in neurophysiology research.</a> Front Neuroinform. 8 (3), (2014).</li><li>Kolb, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleaning+patch-clamp+pipettes+for+immediate+reuse.">Cleaning patch-clamp pipettes for immediate reuse.</a> Sci Rep. 6, (2016).</li></ol>

Geçici olmayan patent başvurusu &quot;SİSTEMLER VE YÖNTEMLER OTOMATİK GÖRÜNTÜ YÖNLENDİRİLMİŞ YARIM-KPLAMP ELEKTROFİZYOLOJİSİNE VİTRO,&quot; ABD Seri No: 15 / 353,719, 16 Kasım 2016, Ref. No: PRF 67270-02.

Burada, in vitro olarak otomatik görüntü yönlendirmeli yama tutma kayıtları için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu işlemin ana adımları aşağıda özetlenmiştir. Birincisi, bilgisayarla görme, mikroskop kullanılarak elde edilen bir dizi görüntü kullanarak pipetin ucunu otomatik olarak tanımak için kullanılır. Bu bilgi daha sonra mikroskop ile manipülatör koordinat sistemleri arasındaki koordinat dönüşüm fonksiyonunu hesaplamak için kullanılır. Bilgisayarla görme, flüoresan etik...

Yama kenetleme tekniği ilk uyarılabilir membranların 1 iyonik kanal incelemek için 1970&#39;lerde Neher ve Sakmann tarafından geliştirilmiştir. O zamandan beri, yama sıkıştırma, nöronlar, kardiyomiyositler, Xenopus oositleri ve yapay lipozomlar dahil olmak üzere birçok farklı hücre tipinde hücresel, sinaptik ve devre seviyesinde - hem in vitro hem de in vivo - birçok farklı çalışmada uygulanmıştır 2 . Bu süreç, bir hücrenin doğru tanımlanması ve hedeflenmesi, hücreye yakın yama pipetini taşımak için karmaşık mikromanipülatör kontrolü, sıkı bir gigaseal yama oluşturmak için uygun zamanda pipete pozitif ve negatif basınç uygulanmasını, Ve tam hücreli bir yama konfigürasyonu oluşturmak için bir kırılma. Mandal sıkıştırma genellikle manuel olarak yapılır ve ustalık için kapsamlı eğitim gerektirir. Yama ile deneyimli bir araştırmacı için bileKelepçe, başarı oranı nispeten düşüktür. Daha yakın zamanda, patch-clamp deneylerini otomatikleştirmek için çeşitli girişimler yapılmıştır. Otomasyonu başarmak için iki temel strateji geliştirildi: yama sürecinin otomatik kontrolü ve yeni ekipmanların ve tekniğin baştan tasarlanmasını sağlamak için standart patch clamp ekipmanının güçlendirilmesi. Eski strateji, mevcut donanıma uyarlanabilir ve in vivo kör yama kelepçesi 3 , 4 , 5 , akut beyin dilimleri, organotipik dilim kültürlerinin in vitro yama kelepçesi ve kültürlenmiş ayrışmış nöronlar da dahil olmak üzere çeşitli yama kelepçesi uygulamalarında kullanılabilir 6 . Aynı anda birden çok mikromanipülatör kullanarak kompleks yerel devrelerin sorgulanmasını sağlar 7 . Düzlemsel yama yöntemi, yüksek verimli eşzamanlı p elde edebilen yeni kalkınma stratejisinin bir örneğidirİlaç tarama amaçları için askıdaki hücrelerin atch kelepçesi 8 . Bununla birlikte, düzlemsel yama yöntemi, özellikle uzun proseslere sahip nöronlar veya kapsamlı bağlantılar içeren sağlam devreler olmak üzere tüm hücre tipleri için geçerli değildir. Bu, geleneksel patch clamp teknolojisinin önemli bir avantajı olan sinir sisteminin karmaşık devre haritalarına uygulanmasını sınırlar. Standart yama kelepçesi donanımını güçlendirerek elle yama klemp prosesini in vitro otomatik hale getiren bir sistem geliştirdik. Autopatcher IG sistemimiz, otomatik pipet kalibrasyonu, floresan hücre hedef belirleme, pipet hareketinin otomatik kontrolü, otomatik tam hücre yamalama ve veri günlüğü sağlar. Sistem, otomatik olarak farklı derinliklerde birden fazla beyin dilimi imgesi edinebilir; Bilgisayar vizyonu ile analiz edebilecek; Ve floresan etiketli hücrelerin koordinatları da dahil olmak üzere bilgi çıkarmak. Bu bilgiler daha sonraIlgilenilen hücreleri hedeflemek ve otomatik olarak düzeltmek için kullanılır. Yazılım, birkaç açık kaynak kütüphanesi kullanarak, özgür, açık kaynaklı bir programlama dili olan Python&#39;da yazılmıştır. Bu, diğer araştırmacılara erişebilmesini sağlar ve elektrofizyoloji deneylerinin tekrarlanabilirlik ve titizliğini geliştirir. Sistem, modüler bir tasarıma sahiptir; böylece ek donanım, burada gösterilen mevcut sistemle kolayca arayüz oluşturabilir.

<table><tbody><tr><td>CCD Camera</td><td>QImaging</td><td>Rolera Bolt</td><td></td></tr><tr><td>Electrophysiology rig</td><td>Scientifica</td><td>SliceScope Pro 2000</td><td>Include microscope and manipulators. The manufacturer provided manipulator control software demonstrated in this manuscript is &amp;ldquo;Linlab2&amp;rdquo;.</td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td>MultiClamp 700B</td><td>computer-controlled microelectrode amplifier</td></tr><tr><td>Digitizer</td><td>Molecular Devices</td><td>Axon Digidata 1550</td><td></td></tr><tr><td>LED light source</td><td>Cool LED</td><td>pE-100</td><td>488 nm wavelength</td></tr><tr><td>Data acquisition board</td><td>Measurement Computing</td><td>USB1208-FS</td><td>Secondary DAQ.&lt;br/&gt; See manual at : http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf</td></tr><tr><td>Solenoid valves</td><td>The Lee Co.</td><td>LHDA0531115H</td><td></td></tr><tr><td>Air pump</td><td>Virtual industry</td><td>VMP1625MX-12-90-CH</td><td></td></tr><tr><td>Air pressure sensor</td><td>Freescale semiconductor</td><td>MPXV7025G</td><td></td></tr><tr><td>Slice hold-down</td><td>Warner instruments</td><td>64-1415 (SHD-40/2)</td><td>Slice Anchor Kit, Flat for RC-40 Chamber, 2.0 mm, 19.7 mm</td></tr><tr><td>Python</td><td>Anaconda</td><td>version 2.7 (32-bit for windows)</td><td>https://www.continuum.io/downloads</td></tr><tr><td>Screw Terminals</td><td>Sparkfun</td><td>PRT - 08084</td><td>Screw Terminals 3.5 mm Pitch (2-Pin)</td></tr><tr><td>(2-Pin)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-Channel MOSFET 60 V 30 A</td><td>Sparkfun</td><td>COM - 10213</td><td></td></tr><tr><td>DIP Sockets Solder Tail - 8-Pin</td><td>Sparkfun</td><td>PRT-07937</td><td></td></tr><tr><td>LED - Basic Red 5 mm</td><td>Sparkfun</td><td>COM-09590</td><td></td></tr><tr><td>LED - Basic Green 5mm</td><td>Sparkfun</td><td>COM-09592</td><td></td></tr><tr><td>DC Barrel Power Jack/Connector (SMD)</td><td>Sparkfun</td><td>PRT-12748</td><td></td></tr><tr><td>Wall Adapter Power Supply - 12 V DC 600 mA</td><td>Sparkfun</td><td>TOL-09442</td><td></td></tr><tr><td>Hook-Up Wire - Assortment (Solid Core, 22 AWG)</td><td>Sparkfun</td><td>PRT-11367</td><td></td></tr><tr><td>Locking Male x Female x Female Stopcock</td><td>ARK-PLAS</td><td>RCX10-GP0</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Tygon S3 E-3603 Flexible Tubings</td><td>Fisher scientific</td><td>14-171-129</td><td>Outer Diameter: 1/8 in.&lt;br/&gt; Inner Diameter: 1/16 in.</td></tr><tr><td>BNC male to BNC male coaxial cable</td><td>Belkin Components</td><td>F3K101-06-E</td><td></td></tr><tr><td>560 Ohm Resistor (5% tolerance)</td><td>Radioshack</td><td>2711116</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer</td><td>General Valve</td><td>Picospritzer II</td><td></td></tr></tbody></table>

application of automated image-guided patch clamp for the study of neurons in brain slices

Tam hücre yama kelepçesi, tekli hücrelerin elektriksel özelliklerini ölçmek için altın standart yöntemdir. Bununla birlikte, in vitro yama kelepçesi, karmaşıklığı ve kullanıcı operasyonu ve kontrolüne yüksek bağımlılığı nedeniyle zorlu ve düşük üretim tekniği kalmaktadır. Bu el yazması, akut beyin dilimlerinde in vitro tüm hücre yaması klemp deneyleri için görüntü yönlendirmeli bir otomatik tutma kelepçesi sistemini göstermektedir. Sistemimiz, floresan etiketli hücreleri algılamak ve bir mikromanipülatör ve dahili pipet basınç kontrolü kullanarak tam otomatik yama için onları hedeflemek için bir bilgisayar görme tabanlı algoritma uygular. Bütün süreç, insan müdahalesi için asgari gereklilikler ile son derece otomatiktir. Elektrik direnci ve dahili pipet basıncı da dahil olmak üzere gerçek zamanlı deney bilgileri gelecekteki analizler ve farklı hücre tiplerine göre optimizasyon için elektronik olarak belgelenmiştir. Sistemimiz akut beyin bağlamında tanımlansa daN dilim kayıtlarında, aynı zamanda ayrışmış nöronların, organotipik dilim kültürlerinin ve diğer nöronal olmayan hücre tiplerinin otomatik görüntü yönlendirmeli yama kelepçesine de uygulanabilir.

<html> Sistemimiz akut beyin dilimleri, fare ile uyarılmış Pluripotent Kök Hücreler (iPSC&#39;ler) nöronlara ayırdıklarında hücreleri düzeltme yeteneği ve yapay olarak ilgi kanallarını ifade eden HEK 293 hücreleri üzerinde test edilmiştir. Şekil 3 , görsel kortekste floresan olarak etiketlenmiş tabaka 5 piramidal nöronları hedefleyen Thy1-ChR2-YFP transgenik farelerini (B6.Cg-Tg (Thy1-COP4 / EYFP) 18Gfng / J) kullanan bir deney gösterme...

Watch this Scientific Journal Video about Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices at JoVE.com

Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

Bu protokol, standart in vitro elektrofizyoloji ekipmanı için yakın zamanda geliştirilen bir sistemi kullanarak otomatik görüntü yönlendirmeli patch-clamp deneylerini nasıl yürüttüreceğinizi açıklamaktadır.

Beyin dilimlerinde nöronların çalışması için otomatik görüntü yönlendirmeli Yama Kelepçesi Uygulaması

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...

application-automated-image-guided-patch-clamp-for-study-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.4K Görüntüleme.  Purdue University.  Bu protokol, standart in vitro elektrofizyoloji ekipmanı için yakın zamanda geliştirilen bir sistemi kullanarak otomatik görüntü yönlendirmeli patch-clamp deneylerini nasıl yürüttüreceğinizi açıklamaktadır. 

Video: Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

Local Application of Drugs to Study Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices

Tobacco use leads to numerous health problems, including cancer, heart disease, emphysema, and stroke. Addiction to cigarette smoking is a prevalent neuropsychiatric disorder that stems from the biophysical and cellular actions of nicotine on nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) throughout the central nervous system. Understanding the various nAChR subtypes that exist in brain areas relevant to nicotine addiction is a major priority.
Experiments that employ electrophysiology techniques such as whole-cell patch clamp or two-electrode voltage clamp recordings are useful for pharmacological characterization of nAChRs of interest. Cells expressing nAChRs, such as mammalian tissue culture cells or Xenopus laevis oocytes, are physically isolated and are therefore easily studied using the tools of modern pharmacology. Much progress has been made using these techniques, particularly when the target receptor was already known and ectopic expression was easily achieved. Often, however, it is necessary to study nAChRs in their native environment: in neurons within brain slices acutely harvested from laboratory mice or rats. For example, mice expressing "hypersensitive" nAChR subunits such as &alpha;4 L9&prime;A mice 1 and &alpha;6 L9&prime;S mice 2, allow for unambiguous identification of neurons based on their functional expression of a specific nAChR subunit. Although whole-cell patch clamp recordings from neurons in brain slices is routinely done by the skilled electrophysiologist, it is challenging to locally apply drugs such as acetylcholine or nicotine to the recorded cell within a brain slice. Dilution of drugs into the superfusate (bath application) is not rapidly reversible, and U-tube systems are not easily adapted to work with brain slices.
In this paper, we describe a method for rapidly applying nAChR-activating drugs to neurons recorded in adult mouse brain slices. Standard whole-cell recordings are made from neurons in slices, and a second micropipette filled with a drug of interest is maneuvered into position near the recorded cell. An injection of pressurized air or inert nitrogen into the drug-filled pipette causes a small amount of drug solution to be ejected from the pipette onto the recorded cell. Using this method, nAChR-mediated currents are able to be resolved with millisecond accuracy. Drug application times can easily be varied, and the drug-filled pipette can be retracted and replaced with a new pipette, allowing for concentration-response curves to be created for a single neuron. Although described in the context of nAChR neurobiology, this technique should be useful for studying many types of ligand-gated ion channels or receptors in neurons from brain slices.

In this paper, we describe a useful method to study ligand-gated ion channel function in neurons of acutely isolated brain slices. This method involves the use of a drug-filled micropipette for local application of drugs to neurons recorded using standard patch clamp techniques.

Fare Beyin dilimleri içinde Nikotinik Asetilkolin Reseptör Fonksiyon Okumak Uyuşturucu Yerel Uygulama

Tobacco use leads to numerous health problems, including cancer, heart disease, emphysema, and stroke. Addiction to cigarette smoking is a prevalent ...

Nörobilim

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with simultaneous intracellular biocytin filling allows a correlated analysis of their structural and functional properties. With this method it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their morphology and electrophysiological response pattern. Paired recordings allow studying the connectivity patterns between these neurons as well as the properties of both chemical and electrical synaptic transmission. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to obtain reliable paired recordings together with an optimal recovery of the neuron morphology. We will describe how pairs of neurons connected via chemical synapses or gap junctions are identified in brain slice preparations. We will outline how neurons are reconstructed to obtain their 3D morphology of the dendritic and axonal domain and how synaptic contacts are identified and localized. We will also discuss the caveats and limitations of the paired recording technique, in particular those associated with dendritic and axonal truncations during the preparation of brain slices because these strongly affect connectivity estimates. However, because of the versatility of the paired recording approach it will remain a valuable tool in characterizing different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

Akut Beyin Dilimleri nöronal Mikro şemalar Elektrofizyolojik ve Morfolojik Karakterizasyonu Eşleştirilmiş Patch-Kelepçe Kayıtlar Kullanma

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have validated the utility of this method for enhancing neuronal preservation and overall brain slice viability. The implementation of this technique by early adopters has facilitated detailed investigations into brain function using diverse experimental applications and spanning a wide range of animal ages, brain regions, and cell types. Steps are outlined for carrying out the protective recovery brain slice technique using an optimized NMDG artificial cerebrospinal fluid (aCSF) media formulation and enhanced procedure to reliably obtain healthy brain slices for patch clamp electrophysiology. With this updated approach, a substantial improvement is observed in the speed and reliability of gigaohm seal formation during targeted patch clamp recording experiments while maintaining excellent neuronal preservation, thereby facilitating challenging experimental applications. Representative results are provided from multi-neuron patch clamp recording experiments to assay synaptic connectivity in neocortical brain slices prepared from young adult transgenic mice and mature adult human neurosurgical specimens. Furthermore, the optimized NMDG protective recovery method of brain slicing is compatible with both juvenile and adult animals, thus resolving a limitation of the original methodology. In summary, a single media formulation and brain slicing procedure can be implemented across various species and ages to achieve excellent viability and tissue preservation.

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol demonstrates the implementation of an optimized N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. A single media formulation is used to reliably obtain healthy brain slices from animals of any age and for diverse experimental applications.

En iyi duruma getirilmiş bir Nkullanarak akut beyin dilimleri hazırlanması-metil-D-glucamine koruyucu kurtarma yöntemi

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Beyin Dilimleri tüm hücre Patch-kelepçe Kayıtlar

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Slice Patch Clamp Technique for Analyzing Learning-Induced Plasticity

The slice patch clamp technique is a powerful tool for investigating learning-induced neural plasticity in specific brain regions. To analyze motor-learning induced plasticity, we trained rats using an accelerated rotor rod task. Rats performed the task 10 times at 30-s intervals for 1 or 2 days. Performance was significantly improved on the training days compared to the first trial. We then prepared acute brain slices of the primary motor cortex (M1) in untrained and trained rats. Current-clamp analysis showed dynamic changes in resting membrane potential, spike threshold, afterhyperpolarization, and membrane resistance in layer II/III pyramidal neurons. Current injection induced many more spikes in 2-day trained rats than in untrained controls.
To analyze contextual-learning induced plasticity, we trained rats using an inhibitory avoidance (IA) task. After experiencing foot-shock in the dark side of a box, the rats learned to avoid it, staying in the lighted side. We prepared acute hippocampal slices from untrained, IA-trained, unpaired, and walk-through rats. Voltage-clamp analysis was used to sequentially record miniature excitatory and inhibitory postsynaptic currents (mEPSCs and mIPSCs) from the same CA1 neuron. We found different mean mEPSC and mIPSC amplitudes in each CA1 neuron, suggesting that each neuron had different postsynaptic strengths at its excitatory and inhibitory synapses. Moreover, compared with untrained controls, IA-trained rats had higher mEPSC and mIPSC amplitudes, with broad diversity. These results suggested that contextual learning creates postsynaptic diversity in both excitatory and inhibitory synapses at each CA1 neuron.
AMPA or GABAA receptors seemed to mediate the postsynaptic currents, since bath treatment with CNQX or bicuculline blocked the mEPSC or mIPSC events, respectively. This technique can be used to study different types of learning in other regions, such as the sensory cortex and amygdala.

The slice patch clamp technique is an effective method for analyzing learning-induced changes in the intrinsic properties and plasticity of excitatory or inhibitory synapses.

Dilim yama klemp tekniği öğrenme kaynaklı plastisite analiz etmek için

The slice patch clamp technique is a powerful tool for investigating learning-induced neural plasticity in specific brain regions. To analyze ...

Hypothalamic Kisspeptin Neurons as a Target for Whole-Cell Patch-Clamp Recordings

Kisspeptins are essential for the maturation of the hypothalamic-pituitary-gonadal (HPG) axis and fertility. Hypothalamic kisspeptin neurons located in the anteroventral periventricular nucleus and rostral periventricular nucleus, as well as the arcuate nucleus of the hypothalamus, project to gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) neurons, among other cells. Previous studies have demonstrated that kisspeptin signaling occurs through the Kiss1 receptor (Kiss1r), ultimately exciting GnRH neuron activity. In humans and experimental animal models, kisspeptins are sufficient for inducing GnRH secretion and, consequently, luteinizing hormone (LH) and follicle stimulant hormone (FSH) release. Since kisspeptins play an essential role in reproductive functions, researchers are working to assess how the intrinsic activity of hypothalamic kisspeptin neurons contributes to reproduction-related actions and identify the primary neurotransmitters/neuromodulators capable of changing these properties. The whole-cell patch-clamp technique has become a valuable tool for investigating kisspeptin neuron activity in rodent cells. This experimental technique allows researchers to record and measure spontaneous excitatory and inhibitory ionic currents, resting membrane potential, action potential firing, and other electrophysiological properties of cell membranes. In the present study, crucial aspects of the whole-cell patch-clamp technique, known as electrophysiological measurements that define hypothalamic kisspeptin neurons, and a discussion of relevant issues about the technique, are reviewed.

Here, we present a protocol to perform a whole-cell patch-clamp on brain slices containing kisspeptin neurons, the primary modulator of gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) cells. By adding knowledge about kisspeptin neuron activity, this electrophysiological tool has served as the basis for significant advancements in the neuroendocrinology field over the last 20 years.

Tüm hücre yama-kelepçe kayıtları için bir hedef olarak hipotalamik kisspeptin nöronları

Kisspeptins are essential for the maturation of the hypothalamic-pituitary-gonadal (HPG) axis and fertility. Hypothalamic kisspeptin neurons located in ...

Establishing a Whole-Cell Voltage-Clamp Configuration for Electrophysiological Recordings in Brain Slices

Source: Sunstrum, J. K., et al. <a href="https://app.jove.com/v/59461">Evaluation of synaptic multiplicity using whole-cell patch-clamp electrophysiology.</a> J. Vis. Exp. (2019)
This video demonstrates positioning a fine-pointed pipette near brain slices, forming a seal with a neuronal cell. Suction breaks the cell membrane, thereby creating a whole-cell patch clamp that enables current measurements for electrophysiology experiments.

Beyin Dilimlerinde Elektrofizyolojik Kayıtlar için Tüm Hücre Voltaj-Kelepçe Konfigürasyonunun Oluşturulması

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurophysiology

Electrophysiology Techniques

Automated Image-Guided Patch Clamp Technique for Studying Neurons in Brain Slices

Source: Wu, Q., et al. <a href="https://app.jove.com/v/56010">Application of automated image-guided patch clamp for the study of neurons in brain slices.</a> J. Vis. Exp. (2017).
In this video, brain slices are immobilized in a recording chamber, and cells of interest are located and focused on using a computer-controlled microscope. The automated image processing system then precisely positions a patch pipette to seal the cell membrane and monitor electrical signals.

Beyin dilimlerindeki nöronları incelemek için otomatik görüntü kılavuzlu yama kelepçesi tekniği

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. System Setup

	Construct ...

Paired Patch Clamp Recording of the Neuronal Connections in Acute Brain Slices

Source: Qi, G., et al. <a href="https://app.jove.com/v/52358">Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings.</a> J. Vis. Exp. (2015)
This video demonstrates the procedure to map synaptic connections by securing a brain slice, positioning pipettes to achieve whole-cell configurations, and stimulating presynaptic neurons to record postsynaptic responses, thereby elucidating neuronal connectivity.

Akut Beyin Dilimlerinde Nöronal Bağlantıların Eşleştirilmiş Yama Kelepçesi Kaydı

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Paired Patch-Clamp ...

Simultaneous Optical and Electrophysiological Monitoring of Neuronal Cells in Brain Slices

To place the multi-channel probe in the ex vivo brain tissue slide, perfuse bubbled experimental ACSF at three to six milliliters per minute, and transfer the brain slice containing the area of interest onto the mesh grid in the microscope perfusion chamber. Anchor the brain slice with a platinum harp. Rotate the mesh grid so that the line of electrode contacts on the distal end of the multichannel probe is approximately perpendicular to the PL surface.
Under broad-field illumination and fine control of the micromanipulator, lower the multichannel probe toward the surface of the slice. Engage the appropriate filter cube for visualization of the fluorescent reporter protein expressed in axon terminals of cortical afferents.
If necessary, rotate the slice to more precisely align the probe with the PL surface. Position the probe just above the plane of the slice, 200 micrometers short of the final target position along the x-axis, leaving at least one channel outside of the area of tissue being recorded. Slowly, insert the probe into the slice along its longitudinal axis.
To minimize damage to the tissue, only advance the probe to the extent that the sharp tips are just visible below the tissue surface. Switch experimental ACSF source to bagged control solution, and identify the fluorescently labeled cell for targeted patch-clamp recording. Restrict the aperture to the smallest diameter, and engage the high-power water-immersion objective, taking care to avoid contact between the multichannel probe and objective lens. Bring the tissue into focus.
Center the light over an area of tissue adjacent to, but not overlapping the multi-channel probe. Engage the appropriate filter set to allow imaging of cells expressing the Cre-dependent fluorescent marker. Raise the objective lens to create ample space for lowering a patch pipette.
Load a patch pipette with internal solution and mounted on the electrode holder. Use a one-milliliter syringe to apply positive pressure corresponding to approximately 0.1 milliliter air. Lower the patch pipette into the solution, bringing the tip into focus under visual guidance, and obtain whole-cell recording from the targeted cell.