Burada, Pol II transkripsiyon ve RNA kapama fonksiyonel kaplin araştırmak için uygun aktif Pol II uzama kompleksleri yeniden anayasa sağlayan basit bir deneysel sistem kurduk. Bu yöntemle, fonksiyonel uzama kompleksleri sadece birkaç bileşenle kolayca monte edilebilir. Uzama kompleksleri manyetik boncuklar üzerinde hareketsiz hale getirilmiştir, bu yüzden reaksiyon koşullarını değiştirmek kolaydır.
Manyetik boncuklar üzerinde biotin içeren DNA oligohareketsiz için, ilk düşük protein bağlayıcı 1.5 mililitretüp için manyetik boncuk 200 mikrolitre ekleyin, ve sonra iki dakika boyunca bir manyetik raf üzerinde tüp yerleştirin. Tüp manyetik rafta yken, boncukları rahatsız etmeden sıvıyı tüpten çıkarmak için bir pipet kullanın. Boncukları yıkamak için tüpü raftan çıkarın ve Tris-hidroklorür, EDTA ve sodyum klorür içeren bir mililitre yıkama tamponu ekleyin.
Tüpü rafa geri ver. İki dakika sonra, yıkama çözeltisini çıkarın ve aynı tamponun 200 mikrolitresini kullanarak yıkamaları iki kez daha tekrarlayın. 2X tampon 400 mikrolitre manyetik boncuklar resuspend.
Sonra, karıştırmak için 380 mikrolitre su ve 10 mikromolar olmayan şablon biyotinylated DNA oligo 20 mikrolitre ekleyin. Bir nutator üzerine tüp yerleştirin ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçka. Bundan sonra, immobilize olmayan şablon olmayan DNA oligo ile üç kez tampon 200 mikrolitre ve daha sonra depolama ve seyreltme tampon 200 mikrolitre ile üç kez boncukyı yıkayın.
BSA ile boncuk engelleme bitirmek için bir gecede dört derece santigrat tüp saklayın. Ertesi gün, çözeltiyi atın, 200 mikrolitre depolama ve seyreltme tamponundaki boncukları yeniden askıya alın, yaklaşık beş mikromos DNA konsantrasyonuna ulaşın ve sonra da boncuklarla birlikte çözeltiyi yeni bir tüpe aktarın. DNA-RNA dubleksini elde etmek için, yazılı protokolde açıklandığı gibi, bir PCR tüpünde iki-bir RNA-DNA molar oranına sahip 10 mikrolitrelik bir karıştırma karışımı hazırlayın.
Tüpü termal bir döngüye yerleştirin. Programı beş dakika boyunca 45 dereceye ayarlayın, ardından her biri 12 devir iki dakika, 43 santigrat dereceden başlayıp sıcaklığı döngü başına iki derece düşürün. Son olarak, dört santigrat derecede boşta tutun.
Saflaştırılmış RNA polimeraz II'yi DNA-RNA hibridine yüklemek için, bir tüpte 13 mikrolitre yeni hazırlanmış polimeraz II tamponu ile bir mikrolitre DNA-RNA dubleksini karıştırın. Saflaştırılmış RNA polimeraz II bir mikrolitre ekleyin ve yavaşça yukarı ve aşağı boru lama ve pipet ucu ile karıştırarak karıştırın, kabarcıklar tanıtmadan. Tüpü 10 dakika 30 derecede kuluçkaya yatırın.
Uzama kompleksini tamamlamak için, şablonsuz DNA tamponunun 14 mikrolitresine bir mikrolitre hareketsiz DNA oligo boncuk ekleyin, 15 mikrolitrelik karışımı daha önce kuluçkaya yatan tüpe ekleyin ve 37 santigrat derecede 10 dakika daha kuluçkaya yatırın. Numuneyi iki dakika boyunca manyetik rafa yerleştirin. Dahil edilmemiş polimeraz II ve oligoları temizlemek için numuneyi 30 mikrolitre yıkama tamponuyla bir kez yıkayın.
RNA 23mers ile uzama kompleksleri radiolabel için, pulse tampon 23 mikrolitre için ATP ve radyoetiketli UTP bir mikrolitre bir mikrolitre ekleyin ve bu karışımı yıkanmış manyetik boncuklar için yeniden askıya almak için ekleyin. Radiolabeled 23mers sentezini sağlamak için 10 dakika boyunca reaksiyon kuluçka. 100 mikromolar ATP ve 100 mikromolar UTP karışımı içeren çözeltinin 1,5 mikrolitresini 3,5 mikrolitre kovalamaca tamponuna ekleyin ve karışımı boncuklar üzerinde önceden monte edilmiş uzama kompleksleri içeren tüpe ekleyin.
Yine, 23mers içine tüm doğmakta olan transkript kovalamak için beş dakika boyunca tüp kuluçka. Daha sonra tüpü manyetik rafa yerleştirin ve daha önce anonimleri çıkarmak için yapıldığı gibi yıkayın. 30 mikrolitre yıkama tamponu yla numuneyi yeniden askıya alın.
Daha uzun transkriptlerle uzama kompleksleri oluşturmak için önceki yordamları izleyin ve dört reaksiyon için 120 mikrolitre yıkanmış uzama kompleksi oluşturmak için dört kat büyütün. Etiket üç yeni tüpler 23mer, 25mer ve 29mer. 23mer tüpüne yıkanmış uzama komplekslerinin 30 mikrolitresini aktarın ve proteinaz K ve glikojen içeren 94 mikrolitre stop karışımı ekleyin.
Yıkanmış uzama komplekslerinin kalan 90 mikrolitresini içeren tüpü iki dakika boyunca manyetik rafa yerleştirin, süpernatantı çıkarın ve 1,2 mikrolitre ATP ve CTP ile desteklenen BTB'nin 90 mikrolitresindeki boncukları yeniden askıya alın. 30 derecede 10 dakika kuluçkaya yat. 90 mikrolitre yıkama tamponu yla yıkadıktan sonra, 30 mikrolitre uzama kompleksini 25mer tüpüne aktarın ve Proteinase K ve glikojen içeren 94 mikrolitre stop karışımı ekleyin.
Yine, uzama komplekslerinin kalan 60 mikrolitresini içeren tüpü iki dakika boyunca manyetik rafa yerleştirin. 0,8 mikrolitre ATP ve CTP ile takviye edilmiş 60 mikrolitre tampon ile BTB tedavisini tekrarlayın. Daha önce olduğu gibi kuluçka ve yıkama sonra, yıkama tampon 60 mikrolitre içinde örnek resuspend.
Örnekten 29mer tüpüne 30 mikrolitre aktarın ve proteinaz K ve glikojen içeren 94 mikrolitre stop karışımı ekleyin. Bir denaturing poliakrilamid jel üzerinde reaksiyon ürünleri analiz. İlk olarak, 12 reaksiyonlar ve bir ekstra için 390 mikrolitre elde etmek için daha önce açıklanan prosedürü 13 kat ölçeklendirme tarafından 23mers içeren yıkanmış uzama kompleksleri oluşturun.
Polimeraz II CTD fosforilasyon gerçekleştirmek için, manyetik raf ait örnek yerleştirdikten sonra supernatant çıkarın ve BTB 377 mikrolitre boncuk resuspend. Etiket iki yeni tüpler artı H ve eksi H.To artı H, transkripsiyon inisiyasyon faktörü TFIIH mikrolitre başına 300 nanogram konsantrasyonunda üç mikrolitre ekleyin ve eksi H, depolama ve seyreltme tampon dokuz mikrolitre ekleyin. Artı H tüpüne yıkanmış uzama komplekslerinden 87 mikrolitre ve eksi H tüpüne 261 mikrolitre ekleyin.
Tüpleri 10 dakika kuluçkaya yatırın ve yıkama tamponuile yıkayın. RNA kapama gerçekleştirmek için, artı H tüpüne 87 mikrolitre kapama karışımı ve eksi H tüpüne 261 mikrolitre ekleyin. Etiket dört yeni tüpler, beş artı H, beş eksi H, 15 eksi H, ve 45 eksi H, ve ilgili tüpler içine mikrolitre kapama enzim başına beş, 15 veya 45 nanogram üç mikrolitre dağıtmak.
Daha sonra, stop tampon 94 mikrolitre ile 12 yeni tüpler hazırlayın. Bir ısı bloğunda 30 santigrat derecede beş artı H.Incubate etiketli tüpe TFIIH ile işlenmiş 87 mikrolitre uzama kompleksini ekleyerek ilk kapama reaksiyonunu başlatın. Kapama reaksiyonları tam olarak bir kronometre kullanılarak zamanlanmış olması gerekir.
Birden fazla reaksiyonla çalışırken, her reaksiyonun başlangıç süreleri şaşırtıcı olmalıdır. Bir, iki veya dört dakika sonra, reaksiyonları durdurmak için bir, iki ve üç 94 mikrolitre stop tampon içeren tüplere beş artı reaksiyon karışımı 30 mikrolitre aktarın. TFIIH olmadan tedavi edilen uzama komplekslerini kullanarak, kalan eksi H tüplerinde bulunan numuneler için kapama reaksiyonlarına tam olarak aynı şekilde devam edin.
Bir denaturing poliakrilamid jel üzerinde reaksiyon ürünleri analiz. Yapay uzama komplekslerinde DNA ve RNA molekülleri için burada bir diyagram gösterilmiştir. Yapay uzama komplekslerinin montajı sırasında 20 nükleotitin sentetik RNA oligosu Kullanılarak, protokolün her ardışık yürüyüş adımında 23mer, 25 mer ve 29 mer oluşturmak için nükleotitler eklendi.
Farklı kaynaklardan RNA polimeraz II kullanılarak reaksiyonlar karşılaştırıldı. Yapay uzama kompleksleri endojen, yabani tip polimeraz II fare karaciğeri veya fizyon mayası saf ve 23mers veya 25mers oluşturmak için yürüdü monte edildi. Beş prime trifosfat ucu ile 23 nükleotit transkript içeren yapay uzama kompleksleri ile ilişkili radyoetiketli transkript kapama ölçmek için bir tofma yapıldı.
Son iki şerit, uzama komplekslerinin TFIIH varlığında enzimle veya kapamaolmadan kuluçkaya yatırıldığı reaksiyonların ürünlerini göstermektedir. Daha yavaş ve daha hızlı göç eden bantlar sırasıyla kapaklı ve kapaksız transkriptler içerir. İlk 12 şeritte uzama kompleksleri ile ilişkili transkriptlerin fosforiveya fosforilasyonsuz CTD ile kapama göstermesi.
Polimeraz II ve diğer enzimlerin aktiviteleri hazırlıktan hazırlıklara kadar değişebilir, bu nedenle enzim konsantrasyonlarını titrating ederek optimal seviyeleri tanımlamak için reaksiyon koşullarını optimize etmek gereklidir. Radyoaktif maddeyi güvenli bir şekilde kullanmak ve kontaminasyonu önlemek önemlidir. Lütfen radyoaktivite ile deneyler yaparken laboratuvar ve enstitü yönergelerinize uyduğunuzdan emin olun.
