Bizim laboratuar araştırmaları NIH İntramural Araştırma Programı, Ulusal Alkol İstismarı ve Alkolizm Enstitüsü tarafından desteklenmektedir.

<html> I. enjeksiyon için hazırlanması Bu bölümde cDNA nöron çekirdeği içine enjekte önce alınması gereken hazırlık adımları açıklar. Nöronlar için izolasyon prosedürü, bu makalenin kapsamı dışındadır, ancak, bireysel hücrelerine ayrı nöron var ve (bunu elde etmek için yararlı ipuçları için tartışma bakınız), 35 mm, hücre kültürü yemekleri alt yüzeyi iyice yapışmış önemlidir. Farklı nöronların çeşitli potansiyel olabilir rağmen rahatlıkla erişilebilir ve çok sayıda nöron verim, çünkü üstün servikal ganglion (SCG) veya dorsal kök gangliyon gibi periferik ganglionlar diseksiyonu için tercih edilir. SCG nöronlar kullanarak ek avantajlar hücrelerinin görece homojen bir nüfus olduğunu ve 1,2,3,4 iyi karakterize . A. hazırlanması, enjeksiyon için cDNA plazmid <ol><li> Kontaminasyon veya DNA dökümünü önlemek için, hazırlanması sırasında eldiven giyilmelidir. </li><li> Ilgi protein kodlayan DNA yapısal olarak aktif ve son derece sitomegalovirüs (CMV) organizatörü düzenleme altında PCI (Promega, Madison, WI) gibi uygun bir memeli ekspresyon vektörü, subcloned. Protein etiketli değilse, plazmid bir muhabir, örneğin kodlama EGFP (pEGFP-N1, BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA), başarılı bir enjeksiyon ve ifade onaylamak için ortak enjekte edilir. DNA parçacık kaldırmak için bir PVDF filtresi (0.1 mikron, Millipore, Bedford, MA) ile santrifüj bir filtre ünitesi kullanarak yüksek kaliteli ayırma sütun (örneğin QIAfilter Midi-prep kiti, Qiagen, Chatsworth, CA) ve daha arıtılmış kullanılarak izole edilmiştir plazmid hazırlanması, enjeksiyon işlemi sırasında enjeksiyon pipetleri engelleyebilir. Plazmidler yaklaşık 1 mg / ml konsantrasyonda uygun bir DNA saklama tamponu (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0, örneğin TE tamponu) -20 ° C&#39;de saklanır. </li><li> Mikroenjeksiyon için hemen önce, plazmid cDNAs TE tampon ya da H 2 O. istenen nihai konsantrasyonu seyreltilir ve karıştırılır Tipik olarak, 5-10 ng / ul muhabir gen enjekte edilen hücrelerin etiketlemek için yeterli ve DNA yüksek konsantrasyonlarda az viskoz ve enjeksiyon pipetleri yapışmasına neden olabilir enjekte edilecek cDNA toplam konsantrasyonu 200 ng / ml geçmemelidir. Enjeksiyon için cDNA küçük hacimli (5-10 ul) Parafilm (kağıt desteğini altında yan) küçük bir parça temiz bir yüzey üzerine çözüm karıştırma damla tarafından hazırlanmıştır. Pipetor ile birkaç kez yukarı ve aşağı pipeting birlikte çözüm damla karıştırın ve karıştırma sırasında hava kabarcıkları almaktan kaçınması. </li><li> Microloader pipetlemeyin ucu (Eppendorf, Brinkmann Instruments, Westbury, NY) kullanarak, özel olarak hazırlanmış bir hematokrit tüpü (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) cDNA çözüm aktarın. Hematokrit tüpleri (Malzeme Tablo) hazırlanması ile ilgili talimatlar için malzemeler bölümüne bakın. Hematokrit tüpü, tüpe 1,5 ml mikrosantrifüj cDNA enjeksiyon solüsyonu içeren yerleştirin. </li><li> Oda sıcaklığında (20-24 ° C) tortu parçacıklara cDNA çözüm blok olabilir, 15-30 dakika süreyle sabit bir açı ya da sallanan bir kova rotor (Eppendorf) ile donatılmış bir mikrosantrifüj 10 000 g tüp Santrifüj mikroenjeksiyon pipetlemeyin. CDNA enjeksiyon çözüm enjeksiyon oturumu sırasında, oda sıcaklığında muhafaza edilebilir. </li></ol> B. Fabrikasyon enjeksiyon pipetleri <ol><li> Tek kullanımlık cam mikroenjeksiyon pipetleri kolay ancak pahalı (mikroenjeksiyon pipetlemeyin başına 10 $), (Femtotips örneğin, Eppendorf) piyasada mevcuttur. Enjeksiyon pipetleri programlanabilir P-97 Brown pipetlemeyin çektirmenin Flaming (Sutter Instrument Company, Novato, CA) ve filamented, ince duvarlı borosilikat camdan kılcal tüpler (Dünya Hassas Aletler, Sarasota, FL) kullanarak laboratuvarda imal edilebilir. Bu seçenek, daha maliyet-etkin ve mikroenjeksiyon pipetlemeyin şekil ve boyut kontrolü sağlar. </li><li> Iki aşamalı bir program dar mikroenjeksiyon pipetlemeyin ipuçları çekmek için kullanılır. Mikroenjeksiyon pipetleri açılışında bir ışık mikroskop altında incelemek için çok dar olduğundan, enjeksiyon pipetleri kalitesini program ayarları kesinleşir önce birkaç hücre enjekte edilerek doğrudan değerlendirmek gerekmektedir. Aşağıda, ısı, çekme, hız ve zaman ayarları için yaklaşık ayarlar şunlardır: (çekme 1) 600, 115, 15, 250; (çekme 2) 640, 130, 65, 200. Bu ayarlar farklı toplu cam ve ısıtma filament çektirmenin durumu değişir ve gerektiği şekilde ayarlanması gerekir. Daha fazla ayrıntı için 5&#39;e bakınız. </li><li> Enjeksiyon oturumu sırasında hasar veya sorunlar durumunda, enjekte edilecek, nöron çanak başına birkaç (2-5) enjeksiyon pipetleri çekin. Mağaza enjeksiyon, toz mikroenjeksiyon pipetlemeyin ucu girmesini önlemek için kapalı bir kapta pipetleri. </li></ol> II. Intranükleer mikroenjeksiyon çadır &quot;&gt; Bu bölümde ayrıntıları cDNA nöron çekirdek içine enjekte sürecinin temel bir mikroenjeksiyon set-up işlemini görselleştirmek için bir ters faz-kontrast mikroskobu (örneğin Nikon Diaphot TMD, Nikon, Melville, NY), mikromanipülatör (örn. pipetlemeyin cDNA çözüm sınırdışı enjeksiyon pipetlemeyin hareket ve enjektör (örneğin Eppendorf FemtoJet Express) bir basınç kontrol etmek için Eppendorf 5171). mikromanipülatör basıncı enjektör bağlanması enjeksiyonlar sırasında son iki süreçlerin senkronizasyon sağlar. isteğe bağlı, ancak şiddetle tavsiye bağlanmış bir video izleme sistemi (CCD kamera, Cohu Inc, San Diego, CA, siyah ve beyaz video monitör, Sony Corporation, Tokyo, Japonya), bileşenler içerir. Bu sistem, enjeksiyon için mutlak bir gereklilik değildir; Ancak, siyah ve beyaz monitör, hücre çekirdeğinin gelişmiş görselleştirme için yüksek kontrast sunar ve uzun enjeksiyon oturumları sırasında daha rahat bir izleme deneyimi sunuyor. Buna ek olarak, elde tutulan bir kontrol ünitesi çalışması için yazılımı çalıştıran bir dizüstü bilgisayar yarı-yararlanılabilir (Detaylar için tartışılması bakınız) enjeksiyon işlemi otomatikleştirmek. SCG nöronlar enjekte etmek için ideal zaman 3-6 saat sonrası disosiasyon. Bu aşamada, hücreleri yemeğin altına sıkıca bağlı ve çekirdeği, tek veya birden çok nükleol (Şekil içeren karanlık bir membran ile merkezi bir yuvarlak organel olarak, faz-kontrast mikroskop altında, açıkça görülebilir, küresel 1A). <ol><li> Ayrışmış nöronlar mikroskop sahne ortasına bir tabak koyun. Odağı ayarlayın ve faz kontrast mikroskop optik optimize nöronların çekirdekleri açıkça görülebilir. </li><li> Microloader pipetlemeyin ucu kullanarak mikroenjeksiyon pipetlemeyin içine hazırlanmış cDNA çözüm pipetleyin 2 ul. Bu santrifüj sırasında yerleşen parçacık kadar karıştırın beri hematokrit tüpünün alt kısmına yakın çözüm çizim kaçının. Mikroenjeksiyon pipetleri filament ucu çözüm çizim yardım, ancak küçük hava kabarcıkları devam ederse, onları hafifçe çıkarmak için cam yan fiske olmalıdır. </li><li> Kapiller basıncı enjektör tutucu içine mikroenjeksiyon pipetlemeyin takın ve ardından mikromanipülatör sahibinin güvenli. 45 ° açıyla sahibinin sabittir. </li><li> Çanak içine mikroenjeksiyon pipetlemeyin indirin. Pipetlemeyin kültür ortamı girerken, menisküs ışığın kırılma etkiler ve nöronlar görüntü kalitesini düşürür oluşur. Bu sorunu hafifletmek için, nöronların çekirdekleri daha net bir şekilde görülebiliyor kadar faz halka taret biraz mahsup edilebilir. </li><li> Bazı basınçlı enjeksiyon sistemleri, kısa bir süre için mikroenjeksiyon pipetlemeyin ucundan maksimum hava basıncı uygulayan bir &quot;temiz&quot; fonksiyonu var. Ucu tıkanmış görünüyor başlamadan önce ve enjeksiyon sırasında enkaz pipetlemeyin temizlemek için bu işlevi kullanın. Bu işlevi kullanırken effect sıvı ekranda görünmüyorsa, yeni bir enjeksiyon pipetlemeyin ile değiştirin. </li><li> Merkezi mikroenjeksiyon görüntüleme monitör pipetlemeyin ve nöron bir yanında ve nükleolus aynı odak düzlemli ucu hizalamak. Bu pozisyonda mikromanipülatör z-ekseni alt limit olarak ayarlayın. Bu pozisyon, mikroenjeksiyon pipetlemeyin enjeksiyonlar sırasında önceden derinliği. Şimdi bu noktada üzerinde yaklaşık 30 mikron ucu mikroenjeksiyon pipetlemeyin nöron üst temizler böylece yerleştirin. </li><li> Intranükleer enjeksiyonları gerçekleştirmek için aşağıdaki ayarları ile tanımlanan bir Eppendorf 5171 mikromanipülatör &quot;enjekte&quot; modunda olabilir. Enjekte fonksiyonu ayarlandığında, Impale fonksiyonu kapalı iken. Çapraz enjeksiyon yolu (x-ve z-ekseni boyunca) hücre hasarı en az üretir ve böylece eksenel mod enjeksiyonlar için kullanılmalıdır. 300 mm / sn &#39;lik bir enjeksiyon hızı yeterli ve mikroenjeksiyon pipetlemeyin z-ekseni sınırı set ulaştığında basınç birikmesini senkronize. </li><li> Basıncı enjektör çekirdeğin içine enjekte cDNA çözüm miktarını kontrol eder. &quot;Otomatik&quot; enjeksiyon modunda, DNA teslim süresi kontrollü ve bağlı mikromanipülatör tarafından başlatılan. Enjeksiyon basıncı (Pi) 100 ila 200 hectopascals (1 inç ~ 0.015 psi hPa) arasında ayarlanabilir olmalıdır yüksek enjeksiyon basınçları enjeksiyon başarı oranları veya kalitesini artırmak ve mikroenjeksiyon pipetlemeyin ucu boyutu veya DNA saflık diğer sorunlara işaret edebilir . Bir enjeksiyon süresi 0.3 sn (ti) ve 30 hPa, parçacıklar kapatılmasıy kültür ortamı pipetlemeyin ucu içine girişini önlemek için sabit bir pozitif basınç sağlayan bir tazminat basıncı (Adet) kullanılmalıdır. </li><li> Mikroenjeksiyon pipetlemeyin ucu xy eksen sahne kumanda kullanılarak mikroskop altında enjekte edilir nöron yerleştirin. T arasında ileri ve geri odaklanarak, merkezi çekirdeğin yukarıdaki pipetlemeyin ucu hizalayıno ucu ve nükleol. </li><li> Enjekte düğmesine (mikromanipülatör) basarak çekirdeği enjekte edilir. Enjeksiyon adım için, mikroenjeksiyon pipetlemeyin ve cDNA çözümün serbest hareket mikromanipülatör tarafından kontrol edilir. Göz başarılı intranükleer enjeksiyonları onaylamak için zordur, fakat nispeten düşük viskoziteli cDNA çözüm enjeksiyon (viskoz nükleer çevreye göre), genellikle faz-kontrast optik altında beyaz bir tüy gibi görünür ve enjeksiyon bir göstergesi olarak kullanılabilir çekirdeğin içine. Bazen mikroenjeksiyon pipetlemeyin nükleer membran nüfuz değildir ve sadece çekirdeğin titreşim. Aynı pozisyonda ikinci bir enjeksiyon denemesinde başarılı bir enjeksiyon çekirdeğin içine DNA yol açabilir. Hücre şişmesi genellikle kasıtsız sitoplazmik enjeksiyon göstergesidir. Ayrıca, önemli bir nükleer şişme nöronların hücre ölümü ve genellikle sonuçları kısa bir süre sonra tolere değildir, bu yüzden enjeksiyon basıncı ve süresi önerilen değerleri aşmamalıdır. </li><li> Mikroenjeksiyon pipetlemeyin altında bir sonraki nörona hizalamak için mikroskop aşamasında yeniden nöronlar enjekte devam edin. Sistematik, tabak nöron gece inkübasyon için inkübatör dönmeden önce yaklaşık 50-100 çekirdekleri enjekte çanak gezinmek. Başarıyla enjekte nöronlar muhabiri gen ekspresyonu tarafından ertesi gün tespit edilebilir. </li></ol> III. Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/1614/1614fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1: Superior servikal ganglion (SCG) nöronlar. Faz kontrastlı görüntü nöronlar SCG 3 saat sonrası disosiasyon (A). Bu aşamada, mikroenjeksiyon pipetlemeyin ucu uyumuna yardımcı olan çekirdeğin açıkça görülebilir. Çekirdeği, bir tek (sol) veya birden fazla (sağda) karanlık nükleol nöron merkezinde görünür. Çekirdeği (B) cDNA EGFP enjeksiyonu takiben 16 saat SCG nöronlar. Sol, faz-kontrast aydınlatma altında görüntülenen nöronlar SCG. Sağ, başarılı bir enjeksiyon gösteren ve bir nöron EGFP ifade sonuçlanan aynı nöron epifluorescent görüntü. Beyaz ölçek çubuğu 20 mm. <img src="/files/ftp_upload/1614/1614figure2tmb.jpg" alt="Şekil 2" border="0" /> Şekil 2: aracılığıyla akımların Tüm hücre kayıtları heterologously ifade G-protein, K + (GIRK) kanalları içsel nöronlar SCG giderilmesi birleştiğinde . GIRK akımları (I GIRK) -140 bir holding potansiyeli -60 mV 40 mV 200 ms gerilim rampası (A İçerlek) endojen α 2-adrenerjik norepinefrin tarafından aşağıdaki aktivasyon (KD, 10 mcM) tarafından uyarılmış . Süperempoze izleri önce (siyah) ve KD tek başına (mavi) veya NE uygulama artı 10 mM Ba 2 + (kırmızı) sonra aynı nöron kayıtları ve gösterir. Kesikli çizgiler sıfır akım düzeyini gösterir. Ben GIRK, harici bir çözüm (mM) 130 NaCl, 5.4 KCl, 10 Hepes, 10 CaCl 2, 0.8 MgCl 2, 15 glikoz, sakkaroz, 15 ve 0.0003 TTX NaOH ile pH 7.4 &#39;e ayarlanmış kayıt için . Dahili kayıt çözümü (mM) 135 KCl, 11 EGTA, 1 CaCl 2, 2 MgCl 2, 10 Hepes, 4 MgATP, ve KOH ile pH 7.2 &#39;ye ayarlanır 0,3 Na 2 GTP, içeriyordu. (A) akım eksikliği KD uninjected SCG nöronların varlığını gerilim rampası tarafından ortaya. Gösterir, bu SCG nöronların endojen GIRK kanalları ifade yoktur. Başarılı enjeksiyon plazmid cDNA kodlama fonksiyonel bir GIRK kanal 11 KD (B, sol) maruz kaldığında gerilim rampası sırasında büyük akımlara yol açmaktadır. : G-protein kenetli reseptör agonist (NE), içe düzeltme ve varsayılan GIRK kanal blokeri, Ba 2 + (B, sağ kırmızı iz) akımları blok tarafından aktive Akımlar GIRK kanallar aracılığıyla akımların tipik özellikler var. Açık ve dolu çevreler sırasıyla, holding ve pik akım GIRK temsil eder. Lütfen Şekil 2&#39;de büyük halini görmek için <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1614/1614figure2.jpg">buraya tıklayın</a> .

<ol>
	<li>Eccles, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+action+potential+of+the+superior+cervical+ganglion.">The action potential of the superior cervical ganglion.</a> J Physiol. 85, 179-206 (1935).</li><li>Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-dependent+modulation+of+N-type+calcium+channels+by+G-protein+&#x03B2;&#x03B3;+subunits.">Voltage-dependent modulation of N-type calcium channels by G-protein &#x03B2;&#x03B3; subunits.</a> Nature. 380, 255-258 (1996).</li><li>Schofield, G. G., Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+currents+of+acutely+isolated+adult+rat+superior+cervical+ganglion+neurons.">Potassium currents of acutely isolated adult rat superior cervical ganglion neurons.</a> Brain Res. 485, 205-214 (1989).</li><li>Schofield, G. G., Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+and+calcium+currents+of+acutely+isolated+adult+rat+superior+cervical+ganglion+neurons.">Sodium and calcium currents of acutely isolated adult rat superior cervical ganglion neurons.</a> Pflugers Arch. 411, 481-490 (1988).</li><li>Dean, D. A., Goldman, R. D., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4.">Chapter 4.</a> Live Cell Imaging: a Laboratory Manual. 1, 51-66 (2005).</li><li>Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+expression+of+receptors+and+signaling+proteins+in+adult+mammalian+sympathetic+neurons+by+microinjection.">Heterologous expression of receptors and signaling proteins in adult mammalian sympathetic neurons by microinjection.</a> Methods Mol Biol. 83, 191-202 (1997).</li><li>Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+G-protein+signaling+components+in+adult+mammalian+neurons+by+microinjection.">Expression of G-protein signaling components in adult mammalian neurons by microinjection.</a> Methods Mol Biol. 259, 167-181 (2004).</li><li>Ikeda, S. R., Jeong, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+RGS-insensitive+G&#x03B1;+subunits+to+study+endogenous+RGS+protein+action+on+G-protein+modulation+of+N-type+calcium+channels+in+sympathetic+neurons..">Use of RGS-insensitive G&#x03B1; subunits to study endogenous RGS protein action on G-protein modulation of N-type calcium channels in sympathetic neurons..</a> Methods Enzymol. 389, 170-189 (2004).</li><li>Washbourne, P., McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+gene+transfer+into+neurons.">Techniques for gene transfer into neurons.</a> Curr Opin Neurobiol. 12, 566-573 (2002).</li><li>Zhang, Y., Yu, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+microinjection+technology+in+cell+biology.">Single-cell microinjection technology in cell biology.</a> Bioessays. 30, 606-610 (2008).</li><li>Vivaudou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+G-protein+regulation+of+GIRK1+and+GIRK4,+the+two+subunits+of+the+KACh+channel,+using+functional+homomeric+mutants.">Probing the G-protein regulation of GIRK1 and GIRK4, the two subunits of the KACh channel, using functional homomeric mutants.</a> J Biol Chem. 272, 31553-31560 (1997).</li></ol>

Karşılaşılan ortak sorunları ve önerileri: Daha önce belirtildiği gibi, başarılı bir nükleer enjeksiyonlar doku kültürü plakaları yapışık hücrelere sahip bağlıdır. Enjeksiyon başlangıç ​​ertelemek hücre disosiasyon prosedürü izleyerek bir kaç saat nöronlar yemekleri alt yapışmasına yol açar. Buna ek olarak, 0.1 mg / ml &#39;lik yüksek molekül ağırlıklı poli-L-lisin (Sigma, St Louis, MO) yemekleri alt yüzeye nöronların yardımcıları yapışma kaplama yemekler. Yüksek konsantrasyonda DNA enjekte etmeye çalışırken özellikle mikroenjeksiyon pipetleri tıkanması, sık görülen bir sorun olabilir. Plazmid DNA izole etmek ve arındırmak için yüksek kaliteli ayırma kolonları kullanarak ve (spin filtreler, hematokrit tüpler iplik) belirtilen ek saflaştırma adımları gerçekleştirmeden önce enjekte parçacık kaldırmak için yardımcı olabilir. Enjeksiyonlar sırasında, basınç enjektör &quot;temiz&quot; fonksiyonu (0.2 s için yeterli) olabilir, ancak bu sorunu çözmezse, yeni bir enjeksiyon pipetlemeyin kullanılmalıdır. Mikroenjeksiyon pipetleri çoğunluğu bir enjeksiyon oturumu sırasında tıkanmış hale gelirse, daha büyük bir açılış ile mikroenjeksiyon pipetlemeyin ipuçları üretmek için damlalıklı cam çektirmenin ayarlarını değiştirerek düşünün. Nükleer enjeksiyonlar sırasında ortaya çıkan diğer bir konu, doku kültürü yemekleri alt yüzeyi eşitsizliği. Bu değişkenliği doğrudan derinlik beri enjeksiyonlar sırasında pipetlemeyin traversler sabit çekirdeğine enjeksiyon pipetlemeyin ipuçları hedefleme doğruluğunu etkiler. Bu nedenle, bu z-ekseni sınırı, aynı tabak içinde enjeksiyonların seyri sırasında ayarlanması gerekir. Bir ayarlama gerekli olduğunda belirgin olacaktır: (nükleer enjeksiyon (çekirdeği veya hücre tamamen cevapsız hiçbir beyaz tüy) dair hiçbir işaret yok, ya da enjeksiyon pipetlemeyin ucu çanak alt gelir hücre sıkıştırarak hatta) pipetlemeyin ucu çanağın dibine çöküyor. Cam klonlama silindir (OD 10 mm, Kedi No 2.090-01.010, Bellco Cam, Vineland, NJ) nöronların kaplama sırasında daha küçük, daha dar bir alanda onları kısıtlamak için kullanılan olabilir, bu nedenle hareket ettirmek için gerekli mesafeyi en aza indirmek enjeksiyonlar arasındaki enjeksiyon pipetlemeyin. Bu klonlama silindir microinjections performans önce kaldırılır. Teknik Dezavantajları: Intranükleer microinjections teknik sabır ve yüksek derecede bir operatör tarafından el becerisi gerektiren talep ediyorlar. Bu tekniği ile Yeterlik, başka bir beceri ile gibi, uygulama ile geliyor. Bu nedenle, gerçek deneyler denemeden önce muhabiri genin tek başına nükleer enjeksiyon uygulama tavsiye edilir. Daha fazla enjeksiyon işlemi yardımcı olmak için, bir bilgisayar programı ve basıncı enjektör içine mikromanipülatör adımları sağlamlaştırmak için mümkün olabilir. Igor Pro (WaveMetrics, Lake Oswego, OR) gibi programlar (mikroenjeksiyon ayarları saklamak için 6,7,8 görmek ve yarı otomatikleştirmek enjeksiyon işlemi için programı çok fonksiyonlu denetleyicileri (ShuttlePro, Çevre Tasarım, Windham, NH) kullanılmalıdır. bakın). Intranükleer mikroenjeksiyon tekniği Bir diğer dezavantajı ise düşük başarı oranı. Teşebbüs nükleer enjeksiyonlar yaklaşık% 10-20 protein ifade neden olur. Bu etkinliği çok sayıda ifade hücreler, örneğin elektrofizyoloji, çeşitli biyokimyasal testleri için bu yeterli olmayabilir gerekmez uygulamaları için yeterli olabilir rağmen. Teknik Uygulamalar: Sakıncaları olmasına rağmen, DNA intranükleer mikroenjeksiyon heterologously nöronların proteinleri ifade etmek için son derece yararlı bir tekniktir. Yüksek düzeyde protein ekspresyonu, çünkü çekirdeğin enjeksiyonları, düzenleyen bir gen transkripsiyonu ve çekirdeğinde bulunan plazmid uzun istikrar son derece aktif CMV organizatörü sırasında salınan plazmid çok sayıda nükleer microinjections ile elde edilir. Protein-ifadesi üzerine heterolog proteinlerin yüksek düzeyde endojen protein istila etmek için gerekli olan dominant-negatif deneylerde özellikle yararlıdır. Intranükleer enjeksiyonları diğer bir avantajı çok yapıları enjekte edilir çekirdeğine cDNA yapıları tutarlı bir kısmı teslim yeteneğidir. Diğer transfeksiyon yöntemleri ile, her DNA aynı oranda tekrarlanabilir aynı çanağı içinde ve transfections arasında farklı hücrelerin içine inşa tanıtmak için zordur. Çekirdeğin içine cDNA çözüm Direkt enjeksiyonlu değişkenlik bu kaynağı ortadan kaldırır ve ifade proteinlerin oranının etkin bir şekilde titre olanak sağlar. Geleneksel transfeksiyon yöntemleri post-mitotik hücrelerin içine DNA transfeksiyon REAG ile ilişkili 9 çekirdeği ve kimyasal toksisitesi düşük esas nedeniyle sınırlı etkinliğiveliler 10. Nükleer microinjections çekirdeğindeki genetik materyalin içine mekanik getirerek bu sorunların üstesinden gelmek. Bu tekniği daha fazla dahil olmasına rağmen, fonksiyonel bir biyolojik sistem bir proteinin etkisini araştırmak için yeteneği, bu tekniğin zahmetli doğa dengeler daha fazla endojen sinyal yolları tamamlamak. Tüm hayvanlar üzerinde deney prosedürleri göre, Ulusal Sağlık Hayvan Bakım ve Kullanım Kuralları Enstitüleri ile yapıldı.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Ultrafree-MC Filter Unit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>UFC30VV00</td>
<td>Durapore PVDF filter; 0.1 &mu;m pore-size</td>
</tr>
<tr>
<td>TE buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Quality Biological, Inc</td>
<td>351-010-131</td>
<td>10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro-hematocrit capillary tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>22-362-574</td>
<td>Unheparinized Preparation: 
Soak in 100% ethanol overnight. Wash thoroughly with deionized water three times and dry bake glass in an oven (95&deg;C). Cut the cleaned hematocrit tubes into 3-4 cm length pieces using a diamond-tipped scriber, and seal one end closed with a flame and forceps to hold the glass. Store in a clean glass beaker and cover to prevent dust build-up. </td>
</tr>
<tr>
<td>Microcentrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5417 R</td>
<td>With a fixed angle or swinging-bucket rotor</td>
</tr>
<tr>
<td>Microloader 20 &mu;l pipet tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5242 956.003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microinjection capillary glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>TW120F-4</td>
<td>Thin-walled with filament, 1.2 mm outer-diameter, 0.9 mm inner-diameter, 100 mm length</td>
</tr>
<tr>
<td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instrument Co.</td>
<td>P-97</td>
<td>With platinum-iridium box filament (part # FB330B)</td>
</tr>
<tr>
<td>Nikon Diaphot TMD Inverted Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>20x and 40x phase-contrast objective lenses, mounted on a vibration isolation table</td>
</tr>
<tr>
<td>Charge-coupled device (CCD) camera </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cohu Inc.</td>
<td>6410</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Video monitor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sony Corporation</td>
<td>PVM-122</td>
<td>Black and White, 9&#x201D; screen </td>
</tr>
<tr>
<td>Micromanipulator system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5171</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microinjection Unit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>FemtoJet Express</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microinjection controller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Contour Design</td>
<td>S-PROV2</td>
<td>Programmable multimedia controller</td>
</tr>
<tr>
<td>Igor Pro</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WaveMetrics</td>
<td>Version 4.05A</td>
<td>Command program to control the microinjection controller written by S. Ikeda</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

intranuclear microinjection of dna into dissociated adult mammalian neurons

Primer nöronal hücre kültürleri ölümsüzleştirdi hücre hatları ile karşılaştırıldığında daha fazla biyolojik ilgili sistem temsil ettiği protein fonksiyonu çalışma için değerli araçlar. Ancak, birincil nöronların post-mitotik doğa, elektroporasyon veya kimyasal aracılı transfeksiyon gibi ortak prosedürlerini kullanarak etkili heterolog protein ekspresyonunu engeller. Böylece, diğer tekniklerin etkili olmayan bu bölünen hücreleri proteinleri ifade etmek için istihdam edilmesi gerekmektedir. Bu makalede, ayrışmış yetişkin sempatik nöronlar cDNA yapıları intranükleer enjeksiyonları gerçekleştirmek için gerekli adımları açıklar. Bu teknik, farklı tipte nöron uygulanmıştır başarıyla heterolog protein ekspresyonu neden olabilir. Mikroenjeksiyon işlemi için gerekli ekipman, hücreleri, N 2 (g) basınç dağıtım sistemi bağlı cDNA çözümü ile dolu bir cam enjeksiyon pipetlemeyin ve mikromanipülatör görselleştirmek için ters bir mikroskop içerir . Mikromanipülatör basınçlı N 2 pipetlemeyin ucundan cDNA çözüm çıkarmak için kısa bir darbe ile mikroenjeksiyon pipetlemeyin enjeksiyon hareketi koordine eder. Bu teknik, diğer birçok transfeksiyon yöntemleri ile ilişkili toksisite ve tutarlı bir oranı ifade edilmesi, birden fazla DNA yapıları sağlar değildir. Enjekte edilen hücrelerin sayısının düşük olması gibi elektrofizyolojik kayıtlar ve optik görüntüleme gibi tek bir hücre çalışmaları için uygun mikroenjeksiyon işlemi yapar, ancak hücreleri ve yüksek transfeksiyon verimliliği daha çok sayıda gerektiren biyokimyasal deneyleri için ideal olmayabilir. Intranükleer microinjections ekipman ve zaman bir yatırım gerektirmesine rağmen, yeteneği fizyolojik ilgili çevre heterolog protein ekspresyonu yüksek düzeylerine ulaşmak amacıyla bu tekniğin proteinin fonksiyonunu araştırmak için çok yararlı bir araç yapar.

Watch this Scientific Journal Video about Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons at JoVE.com

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

CDNA Doğrudan intranükleer enjeksiyonu, etkili bir post-mitotik hücrelerin transfeksiyon tekniktir. Bu yöntem, tek veya birden fazla cDNA yapıları heterolog protein ekspresyonu yüksek düzeyde sağlar ve tek bir hücre deneyleri çeşitli fizyolojik ilgili bir ortamda incelenmesi gereken protein fonksiyonu sağlar.

Yetişkin grubuyla Memeli Nöronlar içine DNA intranükleer Mikroenjeksiyon

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

intranuclear-microinjection-dna-into-dissociated-adult-mammalian

Research

JoVE Journal

Biology

16.8K Görüntüleme.  National Institutes of Health (NIH). CDNA Doğrudan intranükleer enjeksiyonu, etkili bir post-mitotik hücrelerin transfeksiyon tekniktir. Bu yöntem, tek veya birden fazla cDNA yapıları heterolog protein ekspresyonu yüksek düzeyde sağlar ve tek bir hücre deneyleri çeşitli fizyolojik ilgili bir ortamda incelenmesi gereken protein fonksiyonu sağlar.

Video: Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures can be used for a variety of applications including immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging, protein and/or RNA isolation. These cultures also provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a late embryonic or postnatal lethal gene mutation. The procedure is relatively straight forward, requires some experience in tissue culture technique and should not take longer than two to three hours if you are properly prepared. Careful separation of the cortical rind from the thalamo-cortical fiber tract will reduce the number of unwanted non-neuronal cells. To increase yields of neuronal cells triturate the pieces of the cortical tissue gently after the enzyme incubation step. This is imperative as it prevents unnecessary injury to cells and premature neuronal cell death. Since these cultures are maintained in the absence of glia feeder cells, they also offer an added advantage of growing cultures enriched in neurons.

This video shows a procedure for generating neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse cortex. These cultures can be used for immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging and provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a postnatal lethal gene mutation.

Grubuyla Fare Kortikal Nöron Kültürler hazırlanması

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures ...

Biyoloji

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant variants) in order to investigate their endogenous distribution and functional relevance. An interesting approach that has been implemented to fulfill this objective in fully differentiated cells is the in vivo transfection of plasmids by various methods into specific tissues such as liver1, skeletal muscle2,3, and even the brain4. We present here a detailed description of the steps that must be followed in order to efficiently transfect genetic material into fibers of the flexor digitorum brevis (FDB) and interosseus (IO) muscles of adult mice using an in vivo electroporation approach. The experimental parameters have been optimized so as to maximize the number of muscle fibers transfected while minimizing tissue damages that may impair the quality and quantity of the proteins expressed in individual fibers. We have verified that the implementation of the methodology described in this paper results in a high yield of soluble proteins, i.e. EGFP and ECFP3, calpain, FKBP12, &beta;2a-DHPR, etc. ; structural proteins, i.e. minidystrophin and &alpha;-actinin; and membrane proteins, i.e. &alpha;1s-DHPR, RyR1, cardiac Na/Ca2+ exchanger , NaV1.4 Na channel, SERCA1, etc., when applied to FDB, IO and other muscles of mice and rats. The efficient expression of some of these proteins has been verified with biochemical3 and functional evidence5. However, by far the most common confirmatory approach used by us are standard fluorescent microscopy and 2-photon laser scanning microscopy (TPLSM), which permit to identify not only the overall expression, but also the detailed intracellular localization, of fluorescently tagged protein constructs. The method could be equally used to transfect plasmids encoding for the expression of proteins of physiological relevance (as shown here), or for interference RNA (siRNA) aiming to suppress the expression of normally expressed proteins (not tested by us yet). It should be noted that the transfection of FDB and IO muscle fibers is particularly relevant for the investigation of mammalian muscle physiology since fibers enzymatically dissociated from these muscles are currently one of the most suitable models to investigate basic mechanisms of excitability and excitation-contraction coupling under current or voltage clamp conditions2,6-8.

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

We describe detailed procedures for the efficient transfection of plasmid DNA into the fibers of foot muscles of live mice using electroporation and the subsequent visualization of protein expression using fluorescence microscopy.

Memeli İskelet Kaslar kullanarak DNA Transfeksiyon In Vivo Elektroporasyon

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death. Cells repair DSBs using two major pathways: nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Perturbations of NHEJ and HR are often associated with premature aging and tumorigenesis, hence it is important to have a quantitative way of measuring each DSB repair pathway. Our laboratory has developed fluorescent reporter constructs that allow sensitive and quantitative measurement of NHEJ and HR. The constructs are based on an engineered GFP gene containing recognition sites for a rare-cutting I-SceI endonuclease for induction of DSBs. The starting constructs are GFP negative as the GFP gene is inactivated by an additional exon, or by mutations. Successful repair of the I-SceI-induced breaks by NHEJ or HR restores the functional GFP gene. The number of GFP positive cells counted by flow cytometry provides quantitative measure of NHEJ or HR efficiency.

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

This article describes GFP-based fluorescence in vivo assays that separately quantify homologous recombination and nonhomologous end joining in mammalian cells.

Memeli Hücrelerde DNA çift iplikli Break (DSB) Tamir Analizi

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, this method makes it difficult to know how much reagent is absorbed or taken up per fish. Some experimental questions, particularly those related to metabolic studies, may be better addressed by delivering a defined quantity to each fish, based on weight. Here we present a method for intraperitoneal (IP) injection into adult zebrafish. Injection is into the abdominal cavity, posterior to the pelvic girdle. This procedure is adapted from veterinary methods used for larger fish. It is safe, as we have observed zero mortality. Additionally, we have seen bleeding at the injection site in only 5 out of 127 injections, and in each of those cases the bleeding was brief, lasting several seconds, and the quantity of blood lost was small. Success with this procedure requires gentle handling of the fish through several steps including fasting, weighing, anesthetizing, injection, and recovery. Precautions are required to minimize stress throughout the procedure. Our precautions include using a small injection volume and a 35G needle. We use Cortland salt solution as the vehicle, which is osmotically balanced for freshwater fish. Aeration of the gills is maintained during the injection procedure by first bringing the fish into a surgical plane of anesthesia, which allows slow operculum movements, and second, by holding the fish in a trough within a water-saturated sponge during the injection itself. We demonstrate the utility of IP injection by injecting glucose and monitoring the rise in blood glucose level and its subsequent return to normal. As stress is known to increase blood glucose in teleost fish, we compare blood glucose levels in vehicle-injected and non-injected adults and show that the procedure does not cause a significant rise in blood glucose.

We demonstrate intraperitoneal injection into adult zebrafish. We use a 10 &mu;l NanoFil microsyringe controlled by a Micro4 controller and UltraMicroPump III. This demonstration includes the use of cold water as an anesthetic.

Yetişkin Zebra balığı içine intraperitoneal enjeksiyon

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Mikroenjeksiyon tarafından Memeli Hücreleri mRNA Nükleer İhracat Kinetik Analizi

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces the 'free' surfaces and the basolateral membrane is in contact with the substrate and neighboring cells. Both membrane domains are separated by tight junctions, which form a diffusion barrier. Apical-basolateral polarization can be recapitulated successfully in culture when epithelial cells such as Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells are seeded at high density on polycarbonate filters and cultured for several days 1 2. Establishment and maintenance of cell polarity is regulated by an array of small GTPases of the Ras superfamily such as RalA, Cdc42, Rab8, Rab10 and Rab13 3 4 5 6 7. Like all GTPases these proteins cycle between an inactive GDP-bound state and an active GTP-bound state. Specific mutations in the nucleotide binding regions interfere with this cycling 8. For example, Rab13T22N is permanently locked in the GDP-form and thus dubbed 'dominant negative', whereas Rab13Q67L can no longer hydrolyze GTP and is thus locked in a 'dominant active' state 7. To analyze their function in cells both dominant negative and dominant active alleles of GTPases are typically expressed at high levels to interfere with the function of the endogenous proteins 9. An elegant way to achieve high levels of overexpression in a short amount of time is to introduce the plasmids encoding the relevant proteins directly into the nuclei of polarized cells grown on filter supports using microinjection technique. This is often combined with the co-injection of reporter plasmids that encode plasma membrane receptors that are specifically sorted to the apical or basolateral domain. A cargo frequently used to analyze cargo sorting to the basolateral domain is a temperature sensitive allele of the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSVGts045) 10. This protein cannot fold properly at 39&deg;C and will thus be retained in the endoplasmic reticulum (ER) while the regulatory protein of interest is assembled in the cytosol. A shift to 31&deg;C will then allow VSVGts045 to fold properly, leave the ER and travel to the plasma membrane 11. This chase is typically performed in the presence of cycloheximide to prevent further protein synthesis leading to cleaner results. Here we describe in detail the procedure of microinjecting plasmids into polarized cells and subsequent incubations including temperature shifts that allow a comprehensive analysis of regulatory proteins involved in basolateral sorting.

This article details the procedures involved in overexpression and analysis of small GTPases in polarized epithelial cells using microinjection technique.

Polarize Epitel Hücreleri içine Plazmidler, Mikroenjeksiyon Küçük GTPases Fonksiyon Analizi

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

Doğrudan Yetişkin Zebra balığı Böbrek Hücre Nakli

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

Morpholinos in vivo Elektroporasyon Yetişkin Zebra balığı Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to screen new drug compounds, and to develop new therapies for motor neuron diseases such as spinal muscular atrophy (SMA) and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Many current protocols use a combination of retinoic acid (RA) and sonic hedgehog (Shh) to differentiate mouse embryonic stem (mES) cells into motor neurons1-4. However, the differentiation efficiency of mES cells into motor neurons has only met with moderate success. We have developed a two-step differentiation protocol5 that significantly improves the differentiation efficiency compared with currently established protocols. The first step is to enhance the neuralization process by adding Noggin and fibroblast growth factors (FGFs). Noggin is a bone morphogenetic protein (BMP) antagonist and is implicated in neural induction according to the default model of neurogenesis and results in the formation of anterior neural patterning6. FGF signaling acts synergistically with Noggin in inducing neural tissue formation by promoting a posterior neural identity7-9. In this step, mES cells were primed with Noggin, bFGF, and FGF-8 for two days to promote differentiation towards neural lineages. The second step is to induce motor neuron specification. Noggin/FGFs exposed mES cells were incubated with RA and a Shh agonist, Smoothened agonist (SAG), for another 5 days to facilitate motor neuron generation. To monitor the differentiation of mESs into motor neurons, we used an ES cell line derived from a transgenic mouse expressing eGFP under the control of the motor neuron specific promoter Hb91. Using this robust protocol, we achieved 51&plusmn;0.8% of differentiation efficiency (n = 3; p &lt; 0.01, Student's t-test)5. Results from immunofluorescent staining showed that GFP+ cells express the motor neuron specific markers, Islet-1 and choline acetyltransferase (ChAT). Our two-step differentiation protocol provides an efficient way to differentiate mES cells into spinal motor neurons.

We developed a new protocol to improve efficiency of in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into motor neurons. The differentiated ES cells acquired motor neurons features as evidenced by expression of neuronal and motor neuron markers using immunohistochemical techniques.

Motor Nöronlar içine Fare Embriyonik Kök Hücre Verimli Farklılaşma

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional  motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to  screen ...

Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic knockdown system, we showed novel functions for HDAC1,2 in replication fork progression and nascent chromatin maintenance in mammalian cells. Additionally, we used a BrdU-ChIP-Slot-Western technique that combines chromatin immunoprecipitation (ChIP) of bromo-deoxyuridine (BrdU)-labeled DNA with slot blot and Western analyses to quantitatively measure proteins or histone modification associated with nascent DNA.
Actively dividing cells were treated with HDAC1,2 selective inhibitor or transfected with siRNAs against Hdac1 and Hdac2 and then newly synthesized DNA was labeled with the thymidine analog bromodeoxyuridine (BrdU). The BrdU labeling was done at a time point when there was no significant cell cycle arrest or apoptosis due to the loss of HDAC1,2 functions. Following labeling of cells with BrdU, chromatin immunoprecipitation (ChIP) of histone acetylation marks or the chromatin-remodeler was performed with specific antibodies. BrdU-labeled input DNA and the immunoprecipitated (or ChIPed) DNA was then spotted onto a membrane using the slot blot technique and immobilized using UV. The amount of nascent DNA in each slot was then quantitatively assessed using Western analysis with an anti-BrdU antibody. The effect of loss of HDAC1,2 functions on the levels of newly synthesized DNA-associated histone acetylation marks and chromatin remodeler was then determined by normalizing the BrdU-ChIP signal obtained from the treated samples to the control samples.

In this protocol, we describe a novel BrdU-ChIP-Slot-Western technique to examine proteins and histone modifications associated with newly synthesized or nascent DNA.