Hücre zarlarının elektrofizyolojik özelliklerini ölçerek, ana soru, bir hücrenin elektriksel aktivitesinin modüle edilmesinin çözülebileceğini kanıtlar. Tüm hücre yama kelepçesi kaydı, bireysel hücrelerdeki iyonik akımları incelemek ve farklı uyaranlara hücresel yanıtı sorgulamak için periferik bir tekniktir. Tüm hücre yama kelepçesi ön kayıtlarında en iyi performans, çok fazla pratik yaptıktan ve çalıştıktan sonra elde edilecektir.
Beyin diseksiyonuna başlamak için, kafası kesilmiş hayvanın kafatasının tepesindeki deride kaudalden rostrale kadar cerrahi makas kullanarak bir kesi yapın ve kafa derisini çıkarın. Daha sonra, inter parietal plakayı sagital sütür boyunca iris makası ile kesin ve oksipital kemiği çıkarın. Osteotomu parietal kemiğin altına kaydırın ve beyin açığa çıkana kadar yavaşça dışarı çekin.
Beyni açığa çıkardıktan sonra, başını baş aşağı çevirin. Her iki taraftaki trigeminal siniri görselleştirmek için beyni yavaşça indirin. Daha sonra Castroviejo kavisli makas kullanarak trigeminal siniri kesin.
Hipotalamusu görselleştirdikten sonra optik siniri tanımlayın ve yavaşça kesin. Daha sonra, frontal lobun uzak ön kısmını kesin. Beyni çıkarın ve dilimleri elde edene kadar hemen dilimleme çözeltisine daldırın.
Beyin örneklerini dilimlemek için, fazla çözeltiyi kurutmak için beyni bir filtre kağıdına yerleştirin. Daha sonra keskin bir kesme tıraş bıçağı ile beyin sapını beyincik ile dokunun geri kalanından ayıran bir koronal kesim gerçekleştirin. Daha sonra, beynin kaud kısmını bir vibratomun tabanına yapıştırın ve dilimleme cihazı odasını dilimleme çözeltisi veya sıfır ila iki santigrat dereceye soğutulmuş aCSF çözeltisi ile doldurun.
İşlem sırasında dilimleme çözeltisini soğuk tutmak için vibratom odasının etrafına kuru buz paketleyin. Tıraş bıçağını vibratoma yerleştirin ve cihazın hız üç, frekans dokuz ve besleme gibi kesme parametrelerini 250 mikrometreye ayarlayın. Doku dilimleme işlemi sırasında akrilik transfer pipeti kullanarak dilimleri geri kazanım odasına aktarın ve dilim alımından sonra doku iyileşmesi için 60 dakika bekleyin.
Hücre sızdırmazlığına ve kaydına başlamadan önce, mikroskop, amplifikatör, sayısallaştırıcı ve mikro manipülatörü açın. Mikroskopa bağlı kayıt odasını aCSF çözümü ile oluşturun. aCSF'yi dakikada iki mililitrede sürekli perfüze etmek için bir perfüzyon pompası kullanın.
Yazılım ayarlarını kontrol edin ve deneme türüne göre kayıtlar için özel protokoller oluşturun. İlgilendiğiniz bir beyin dilimini akrilik transfer pipeti kullanarak kayıt odasına teker teker aktarın. Dilimi bir dilim ankrajıyla tutun, böylece aCSF perfüzyonu sırasında hareket etmez.
Daldırma mikroskobunun düşük güçlü objektif lensi 10X veya 20X'i kullanarak dilimi kayıt odasının ortasına yerleştirin. Dilim konumu, mikroskop altında istenen bölgenin iyi bir şekilde görülebilmesi ve kayıt mikropipetine mükemmel bir erişim sağlamak için kritik öneme sahiptir. İlgilenilen bölgeyi bulduktan sonra objektif lensi yüksek güçlü lense, 63X'e geçirin ve beyin diliminin yüzeyindeki kisspeptin hücrelerini bulmak için endojen floresan proteinini ve hedef bölgedeki hücrelerin şekillerini gözlemleyerek doku seviyesine odaklanın.
Olası bir hedef hücre bulunduğunda, bilgisayar ekranında fare imleciyle veya ilgi alanının üzerine kare gibi bir biçim çizerek işaretleyin. Bilgisayar ekran işareti, kayıt pipeti konumunu hücreye yönlendirmeye yardımcı olur. Hedef hücrenin tam yerini belirledikten sonra, hedefi kaldırın ve dahili çözeltinin gümüş elektrotla temas halinde olmasını sağlamak için elektrot tutucusuna dahili çözelti ile doldurulmuş kayıt mikropipetini tanıtın.
Mikropipete döküntülerin girmesini önlemek için mikropipet tutucuya bir polietilen boru aracılığıyla bağlanan bir ila üç mililitrelik hava dolu bir şırınga kullanarak mikropipeti aCSF çözeltisine batırmadan önce pozitif bir basınç uygulayın. Mikro manipülatörü kullanarak mikropipeti hedefin merkezinin altına yönlendirin. Mikropipetin XYZ eksenini ilgilenilen hücreye doğru yönlendirmek için mikro manipülatör düğmelerini hareket ettirin.
Mikropipetin ucunu görmek için odağı ayarlayın ve odağı dilime çok yakın değil, daha yakına getirin. Mikro manipülatörün hızını azaltın ve mikropipet ucunun dilime aniden nüfuz etmemesini, ancak hücrenin yüzeyine veya hedef bölgeye dokunana kadar yavaşça inmesini sağlayarak mikropipeti yavaşça odak düzlüğüne indirin. Yaklaşma yolundaki kalıntıları temizlemek için bir ila üç mililitre hava dolu şırınga ile hafif pozitif basınç uygulamak.
Mikropipet ucunu yakınlaştırmak için mikro manipülatörü XYZ ekseni üzerinde yavaşça hareket ettirin ve uygulanan basınçla çukurlaşmaya neden olan hedef hücreye dokunun. Yazılım üzerindeki voltaj kelepçesi modu yardımıyla çukuru kurduktan sonra, mikropipet tutucuya bağlı tüp aracılığıyla bir ila iki saniye boyunca ağızdan zayıf kısa emme uygulayın ve mikropipet ile hücre arasındaki sızdırmazlığı oluşturun. Conta yaklaşık bir dakika boyunca gürültü paraziti olmadan mekanik olarak sabit kalırsa, tutma voltajını ilgili hücrenin en yakın fizyolojik dinlenme potansiyeline ayarlayın.
Kisspeptin hipotalamik nöronlar için eksi 50 milivolt önerilir. Daha sonra, hücreye yerleştirilen mikropipet ucundaki plazma zarını kırmak için ağız yoluyla kısa bir emme uygulayın, böylece yırtılmış membran mikropipeti tıkamaz veya büyük bir zar kısmını veya hücreyi çekmez. Yeterli kuvvetle emme yapılarak yeterli bir bütün hücre konfigürasyonu elde edilebilir.
Kullanılan sistem ayarları kılavuzunu kontrol edin. Hücre zarını kırdıktan sonra, voltaj kelepçesi modunda tüm hücre seçeneğini etkinleştirin ve tüm hücre sekmesine atıfta bulunan otomatik komuta tıklayın. Hücrenin seri direnci ve tüm hücre kapasitansı yazılım tarafından otomatik olarak hesaplanır ve anında görüntülenir.
Ardından, metin makalesinde açıklandığı gibi yazılımdaki hücre canlılığı parametrelerini kontrol edin. Deneyler sırasında seri direncini ve hücre kararlı durum kapasitansını izleyin. Tüm hücre konfigürasyonu düzgün bir şekilde sağlandıktan sonra, voltaj kelepçesi modunda sinaptik akımları ölçün.
Dinlenme membranı potansiyelindeki değişiklikleri ve mevcut kelepçe modunda indüklenen dinlenme membranı potansiyel değişikliklerini kaydedin. İnsan rekombinant büyüme hormonunun hipotalamik kisspeptin nöronlarının aktivitesi üzerindeki olası etkileri, tüm hücre yama kelepçesi kayıtları yardımıyla incelenmiştir. İnsan rekombinant büyüme hormonu HGH'nin gram başına 20 mikrogramda uygulanması, 12 AVPV / PeN kisspeptin nöronundan 5'inde ve kaydedilen 14 ARH kisspeptin nöronundan 9'unda dinlenme zarı potansiyelinin önemli bir hiperpolarizasyonuna neden oldu.
AVPV / PeN kisspeptin ve ARH kisspeptin hiperpolarize nöronları, yanıt vermeyen hücrelere kıyasla dinlenme zarı potansiyelini önemli ölçüde değiştirdi. HGH uygulaması sırasında dinlenme zarı potansiyeli üzerindeki etkiler, AVPV / PeN kisspeptin nöronları üzerinde yaklaşık 0.9 ila 0.7 gigaohm ve ARH kisspeptin nöronları üzerinde 1.7 ila 1.0 gigaohm arasında tüm hücre giriş direncinin önemli ölçüde azalmasını izlemiştir. Dikkatli gigaseal ile gerçekleştirilen mükemmel beyin hatları sırasında ve plaj parametreleri aracılığıyla hücredeki alan şeyi, en iyi tüm hücre kayıtlarını elde etmek için gereklidir.
Kaydedilen hücrenin mikropipet çözeltisi, izole edilmiş bir hücrenin moleküler karakterizasyonuna izin veren tek hücreli RTPCR için toplanabilir ve kullanılabilir. Genetiği değiştirilmiş hayvanların kullanımı ile birleştirilen tüm hücre yama kelepçesi tekniği, kisspeptin nöronlarının artan özelliklerinin tanımlanmasına izin veren üreme anlayışında bir atılımı temsil eder ve bunlar ana modülatörlerdir.
