Alman Federal Bakanlığı Eğitim ve araştırma fon (BMBF vermek numaraları 03Z22DN11 ve 03Z22DN12) minnetle kabul edilmektedir.

1. plazma tür izleme ve tedavi kurulum
<ol><li>
Plazma tür izleme
	<ol>
<li>İki standart litre / dakika maksimum gaz akı beslemek ve atmosferik basınç plazma jet kullanın.</li>
		<li>Tüy eksenine dik bir optik emisyon Spektrofotometre önünde jet getirin ve kayıt photoemission ve dalga boyu (200-1000 nm) kullanarak yazılım adanmıştır.</li>
		<li>Kuru veya oksijen (% 5) besleme gaz oksijen ve azot % 0.5 karıştırın.</li>
		<li>Optik emisyon spektroskopisi her gaz koşul için yineleyin.</li>
		<li>Veri grafik ekran için uygun yazılım ile analiz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Plazma tedavi kurulum
	<ol>
<li>Bilgisayar temelli xyz tablo için jet düzeltmek.</li>
		<li>Kuyuları konumunu belirlemek ve tablosuna, her şey ortasına yukarıda uygun tedavi kez katıldı jet taşımak için bir bilgisayar komut dosyası oluşturur.</li>
		<li>10 Ekle4 100 µL tam hücre kültür orta memeli yapışık hücreleri herhangi bir tür (RPMI1640% 10 FCS, % 2 glutamin ve % 1 penisilin/streptomisin) laminar akış başlık altında birkaç kuyu içine.</li>
		<li>Gecede 37 ° C % 5 karbon dioksit ile oksijen bir atmosferde oluşacak şekilde hücresel yapışma sağlar.</li>
		<li>Plazma 20 için hücrelerle tedavi s 250 µm aralıklarla farklı yüksekliklerde (z ekseni).</li>
		<li>Propidium iyodür 25 µL hücre kültürü ortamında her şey için ekleyin.</li>
		<li>Kültür orta hücreleri üzerine bir kenara iterek hücreleri hücre nekroz besleme nedeniyle teşvik değil belirli yüksekliği belirlemek için mikroskop altında gaz görüntü. Not: uzun tedavi süreleri için sıvı buharlaşma plazma ve kapalı modu, bu belirli yükseklikte microliters doubledistilled su yeniden kurmak gerekli miktarı tanımlamak için plazma işlemden önce ve sonra plaka ağırlığında tanımlamak arıtılmış kuyu ozmotik homeostazı.</li>
		<li>Son bir protokol ile ilgili tedavi kez xyz tablo için hazırlamak (burada: 20 s, 40 s, 60 s plazma ve 60 s gaz kontrolü) ve iyi pozisyonlar ve hazır çok kanallı Pipetler ve rezervuar 96-şey tabak sıvı işleme sonraki deneyleri hakkına sahiptir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. reaktif bileşenlerinde büyük plazma tedavi sıvı analizi
<ol><li>
Hidrojen peroksit plazma tedavi analizi
	<ol>
<li>Fosfat tamponlu tuz (PBS) plazma ile 100 µL nüsha düz-alt 96-şey tabak içinde tedavi.</li>
		<li>PBS 100 µL 10 U horseradish peroksidaz ile ve hidrojen peroksit algılama reaktif 5 mikron yükleyerek bir ana karışım hazırlamak (biri için yeterli iyi; buna göre ölçek).</li>
		<li>Her şey için 95 µL ana karışımı ekleyin. Not: ortam havası ozon tahlil duyarlılığını azaltmak gibi önceki adımı temiz bir tezgah altında veya plazma kaynak ayrı bir odada yapılmalıdır.</li>
		<li>Ayrı bir tabak içinde hidrojen peroksit PBS içinde bir iki kat seyreltme serisi 100 µL PBS 100 µM en iyi bir konsantrasyon ile hazırlayın.</li>
		<li>5 µL örnekleri veya hidrojen peroksit standartları algılama reaktif içeren wells için ekleyin.</li>
		<li>Yalnızca arka plan çıkarma eşleştirmeyi sonra için algılama reaktif içeren kuyu bulunmaktadır.</li>
		<li>Kalenin içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında 15 dk için kuluçkaya.</li>
		<li>Plaka Floresans λex 535 nm ve λem 590 nm ölçme Mikroplaka okuyucu yerleştirin. Not: yüksek peroksit konsantrasyonları örneklerinde bekleniyor Numune dilüsyonu artırılması gerekiyor yoksa, okuma kısa kuluçka süreleri de testin doygunluk önlemek için yapılması.</li>
		<li>Tüm örnekleri boş değerleri çıkarmak, peroksit standart eğri hesaplamak ve bilinmeyen örnek peroksit konsantrasyonları bu temel eğri üzerinden ölçmek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Plazma tedavi nitrit analizi
	<ol>
<li>Flatbottom 96well plakaları nüsha olarak PBS 100 µL plazma ile tedavi.</li>
		<li>Nitrit algılama çözüm ana karışımı doubledistilled 99 µL için miktar reaktif 1 µL ekleyerek su hazırlar (biri için yeterli iyi; buna göre ölçek).</li>
		<li>İyi ücret 100 µL açık, flatbottom 96well plakasına ekleyin. Kuyu sayısı için gerektiği gibi büyütmek.</li>
		<li>Seyreltme serisi doubledistilled suda nitrit standartların hazırlayın.</li>
		<li>Standartlar veya örnekleri 10 µL 96well tabak içinde ana karışıma ekleyin.</li>
		<li>Kalenin içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya.</li>
		<li>5 µL nitrit miktar geliştirici çözüm her şey için ekleyin.</li>
		<li>Floresans Mikroplaka okuyucu λex 365 nm ve λem 450 nm okuyun.</li>
		<li>Tüm örnekleri boş değerleri çıkarmak, nitrit standart eğri hesaplamak ve bilinmeyen örnek nitrit konsantrasyonları bu temel eğri üzerinden ölçmek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Plazma tedavi süperoksit analizi
	<ol>
<li>Oksitlenmiş sitokrom (1 mg/mL) ana bir karışımını yapmak ve katalaz (20 µg/mL) PBS içinde.</li>
		<li>100 µL ana Mix açık, düz dipli 96-şey plaka wells için ekleyin.</li>
		<li>Plazma ile ana karıştırın nüsha tedavi koşul başına tedavi.</li>
		<li>550 Absorbans okumak nm istimal a Mikroplaka okuyucu; Bu veri grafiğini çizin.</li>
		<li>Sitokrom C molar tükenme katsayısı ve sıvı ışık yolu uzunluğu bir kuyu içinde kullanılarak oluşturulan süperoksit tutarını hesaplar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. hücre plazma için maruz biyolojik yanıtı
<ol><li>
Hücrelerinin plazma tedavi çok boyutlu okuma: metabolik aktivite
	<ol>
<li>Laminar akış başlığı tüm aşağıdaki yordamları için kullan.</li>
		<li>Tohum 104 hücreleri (B16 fare Melanom) 100 µL tam olarak hücre kültür orta düz-alt 96-şey plakaları kuyuda başına desteklenmiştir.</li>
		<li>Hücresel yapışma gecede kuluçka % 5 karbon dioksit ile oksijen atmosferinde 37 ° C'de izin verir.</li>
		<li>Xyz-tablo kullanarak, wells plazma veya önceden tanımlanmış bir düzeni göre yalnız gaz ile tedavi ve 20 h için kuluçka makinesi içine geri hücreleri ekleyin. Not: arzu edilirse, supernatants 20 h sonra hücre dışı ürünler analiz etmek almak; 100 µL taze orta daha sonra ekleyin.</li>
		<li>Her şey için hücre kültürü 500 µM resazurin (son toplama 100 µM); içeren Orta 25 µL Ekle Üç kuyu resazurin hücre kültür orta hücreler için arka plan çıkarma olmadan yalnız içeren hazır olun.</li>
		<li>Kuluçka 3 h için kuluçkaya.</li>
		<li>Floresans λex 535 nm ve λem 590 nm içinde Mikroplaka okuyucu okumak.</li>
		<li>Arka plan Floresans tüm örneklerinden çıkarma ve denetim değerleri için veri normalleştirmek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hücrelerinin plazma tedavi çok boyutlu okuma: görüntü analizi
	<ol>
<li>3.1.7 iyi plaka kullanın ve süpernatant atın.</li>
		<li>Taze hücre kültürü 1 µg/mL propidium iyodür içeren orta 100 µL ekleyin.</li>
		<li>Her şey görüntü için bir motorlu sahne ile mikroskop altında tabak koyun. Not: Görüntüleme ayrıntılar üzerinde deneysel soru değişir; Burada, 20 X objektif bir yüksek-içerik görüntüleme cihazı 3 x 3 alanları bakış parlak alan kanal, dijital faz kontrast kanal ve floresan (propidium iyodür) kanal, uygun uyarma ışık ve emisyon kullanan her iyi okumak için kullanılan filtreler.</li>
		<li>Kullanım nicel görüntü analiz yazılımı dijital faz kontrast görüntüler tüm alanları bakış toplam sitozolik alan belirlemek için her bir kuyu görüntüsü. Not: Örneğin, uygun ve/veya ölü hücreleri veya adanmış lekeler kullanarak mitokondrial etkinliğini numarasını isterseniz, daha fazla parametreler analiz. Bu çalışmada açıklanan diğer lekeler kullanarak Floresans lekeleri mikroskopi için kullanılan hayalice sonraki Akış Sitometresi deneylerde kullanılan fluorochromes ile örtüşmeyen olduğunu emin olun.</li>
		<li>Veri grafiğini ve istenirse, metabolik aktivite için elde edilen değerler ile korelasyon için test edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hücrelerinin plazma tedavi çok boyutlu okuma: Akış Sitometresi
	<ol>
<li>Bu çözümleme için adım 3.2.5 iyi plaka kullanın.</li>
		<li>Süpernatant atmak ve yıkama iki kez 200 µL kalsiyum ve magnezyum içeren PBS ile (0.9 mM ile 0,5 mM, sırasıyla). Not: Tamir ve/veya daha fazla hücre içi antijen veya hücre döngüsü analizi boyama gibi bu katkı içinde yer almayan biyolojik veriler için bu aşamada hücreleri permeabilize.</li>
		<li>Her şey için PBS 50 µL kalsiyum ve magnezyum 50 ng/mL Anti-fare calreticulin monoklonal antikorlar içeren ekleyin.</li>
		<li>Kuluçka 15dk için kuluçkaya.</li>
		<li>Yıkama 200 µL ile iki kez tam olarak hücre kültür orta desteklenmiş ve sıvı plaka içinde atın.</li>
		<li>Her şey için 100 µL hücre dekolmanı çözüm ekleyin ve 20 dk kuluçka için kuluçkaya.</li>
		<li>Strateji ve kazanç ve gerilimleri, photodetectors geçişi akış sitometrik Alım Protokolü kurulum için başka bir süspansiyon günahı B16 hücre kümesi kullanın.</li>
		<li>96-şey plakalar için otomatik örnekleyici ile donatılmış bir Akış Sitometresi plaka yüklemek.</li>
		<li>En az 1000 ileri hücrelerde ve yan dağılım nüfus genellikle uygulanabilir hücrelerle ilişkili edinme.</li>
		<li>Akış Sitometresi, faiz, nüfusu kapı için .fcs dosyaları analiz için özel yazılım kullanmak ve calreticulin ortalama Floresans yoğunluğunu belirlemek.</li>
		<li>Veri grafiğini ve istenirse, metabolik aktivite, görüntüleme ve/veya oksidan ifade için elde edilen değerler ile korelasyon için test edin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Temel araştırma etkinliğini ve plazma ilaç preklinik ve klinik araştırmalarda destek mekanizmaları bir anlayış geliştirmek için esastır. Temel araştırma Ayrıca soruşturma tedaviler için yeni uygulamalar teşvik etmektedir. Plazmaları Reaktif oksijen ve azot türler19nesil aracılığıyla biyolojik etkileri arabuluculuk de oluşturulduktan iken, hala alanına üç ana sorun vardır. İlk olarak, hangi tür önemlidir? Bu kısmen plazmasının optik tanılama ve biyolojik çıktıları ile besleme gaz bileşimi oransal tarafından cevaplanabilir. 20 ikinci olarak, ne etkileri hücreleri gibi biyolojik hedefler görülebilir? Bu en azından kısmen, hücre kültürü deneyleri ve deneyleri bir sayısını kullanarak ele olduğunu. Ökaryotik hücrelerde etkileri pleiotropic dahil olmak üzere hücre döngüsü tutuklama21, Apoptozis22, nekroz23ve cilt hücre stimülasyon24,25,26yanı sıra bir destek vardır veya hücrenin azaltmak motilite veya metabolik aktivite27,28,29. Bu pleiotropic etkileri, ilgili üçüncü meydan okuma, hücresel yanıt için farklı efektler sık görülen farklı hücre tiplerinde açıklamak için plazma kaynaklı oksidanlar belirlemek anahtar molekülleri belirlemektir. Bu omics teknikleri30,31,32 ve/veya kadar yapılabilir veya downregülasyon siRNA (redoks) inhibitörleri, antioksidanlar ve antioksidan enzimler yanı sıra, modülasyon sinyali kullanarak hedef genlerin Plazma'nın reaktif tür çıktı. 33 , 34 , 35 dolayısıyla, çok sayıda yineleme ile daha büyük örnek kümelerini test etmek için aerodinamik tahlil iletişim kurallarına gerek.
Bu çalışmada bir verimli deneysel iş akışı, biyoloji, söz konusu sorunları ile ilgili olarak plazma Tıbbi araştırmalar için fizik örneğidir. Plazma kaynağı ve plazma üretimi mühendisliği yönleri ile ilgili ayrıntılar daha önce tarif edilmistir. 36 , 37 , 38 birçok avantajı vardır 96well levha, tüm bu deneyleri yapılmaktadır. Örneğin, hücre kültürü supernatants gibi örnekleri kolayca tahlil koleksiyonu plakaları araştırmaya, örneğin, protein konsantrasyonları ile enzim-bağlantılı-immunosorbent-tahlil için yapılabilir. Bilimsel ekipman 96-kuyulardan doğrudan okuma yeteneğine varsa, böyle bir yaklaşım örnek ve handsontime maliyeti en aza indirir ve sonuçları aynı örnekten farklı deneyleri çoğullama tarafından en üst düzeye çıkarır. Çok kanallı kullanımı Ayrıca Pipetler örnek işleme hızlandırır. Bu ek pipetting adımlar diğer tüpler ve aşağı akım deneyleri kapları gerektirir rağmen prensip olarak, burada açıklanan tahlil de büyük iyi çapları ile iyi plaka biçimleri kullanarak yürütülen olabilir. 384well levha gibi daha küçük tabak türleri ancak, geometri jetleri ile büyük besleme gaz Cerayanlar kullanarak Biyomedikal plazma araştırma için uygun mevcut değil. Özellikle, yalnızca tek ama değil bitişik wells bir tedavi sırasında etkilenir garanti edilemez.
Sıvı analiz tür ifade tarafından plazma araştırmak için esastır. Uzman analizleri içinde farklı deneyleri paralel bir kurulumunu aynı anda plasmatreated sıvılar farklı oksidanlar ile ilgili olarak karakterize olabilir. Bu çoklama plasmaderived türlerin farklı bir resim geliştirme sağlar. Açıklanan yaklaşım hidrojen peroksit konsantrasyonları39, hangi genellikle gerekli ancak plazma etkileri açıklamak her zaman yeterli olduğunu araştırmak için son derece duyarlıdır. 40 , 41 , 42 biyolojik ilgili etkileri de sıvı burada bulunmayan bir glutatyon tahlil ile değerlendirilebilir. 43 belirli nitrit tahlil 10fold daha yüksek tahlil hassasiyet (veri gösterilmez) nedeniyle konvansiyonel Griess deneyleri üzerinde önemle önerilir. Plasmatreated sıvı Hipokloröz asit DTNB tahlil kullanarak oluşumu için soruşturma olması. Henüz, önceki sonuçları plazma kaynağımız bu türü oluşumu işaret vermedi. 19 , 39 , 44 plazma tedavi bittikten sonra tür bozulma zaman içinde yer alır. Nitrit nitrat için tepki verir; Ayrıca, peroksit zaman içinde tüketilmektedir. Ancak, bu işlem birkaç saat sürebilir. 35 sitokrom c emme birkaç saat içinde de durumu iyi. Bu nedenle, işlemleri tedaviden sonra ilk 30 dk içinde oluşursa, burada açıklanan uzun ömürlü tür konsantrasyonları varyasyon ihmal edilebilir. Medya (örneğin, Dulbecco'nın modifiye kartal orta) belirli türde maddeler soruşturma kadar % 90 peroksit 1 h (veri gösterilmez) içinde için kayıt atmak ancak, bakım alınmalıdır peroksit plazma yükünün bir küçümseme önde gelen sıvılar.
Çok katmanlı bir tahlil hangi aralıkları hücre alana (Morfoloji) metabolik aktivite soruşturma hücre yüzey marker ifade için sunulmaktadır. Bu deneyleri kombinasyonu ilginç sonuçlar ortaya çıkarabilir. Örneğin, biz daha önce THP1 monosit metabolik aktivite ve hücre sayımları plazma maruz takip doğrusal bir biçimde azaltamaz olduğunu göstermiştir. Plazma tedavi süresi, artan ile 45 aksine, bu boyut olarak büyütülmüş ve böylece daha yüksek metabolik oranları bir percell olarak önde gelen bir daha yüksek mitokondrial kitle vardı hücreleri tespit edildi. Esasen, multiplate okuyucu, mikroskobu ve Akış Sitometresi hücresel yanıt plazma tedavi aşağıdaki hakkında bilgi multiplexes. Melanom hücreleri, sitotoksik efekt ve calreticulin tarafından aracılı onların immünojenisite üzerinde odaklanabilir. 46 prensip olarak, diğer pek çok soru metabolik aktivite görüntüleme ve Akış Sitometresi sonuçları ile bağlama Bu yaklaşımla saptanabilir. Örneğin, hücre farklılaşması (örneğin makrofaj polarizasyon), mitokondri zar potansiyeli, hücre döngüsü analizi, hücre hareketliliği, biyomekanik veya çözümleme için Mikronukleus oluşumu genotoxicity da içinde araştırılması hücreler plazma tedavi. Çok renkli Akış Sitometresi aynı anda farklı hücre popülasyonlarının içinde bile daha fazla uygulama için izin verir. Bu, örneğin, proteinler transkripsiyon faktörleri, mRNA miktar, hücre içi sitokinler ölçümü ve/veya tek hücre düzeyinde toplam azaltılmış thiols değerlendirilmesi gibi sinyal fosforilasyon durumu analizini içerir. Her örnek için kullanılabilir ek biyolojik ilgili bilgi daha fazla plazma Redoks etkileri resmini geliştirmede mevcut ve gelecekteki plazma uygulamaları daha iyi anlamak için yardımcı olur.

Reaktif türü önemli Redoks düzenleyiciler hastalığında anormal yara iyileşme1 ve kanser de dahil olmak üzere bulunmaktadır. 2 önemli, bu türlerin patoloji yanı sıra tedavi çözünürlüğü söz konusu. 3 , 4 soğuk fiziksel plazma reaktif pek çok tür ihraç etti iyonize bir gazdır. 5 vücut sıcaklığı6' faaliyet sözde soğuk plazmasının advent beri soğuk plazmasının hücre ve dokulara termal zarar vermeden uygulanabilir. Etkinlik ve önceden klinik ve klinik gözlemler plazma cihazların güvenli uygulama göstererek, üç Almanya'da Tıbbi cihaz olarak akreditasyon almış. 7 genotoksik güvenliği ile ilgili olarak özellikle, mutajenik olaylar istimal belgili tanımlık ilk aygıt, bir atmosfer basıncı argon plazma jeti yokluğu çeşitli çalışmalar göstermiştir. 8 , 9 , 10 diğer iki sözde Dielektrik bariyer deşarj (DBD), plazma jet daha farklı bir prensibi ile çalışan cihazlardır. Özellikle, jetler DBD plazmasının daha büyük ama yüzeysel doku alanları tedavisinde etkili ise yüzeyler ve boşluklar neşter gibi tedavisi için izin verir. Hücresel Redoks Sinyal11istismar, teknik amacı plazma tarafından oluşturulan reaktif türler Biyomedikal uygulamalar için kullanmaktır. 12 yara iyileşmesi destek klinik plazma tedavisinin özellikle umut verici bir uygulamadır. 13 , 14 , 15 Ayrıca, plazma antikanser etkileri hayvan modellerinde olduğu gösterildi. 16 , 17 , 18
Etkinliği ve güvenliği hayvan modelleri, ya da düz insana ilişkin plazma uygulamaların doğrulamadan önce vitro araştırma ihtiyaçlarını plazma cihazları ile gerçekleştirilebilmesi için standart. Bu deneyler plazma uygulamaları keşfetmek için ve mekanizmaları işte betimlemek için gereklidir. Ayrıca, temel araştırma kompozisyon reaktif türler ve sonraki biyolojik etkileri etkisini anlamak için gereklidir. Bu çalışma nasıl plazma daha iyi anlamak ve hücreleri üzerindeki etkilerini kontrol için Biyomedikal Araştırma içine entegre edilebilir gösterir. Ayarlama besleme gaz kompozisyon, reaktif tür çıkışını izleme, sıvılar, hücre ve dokulara ve sonuç kimyasal ve biyolojik sonuçlara plazma uygulamaları açıklar. Ayrıca, örnek olan plazma tıbbi araştırma 96-şey levha yapılan yerleştirilen bir vurgu ile plazma tedavi ve aşağı akım biyolojik deneyleri, standardizasyon talimat verilmiştir. Bu yaklaşım farklı avantajlar vardır: Ben) koşulu, reaktif maliyet ve uygulamalı zaman örnek; başına başına gerekli hücre sayısı indirilmesi II) ödenek olarak çoğaltmak veya tedaviler onaylatılacak sonuçlarının daha doğru kolaylıkla ayarlanabilir; ve III) sorunsuz akış aşağı 96-şey biçimi plaka okuyucu, görüntü ve Akış Sitometresi deneyler raporlaması kolaylaştırma.

<table><tbody><tr><td>accutase</td><td>BioLegend</td><td>423201</td><td></td></tr><tr><td>amplex Ultra Red detection kit (includes horse-radish peroxidase and H2O2)</td><td>Thermo</td><td>A36006</td><td></td></tr><tr><td>argon gas</td><td>Air Liquide</td><td>N50</td><td></td></tr><tr><td>B16F10 murine melanoma cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-6475</td><td></td></tr><tr><td>catalase</td><td>Sigma</td><td>C30</td><td></td></tr><tr><td>cell culture incubator</td><td>Binder</td><td>CB210</td><td></td></tr><tr><td>cell culture plastic</td><td>NUNC</td><td>156545</td><td></td></tr><tr><td>cytochrome c, oxidized</td><td>Sigma</td><td>C2037</td><td></td></tr><tr><td>data analysis</td><td>GraphPad software</td><td>prism 7.03</td><td></td></tr><tr><td>fetal bovine serum</td><td>Sigma</td><td></td><td>batch-tested</td></tr><tr><td>fine scale</td><td></td><td></td><td>any with resolution of 0.01mg</td></tr><tr><td>flow cytometer</td><td>Beckman-Coulter</td><td>CytoFlex S</td><td></td></tr><tr><td>flow cytometry data analysis</td><td>Beckman-Coulter</td><td>Kaluza 1.5a</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>imaging quantification software</td><td>PerkinElmer</td><td>Harmony 4.5</td><td></td></tr><tr><td>laminar flow hood</td><td>Thermo</td><td>Maxisafe 2020</td><td></td></tr><tr><td>mass flow controller</td><td>MKS</td><td>G-series</td><td></td></tr><tr><td>Measure-iT nitrite detection kit</td><td>Thermo</td><td>M36051</td><td></td></tr><tr><td>microscope</td><td>PerkinElmer</td><td>Operetta CLS</td><td></td></tr><tr><td>optical emssion spectroscopy</td><td>Avantes</td><td>AvaSpec-DDDD-2-USB2</td><td></td></tr><tr><td>penicilin/streptomycin</td><td>Thermo</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>pipettes</td><td>Eppendorf/Brand</td><td>single/multi chanel</td><td></td></tr><tr><td>plate reader</td><td>Tecan</td><td>M200pro</td><td></td></tr><tr><td>propidium iodide</td><td>BioLegend</td><td>421301</td><td></td></tr><tr><td>resazurin</td><td>VWR</td><td>B21187.06</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 cell culture media</td><td>PanbioTech</td><td>P04-16500</td><td></td></tr><tr><td>xyz table</td><td>CNC step</td><td>HIGH-Z S-400/T&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

basic research in plasma medicine - a throughput approach from liquids to cells

Plazma tıpta, iyonize gazların sıcaklıkları omurgalı sistemlere yakın hücre ve doku için uygulanır. Soğuk plazmasının reaktif türler oluşturmak Redoks bilinen düzenleyen sağlık ve hastalığında biyolojik süreçlerin. Plazma tedavisinin kronik deri Ülseri iyileşmesinde faydalı etkileri önceden klinik ve klinik kanıtlar gösteriyor. Plazma kanser tedavisi gibi diğer gelişmekte olan konular artan ilgi alıyorsunuz. Plazma tıbbi araştırma Fizik, kimya, biyomedikal disiplinler arası uzmanlık gerektirir. Bir plazma araştırma plazma tedavi hücreleri belirli uygulamalar çeşitli karakterize etmek için hedeftir. Bu içerir, örneğin, hücre sayısı ve hücre yüzey marker ifade ve sitokin yayın canlılığı, hücresel oksidasyon, mitokondrial aktivite, sitotoksisite ve hücre ölümü, hücre döngüsü analizi, modu. Bu çalışmanın temel ekipman ve iş akışları böyle plazma Biyomedikal Araştırma için gerekli açıklar. Özellikle onun temel emisyon spectra izleme ve reaktif tür çıktı modüle için gaz ayarlarını yem bir atmosfer basıncı argon plazma jeti, düzgün çalışmasını açıklar. Bir yüksek-tamlık xyz-tablo ve bilgisayar yazılımı kullanarak, jet milisaniyesini duyarlık mikrometre duyarlıklı maksimal tekrarlanabilirlik için 96-şey levha boşluklar üzerinde süpürdü. Redoks aktif moleküllerin sıvı analizi için aşağı akım deneyleri gösterilir ve plazma tedavi hedef hücrelerdir. Özellikle, Melanom hücreleri farklı ardışık deneyleri ama aynı hücreleri kullanarak verimli bir sýrada analiz edilir: ölçüm metabolik aktivite, toplam hücresini alan ve yüzey marker ifade calreticulin, bir molekül için önemli kanser hücrelerinin immünojenik hücre ölümü. Bu deneyleri plazma etkileri hakkında zengin içerikli biyolojik bilgi tek bir plaka almak. Özet olarak, bu çalışmada temel adımları ve plazma Tıbbi araştırmalar için iletişim kuralları açıklar.

Bu çalışmada, plazma Effects'e tıbbi araştırma için kolaylaştırılmış bir iş akışı açıklanmıştır. Burada kullanılan multidisipliner yaklaşım plazma jeti, sıvı, ana reaktif bileşenlerinde temel optik emisyon profil analiz eder ve biyolojik yanıt hücrelerinin plazma (şekil 1) ile tedavi.
Bu iş akışı yürütmek için bir dizi bileşen düzgün plazma kaynağı (Şekil 2) kurmak için ihtiyaç vardı. Farklı gazlar (burada çoğunlukla argon, oksijen ve azot) için temin edildi ve birkaç kütle akış denetleyicileri tarafından kontrol. Merkezi bir panel dijital olarak önceden belirlenmiş besleme gaz Cerayanlar kütle akış denetleyicilerine ayarlamak için kullanıldı. Belirli besleme gaz besteleri vermeye, gazlar fiziksel olarak bir panel gazlar birkaç kütle akış denetleyicilerinden (Şekil 2A) birlikte vanaları kullanan karıştırıldı. Plazma kaynağı açık ve plazma atık bir USB-Spektrofotometre (Şekil 2B) optik aralığı 200 önünde kuruldu nm 1000 nm. Sıvılar ve hücre tedavisi için etkin bir iş akışı 96-şey levhalar kullanılarak tanımlanmıştır. Çok iyi yemekler, baskılı delik (Şekil 2C) eşleşen eklemeleri ile taban plakası tespit edildi bir plastik çerçeve kullanılarak yapıldı. Tüm kurulum bir laminar akış başlık altında (Şekil 2D) yerleştirildi. Bu kurulum xyz-tablo plazma jet el parçası monte edilmiş dahil. İse ikinci dan ve xyz-tablo için yeterince büyük kablo bağlantı noktalarını motor kontrol elemanları tezgah dışında bulunabilir. Önemlisi, tablo bilgisayar kontrollü ve istediğiniz süreyi her şey mikrometre hassasiyetle ortasına jet hover için programlanabilir. Ayrıca, başlangıç konumu (olduğu gibi bizim kurulum, iyi A1) serbestçe (Şekil 2E) seçildi. Plastik plaka sahibi ile birlikte, bu yalnızca sıvı ve biyolojik deneyler kuruluşu ile ilgili herhangi bir gün için günlük varyasyon içeren bir tekrarlanabilir plazma tedavisi için izin verdi.
Optik emisyon spektroskopisi (OES) farklı zirveleri reaktif plazma bileşenleri farklı besleme gaz koşullarda (şekil 3A) bağlı takip için kullanıldı. Örneğin, ikinci olumlu sistemi 330 dan zirveleri ile azot nm 380 nm temsil reaktif nitrojen türler ve 309 temsil nm hidroksil radikalleri ( şekil 3Aok) zirve için. Oysa oksijen veya nem eklenmesi azalmış veya sırasıyla azaltmak o, argon gazı yalnız karşılaştırıldığında, azot türlerin varlığı azot karışımı ile besleme gaz haline arttı. Buna karşılık, hidroksil radikalleri varlığı azalmış oksijen veya azot ile ancak oksijen argon besleme gaz olarak kullanıldığında belirgin arttı. Sıvı plazma tedavisinde argon gazı ve argon plazma neden buharlaşma tespit edilmiştir (şekil 3B) ilk. Önemlisi, plazma Ayrıca sıcaklık etkisi giderek artan çünkü koşulların her ikisi de benzer sonuçlar vermemiştir. Hidroksil radikalleri OES sonuçlarını, doğrultusunda hidrojen peroksit ifade önemli ölçüde azalmış oksijen veya azot katkı ile ancak oksijen besleme gazıyla (şekil 3C) arttı. Ayrıca, ek besleme gaz için azot argon plazma tedavi sıvı (şekil 3D) göre anlamlı olarak daha yüksek nitrit konsantrasyonları yol açtı. Bu iş akışı da plazma farklı besteleri ile sıvı üzerinde etkisini araştırmak için istihdam. Örneğin, hidrojen peroksit konsantrasyonları bağımsız olarak fetal buzağı serum PBS ve RPMI1640 hücre kültür orta (şekil 3E) varlığı gibi görünüyordu. Aynı örnekleri, serum varlığı PBS ve hücre kültür onların sigara serum içeren göre (şekil 3F) karşılaştırıldığında orta konsantrasyonlarda nitrit azalmıştır. Çoğu süperoksit kuru argon gazı koşullarında önemli ölçüde oksijen argon-oksijen plazma (şekil 3G) dışında süperoksit üretimi Şoklama oksijen ve/veya azot katkıları ile üretildi.
Plazma hücreleri çok iyi yemekler tedavisinde, önceki gün içeren hücreleri seribaşı plaka kuluçka makinesi kaldırıldı ve plastik tutucu ekledi. Programlanmış tedavi desen uygulandı, buharlaşma için telafi edildi ve plaka 20 h. bu kuluçka sonra hücre kültür supernatants bir yeni, boş 96-şey plaka ulaştırılması ve depolandığı için kuluçka makinesi içine geri yerleştirildi- 80 ° C proteinler ilgi değerlendirilmesi için. Sonra resazurin her şey hücrelere eklendi. Floresan floresan resorufin için resazurin ciro yalnızca etkin NADPH üreten enzimler tarafından kolaylaştırdı ve genel olarak metabolik aktivite (şekil 4A) ile ilişkili. Floresans yoğunluklarda plaka görsel algı benzerdi ve uzun süreli plazma tedavisinin (şekil 4B) sitotoksik etkileri belirtti. Oksijen gaz koşulları daha kuru gaz koşulları daha zararlı. Plaka aynı hücrelerinde daha fazla aşağı akım deneyleri için kullanılmıştır. Plaka hücrelerde olduğunu mikroskobik (şekil 4C) araştırıldı. Düşsel bilgisayar yazılımı kullanarak, plaka birkaç kuyu nitel karşılaştırma (şekil 4D) incelenmiş. Yazılım her kuyuya satın alanların bakış içindeki hücreleri miktar toplam alanın kapsadığı ve sonuçta elde edilen veriler ilgili denetimleri (şekil 4E) normalleştirilmiş izin. Toplam hücre alan bir azalma plazma tedavi örnekleri, özellikle oksijen besleme gaz koşullarla görülmüş. Görüntüleme sonra hücreleri yıkanmış, Anti-fare calreticulin antikorlar ile lekeli, müstakil ve Akış Sitometresi (şekil 4F) ile analiz. Calreticulin (şekil 4G) hücrelerin içinde boyama yoğunluklarda hesaplanır ve örnekleri arasında (şekil 4H) karşılaştırıldığında Floresans demek. Plazma tedavi calreticulin kuru yem gaz koşulları ile uygulanan plazma tedavi süresine denk fare melanoma hücre yüzeyi bir upregulation indüklenen. Besleme gaz koşulları, 20 nemlendirilmelidir için s ve 40 s tedavi indüklenen daha ölümcül 60 s tesir süresi göre daha güçlü bir calreticulin maruz kalma. Bu bir doğrusal olmayan düzenleme calreticulin pozlama hücrelere tanıttı oksidanlar miktarı ile ilgili olarak, olduğunu gösteriyor.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56331/56331fig1.jpg"> Resim 1 : İş akışı plazma Biyoloji fizik gelen tıbbi araştırma. Atmosferik basınç argon plazma jet reaktif tür çıkışını besleme gaz oransal olarak ayarlanmıştır. Plazma gaz aşamasında seçili molekül spektroskopisi kullanılarak izlenir. Plazma sıvı tedavi ve oksidan ifade araştırmak için kullanılır. Mikroplaka içinde kültürlü plazma tedavi hücrelerdir ve biyolojik dökümanları gerçekleştirilir. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56331/56331fig1large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56331/56331fig2.jpg"> Resim 2 : Kurulum plazma araştırma tezgahın. (A)paslanmaz çelik boruları kontrol edilen çeşitli kitle Akış kontrolcüler bir merkezi paneli üzerinden yürütülen farklı gazlar. Bireysel yem gaz kompozisyon bundan sonra kapakların panelini kullanarak karıştırılır. (B) plazma reaktif bazı bileşenleri çeşitli besleme gaz besteleri arasındaki farklar araştırmak için optik emisyon spektroskopisi kullanılarak izlenebilir. (C) yüksek üretilen iş plazma araştırma, 96-şey Mikroplaka kullanılır. Programlanabilir ve otomatik plazma tedavisi için başlangıç noktası sabit emin olmak için plaka günden güne plakaları aynı mutlak konumunu garanti bir kareye eklenir. (D) plazma jet bir bilgisayar kontrollü xyz-Laminer akış başlık altında yer alan tabloya sabittir. Tüm 96 tam konumları ve plazma her bekleme süresi de plazma kaynak hareketini gösterecek bir program dosyasına yazılır. Ana gövdesi motor denetimlerin yanı sıra, plazma jeti aparatı ile yakın bir konumda bulunur. (E) bir 96-şey plaka tedavisinde plazma otomatik. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56331/56331fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56331/56331fig3.jpg"> Şekil 3 : Plazma jet ve sıvı analizi. (A)optik emisyon spektroskopisi farklı besleme gaz koşullardan gösterilir. İkinci olumlu sistemi azot (330 nm 380 için nm) ile azot, katkı yok oksijen katkı olması durumunda, artan ve belirgin oksijen argon (sol kapı aynası) ile sınırlı. Hidroksil radikalleri 309, zirve nm (ok) azot ve oksijen koşullarında azaldı ama oksijen argon argon gazı yalnız karşılaştırıldığında belirgin artmış. (B) gaz sıvı pozlama buharlaşma için yol açar. 96well plaka üzerine yalnız plazma ve argon gaz ile tedavi bir kuyu başına buharlaşma miktarı iyi bir ölçek kullanarak işlemden önce ve sonra plaka ağırlığında tarafından tespit edilmiştir. Buharlaşma plasmatreated örneklerinde daha argon gastreated örneklerinde buna göre. (C) üretimi hidrojen peroksit plasmatreated sıvılar içinde bir ölçüde (a) hidroksil radikalleri 309 nm pik ile ilişkili. Oksijen (% 5) argon plazma peroksit konsantrasyonları yaklaşık 4fold arttı. (D) nitrit azot besleme gaz eklendi ve bu etkisi ile oksijen argon plazma arttı yüksek. Oksijen ilavesi nitrit üretimi azaldı ama önemli. (E, F) Hidrojen peroksit ve nitrit konsantrasyonları farklı sıvılar, yani RPMI1640 hücre kültür orta (R10F) ile gösterilir ve (R0F) olmadan yanı sıra PBS ve fetal buzağı serum (FCS) olmadan. Peroksit düzeyleri nitrit seviyeleri önemli ölçüde serum huzurunda azalma, ancak farklı medya (E) arasında farklı değil. (G) süperoksit üretimi en yüksek kuru argon gazı gaz; besleme için azot, oksijen veya oksijen argon katkı sıvı içinde alt süperoksit ifade verdi. (B-G) gösterilen veriler ortalama + 2-3 deneyler SEM vardır. İstatistiksel analiz yapıldı gerçekleştirilen (C, D) kullanan tek yönlü kuru veya nemli besleme gaz koşullarına karşı ilgili denetim araçlarının tüm grup karşılaştıran Varyans analizi (** p < 0,01; *** p < 0.001). Ayrıca, argon salt gaz plazma koşullar bütün grup ortalama ve t-testi kullanarak karşılaştırıldı (### p < 0.001). Daha fazla istatistiksel analiz (F) t-testleri her plazma tedavi ve FCS ve FCS olmadan örneklerdeki orta durum değerleri karşılaştırarak kullanılarak gerçekleştirildi (* p < 0,05; ** p < 0,01); Ayrıca, FCS veya sigara FCS içeren çözümler t-testi kullanarak her plazma tedavi süresi içinde karşılaştırıldı (# p < 0,05; ## p < 0.001). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56331/56331fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56331/56331fig4.jpg"> Şekil 4 : Plazma tedavi ve hücreleri üzerindeki etkisi. (A)hücreler plazma için maruz ve resazurin metabolik etkinliğini değerlendirmek için 20 h sonra eklendi. (B) etkinliği önemli ölçüde plasmatreated örneklerinde gaz kontrollere göre azalma. Ayrıca oksijen ve/veya azot kuru ve nemli argon gazı koşulların her ikisi de toksisite yol açar, ancak belirgin bir azalma ile besleme gaz nemlendirme görüldü. Propidium iyodür (PI) içeren (C) orta eklendi. (D) genel bir bakış ile dijital faz kontrast (turuncu) her hücre ve PI sitozolik kısmını temsil eden plaka Wells (ölü hücreleri tanımlamak için yeşil) gösterilir. Görüntüleme araçları her iyi hücrelerle kapalı görüş alanı içinde Toplam alan miktarının izin. (F) hücreleri daha sonra yıkanmış ve antikorlar veya biyolojik plazma etkileri Akış Sitometresi kullanılarak karakterize etmek için diğer hücre işaretleri ile inkübe edildi. (G) Gating stratejileri istihdam ve marker analizi gerçekleştirilen ve örnekleri arasında karşılaştırıldığında. (B, E, H) gösterilen verileri belirtmek ortalama + SEM üç bağımsız deneyler bir temsilcisi. Ölçek çubuğu 200 µm (D) =. İstatistiksel karşılaştırma yapılacak iki yönlü varyans karşılaştırarak, her gaz koşul için her plazma tedavi onun ilgili gaz kontrolü için (B, H) analizini kullanarak (* p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0.001). Ayrıca, azot ve/veya oksijen katkıları her koşul için değerler argon gaz plazma için Kuru değerlerine karşılaştırıldı ve nemli ayrı ayrı koşullar (iki yönlü varyans; analizini ### p < 0.001). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56331/56331fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Basic Research in Plasma Medicine - A Throughput Approach from Liquids to Cells at JoVE.com

Basic Research in Plasma Medicine - A Throughput Approach from Liquids to Cells

Bir yüksek-den geçerek soğuk fiziksel plazma tedavi protokolü sıvılar ve hücre gösterilir. Farklı besleme gaz besteleri için plazma ateşleme, plazma 's emisyon spectra ve sıvılar ve hücresel hareketlilik daha sonraki analiz plazma tedaviden sonra ölçme kurma içerir.

Plazma tıp - sıvı hücreleri bir üretilen iş yaklaşımı temel araştırma

In plasma medicine, ionized gases with temperatures close to that of vertebrate systems are applied to cells and tissues. Cold plasmas generate reactive ...

basic-research-plasma-medicine-throughput-approach-from-liquids-to

Research

JoVE Journal

Environment

12.7K Görüntüleme.  Leibniz-Institute for Plasma Science and Technology. Bir yüksek-den geçerek soğuk fiziksel plazma tedavi protokolü sıvılar ve hücre gösterilir. Farklı besleme gaz besteleri için plazma ateşleme, plazma 's emisyon spectra ve sıvılar ve hücresel hareketlilik daha sonraki analiz plazma tedaviden sonra ölçme kurma içerir.

Video: Basic Research in Plasma Medicine - A Throughput Approach from Liquids to Cells

Micro-particle Image Velocimetry for Velocity Profile Measurements of Micro Blood Flows

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to give an accurate velocity profile. A protocol is presented for &mu;PIV measurements of blood flows in microchannels. At the scale of the microcirculation, blood cannot be considered a homogeneous fluid, as it is a suspension of flexible particles suspended in plasma, a Newtonian fluid. Shear rate, maximum velocity, velocity profile shape, and flow rate can be derived from these measurements. Several key parameters such as focal depth, particle concentration, and system compliance, are presented in order to ensure accurate, useful data along with examples and representative results for various hematocrits and flow conditions.

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows which are cross-correlated to give an accurate velocity profile. Shear rate, maximum velocity, velocity profile shape, and flow rate, each of which has clinical applications, can be derived from these measurements.

Mikro Kan akış hızı Profil ölçümleri için mikro-parçacık imaj velosimetri

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to ...

Biyomühendislik

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves numerous incubation and liquid transfer steps in order to achieve denaturation, reduction, alkylation, and cleavage. Adapting this workflow onto an automated workstation can increase efficiency and reduce coefficients of variance, thereby providing more reliable data for statistical comparisons between sample types. We previously described an automated proteomic sample preparation workflow1. Here, we report the development of a more efficient and better controlled workflow with the following advantages: 1) The number of liquid transfer steps is reduced from nine to six by combining reagents; 2) Pipetting time is reduced by selective tip pipetting using a 96-position pipetting head with multiple channels; 3) Potential throughput is increased by the availability of up to 45 deck positions; 4) Complete enclosure of the system provides improved temperature and environmental control and reduces the potential for contamination of samples or reagents; and 5) The addition of stable isotope labeled peptides, as well as &#946;-galactosidase protein, to each sample makes monitoring and quality control possible throughout the entire process. These hardware and process improvements provide good reproducibility and improve intra-assay and inter-assay precision (CV of less than 20%) for LC-MS based protein and peptide quantification. The entire workflow for digesting 96 samples in a 96-well plate can be completed in approximately 5 hours.

Here, we present an automated plasma protein digestion method for mass spectrometry-based quantitative proteomic analysis. In this protocol, the liquid transferring and incubation steps for protein denaturation, reduction, alkylation, and trypsin digestion reactions are streamlined and automated. It takes approximately five hours to prepare a 96-well plate with desired precision.

Otomatik İş İstasyonu Kullanarak Kütle Spektrometresi Için Plazma Numune Spektrometresi Hazırlığı

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Biyokimya

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards vascular disease pathologies. Unhealthy arteries often present with wall stiffening, scarring, or partial stenosis which may all affect fluid flow rates, and the magnitude of pulsatile flow, or pulsatility index. Replication of various flow conditions is the result of tuning a flow pressure damping chamber downstream of a blood pump. Introduction of air within a closed flow system allows for a compressible medium to absorb pulsatile pressure from the pump, and therefore vary the pulsatility index. The method described herein is simply reproduced, with highly controllable input, and easily measurable results. Some limitations are recreation of the complex physiological pulse waveform, which is only approximated by the system. Endothelial cells, smooth muscle cells, and fibroblasts are affected by the blood flow through the artery. The dynamic component of blood flow is determined by the cardiac output and arterial wall compliance. Vascular cell mechano-transduction of flow dynamics may trigger cytokine release and cross-talk between cell types within the artery. Co-culture of vascular cells is a more accurate picture reflecting cell-cell interaction on the blood vessel wall and vascular response to mechanical signaling. Contribution of flow dynamics, including the cell response to the dynamic and mean (or steady) components of flow, is therefore an important metric in determining disease pathology and treatment efficacy. Through introducing an in vitro co-culture model and pressure damping downstream of blood pump which produces simulated cardiac output, various arterial disease pathologies may be investigated.

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

This protocol replicates physiological or pathological blood flow in vitro to aid in determining cell response in disease pathologies. By introducing a pressure damping chamber downstream of a blood pump, blood flow across the vasculature can be recapitulated and imposed on a monolayer of vascular endothelium or a mimetic co-culture.

Vasküler Hücre Remodeling Soruşturma Fizyolojik in vitro Modeli ve Uygulaması ile Patolojik Kan Akış

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of (indirect) in vitro experiments, but none of these is as comprehensive as microfluidic flow chambers. In this protocol, the reconstitution of thrombocytopenic fresh blood with stored blood bank platelets is used to simulate platelet transfusion. Next, the reconstituted sample is perfused in microfluidic flow chambers which mimic hemostasis on exposed subendothelial matrix proteins. Effects of blood donation, transport, component separation, storage and pathogen inactivation can be measured in paired experimental designs. This allows reliable comparison of the impact every manipulation in blood component preparation has on hemostasis. Our results demonstrate the impact of temperature cycling, shear rates, platelet concentration and storage duration on platelet function. In conclusion, this protocol analyzes the function of blood bank platelets and this ultimately aids in optimization of the processing chain including phlebotomy, transport, component preparation, storage and transfusion.

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Platelet transfusion and hemostasis was modeled using blood reconstitution and microfluidic flow chambers to investigate the function of blood banking platelets. The data demonstrate the consequences of platelet storage lesion on hemostasis, in vitro.

Mikroakışkan Akış Chambers Hemostaz ve Trombosit Transfüzyon Model Sulandırılarak Kan kullanma<em&gt; İn Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Treating Surfaces with a Cold Atmospheric Pressure Plasma using the COST-Jet

In recent years, non-thermal atmospheric pressure plasmas have been used extensively for surface treatments, in particular, due to their potential in biological applications. However, the scientific results often suffer from reproducibility problems due to unreliable plasma conditions as well as complex treatment procedures. To address this issue and provide a stable and reproducible plasma source, the COST-Jet reference source was developed.
In this work, we propose a detailed protocol to perform reliable and reproducible surface treatments using the COST reference microplasma jet (COST-Jet). Common issues and pitfalls are discussed, as well as the peculiarities of the COST-Jet compared to other devices and its advantageous remote character. A detailed description of both solid and liquid surface treatment is provided. The described methods are versatile and can be adapted for other types of atmospheric pressure plasma devices.

This protocol is presented to characterize the setup, handling, and application of the COST-Jet for the treatment of diverse surfaces such as solids and liquids.

COST-Jet kullanarak Yüzeyleri Soğuk Atmosferik Basınçlı Plazma ile Tedavi Etme

In recent years, non-thermal atmospheric pressure plasmas have been used extensively for surface treatments, in particular, due to their potential in ...

Mühendislik

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is restricted to platelet deposition only. The intricate relationship between Ca2+-dependent coagulation and platelet function requires careful and controlled recalcification of blood prior to analysis. Our setup uses a Y-shaped mixing channel, which supplies concentrated Ca2+/Mg2+ buffer to flowing blood just prior to perfusion, enabling rapid recalcification without sample stasis. A ten-fold difference in flow velocity between both reservoirs minimizes dilution. The recalcified blood is then perfused in a collagen-coated analysis chamber, and differential labeling permits real-time imaging of both platelet and fibrin deposition using fluorescence video microscopy. The system uses only commercially available tools, increasing the chances of standardization. Reconstitution of thrombocytopenic blood with platelets from banked concentrates furthermore models platelet transfusion, proving its use in this research domain. Exemplary data demonstrated that coagulation onset and fibrin deposition were linearly dependent on the platelet concentration, confirming the relationship between primary and secondary hemostasis in our model. In a timeframe of 16 perfusion min, contact activation did not take place, despite recalcification to normal Ca2+ and Mg2+ levels. When coagulation factor XIIa was inhibited by corn trypsin inhibitor, this time frame was even longer, indicating a considerable dynamic range in which the changes in the procoagulant nature of the platelets can be assessed. Co-immobilization of tissue factor with collagen significantly reduced the time to onset of coagulation, but not its rate. The option to study the tissue factor and/or the contact pathway increases the versatility and utility of the assay.

This paper describes an experimental model of hemostasis that simultaneously measures platelet function and coagulation. Platelet and fibrin fluorescence is measured in real-time, and platelet adhesion rate, coagulation rate, and onset of coagulation are determined. The model is used to determine platelet procoagulant properties under flow in concentrates for transfusion.

Trombosit Transfüzyon ve Hemostaz için bir mikroakışkan Akış Odası Modeli Gerçek zamanlı Trombosit Birikimi ve Fibrin oluşumu Tedbirleri

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

A RAPID Method for Blood Processing to Increase the Yield of Plasma Peptide Levels in Human Blood

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the correct determination of a peptide&#39;s concentration, it should be stable during blood processing. However, this is not the case for several peptides which are quickly degraded by endogenous peptidases. Recently, we developed a blood processing method employing Reduced temperatures, Acidification, Protease inhibition, Isotopic exogenous controls and Dilution (RAPID) for the use in rats. Here, we have established this technique for the use in humans and investigated recovery, molecular form and circulating concentration of food intake regulatory hormones. The RAPID method significantly improved the recovery for 125I-labeled somatostatin-28 (+39%), glucagon-like peptide-1 (+35%), acyl ghrelin and glucagon (+32%), insulin and kisspeptin (+29%), nesfatin-1 (+28%), leptin (+21%) and peptide YY3-36 (+19%) compared to standard processing (EDTA blood on ice, p&#160;&#60;0.001). High performance liquid chromatography showed the elution of endogenous acyl ghrelin at the expected position after RAPID processing, while after standard processing 62% of acyl ghrelin were degraded resulting in an earlier peak likely representing desacyl ghrelin. After RAPID processing the acyl/desacyl ghrelin ratio in blood of normal weight subjects was 1:3 compared to 1:23 following standard processing (p&#160;= 0.03). Also endogenous kisspeptin levels were higher after RAPID compared to standard processing (+99%, p&#160;= 0.02). The RAPID blood processing method can be used in humans, yields higher peptide levels and allows for assessment of the correct molecular form.

The RAPID blood processing method can be used in humans and yields higher peptide levels as well as allows for assessment of the correct molecular form. Therefore, this method will be a valuable tool in peptide research.

Kan işleme için hızlı bir yöntem insan kanı plazma peptid düzeylerinin veriminin arttırılması için

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Multi-Stream Perfusion Bioreactor Integrated with Outlet Fractionation for Dynamic Cell Culture

Certain cell and tissue functions operate within the dynamic time scale of minutes to hours that are poorly resolved by conventional culture systems. This work has developed a low-cost perfusion bioreactor system that allows culture medium to be continuously perfused into a cell culture module and fractionated in a downstream module to measure dynamics on this scale. The system is constructed almost entirely from commercially available parts and can be parallelized to conduct independent experiments in conventional multi-well cell culture plates simultaneously. This video article demonstrates how to assemble the base setup, which requires only a single multichannel syringe pump and a modified fraction collector to perfuse up to six cultures in parallel. Useful variants on the modular design are also presented that allow for controlled stimulation dynamics, such as solute pulses or pharmacokinetic-like profiles. Importantly, as solute signals travel through the system, they are distorted due to solute dispersion. Furthermore, a method for measuring the residence time distributions (RTDs) of the components of the perfusion setup with a tracer using MATLAB is described. RTDs are useful to calculate how solute signals are distorted by the flow in the multi-compartment system. This system is highly robust and reproducible, so basic researchers can easily adopt it without the need for specialized fabrication facilities.

This paper presents a method to construct and operate a low-cost, multichannel perfusion cell culture system for measuring the dynamics of secretion and absorption rates of solutes in cellular processes. The system can also expose cells to dynamic stimulus profiles.

Dinamik Hücre Kültürü için Çıkış Fraksiyonasyonu ile Entegre Çok Akışlı Perfüzyon Biyoreaktörü

Certain cell and tissue functions operate within the dynamic time scale of minutes to hours that are poorly resolved by conventional culture systems. This ...

In Vitro Microfluidic Disease Model to Study Whole Blood-Endothelial Interactions and Blood Clot Dynamics in Real-Time

The formation of blood clots involves complex interactions between endothelial cells, their underlying matrix, various blood cells, and proteins. The endothelium is the primary source of many of the major hemostatic molecules that control platelet aggregation, coagulation, and fibrinolysis. Although the mechanism of thrombosis has been investigated for decades, in vitro studies mainly focus on situations of vascular damage where the subendothelial matrix gets exposed, or on interactions between cells with single blood components. Our method allows studying interactions between whole blood and an intact, confluent vascular cell network.
By utilizing primary human endothelial cells, this protocol provides the unique opportunity to study the influence of endothelial cells on thrombus dynamics and gives&#160;valuable insights into the pathophysiology of thrombotic disease. The use of custom-made microfluidic flow channels allows application of disease-specific vascular geometries and model specific morphological vascular changes. The development of a thrombus is recorded in real-time and quantitatively characterized by platelet adhesion and fibrin deposition. The effect of endothelial function in altered thrombus dynamics is determined by postanalysis through immunofluorescence staining of specific molecules.
The representative results describe the experimental setup, data collection, and data analysis. Depending on the research question, parameters for every section can be adjusted including cell type, shear rates, channel geometry, drug therapy, and postanalysis procedures. The protocol is validated by quantifying thrombus formation on the pulmonary artery endothelium of patients with chronic thromboembolic disease.

We present an in vitro vascular disease model to investigate whole blood interactions with patient-derived endothelium. This system allows the study of thrombogenic properties of primary endothelial cells under various circumstances. The method is especially suited to evaluate in situ thrombogenicity and anticoagulation therapy during different phases of coagulation.

In Vitro Mikroakışkan Hastalık Modeli Gerçek Zamanlı Olarak Tam Kan-Endotel Etkileşimleri ve Kan Pıhtısı Dinamikleri Çalışma

The formation of blood clots involves complex interactions between endothelial cells, their underlying matrix, various blood cells, and proteins. The ...

Preparation of Peripheral Blood Mononuclear Cell Pellets and Plasma from a Single Blood Draw at Clinical Trial Sites for Biomarker Analysis

Analysis of biomarkers in peripheral blood is becoming increasingly important in clinical trials to establish proof of mechanism to evaluate effects of treatment, and help guide dose and schedule setting of therapeutics. From a single blood draw, peripheral blood mononuclear cells can be isolated and processed to analyze and quantify protein markers, and plasma samples can be used for the analysis of circulating tumor DNA, cytokines, and plasma metabolomics. Longitudinal samples from a treatment provide information on the evolution of a given protein marker, the mutational status and immunological landscape of the patient. This can only be achieved if the processing of the peripheral blood is carried out effectively in clinical sites and samples are properly preserved from the bedside to bench. Here, we present an optimized general-purpose protocol that can be implemented at clinical sites for obtaining PBMC pellets and plasma samples in multi-center clinical trials, that will enable clinical professionals in hospital laboratories to successfully provide high quality samples, regardless of their level of technical expertise. Alternative protocol variations are also presented that are optimized for more specific downstream analytical methods. We apply this protocol for studying protein biomarkers against DNA damage response (DDR) on X-ray irradiated blood to demonstrate the suitability of the approach in oncology settings where DDR drugs and/or radiotherapy have been practiced as well as in preclinical stages where mechanistic hypothesis testing is required.

This protocol details clinically implementable preparation of high quality PBMC and plasma biosamples at the clinical trial site that can be used for translational biomarker analysis.

Biyobelirteç Analizi için Klinik Çalışma Alanlarında Tek Bir Kan Çekiminden Periferik Kan Mononükleer Hücre Peletleri ve Plazma Hazırlanması

Analysis of biomarkers in peripheral blood is becoming increasingly important in clinical trials to establish proof of mechanism to evaluate effects of ...