Bu, dolaşımdaki serbest DNA'ya dayanan aşağı akış sıvı biyopsi uygulamaları için kan örneklerinin işlenmesi ve depolanması için standart bir protokoldür. Bu, teknik birkaç yıldır kullanılmasına rağmen, yayınlanan ilk standart protokoldür. Çoğu çeviri veya bilimsel laboratuvarda bulunan standart ekipmanlarla takip etmek kolaydır.
Protokol tüm laboratuvar personeli tarafından gerçekleştirilebilir. Protokol, numuneleri toplama ve saklama şeklimizi standartlaştırmaya yardımcı olur, bu da sonuçta klinikte etki yaratacak ve hassasiyetin en önemli olduğu aynı veya benzer aşağı akış analizini gerçekleştiren farklı merkezler arasındaki değişkenliği azaltacaktır. Bu yöntem özellikle onkoloji araştırmalarında ve klinik uygulamalarda yararlıdır.
Bununla birlikte, sıvı biyopsisinin de kullanıldığı diğer kanser dışı hastalıklarda da uygulanabilir. Kan örneği santrifüj edildikten sonra, ne kadar plazma veya serumun çıkarılacağını bilmek zor olabilir, ancak bu özel yönergeleri takip etmek bu konuda yardımcı olacaktır. Protokolün geri kalanını laboratuvarda sınırlı deneyimle takip etmek çok kolaydır.
Prosedürü gösteren, laboratuvarımızdan bir teknisyen olan Jorge olacaktır. Başlamak için, oda sıcaklığında taze kan içeren tüpü, maksimum mola uygulanarak, 1600 kez g'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın. Tüpü santrifüjden dikkatlice çıkarın.
Serum süpernatantının üst fazı berrak ve sarımsı görünecektir. Numunenin hemoliz belirtileri gösterip göstermediğini kontrol edin ve uygun olduğunda hemoliz varlığını kaydedin. Sınıf II biyogüvenlik kabininde, serumu toplama tüplerine 250 mikrolitrelik alikotlar olarak aktarın.
Aliquots doğru etiketlenmelidir. Serumu hemen saklama kutusunda eksi 80 santigrat derecede dik olarak dondurun ve numune depolama süresini kaydedin. Örneklerin gerekli dört saatlik zaman dilimi içinde işlendiğini doğrulayın.
EDTA tüpünü oda sıcaklığında 1600 kez g'de 10 dakika boyunca santrifüj edin, maksimum mola uygulanır. Santrifüjlemeden sonra, plazma süpernatantı berrak ve sarımsı görünecektir. Numunenin hemoliz belirtileri gösterip göstermediğini kontrol edin ve plazmayı tek kullanımlık bir serolojik pipet kullanarak hücresel tabakayı rahatsız etmeden 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.
Hücre tabakasının üzerinde yaklaşık beş milimetrede küçük bir plazma kalıntısı hacmi bırakın. Hemoliz gözlenirse, daha fazla analiz için numuneyi atın. İlk santrifüjleme adımından taşınan artık sağlam kan hücrelerini çıkarmak için plazmayı ve 15 mililitrelik bir santrifüj tüpünü santrifüj yapın.
Tüpün altındaki hücre peletini değil, tüpü santrifüjden dikkatlice çıkarın ve tek kullanımlık bir serolojik pipet kullanarak bir ila dört mililitre polipropilen kriyojenik bios veya Eppendorfs'a bir ila dört mililitre plazma aktarın. Plazmanın kan hücreleri ile kirlenmesini önlemek için tüpün dibinde artık bir plazma hacmi bırakılmalıdır. Plazmayı hemen saklama kutusunda eksi 80 santigrat derecede dik olarak dondurun ve numune depolama süresini kaydedin.
Numunelerin doğru şekilde etiketlendiğini ve gerekli dört saatlik zaman dilimi içinde işlendiğini doğrulayın. Bir P1000 ve filtrelenmiş uç kullanarak hücresel tabakayı toplayın ve iki mililitrelik bir tüpe aktarın. Hemen dondurun ve eksi 80 santigrat derecede saklayın.
Aşağı akış uygulamaları için kullanılabilecek yüksek kaliteli cfDNA ekstraksiyonunun bir örneği burada gösterilirken, bu grafik görüntü yüksek düzeyde genomik kontaminasyona sahip uygun olmayan bir numunenin bir örneğini temsil etmektedir. Plazma veya serum fraksiyonu sarı renkte olmalıdır. Bu, bireysel örneğe bağlı olarak değişebilir.
Hemolizli örnekler atılmalıdır. Plazma fraksiyonunu çıkarırken herhangi bir hücre peletini çıkarmamaya dikkat edin. Bu protokol, immün tespit teknikleri kullanılarak serum ve plazma örneklerinde kodlanamayan RNA'ların veya proteinlerin tespiti gibi diğer nükleik asit bazlı ve protein uygulamaları için de kullanılabilir.
Bu, birçok laboratuvarda kullanılan çok standart bir tekniktir. Bu protokol, araştırmacıların analizimizi nasıl yaptığımızı standartlaştırmalarına yardımcı olur, çünkü bu, gelecekteki klinik uygulamalar için gerekli olan çok önemli bir husustur.
