Bu yazının hazırlanması, Colorado Denver Üniversitesi&#39;nden (JMRE) başlatılan fonlarla desteklendi. AF bir Araştırma ve Yaratıcı Etkinlikler ödülünün (RaCAS, CU Denver) desteğini kabul etmek istiyor. Colorado Denver Üniversitesi Araştırma Hizmetleri Ofisi&#39;nden yayın masraflarını karşılamak üzere finanse edildi. Video bölümündeki katkıları için Bayan Cassandra Herbert ve Sayın Yannick K. Dzowo&#39;ya laboratuvar üyelerine teşekkür etmek istiyoruz.

1. RNA Oligonükleotidlerinin Katı Faz Sentezi <ol><li> Her fosforamiditi içeren solüsyonların hazırlanması (Tablo 1). <ol><li> Nükleotid sayısını sayın ve her tabana karşılık gelen n + 1 denklemine (n = nükleotid sayısı) uyun ve eksik değerleri içeren tabloyu doldurun. Hacim = 0,1 M konsantrasyonda nükleotid başına 0,15 mL, susuz asetonitril içinde çözülmüştür. </li><li> Her bir fosforamiditi fırında kurutulmuş 10 mL kehribar şişelere (Septum Üst Amber 394 Amidite 13 mm ID x 20 mm OD Üstü) tartın ve bir kurutma ajanı içeren bir desikatör kullanarak vakum altına yerleştirin. </li><li> Desikatörü kuru argon ile doldurun, şişeyi çıkarın ve alete sabitlemeden önce ilgili miktarda asetonitril ile (susuz) hemen inceltin. NOT: Gaz geçirmez şırınga kullandığınızdan ve susuz bir atmosfere sahip olduğunuzdan emin olun. </li><li> Şişeden septayı çıkarın ve mAchine, bir şişe değiştirme işlevi aracılığıyla. NOT: Bu işlem, sentezden önce hattı astarlamak için her bir çözeltinin ek bir 0.15 mL&#39;sini (dolayısıyla yukarıdaki n + 1 denklemindeki fazla hacim) gerektirir. </li></ol></li><li> Yazılımı kullanarak dizi ve katı faz sentezinin kurulması ( Şekil 3 ). <ol><li> Yazılım simgesini ( örn . OligoNet 1.0.1) tıklayın ve Gösterge adı&gt; Tamam&#39;ı seçin . Dosya&gt; Yeni Sentez&gt; Sipariş ile yeni bir sentez oluşturun. </li><li> Doldurun: Tarih; RunID; Alet seç; Sıra adı; Dizisi (5&#39;-3 &#39;sonu). Çevrimin altında, daha önce yaratılan yöntemi atayın ( Şekil 3 ). Son prosedürü seçin, ( oligonükleotid CPG reçinesine yapışır bırakır)&gt; manuel. </li><li> DMT Off&gt; (sentezin sonunda bir 5&#39;-OH grubu elde etmek için son adımda TCA muamelesi) seçin ; Dosya kaydet&gt; Farklı kaydetVe deney için bir isim verin. </li><li> Senteze başlamak için dosyayı gönderin Sipariş&gt; Sentezöre sipariş gönder ve sütunu seçin 1-4 . Synthesizer penceresini açın ve her adımı izlemek için trityl monitor | işlevi seçin | trity&gt; seçeneğini seçin. </li><li> Bir kerede sentezlenecek olan oligonükleotidlerin sayısına bağlı olarak adımları tekrarlayın (tüm siparişlerin aynı yöntemi, yani aynı eşleşme sürelerini ve olayların sırasını belirttiğine dikkat edin). </li><li> Sentez başlatmak Synthesizer&gt; Hazırlanmaya hazırlanın . Sütunları istenen 3&#39;üncü uçla birlikte alet üzerinde belirtilen konumlara yerleştirin. Enstrüman üzerinde Başlat&gt; Hayır&#39;ı tıklayın (ABI hazırlığı için). </li><li> Sentez tamamlandıktan sonra, kolonu aletten çıkarın ve yuvarlak tabanlı bir şişeye yerleştirin, ardından yaklaşık 0.5 saat boyunca düşük basınç altında kurutun. NOT: rand&#39;da derin bir portakal rengi olup olmadığını kontrol etmeniz önerilirTritil monitör işlevinden kaynaklanabilecek olası hataları önlemek için kaplinler (adım 1.2.4 - 1.2.7). </li></ol></li><li> RNA oligonükleotidlerinin korumasızlaştırılması ve saflaştırılması. <ol><li> Siyah kapağı çevirerek sütunu açın ve beyaz reçinenin tümünü veya bir kısmını 1.6 mL&#39;lik bir santrifüj tüpüne aktarın (veya ihtiyaca göre veya amacına göre). 1: 1&#39;de 0.5 mL metilamine (suda% 40) / amonyak (% 40 su) ekleyin. </li><li> Santrifüj tüp kapağını parafilm ile sabitleyin ve bir ısı bloğu kullanarak 1.5 saat boyunca 60 ° C&#39;ye ısıtın. NOT: Amonyak konsantrasyonunun reaksiyon tüpü içinde sabit kaldığından emin olmak için tüpün üzerine ağır bir cisim yerleştirilebilir. </li><li> Isı bloğundan çıkarın ve oda sıcaklığına kadar yavaşça soğutun. İçeriği aşağı doğru döndürmek için numuneyi kısaca santrifüjleyin, sonra süpernatanı yeni bir santrifüj tüpüne aktarın. </li><li> Tüpleri sıvı azot (veya kuru buz / etanol banyosu) içine batırarak örnekleri dondurun ve dönerken kurumaya konsantre edinIndirgenmiş basınç altında bir santrifüjde karıştırın. </li><li> Katıları 0.4 mL trietilamin / N-metilpirolidinon / trietilamin-trihidroflorür (2: 2: 3 oranında) çözeltisinde yeniden askıya alınız. 1,5 saat boyunca 60 ° C&#39;ye ısıtıp yavaş yavaş oda sıcaklığına soğutulur. </li><li> 0.04 mL NaOAc çözeltisi (3M, pH 5.5 - HC1 ile ayarlanır) ilave edildikten sonra bir pipet ucu ile hafifçe karıştırılır. Etanol (1 mL) ilave edin ve ca. -70 ° C (kuru buz / etanol banyosu) 15 dakika boyunca. </li><li> 15.000 rpm&#39;de ve 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Alikuğin çıkarılması için bir pipet kullanın ve oluşan pelleti düşürülen basınç altında kurutun. </li><li> Elde edilen katı, yükleme tamponu (0.2 mL,% 90 sulu formamit, 1 mM EDTA) içinde yeniden askıya alın ve karışım homojen olana kadar karıştırın. </li><li> Süspansiyonu önceden hazırlanmış bir poliakrilamid jeline yükleyin (% 20 denatüre edici, kuyu boyutları: 30 cm x 1 mm) 22 . </li><li> Jel üzerinde bromofenol mavi işareti 1 / 2-2 / 3 arasında bulunana kadar bir akım uygulayın.(Jel boyutları: ~ 21.5 cm x 30 cm). </li><li> Jeli standtan çıkarın ve jel içeriklerini camdan plastik sargısına (her iki tarafın üstü örtülü olarak) aktarın ve bantları görselleştirmek için silika ile kaplı ince tabaka kromatografi (TLC) plakasının üzerine yerleştirin (254 nm&#39;de floresan boya içerir) Bir UV-lamba kullanarak ( λmax = 254 nm). </li><li> Üst bandın bulunduğu konumu tanımlamak için bir işaretleyici kullanın ve yeni bir traş bıçağı kullanarak kesiniz. RNA içeren (plastik sarım olmadan) jel 50 mL&#39;lik konik bir tüp içine yerleştirilir ve bir cam çubuk kullanılarak küçük parçalara ezilir. </li><li> Jel artıkları bir NaCl aq içine asar. Solüsyonu (2 mM ve 1 mM EDTA) ilave edin ve süspansiyonu 37 ° C&#39;de 12 saat çalkalayın. Konik boruyu 10 dakika boyunca santrifüjleyin. </li><li> Bir ters faz C18 kartuşu kullanarak Desalt. <ol><li> Kartuşu, 10 mL şırınga kullanarak, aşağıdakilerle yıkayarak hazırlayın: Asetonitril (10 mL) H2O (iki kez, 10 mL) 5 mM NH4 Cl sulu. Çözeltisi (3 mL) RNA içeren çözelti, jel kalıntılarından hiçbirini dökmemeye özen gösterilir. </li><li> H2O ile (üç kez, 10 mL) yıkanır. </li><li> % 60 sulu bir çözeltiyi kullanarak kolondan alın. Metanol çözeltisi (3 mL) </li></ol></li><li> İndirgenmiş basınç altında konsantre edin ve RNaz içermeyen suda (0.3 mL) yeniden çözülür, </li><li> UV-vis spektrumunu (200-450 nm) ölçmek için, seyreltilmiş bir solüsyon (10 mcL) hazırlayın ve UV-vis aletine ( örn . Nanodrop) 1 mcL koyun. </li><li> Elde edilen çözeltinin konsantrasyonunu belirlemek için bira Lambert Kanunu kullanın: <img alt="Denklem 1" src="/files/ftp_upload/56189/56189eq1.jpg" /> Burada A = elde edilen absorbans; Ε = hesaplanan molar sönme katsayısı; C = konsantrasyon ve 1 mm&#39;lik bir yol uzunluğu için l = 0.1. </li><li> Oligonükleotitler için molar sönme katsayılarını hesaplayın; Burada bir on-line hesap makinesi ile hesaplanmıştırDINAMelt yazılımını kullanan (http://unafold.ra.albany.edu/?q=dinamelt) 23 </li></ol></li><li> MALDI-TOF yoluyla yoğunlaşma tayini ve karakterizasyonu. <ol><li> Desalete tabi tutmak için bir C18 ucu yüklü bir pipet ucu kullanarak bir MALDI plakasına numuneler yükleyin ve her bir oligonükleotidi spot edin. <ol><li> Ucu% 50 asetonitril (10 uL x 2) ile yıkayın. Ucu% 0.1 trifluoroasetik asit (TFA; 10 uL x 2) ile dengeleyin. İpucu örnekle yükleyin (tipik olarak 100-150 pmol). </li><li> Ucu% 0.1 TFA (10 uL x 2) ve daha sonra su (10 mcL x 2) ile yıkayın. </li><li> Numuneyi istenen matrisi içeren bir solüsyona süzün; % 50 asetonitril içerisinde 10 uL 25 mM-2,4,6-trihidroksiasetofenon monohidrat (THAP), 10 mM amonyum sitrat ve 300 mM amonyum florürden oluşan bir solüsyon kullandık. </li><li> Doğrudan MALDI plakası üzerinde, 0.9 uL (hava ile kurutma) takiben ve gerekirse prosedürü tekrarlayın. NOT: Tüm spektrumlar reflektör pozitif modunda elde edilmiştir. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. CD yoluyla RNA Yapı Analizi <ol><li> CD çözümleri hazırlama. <ol><li> Modifiye edilmiş RNA [3 uM] NaCl [10 mM] ihtiva eden 0.25 mL Hazırlama, sodyum fosfat tamponu [10 mM, pH 7.2] ve MgCl2 [5 mM]. Numune, analiz için hazırdır, özellikle de moleküler olmayan bir geçiş gösterirse. </li><li> Amaç, dupleks yapıları veya bimoleküler geçişleri analiz etmekse, şu an kompleman (mevcutsa 1 molar eşdeğer) ekleyin veya aşağıdaki adıma geçin. </li><li> Numuneyi, 90 ° C&#39;ye önceden ısıtılmış bir ısı bloğuna yerleştirin ve yavaş soğutmayı oda sıcaklığına (genellikle 2 - 4 saat) kontrol etmek için sıcaklığı kapatın. </li></ol></li><li> Spektrum edinimi <ol><li> Boş çözeltisi (NaCI, 10 mM sodyum fosfat, 10 mM, pH 7.3, MgCl2, 5 mM) hazırlanması, transfer tOa mikro-küvet (1 cm yol uzunluğu, 250 μL minimum hacim) yerleştirin ve cihaz içindeki numune değiştiricisinin bir tutma yerine yerleştirin. </li><li> RNA içeren örneği başka bir mikro küvete aktarın ve örnek değiştiricide konumlandırın. Termal denatürasyon geçişini ölçüyorsanız, sulu katmanı bozmadan bir yağ yatağı ekleyin ve bir parça Teflon bant kullanarak küvet kapağını sabitleyin. </li><li> Enstrümanda bulunan hava yüzer havasını yaklaşık olarak hareket ettiren bir akış sağlamak için azot tankını açın. 40. Soğutucuyu açın. </li><li> Cihazı açın ve yazılımı Spectra Manager simgesini açın, ardından satın alma penceresi Spectra Measurement&#39;i açın . </li><li> Alma işleminden önce aleti azot ile 5 dakika temizleyin. </li><li> Aşağıdaki parametreleri ölçün&gt; Parametreleri kullanarak spektrumları elde edin ve parametreleri aşağıdaki gibi ayarlayın: <ol><li> Genel altında şunları seçin: Tarama 200-350 nm; Kanallar CD ve HT: Veri0.1 nm&#39;de perde; 100 nm / dak&#39;da tarama hızı; 1 nm&#39;de bant genişliği; 5 birikim sayısı. </li><li> Hücre birimi altında 20 ° C&#39;yi seçin. Kontrol altında, Deklanşör otomatik olarak açılıp kapanır&#39;ı seçin. Bilgi altında, adı, konsantrasyon, operatör seçin. </li><li> Veri altında istediğiniz klasöre gidin. Tamam&#39;a tıklayın. </li></ol></li><li> Tamam tıklama, buna uygun olarak örnek değiştirici 1-6 küvetlerin pozisyon (lar) tespit, spektrumları Ölçü&gt; Örnek ölçümü elde edin. </li></ol></li><li> Termal denatürasyon geçişi yapacaksanız: <ol><li> Kapat Edinim yazılımı Dosya&gt; Çıkış ve yeni bir program açın Değişken Sıcaklık Ölçümü&gt; Ölçüm&gt; Parametreler . </li><li> İstenilen şekilde ayarlanabilen bir termal geçiş kaydetmek için aşağıdaki parametreleri uygulayın: <ol><li> Sıcaklık altında başlangıç ​​sıcaklığı seçin: 4 ° C; Aralık: 0.2; taRget: 90 ° C; Gradyan: 1 ° C / dak; 0 saniye bekle Başlangıç ​​/ Bitiş altında, Durum ve bitiş durumunu istediğiniz gibi seçin. </li><li> Genel altında, 3 Kanal, CD / HT / Abs; Bant genişliği: 1 nm; Dalga boyu: 270 nm (veya istenen şekilde). Kontrol altında, hiçbiri seçin. Bilgi altında, adını, yoğunluğunu, operatörünü seçin. </li><li> Veri altında istediğiniz klasöre gidin. Tamam&#39;a tıklayın. </li></ol></li><li> Örnekleri 4 ° C&#39;ye soğutun ve bir spektrum ölümü elde etmeden önce bu sıcaklıkta 5 dakika bekleyin. </li></ol></li><li> Spektrum için veri inceleme. <ol><li> Fonksiyonu yazılımda kullanarak, boş tayfı, hedef tayin etmeden, tampon sisteminden kaynaklanan arka plan sinyalleri için hesaba katın : Spektrum Analizi&gt; Dosya&gt; Aç . </li><li> Boş bir dosya ve bir spektrum dosyası açıldıktan sonra, Görünüm 2&#39;yi Görünüm 1&#39;in (ekranın sol tarafında) altında sürükleyin. </li><li> Pr için tıklayınÇıkarma&gt; çıkarma&gt; Tamam veya veri alışverişi&gt; Tamam . </li><li> Verileri bir ASCII dosyası olarak ayıklayın: Dosya&gt; Ver ve ASCII&#39;yi seçin. </li><li> Karşılık gelen spektrumu oluşturmak için yazılımı kullanın. Sinyal-gürültü oranının beklenenden düşük olduğu durumlarda verilerin düzleştirilmesi isteğe bağlıdır. Bu dönüşüm düzleştirme verisi seçeneğini uygulayarak uygulanabilir. </li></ol></li><li> Termal denatürasyon geçişleri için veri incelemesi. <ol><li> Verileri bir ASCII dosyası olarak JASCO dosyasından ayıklayın. </li><li> Eliptikite noktalarını sıcaklığın bir fonksiyonu olarak çizin. Genellikle, incelenen dalga boyuna bağlı olarak verilerin düzeltilmesi gereklidir. Bazı durumlarda, 210 nm&#39;de dalga boyunun kullanımı düzleştirmeyi gerektiren çizimler arasında daha büyük varyasyonlar gösterdi. Bununla birlikte, numune ve konsantrasyonlara bağlı olarak, ham veriler kullanılarak bir takım hesaplamalar yapılmıştır. </li><li> Termal deneyi hesaplamak için(T m ) değeri, eğrinin birinci türevi elde edilir. Maksimum veya minimum bu parametrenin bir göstergesi idi. Önceki adımda olduğu gibi, bazı durumlarda en doğru değeri elde etmek için verilerin düzgünleştirilmesi gerekir. NOT: Deneyler tipik olarak üçlü olarak gerçekleştirilmiştir, bu da ölçüm için ilgili ortalama ve standart sapma ile sonuçlanmıştır. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/229210603_The_synthesis_of_oligodeoxyprimidines_on_a_polymer_support">The synthesis of oligodeoxypyrimidines on a polymer support.</a> Tetrahedron Lett. 21 (8), 719-722 (1980).</li>
<li>Beaucage, S. L., Caruthers, M. H. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0040403901904617">Deoxynucleoside phosphoramidites-A new class of key intermediates for deoxypolynucleotides.</a> Tetrahedron Lett. 22 (20), 1859-1862 (1981).</li>
<li>Caruthers, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+synthesis+machines%3A+DNA+Chemistry+and+its+uses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene synthesis machines: DNA Chemistry and its uses.</a> Science. 230 (4723), 281-285 (1985).</li>
<li>Nguyen, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis%2C+Thermal+Stability%2C+Biophysical+Properties%2C+and+Molecular+Modeling+of+Oligonucleotides+of+RNA+Containing+2%27-O-2-Thiophenylmethyl+Groups%5BTitle%5D)+AND+%22J+Org+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthesis, Thermal Stability, Biophysical Properties, and Molecular Modeling of Oligonucleotides of RNA Containing 2'-O-2-Thiophenylmethyl Groups.</a> J Org Chem. 81 (19), 8947-8958 (2016).</li>
<li>El-Sagheer, A. H., Brown, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+chemistry+with+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">Click chemistry with DNA.</a> Chem Soc Rev. 39, 1388-1405 (2010).</li>
<li>Puffer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Fluoro+pyrimidines%3A+labels+to+probe+DNA+and+RNA+secondary+structures+by+1D+19F+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">5-Fluoro pyrimidines: labels to probe DNA and RNA secondary structures by 1D 19F NMR spectroscopy.</a> Nucleic Acids Res. 37 (22), 7728-7740 (2009).</li>
<li>Wan, W. B., Seth, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+medicinal+chemistry+of+therapeutic+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">The medicinal chemistry of therapeutic oligonucleotides.</a> J Med Chem. 59 (21), 9645-9667 (2016).</li>
<li>Zhou, C., Greenberg, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Damage+by+histone+radicals+in+nucleosome+core+particles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">DNA Damage by histone radicals in nucleosome core particles.</a> J Am Chem Soc. 136 (18), 6562-6565 (2014).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UV-Induced+proton-coupled+electron+transfer+in+cyclic+DNA+miniduplexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">UV-Induced proton-coupled electron transfer in cyclic DNA miniduplexes.</a> J Am Chem Soc. 138 (23), 7395-7401 (2016).</li>
<li>Anosova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+diversity+of+artificial+genetic+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The structural diversity of artificial genetic polymers.</a> Nucleic Acids Res. 44 (3), 1007-1021 (2016).</li>
<li>Riml, C., Micura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+5-Hydroxymethylcytidine-+and+5-Hydroxymethyl-uridine-Modified+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Synthesis%22%5BJournal%5D)">Synthesis of 5-Hydroxymethylcytidine- and 5-Hydroxymethyl-uridine-Modified RNA.</a> Synthesis. 48, 1108-1116 (2016).</li>
<li>Anderson, B. A., Hrdlicka, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merging+Two+Strategies+for+Mixed-Sequence+Recognition+of+Double-Stranded+DNA%3A+Pseudocomplementary+Invader+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Org+Chem%22%5BJournal%5D)">Merging Two Strategies for Mixed-Sequence Recognition of Double-Stranded DNA: Pseudocomplementary Invader Probes.</a> J Org Chem. 81 (8), 3335-3346 (2016).</li>
<li>Beaucage, S. L., Iyer, R. P. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0040402001879588">Synthesis of oligonucleotides by the phosphoramidite approach.</a> Tetrahedron. 48 (12), 2223-2311 (1992).</li>
<li>Gillet, L. C. J., Alzeer, J., Schärer, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+incorporation+of+N-%28deoxyguanosin-8-yl%29-2-acetylaminofluorene+%28dG-AAF%29+into+oligonucleotides+using+modified+%27ultra-mild%27+DNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Site-specific incorporation of N-(deoxyguanosin-8-yl)-2-acetylaminofluorene (dG-AAF) into oligonucleotides using modified 'ultra-mild' DNA synthesis.</a> Nucleic Acids Res. 33 (6), 1961-1969 (2005).</li>
<li>Shiba, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+synthesis+of+a+very+long+oligoribonucleotide+with+2-cyanoethoxymethyl+%28CEM%29+as+the+2%27-O.-protecting+group%3A+structural+identification+and+biological+activity+of+a+synthetic+110mer+precursor-microRNA+candidate%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Chemical synthesis of a very long oligoribonucleotide with 2-cyanoethoxymethyl (CEM) as the 2'-O.-protecting group: structural identification and biological activity of a synthetic 110mer precursor-microRNA candidate.</a> Nucleic Acids Res. 35 (10), 3287-3296 (2007).</li>
<li>Choi, Y. J., Gibala, K. S., Ayele, T., Deventer, K. D., Resendiz, M. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+properties%2C+thermal+stability+and+functional+impact+of+8-oxo-7%2C8-dihydroguanine+on+oligonucleotides+of+RNA+-+a+study+of+duplex%2C+hairpins+and+the+aptamer+for+preQ1+as+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Biophysical properties, thermal stability and functional impact of 8-oxo-7,8-dihydroguanine on oligonucleotides of RNA - a study of duplex, hairpins and the aptamer for preQ1 as models.</a> Nucleic Acids Res. 45 (4), 2099-2111 (2017).</li>
<li>Ranjbar, B., Gill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+dichroism+techniques%3A+Biomolecular+and+nanostructural+analyses+-+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol+Drug+Des%22%5BJournal%5D)">Circular dichroism techniques: Biomolecular and nanostructural analyses - A review.</a> Chem Biol Drug Des. 74 (2), 101-120 (2009).</li>
<li>Mergny, J. -L., Lacroix, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+thermal+melting+curves%5BTitle%5D)+AND+%22Oligonucleotides%22%5BJournal%5D)">Analysis of thermal melting curves.</a> Oligonucleotides. 13 (6), 515-537 (2003).</li>
<li>Jin, R., Breslauer, K. J., Jones, R. A., Gaffney, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetraplex+formation+of+a+guanine-containing+nonameric+DNA+fragment%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tetraplex formation of a guanine-containing nonameric DNA fragment.</a> Science. 250 (4980), 543-546 (1990).</li>
<li>Virgilio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Hydroxymethyl-2%27-deoxyuridine+residues+in+the+thrombin+binding+aptamer%3A+Investigating+anticoagulant+activity+by+making+a+tiny+chemical+modification%5BTitle%5D)+AND+%22CHEMBIOCHEM%22%5BJournal%5D)">5-Hydroxymethyl-2'-deoxyuridine residues in the thrombin binding aptamer: Investigating anticoagulant activity by making a tiny chemical modification.</a> CHEMBIOCHEM. 15 (16), 2427-2434 (2014).</li>
<li>Chauca-Diaz, A. M., Choi, Y. J., Resendiz, M. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+properties+and+thermal+stability+of+oligonucleotides+of+RNA+containing+7%2C8-dihydro-8-hydroxyadenosine%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Biophysical properties and thermal stability of oligonucleotides of RNA containing 7,8-dihydro-8-hydroxyadenosine.</a> Biopolymers. 103 (3), 167-174 (2015).</li>
<li>Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aManiatis%2C+T+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning: a laboratory manual</a>. 14, Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, New York. ISBN: 0-87969-136-0 173-185 (1987).</li>
<li>Markham, N. R., Zuker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UNAFold%3A+software+for+nucleic+acid+folding+and+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">UNAFold: software for nucleic acid folding and hybridization.</a> Methods Mol Biol. 453, 3-31 (2008).</li>
<li>Breslow, R., Huang, D. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+metal+ions+including+Mg2%2B+and+lanthanides+on+the+cleavage+of+ribonucleotides+and+RNA+model+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Effects of metal ions including Mg2+ and lanthanides on the cleavage of ribonucleotides and RNA model compounds.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (10), 4080-4083 (1991).</li>
<li>Blumberg, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+a+ribonuclease-free+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Creating a ribonuclease-free environment.</a> Methods Enzymol. 152 (2), 20-24 (1987).</li>
<li>AbouHaidar, M. G., Ivanov, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-enzymatic+RNA+promoted+by+the+combined+catalytic+activity+of+buffers+and+magnesium+ions%5BTitle%5D)+AND+%22Z+Naturforsch+C%22%5BJournal%5D)">Non-enzymatic RNA promoted by the combined catalytic activity of buffers and magnesium ions.</a> Z Naturforsch C. 54 (7-8), 542-548 (1999).</li>
<li>Farrell, R. E. <a target="_blank" href="http://blogsdelagente.com/cefimijegyte/rna-methodologies-fourth-edition-laboratory-guide-for-isolation-and-characterization-ebook-download/">RNA Methodologies (4th Ed): A laboratory guide for isolation and characterization</a>. 2, Academic Press. San Diego, California. 45-80 (2010).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu el yazısının amacı, DNA veya RNA&#39;nın oligonükleotidlerinin sentezini başarılı bir şekilde elde etmek veya arttırmak için alan, acemi veya uzman araştırmacılarına rehberlik etmektir. Açıklanan metodoloji, standart fosforamidit kimyası yoluyla otomatik bir DNA / RNA sentezleyicisi kullanan katı faz sentezinin kullanımına odaklanmaktadır. Raporda, RNA dodecamerlerin sentezi, saflaştırılması ve karakterizasyonu adım adım anlatılıyor. Buna ek olarak, CD&#39;nin kullanımı, ikincil yapı...

DNA / RNA&#39;nın oligonükleotidlerini elde etmek için katı-faz sentezi, 1970&#39;lerden beri çeşitli alanlarda, birçok uygulamaya hizmet eden güçlü bir araçtır 1 , 2 , 3 fosforamidit yapı taşları 4 kullanarak. Geniş etki örnekleri şunlardır: etiketleme (tıklama kimyası reaksiyonları yoluyla ) 5 , yapısal sondalama 6 ve antisens teknolojileri 7&#39;nin yanı sıra, biyolojik mekanizmaları 8 , 9 , genetik materyal olarak kaynakların aydınlatılması 10 ve burada kullanımı birçok others.The modifikasyon arasında çeşitli doğal ve / veya kimyasal modifikasyonlar 11, 12, ihtiva eden bir RNA oligonükleotid elde etmek için gerekli çabalarında ilk adımBu önemli biyopolimerin yapısını ve fonksiyonunu zamansal olarak kontrol edebilmek için fotoaktif sondalar. Diziler ile RNA dodekamerleri sentezi: 5 &#39;- [Cua CG G A AU CAU] -3&#39; / 5 &#39;- [Ağustos AUU CCG UAG] -3&#39; (altı çizili konumları C2&#39;- O -thiophenylmethyl modifikasyonu dahil edilmesini temsil eder ) Bu çalışmanın odağını oluşturmaktadır. Diziler, RNA iplikçiklerinin tekli iplikçikler olarak veya bunların karşılık gelen dupleks yapıları olarak kantifikasyonunu ve ölçülmesini mümkün kılacak şekilde seçildi (diğer ikincil yapılar termodinamik olarak kararlı olarak tahmin edilmedi). Yapısal parametreleri, yani dupleks oluşumu ve termal denatürasyon geçişlerini oluşturmak için CD kullanıldı. sentez Bu oligonükleotidlerin elde edilmesine yönelik genel prosedür Şekil l&#39; de gösterilmekte ve kademeli süreç izlemektedir: otomatik katı faz sentezi → DeprOteksiyon → Saflaştırma → Niceleme → Karakterizasyon. Şekil 2 , bu prosedürde gerekli olan monomerik birimleri göstermektedir. RNA katı faz sentezi (Şekil 2, sol) ve örneğin, G, A ve C, nükleofilik eksosiklik aminler için baz etkisiyle değişen koruma gruplarının kullanımı, fosforamidit kimyası dayandığını DNA benzerdir, Asetil, benzoil, fenoksiasetil, t -butil veya N , N- dimetilformamid ( Şekil 2 , sağda). C2&#39;-OH grubunun (deoksoligonükleotid biyopolimerleri bulunmayan) varlığından dolayı RNA&#39;da göz önüne alınması gereken bir diğer husus, bu nükleofilik konumun korunması ve daha sonra korumanın kaldırılması için eklenmesi gereken ek adımdır. Bu bağlamda, silikondan koruma grupları, biorthogonal kısımları (specificallHalkalı seçimler olarak tert -butildimetilsilil (TBDMS) ve triizopropilsililoksimetil (TOM) gruplarıyla ( Şekil 2 , sol alt) fluorür varlığında korumanın bozulması). Bu çalışmada, otomatik sentez, standart fosforamidit kimyası kullanılan bir DNA / RNA sentezleyicisi üzerinde gerçekleştirildi. Cihaz üzerindeki üretici ayarları, fosforamiditlerin ticari versiyonlarını DNA için kullanırken otomatik seyreltme adımı veya kullanıcı tarafından ayarlanan hacimlerde seyreltme seçeneği içerir. Bununla birlikte, RNA fosforamiditini tartmaya ve elle seyreltmeye karar verdik: 1) RNA&#39;nın kanonik fosforamiditlerinin fiyatı daha yüksek (bazı durumlarda 50 kat daha pahalı); 2) modifiye fosforamiditler genellikle küçük miktarlarda elde edilir; Ve 3) otomatik bir seyreltme basamağı (imalatçı tarafından belirlenmiş) kullanılarak atık malzeme miktarı büyüktür. Buna ilave olarak, 1) ticari olarak temin edilebilen katı destekler3&#39;-uç olarak işlev görecek şekilde korunmuş bir nükleobaz içeren bir antikor ( örn. , CPG); Ve 2) C2&#39;- O -konumunda bir TBDMS grubu ile korunan ticari fosforamiditler (kanonik nükleozazlar). Sentez adımlarının ayrıntılı listesi, Şekil 3 ve Tablo 1&#39;de RNA sentezi için ayarlanmış adımlar için ilave açıklamalar ve yorumlar ile birlikte verilmektedir. Ayrıca, Şekil 4 , her bir detritilasyon adımından çıkan tritil katyonu nicelleştiren &#39;Trityl Monitor&#39; seçeneğini seçtikten sonra her adım için gözlemlenen aşamalı verimleri göstermektedir. Deneyimimizde, tipik olarak sınırlayıcı faktör, istenen modifikasyonu içeren fosforamiditin elde edilmesiydi. Yani, seçilen yerlerde modifikasyonların yapılmasına izin veren sentetik bir metodolojinin geliştirilmesi. Bu raporda,Karşılık gelen sentetik metodoloji olan C2&#39;- O- tiyofenilmetil grubunu kurduğumuz, modifiye edilmiş bir nükleotidin dahil edilmesi. Bu grup, küçük boyutludur ve katı faz sentezini hiçbir şekilde etkilemez. Bu grubun, RNA oligonükleotidlerine dahil edilmesi, yapısal ve termodinamik parametreler 4 ile birlikte rapor edildiği için, burada, modifiye edilmiş fosforamiditlere yol açan organik sentezin hiçbir yönü tarif edilmeyecektir. Korumanın Arındırılması ve Karakterizasyonu Ekzosiklik aminlerin ve β-siyanoetil gruplarının korumasının bozulması, CPG-reçinesinden ayrılma ile aynı adımda gerçekleşir. Bu jel üzerinden ardından arıtma florür iyonu varlığında C2&#39;- O -silil gruplarının ayrılması yolu ile ve ardından AMA sulu bir çözeltisi varlığında elde edilen reçinenin ısıtılması, yaygın olarak kullanılan koşullar, uygulamalı veElektroforez. Bu, birçok durumda, standart koşullar, daha yumuşak koşullar 13, 14, örneğin, metanol / potasyum karbonat (MeOH / K 2CO, 3&#39;tür) veya bütilamin gerektirebilir bazik koşullar ya da florid iyonları ile kararsız olan modifikasyonlar haline iken. Dolayısıyla, karşılık gelen fosforamititlerin üzerinde farklı koruma grupları seti gereklidir. Ayrıca, bu yöntemle önceki tecrübelerimize ve diğer enstrümantasyon eksikliğine bakıldığında korumasız oligomerleri saflaştırmak için tercih edilen alternatif olarak elektroforezi seçtik. Bununla birlikte, HPLC etkili bir yöntem olarak alternatif olarak kullanılabilir 15 . Saflaştırılmış oligonükleotidlerin karakterizasyonu, 16 numaralı grubumuz tarafından bildirilen bir prosedür kullanılarak, kütle spektrometrisi, matris destekli lazer desorpsiyon / iyonlaşma-uçuş süresi (MALDI-TOF) ile gerçekleştirildi. Yapısal karakterizasyonu ve özellikleri<html> Elde edilen dubleks mal stabilitesi CD üzerinden gerçekleştirilmiştir. Spesifik olarak, CD&#39;nin modifiye ve modifiye edilmemiş oligonükleotidlerinin termal denatürasyon geçişlerini belirlemek için CD&#39;nin elastikiyetinde ca. 210 nm &#39;de bir λ max 270 nm, ve aynı zamanda (negatif elipslik) bandın kayboluşu. Hibridizasyon öncesi ve sonrası spektrum karşılaştırması, farklılıklarını göstermek ve kullanılan metodolojinin geçerliliğini sağlamak için verilmiştir. CD kullanımı, nükleik asitler ve aminoasitler 17&#39;deki yapısal motiflerin belirlenmesinde yaygın olarak kabul görür ve bu nedenle çeşitli yapısal ve termodinamik parametreleri belirlemek için bir araç olarak kullanılabilir 18 ; Bununla birlikte, tekniğin termal denatürasyon geçişlerini değerlendirmek için kullanıldığı pek çok örnek bulunmamaktadır. Bazı örnekler, G-quadruplex&#39;leri içeren DNA&#39;daki termal kararlılıkların belirlenmesini içerirAss = &quot;xref&quot;&gt; 19 , 20 veya RNA 21&#39;in dubleksleri ve saç tokalarında. Bu rapor, uzman olmayan okuyucuya veya görüntüleyen kişiye, bu tür bir araştırmaya sorunsuz başlamasını sağlayacak bir dizi araç sunmayı amaçlamaktadır. Bu heyecan verici bilim dalında yer alan diğer araştırma laboratuarlarındaki metodolojiler ve tekniklerle geliştirmek ve karşılaştırmak için hizmet edecektir. Bu rapordaki içerik, bu teknolojinin mevcut protokollerini çeşitli kaynaklardan ekler ve her basamak için görsel bir yardımla deneyimi zenginleştirir ve kolaylaştırır.

<table><tbody><tr><td>AbsolveTM</td><td>PerkinElmer</td><td>6NE9711</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile 99.9%, HPLC Grade</td><td>Fisher Scientific</td><td>75-05-8</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile 99.9%, anhydrous for DNA sequencing</td><td>Fisher BioReagents</td><td>75-05-8</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide, 99+%</td><td>ACROS Organics</td><td>164850025</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium chloride 98+%</td><td>Alfa Aesar</td><td>12125-02-9</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium citrate, dibasic 98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3012-65-5</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Fluoride&amp;nbsp; 98.0%, ACS grade</td><td>Alfa Aesar</td><td>12125-01-8</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium hydroxide 28 - 30% in water, ACS Plus</td><td>Fisher Chemical</td><td>1336-21-6</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium persulfate</td><td>ACROS Organics</td><td>1444</td><td></td></tr><tr><td>Argon-ultra high purity</td><td>&amp;nbsp;Airgas</td><td>7440-37-1</td><td></td></tr><tr><td>Bis-acrylamide Ultra pure</td><td>VWR-Amresco</td><td>172</td><td></td></tr><tr><td>Boric Acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>A73-1</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl pyrocarbonate, 97%</td><td>ACROS Organics</td><td>A0368487</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, anhydrous, histological grade</td><td>Fisher Chemical</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dehydrate 100.2%</td><td>Fisher Chemical</td><td>6381-92-6</td><td></td></tr><tr><td>Formamide&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>75-12-7</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid, 36.5 - 38.0%, Certified ACS Plus</td><td>Fisher Chemical</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate, 99%</td><td>Fisher Scientific</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>Methanol, 99.9%,&amp;nbsp; HPLC Grade</td><td>Fisher Chemical</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Methylamine 40% in water</td><td>Sigma Aldrich</td><td>74-89-5</td><td></td></tr><tr><td>1-Methyl-2-pyrrolidinone, andhydrous, 99.5%</td><td>Aldrich</td><td>872-50-4</td><td></td></tr><tr><td>Opti-TOFTM 96 Well Insert (123 x 81 mm)&amp;nbsp;</td><td>MDS SCIEX</td><td>1020157</td><td></td></tr><tr><td>RNase Away</td><td>Molecular BioProducts</td><td>7005-11</td><td></td></tr><tr><td>Sodium acetate, anhydrous 99.2%, Certified ACS</td><td>Fisher Chemical</td><td>127-09-3</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride, 100.5%, Certified ACS</td><td>Fisher Chemical</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic dihydrate 99.0%</td><td>Sigma</td><td>13472-35-0</td><td></td></tr><tr><td>2&amp;rsquo;,4&amp;rsquo; Triethylamine, 99+%</td><td>Alfa Aesar</td><td>121-44-8</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Amresco</td><td>761</td><td></td></tr><tr><td>Triethylamine trihydrofluoride, 98%</td><td>Aldrich</td><td>73602-61-6</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid, 99%</td><td>Alfa Aesar</td><td>76-05-1</td><td></td></tr><tr><td>6&amp;rsquo;-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>480-66-0</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP154-3</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Fisher Scientific</td><td>U15-3</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents for the RNA synthesis:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deblocking mix, 3% trichloroacetic acid in dichloromethane</td><td>Glen Research</td><td>&amp;nbsp;40-4140-57</td><td></td></tr><tr><td>Cap Mix A, THF/Pyridine/Acetic anhydride</td><td>Glen Research</td><td>40-4110-52</td><td></td></tr><tr><td>Cap Mix B, 10% 1-methylimidazole in THF</td><td>Glen Research</td><td>40-4120-52</td><td></td></tr><tr><td>Activator, 0.25 M 5-ethylthio-1H-tetrazole in anhydrous acetonitrile</td><td>Glen Research</td><td>&amp;nbsp;30-3140-52</td><td></td></tr><tr><td>Oxidizing Solution, 0.02 M iodine in THF/Pyridine/Water</td><td>Glen Research</td><td>40-4330-52</td><td></td></tr><tr><td>U-RNA-CPG</td><td>Glen Research</td><td>20-3330-xx</td><td></td></tr><tr><td>Ac-G-RNA-CPG&amp;nbsp;</td><td>Glen Research</td><td>20-3324-xx</td><td></td></tr><tr><td>Ac-G-CE Phosphoramidite&amp;nbsp;</td><td>Glen Research</td><td>10-3025-xx</td><td></td></tr><tr><td>U-CE Phosphoramidite</td><td>Glen Research</td><td>10-3030-xx</td><td></td></tr><tr><td>Ac-C-CE Phosphoramidite</td><td>Glen Research</td><td>10-3015-xx</td><td></td></tr><tr><td>Bz-A-CE Phosphoramidite&amp;nbsp;</td><td>Glen Research</td><td>10-3003-xx</td><td></td></tr></tbody></table>

protocol for the solid-phase synthesis of oligomers of rna containing a 2'-o-thiophenylmethyl modification and characterization via circular dichroism

Katı faz sentezi, çeşitli alanlardaki uygulamalar için ve farklı araştırma amaçları için popüler bir metodoloji haline getirmiştir, özellikle DNA veya RNA&#39;dan oluşan, kanonik ve modifiye edilmiş nükleik asit polimerleri elde etmek için kullanılmıştır. Burada açıklanan prosedür, C2&#39;- O -konumunda bulunan sıfır, bir veya iki modifikasyon ihtiva eden RNA 5 &#39;- [CUA CGG AAU CAU] -3&#39; dodekamerlerinin sentezi, saflaştırılması ve karakterizasyonu üzerine odaklanmaktadır. Problar, standart organik sentez yoluyla RNA nükleotitlerine dahil edilen ve ilgili fosforamiditleri vasıtasıyla karşılık gelen oligonükleotidlere dahil edilen 2-tiyofenilmetil gruplarına dayanmaktadır. Bu rapor, fosforamidit kimyasından, iki kanonik nükleobaz (Uridin (U), Sitozin (C), Guanozin (G), Adenosin (A)) ve aynı zamanda 2&#39;- 0- konumunda modifiye edilmiş 2-tiyofenilmetil işlevselleştirilmiş nükleotidleri kullanmaktadır. pozisyon; Bununla birlikte, metodoloji büyük bir var için uygundurYıllar içinde geliştirilen değişiklikler. Oligonükleotidler, kontrollü gözenekli cam (CPG) desteğinde, ardından reçineden ayrılma ve standart koşullar altında korumanın bozulması, yani bir amonyak ve metilamin karışımı (AMA), bunu takiben hidrojen florür / trietilamin / N-metilpirolidinon kullanılarak sentezlendi. Karşılık gelen oligonükleotidler, poliakrilamid elektroforezi (% 20 denatürasyon) ile saflaştırılmış, akabinde eluyon, tuz giderme ve ters fazlı kromatografi (Sep-pak, C18 -kolon) yoluyla izole edilmiştir. Nicelik ve yapısal parametreler sırasıyla mor ötesi görünür (UV-vis) ve dairesel dikroizm (CD) fotometrik analizi ile değerlendirildi. Bu rapor, bu alana girmek isteyen yeni başlayanlar ve uzman araştırmacılar için bir kaynak ve rehber görevi görmeyi amaçlamaktadır. Yeni teknolojiler ve metodolojiler geliştirildiğinde ilerlemiş bir iş olarak hizmet etmesi bekleniyor. Bu metodolojilerin ve tekniklerin tanımıAdlı belge, fosforamidit kimyası kullanılan bir DNA / RNA sentezleyicisine (2013 yılında yenilenmiş ve satın alınmış) karşılık gelmektedir.

C2&#39;- O -konumunda sıfır, bir veya iki 2-tiyofenilmetil modifikasyonu içeren RNA dodekamerlerinin sentezi, ilgili saflaştırma ve karakterizasyonu ile birlikte açıklanmaktadır. Dahası, CD yoluyla gerçekleştirilen yapısal analizin ayrıntılı bir tarifi de dahildir. Dört RNA dizisi (tamamlayıcı bir sekansa sahip bir iplik dahil), katı faz sentezi yoluyla elde edildi ve onu her bir oligonükleotidden ...

Watch this Scientific Journal Video about Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism at JoVE

Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

Bu makale, C2&#39;- O -konumunda modifiye edilmiş RNA dodekamerlerinin katı faz sentezi, saflaştırılması ve karakterizasyonu hakkında ayrıntılı bir prosedür sunmaktadır. UV-vis ve dairesiz dikroizyum fotometrik analizleri yapısal yönleri, yani tek telli veya çift telli elektronları ölçmek ve karakterize etmek için kullanılır.

Bir 2&#39;-amino asit içeren RNA Oligomerlerinin Katı Faz Sentezi Protokolü<em&gt; Ç</em&gt; Tiyofenilmetil Değiştirme ve Sirküler Dikroizm ile Karakterizasyonlar

Solid-phase synthesis has been used to obtain canonical and modified polymers of nucleic acids, specifically of DNA or RNA, which has made it a popular ...

protocol-for-solid-phase-synthesis-oligomers-rna-containing-2-o

Research

JoVE Journal

Chemistry

Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

18.9K Görüntüleme.  University of Colorado Denver.  Bu makale, C2'- O -konumunda modifiye edilmiş RNA dodekamerlerinin katı faz sentezi, saflaştırılması ve karakterizasyonu hakkında ayrıntılı bir prosedür sunmaktadır. UV-vis ve dairesiz dikroizyum fotometrik analizleri yapısal yönleri, yani tek telli veya çift telli elektronları ölçmek ve karakterize etmek için kullanılır. 

Video: Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

Nucleoside Triphosphates - From Synthesis to Biochemical Characterization

The traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the use of solid-phase synthesis by appending suitably modified phosphoramidite precursors to the nascent chain. However, the conditions used during the synthesis and the restriction to rather short sequences hamper the applicability of this methodology. On the other hand, modified nucleoside triphosphates are activated building blocks that have been employed for the mild introduction of numerous functional groups into nucleic acids, a strategy that paves the way for the use of modified nucleic acids in a wide-ranging palette of practical applications such as functional tagging and generation of ribozymes and DNAzymes. One of the major challenges resides in the intricacy of the methodology leading to the isolation and characterization of these nucleoside analogues.
	
	In this video article, we present a detailed protocol for the synthesis of these modified analogues using phosphorous(III)-based reagents. In addition, the procedure for their biochemical characterization is divulged, with a special emphasis on primer extension reactions and TdT tailing polymerization. This detailed protocol will be of use for the crafting of modified dNTPs and their further use in chemical biology.

The protocol described herein aims to explain and abridge the numerous obstacles in the way of the intricate route leading to modified nucleoside triphosphates. Consequently, this protocol facilitates both the synthesis of these activated building-blocks and their availability for practical applications.

Nükleosid trifosfatlar - sentezinden Biyokimyasal Karakterizasyonu için

The  traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the  use of solid-phase synthesis by appending suitably modified ...

Kimya

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands for the recognition of RNA sequence and structure. Chemically modified Peptide Nucleic Acid (PNA) oligomers have been recently developed that can recognize RNA duplexes in a sequence-specific manner. PNAs are chemically stable with a neutral peptide-like backbone. PNAs can be synthesized relatively easily by the manual Boc-chemistry solid-phase peptide synthesis method. PNAs are purified by reverse-phase HPLC, followed by molecular weight characterization by matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF). Non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) technique facilitates the imaging of the triplex formation, because carefully designed free RNA duplex constructs and PNA bound triplexes often show different migration rates. Non-denaturing PAGE with ethidium bromide post staining is often an easy and informative technique for characterizing the binding affinities and specificities of PNA oligomers. Typically, multiple RNA hairpins or duplexes with single base pair mutations can be used to characterize PNA binding properties, such as binding affinities and specificities. 2-Aminopurine is an isomer of adenine (6-aminopurine); the 2-aminopurine fluorescence intensity is sensitive to local structural environment changes, and is suitable for the monitoring of triplex formation with the 2-aminopurine residue incorporated near the PNA binding site. 2-Aminopurine fluorescence titration can also be used to confirm the binding selectivity of modified PNAs towards targeted double-stranded RNAs (dsRNAs) over single-stranded RNAs (ssRNAs). UV-absorbance-detected thermal melting experiments allow the measurement of the thermal stability of PNA-RNA duplexes and PNA&#183;RNA2 triplexes. Here, we describe the synthesis and purification of PNA oligomers incorporating modified residues, and describe biochemical and biophysical methods for characterization of the recognition of RNA duplexes by the modified PNAs.

We report the protocols for the synthesis and purification of Peptide Nucleic Acid (PNA) oligomers incorporating modified residues. The biochemical and biophysical methods for the characterization of the recognition of RNA duplexes by the modified PNAs are described.

Çift iplikçikli RNA'ların tek iplikçikli RNA'ların tarafından üzerinde fingerprinting ve seçici tanınması, kimyasal olarak peptit nükleik asitler modifiye

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Genetik

A Novel Saturation Mutagenesis Approach: Single Step Characterization of Regulatory Protein Binding Sites in RNA Using Phosphorothioates

Gene regulation plays an important role in development. Numerous DNA- and RNA-binding proteins bind their target sequences with high specificity to control gene expression. These regulatory proteins control gene expression either at the level of DNA (transcription) or at the level of RNA (pre-mRNA splicing, polyadenylation, mRNA transport, decay, and translation). Identification of regulatory sequences helps understand not only how a gene is switched on or off, but also which downstream genes are regulated by a particular regulatory protein. Here, we describe a one-step approach that allows saturation mutagenesis of a protein binding site in RNA. It involves doping DNA template with non-wild-type nucleotides within the binding site, synthesis of separate RNAs with each phosphorothioate nucleotide, and isolation of the bound fraction following incubation with protein. Interference from non-wild-type nucleotides results in their preferential exclusion from the protein-bound fraction. This is monitored by gel electrophoresis following selective chemical cleavage with iodine of phosphodiester bonds containing phosphorothioates (phosphorothioate mutagenesis or PTM). This single-step saturation mutagenesis approach is applicable to the characterization of any protein binding site in RNA.

Proteins that bind specific RNA sequences play critical roles in gene expression. Detailed characterization of these binding sites is crucial for our understanding of gene regulation. Here, a single-step approach for saturation mutagenesis of protein-binding sites in RNA is described. This approach is relevant for all protein-binding sites in RNA.

Bir roman doygunluk Mutagenesis yaklaşım: Tek adım karakterizasyonu düzenleyici protein RNA Phosphorothioates kullanarak siteleri bağlama

Gene regulation plays an important role in development. Numerous DNA- and RNA-binding proteins bind their target sequences with high specificity to ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences is desired. We herein provide a detailed in vitro and in-cell selective 2&#39;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) protocol to study the RNA structural change in the presence of an experimental drug for spinal muscular atrophy (SMA), survival of motor neuron (SMN)-C2, and in exon 7 of the pre-mRNA of the SMN2 gene. In in vitro SHAPE, an RNA sequence of 140 nucleotides containing SMN2 exon 7 is transcribed by T7 RNA polymerase, folded in the presence of SMN-C2, and subsequently modified by a mild 2&#39;-OH acylation reagent, 2-methylnicotinic acid imidazolide (NAI). This 2&#39;-OH-NAI adduct is further probed by a 32P-labeled primer extension and resolved by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Conversely, 2&#39;-OH acylation in in-cell SHAPE takes place in situ with SMN-C2 bound cellular RNA in living cells. The pre-mRNA sequence of exon 7 in the SMN2 gene, along with SHAPE-induced mutations in the primer extension, was then amplified by PCR and subject to next-generation sequencing. Comparing the two methodologies, in vitro SHAPE is a more cost-effective method and does not require computational power to visualize results. However, the in vitro SHAPE-derived RNA model sometimes deviates from the secondary structure in a cellular context, likely due to the loss of all interactions with RNA-binding proteins. In-cell SHAPE does not need a radioactive material workplace and yields a more accurate RNA secondary structure in the cellular context. Furthermore, in-cell SHAPE is usually applicable for a larger range of RNA sequences (~1,000 nucleotides) by utilizing next-generation sequencing, compared to in vitro SHAPE (~200 nucleotides) that usually relies on PAGE analysis. In case of exon 7 in SMN2 pre-mRNA, the in vitro and in-cell SHAPE derived RNA models are similar to each other.

Detailed protocols for both in vitro and in-cell selective 2&#39;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) experiments to determine the secondary structure of pre-mRNA sequences of interest in the presence of an RNA-targeting small molecule are presented in this article.

İn vitro ve hücre içi şeklinde küçük molekül araştırmak için kullanarak Pre-mRNA yapısal değişiklikler indüklenen

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA polymerase II and co-transcriptional capping and splicing of the precursor RNA to form the mature mRNA. During mRNA synthesis, the RNA polymerase II elongation complex is a target for regulation by a large collection of transcription factors that control its catalytic activity, as well as the capping, splicing, and 3&#8217;-processing enzymes that create the mature mRNA. Because of the inherent complexity of mRNA synthesis, simpler experimental systems enabling isolation and investigation of its various co-transcriptional stages have great utility.
In this article, we describe one such simple experimental system suitable for investigating co-transcriptional RNA capping. This system relies on defined RNA polymerase II elongation complexes assembled from purified polymerase and artificial transcription bubbles. When immobilized via biotinylated DNA, these RNA polymerase II elongation complexes provide an easily manipulable tool for dissecting co-transcriptional RNA capping and mechanisms by which the elongation complex recruits and regulates capping enzyme during co-transcriptional RNA capping. We anticipate this system could be adapted for studying recruitment and/or assembly of proteins or protein complexes with roles in other stages of mRNA maturation coupled to the RNA polymerase II elongation complex.

Here, we describe the assembly of RNA polymerase II (Pol II) elongation complexes requiring only short synthetic DNA and RNA oligonucleotides and purified Pol II. These complexes are useful for studying mechanisms underlying co-transcriptional processing of transcripts associated with the Pol II elongation complex.

Diseksiyon eş transkripsiyon RNA Işleme etkinlikleri için suni RNA polimeraz II uzama kompleksler

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...

2D-HELS MS Seq: A General LC-MS-Based Method for Direct and de novo Sequencing of RNA Mixtures with Different Nucleotide Modifications

Mass spectrometry (MS)-based sequencing approaches have been shown to be useful in&#160;direct&#160;sequencing&#160;RNA without the need for a complementary DNA (cDNA) intermediate. However, such approaches are rarely applied as a de novo RNA sequencing method, but used mainly as a tool that can assist in quality assurance for confirming known sequences of purified single-stranded RNA samples. Recently, we developed&#160;a direct RNA sequencing method by integrating a 2-dimensional mass-retention time hydrophobic end-labeling strategy into MS-based sequencing (2D-HELS MS Seq). This method is capable of accurately sequencing single RNA sequences as well as mixtures containing up to 12 distinct RNA sequences. In addition to the four canonical ribonucleotides (A, C, G, and U), the method has the capacity to sequence RNA oligonucleotides containing modified nucleotides. This is possible because the modified nucleobase either has an intrinsically unique mass that can help in its identification and its location in the RNA sequence, or can be converted into a product with a unique mass. In this study, we have used RNA, incorporating two representative modified nucleotides&#160;(pseudouridine (&#936;) and 5-methylcytosine (m5C)), to illustrate the application of the method for the de novo sequencing of a single RNA oligonucleotide&#160;as well as a mixture of RNA oligonucleotides, each with a different sequence and/or modified nucleotides. The procedures and protocols described here to sequence these model RNAs will be applicable to other short RNA samples (&#60;35 nt) when using a standard high-resolution LC-MS system, and can also be used for&#160;sequence verification of modified therapeutic RNA oligonucleotides.&#160;In the future, with the development of more robust algorithms and with better instruments, this method could allow sequencing of more complex biological samples.&#160;

<meta charset="utf8"></head><body>2D-HELS MS Seq: Farklı Nükleotid Modifikasyonlarına Sahip RNA Karışımlarının Doğrudan ve de novo Dizilimi için Genel LC-MS Tabanlı Bir Yöntem

Here, we describe a detailed protocol for an LC-MS-based sequencing method that can be used as a direct method to sequence short RNA (&#60;35 nt per run) without a cDNA intermediate, and as a general method to sequence different nucleotide modifications in a single study at single-base precision.

2D-HELS MS Seq: Farklı Nükleotid Modifikasyonlarına Sahip RNA Karışımlarının Doğrudan ve de novo Dizilimi için Genel LC-MS Tabanlı Bir Yöntem

Mass spectrometry (MS)-based sequencing approaches have been shown to be useful in&#160;direct&#160;sequencing&#160;RNA without the need for a ...

DNAzyme-dependent Analysis of rRNA 2&#8217;-O-Methylation

Guide box C/D small nucleolar RNAs (snoRNAs) catalyze 2&#8217;-O-methylation of ribosomal and small nuclear RNA. However, a large number of snoRNA in higher eukaryotes may promiscuously recognize other RNA species and 2&#8217;-O-methylate multiple targets. Here, we provide step-by-step guide for the fast and non-expensive analysis of the site-specific 2&#8217;-O-methylation using a well-established method employing short DNA oligonucleotides called DNAzymes. These DNA fragments contain catalytic sequences which cleave RNA at specific consensus positions, as well as variable homology arms directing DNAzyme to its RNA targets. DNAzyme activity is inhibited by 2-&#8217;O-methylation of the nucleotide adjacent to the cleavage site in the RNA. Thus, DNAzymes, limited only by the consensus of the cleaved sequence, are perfect tools for the quick analysis of snoRNA-mediated RNA 2&#8217;-O-methylation. We analyzed snoRNA snR13- and snR47-guided 2&#8217;-O-methylation of 25S ribosomal RNA in Saccharomyces cerevisiae to demonstrate the simplicity of the technique and to provide a detailed protocol for the DNAzyme-dependent assay.

Here we present a protocol for DNAzyme-dependent cleavage of RNA. This enables fast and site-dependent analysis of RNA 2&#8217;-O-methylation. This approach can be used for the preliminary or major assessment of snoRNA activity.

RRNA 2'-O-Metilasyonun DNAzyme bağımlı analizi

Guide box C/D small nucleolar RNAs (snoRNAs) catalyze 2&#8217;-O-methylation of ribosomal and small nuclear RNA. However, a large number of snoRNA in ...

Gelişim Biyolojisi

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1&#961; Relaxation Dispersion Experiments of RNA

RNA is a highly flexible biomolecule, wherein changes in structures play crucial roles in the functions that RNA molecules execute as cellular messengers and modulators. While these dynamic states remain hidden to most structural methods, R1&#961; relaxation dispersion (RD) spectroscopy allows the study of conformational dynamics in the micro- to millisecond regime at atomic resolution. The use of 1H as the observed nucleus further expands the time regime covered and gives direct access to hydrogen bonds and base pairing.
The challenging steps in such a study are high-purity and high-yield sample preparation, potentially 13C- and 15N-labeled, as well as setup of experiments and fitting of data to extract population, exchange rate, and secondary structure of the previously invisible state. This protocol provides crucial hands-on steps in sample preparation to ensure the preparation of a suitable RNA sample and setup of 1H R1&#961; experiments with both isotopically labeled and unlabeled RNA samples.

We present a protocol to measure micro- to millisecond dynamics on 13C/15N-labeled and unlabeled RNA with 1H R1&#961; relaxation dispersion nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. The focus of this protocol lies in high-purity sample preparation and setup of NMR experiments.

RNA'nın 1 H R1φ Gevşeme Dispersiyon Deneylerinin Numune Hazırlama ve Kurulumunun Pratik Yönleri

RNA is a highly flexible biomolecule, wherein changes in structures play crucial roles in the functions that RNA molecules execute as cellular messengers ...

Biyokimya

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be produced to contain any desired DNA or RNA sequence and can be prepared to include a wide variety of base and sugar modifications. Moreover, oligos can be designed to mimic specific nucleic acid alterations and thus, can serve as important tools to investigate effects of DNA damage and mechanisms of repair. We found that Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos with a length between 50 and 80 nucleotides can be particularly suitable to study, in vivo, functions and consequences of chromosomal RNA/DNA hybrids and of ribonucleotides embedded into DNA. RNA/DNA hybrids can readily form during DNA replication, repair and transcription, however, very little is known about the stability of RNA/DNA hybrids in cells and to which extent these hybrids can affect the genetic integrity of cells. RNA-containing oligos, therefore, represent a perfect vector to introduce ribonucleotides into chromosomal DNA and generate RNA/DNA hybrids of chosen length and base composition. Here we present the protocol for the incorporation of ribonucleotides into the genome of the eukaryotic model system yeast /Saccharomyces cerevisiae/. Yet, our lab has utilized Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos to generate RNA/DNA hybrids at the chromosomal level in different cell systems, from bacteria to human cells.

This work shows how to form an RNA/DNA hybrid at the chromosomal level and reveal transfer of genetic information from RNA to genomic DNA in yeast cells.

Bir 2'-amino asit içeren RNA Oligomerlerinin Katı Faz Sentezi Protokolü

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Nükleosid trifosfatlar - sentezinden Biyokimyasal Karakterizasyonu için

Çift iplikçikli RNA'ların tek iplikçikli RNA'ların tarafından üzerinde fingerprinting ve seçici tanınması, kimyasal olarak peptit nükleik asitler modifiye

Bir roman doygunluk Mutagenesis yaklaşım: Tek adım karakterizasyonu düzenleyici protein RNA Phosphorothioates kullanarak siteleri bağlama

İn vitro ve hücre içi şeklinde küçük molekül araştırmak için kullanarak Pre-mRNA yapısal değişiklikler indüklenen

Diseksiyon eş transkripsiyon RNA Işleme etkinlikleri için suni RNA polimeraz II uzama kompleksler

2D-HELS MS Seq: Farklı Nükleotid Modifikasyonlarına Sahip RNA Karışımlarının Doğrudan ve de novo Dizilimi için Genel LC-MS Tabanlı Bir Yöntem

2D-HELS MS Seq: Farklı Nükleotid Modifikasyonlarına Sahip RNA Karışımlarının Doğrudan ve de novo Dizilimi için Genel LC-MS Tabanlı Bir Yöntem

RRNA 2'-O-Metilasyonun DNAzyme bağımlı analizi

RNA'nın 1 H R_1φ Gevşeme Dispersiyon Deneylerinin Numune Hazırlama ve Kurulumunun Pratik Yönleri

RNA içeren Oligonükleotidler kullanarak Dönüşüm Genomik DNA, RNA / DNA Hibritlerin Üretimi