DNAzyme bağımlı sindirim snoRNA fonksiyonları çalışma için yararlı bir yöntemdir. Bu siteye özgü RNA metilasyon analiz etmek için hızlı ve basit bir yöntemdir. Herhangi bir moleküler biyoloji laboratuvarında bulunan kısa bir DNA oligonükleotid ve temel reaktifler gerektirir.
İlgi sırası için DNAzyme tasarlayarak başlayın. Uygun bir veritabanı kullanarak RNA dizisini veya putatif metilasyon alanını bulun. S.cerevisiae snoRNA hedefleri için maya snoRNA veritabanını kullanın.
Örneğin, snR13'e bağımlı bir site olan bir metilasyon bölgesi bulmak için snR13'ü seçin ve değiştirilmiş nükleotitin konumunu not edin. Saccharomyces Genom Veritabanı gibi uygun bir veritabanını kullanarak değiştirilmiş nükleotitin yukarı ve aşağı akışını bulun. Hedef gen adını arayın.
10 ila 23 DNAzyme titreti kullanıyorsanız, metilasyon alanının yukarı ve aşağı akışında 10 ila 15 nükleotit seçin. 8-17 DNAzyme kullanıyorsanız, 20 nükleotit seçin. Beş-prime ve üç-prime kolların tamamlayıcı dizileri oluşturun ve üç-asal ve beş-prime uçları üzerinde DNAzyme katalitik dizi yan kullanabilirsiniz.
DNAzyme'yi normal bir DNA oligonükleotid olarak sipariş et. Uygun bir ortam ve koşullarda ilgi maya suşları büyümek. Hücreler orta üstel faza ulaştığında, 1,000 kez g olarak santrifüj ederek dört santigrat derecede üç dakika pelet ve orta atın.
El yazması talimatlara göre RNA izolasyonu ile devam edin. Daha sonra, RNa peletini 30 mikrolitre RNase ve DNase içermeyen suda yeniden askıya alın. Tüpü buza yerleştirin ve RNA konsantrasyonu bir mikrospektrofotometre üzerinde ölçün.
10-23 DNAzyme kullanarak DNAzyme sindirim gerçekleştirmek için, RNA beş mikrogram ile bir kuluçka karışımı hazırlamak, 10 ila 23 DNAzyme 200 pikomoles, ve 1-X 10-23 kuluçka tampon 10 mikrolitre toplam hacmi. Daha sonra, kuru bir ısı bloğu üzerinde tüpler kuluçka ya da 95 derece santigrat üç dakika ayarlayın. Hemen sonra, buz tüpleri yerleştirin ve beş dakika orada bırakın.
Kısaca tüpleraşağı spin ve buz onları geri koyun. 20 ünite RNase inhibitörü ekleyin ve tüpleri 10 dakika boyunca 25 dereceye ayarlanmış kuru bir ısı bloğuna yerleştirin. Bu arada, dört-X 10 ila 23 reaksiyon tampon beş mikrolitre birleştirerek bir reaksiyon karışımı hazırlamak 300-molar magnezyum klorür ve bir mikrolitre su dört mikrolitre ile.
Bu reaksiyon karışımını 37 dereceye ayarlanmış kuru bir ısı bloğunda önceden ısıtın. 37 derece lik kuru ısı bloğuna kuluçka karışımı ile tüp yerleştirin ve önceden ısıtılmış reaksiyon karışımı 10 mikrolitre ekleyin. Karışımı 37 derecede bir saat kuluçkaya yatırın ve sonra tüpü buza yerleştirin.
8-17 DNAzyme kullanarak DNAzyme sindirim gerçekleştirmek için, altı mikrolitre toplam hacminde RNA beş mikrogram ile 1.5 mililitrelik bir mikrotüp hazırlamak. Sonra, 8-17 DNAzyme 400 picomoles ile ayrı bir tüp hazırlamak. Çalışırken, buz üzerinde her iki tüp tutun.
Her iki tüpü de 95 santigrat dereceye ayarlanmış kuru bir ısı bloğuna aktarın ve iki dakika kuluçkaya yatırın. RNA örneğini buzüzerinde geri hareket ettirin ve DNAzyme ile tüpü beş saniye boyunca aşağı doğru döndürün. DNAzyme'yi 25 derecede 10 dakika kuluçkaya yatırın.
DNAzyme kuluçka iken, iki-X 8-17 reaksiyon tampon 10 mircolitre hazırlamak ve 25 santigrat dereceye prewarm. DNAzyme ile tüpe önceden ısınmış tampon ekleyin ve sonra, RNA ile tüp için bu reaksiyon karışımı 14 mikrolitre aktarın, rna inhibitörü 20 birimleri ile birlikte. Reaksiyonu 25 derecede iki saat kuluçkaya yatırın ve sonra tüpü buza yerleştirin.
DNAzyme sindiriminden sonra RNA'yı arındırmak için reaksiyon tüpüne 350 mikrolitre su ve 400 mikrolitre kloroform ekleyin. Girdap 30 saniye ve santrifüj 20, 000 kez g beş dakika için. Santrifüjden sonra üst fazı bir mililitre etanol, 40 mikrolitre 7,5 molar amonyum asetat ve bir mikrolitre glikojen içeren yeni bir tüpe aktarın.
Tüpü birkaç kez karıştırıp iki saat boyunca negatif 80 santigrat derecede veya bir gecede negatif 20 santigrat derecede tüpe çevirin. El yazması talimatlara göre RNA arınma ile devam edin ve daha sonra 10 mikrolitre RNase ve DNase içermeyen su da RNA pelet yeniden askıya alın. Arınma hemen sonra buz üzerinde RNA tüp yerleştirin.
RNA elektroforezi gerçekleştirmek için, 127,5 mililitre çift distile su da 127,5 mililitre agarose 1.5 gram eriterek mikrodalga karışımı ısıtarak başlar. Daha sonra agarose çözeltisine 15 mililitre 10X MOPS ve 7,5 mililitre %37 formaldehit ekleyin. Agarose çözeltisine uygun miktarda jel lekesi ekleyin.
Tepsiye agarose dökün ve 45 dakika soğumaya bırakın. Sindirilmiş ve saflaştırılmış RNA'nın 10 mikrolitresini, numune denatüre tamponu beş mikrolitre ve 0,5 mikrolitre altı X yükleme boyası ile birleştirerek RNA örneklerini hazırlayın. Örnekleri 70 derecede 5 dakika kuluçkaya yatırın ve sonra 5 dakika buzda.
Hazırlanan jeli elektroforez tankına koyun ve tankı tek X MOPS tamponu ile doldurun. Numunenin 15 mikrolitresinin tamamını jel üzerine yükleyin ve bromothymol mavisi jel uzunluğunun 2/3'üne ulaşana kadar jeli 80 voltta çalıştırın. Uygun görüntüleyici ile jel analiz edin.
Bu tekniğin değeri indüklenebilir bir snoRNA transkripsiyon sisteminde gösterilebilir. SnR13 veya snR47 genlerinin indükleyici gal1 promotörü ne eklenmesi, 25S ribozomal RNA'nın snoRNA'ya bağımlı metilasyonunun analizini sağlar. Hücreler galaktoz da büyüdüğünde, 25S ribozomal RNA snoRNA güdümlü bölgelerde metillenir ve DNAzyme tedavisinden sonra bozulmadan kalır.
Buna karşılık, snoRNA ekspresyonu galaktoz eksikliği nedeniyle kapatıldığında, DNAzyme bağımlı dekolte oluşur. Ayrıca, snoRNA ekspresyonu galaktoz bağımsız olduğundan, vahşi tip kontrollerde RNA sindirimi gözlenmez. RRNA modifikasyonlarımızın analizinde DNAzyme bağımlı dekolteaktivitesi son zamanlarda snoRNA olgunlaşması bağlamında gösterilmiştir.
DNAzyme bağımlı dosdoğru beş asal ve pre-snoRNA işleme eksikliği Saccharomyces cerevisiae 25S ve 18S rRNA metilasyon düzeylerini etkilediğini göstermek için kullanılmıştır. Bu protokol, toksik olan fenol ve kloroform un kullanılmasını ve duman kaputunun altında ele alınmasını gerektirir.
