PBMC ve plazma örneklerinin erken klinik gelişimde elde etmesi kolay ve son derece bilgilendiricidir. Bu sağlam protokol, klinik bölgelerde sunulan ön analitik değişkenliği en aza indirir. Bu protokol hızlı ve kolaydır, kanı PBMC'lere ve plazmaya işlemek için temel laboratuvar ekipmanı ve minimum operatör uzmanlığı gerektirir.
Hastanelerdeki yoğun laboratuvar günleriyle uyumludur. Bu protokolden kaynaklanan kan bileşenlerinin aşağı akış analizi, farmakokinetik ve farmakodinamik ilişkileri, ilaç doz planlamasını ve hedef katılımın kanıtını bilgilendirebilir ve hem gerçek zamanlı hem de iç gözlemsel analizi destekleyen ilaç etki mekanizmaları hakkında içgörüler sağlayabilir. Bu protokolü onkoloji çalışmaları için, özellikle DNA hasar müdahale mekanizmalarını analiz etmek için kullanıyoruz.
Bununla birlikte, bu protokol tarafından toplanan malzemeler birçok hastalık alanında ve çoklu terapötik yöntemlerle ilgili olabilir. Örnek başına sekiz mililitre donör kanı aldıktan sonra, kanın çekildiği zamanı kaydedin ve antikoagülan tedavi edilen kan örneklerini radyasyon için etiketlenmiş tüplerin her birine aktarmadan önce her tüpü sekiz ila 10 kez hafifçe ters çevirin. Klinik örnekler için, tüpleri ters çevirdikten hemen sonra santrifüj edin.
0.2 gri tüpleri önceden ısıtılmış bir x-ray kabinine yerleştirin, kapıyı kapatın ve tüplere 0.2 gri doz uygulayın. Düşük doz ışınlanmış tüpleri yedi gri tüple değiştirin ve yüksek doz ışınlama örneklerine yedi gri radyasyon dozu uygulamak için dozu ayarlayın. Her iki örnek de ışınlandıktan sonra, tüplerin üçünü de bir saat boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.
Hücreleri yüksek hızlı santrifüjleme ile ayırmadan önce numuneleri hücre hazırlama tüplerine aktarın, üniteleri x g veya eşdeğer RCF olarak ayarladığından emin olun. Santrifüjlemeden sonra, plazma, kırmızı kan hücresi ve buffy kat katmanlarını tanımlamak için tüpleri karanlık bir arka plana karşı görüntüleyin. Serolojik bir pipet kullanarak, plazmanın yaklaşık yarısını buffy kat tabakasını bozmadan etiketli 15 mililitre konik santrifüje aktarın ve plazma tüpünü ıslak buzda saklayın.
Ardından, buffy kat tabakası içeren tüm PBMC'yi yeni bir 15 mililitrelik tüpe aktarmak için bir mera pipeti kullanın ve PBMC'ye oda sıcaklığı PBS'yi numune başına 15 mililitrelik son hacme ekleyin. Hücreleri beş kez ters çevrilerek hafifçe karıştırın ve santrifüj ünitelerini kontrol etmeyi sağlamak için hücreleri daha düşük bir hızda santrifüjleme ile toplayın. Son 500 mikrolitrelik süpernatant hariç hepsini peletleri bozmadan aspire edin.
Her tüpe 10 mililitrelik son hacme taze PBS ekleyin ve tüpleri hafifçe ters çevirerek yeniden diriltin. Sayım için hücrelerin 40 mikroliter aliquots kullanın. Sayma yaptıktan sonra, hücreleri başka bir santrifüjle toplayın ve peletleri bozmadan mümkün olduğunca fazla süpernatantı çıkarın.
PBMC'yi daha sonra işlemek üzere saklamak için, peletleri numune başına 50 mikrolitre taze PBS'de hafif pipetleme ile yeniden depolayın ve her hücre süspansiyonunu ıslak buz üzerinde etiketli 1,5 mililitre cryovial'a aktarın. Daha sonra hücreleri tercih edilen yöntemle flaşla dondurun ve eksi 80 derecede bir dondurucu kutuya yerleştirin. Hücrelerin dondurulduğu zamanı kaydedin.
Alternatif olarak, peletleri numune başına bir mililitre veya donma karışımında yeniden depolayın ve hücre süspansiyonlarını tek tek etiketli cryovials'a aktarın. Daha sonra tüpleri ve önceden soğutulmuş dondurma kutularını eksi 80 santigrat derece depolama için yerleştirdi. Plazmayı dondurmak için, kalan peleti bozmadan beş iki mililitre mikrotüpün her birine bir mililitreye kadar plazma ekleyin ve her tüpteki toplam plazma hacmini kaydedin.
Ardından, plazma aliquots'u hemen eksi 80 santigrat derece dondurucuda dik bir yönde dondurun. Örneklerin Batı blot analizi için, peletı her tüpte, hücre pelet hacmininkine eşit proteaz ve fosfataz inhibitörleri ile desteklenmiş uygun bir lizis tamponu hacmi ile hafif pipetleme ile yeniden ıslatın ve hücre örneklerini buzda 10 dakika kuluçkaya bırakın. Kuluçkanın sonunda, örnekleri 1,5 mililitre tüplere aktarın ve dört santigrat derecede döngüler dışında 30 saniyede üç 30 saniye ile sonicate edin.
Numuneleri santrifüjleme ile toplayın ve süpernatantları yeni 1,5 mililitre tüplere aktarın. Daha sonra, yükleme tamponu ile numune başına 40 mikrogram karıştırın ve numuneleri beş dakika kaynatın. Şerit başına her numuneden 20 mikrogramı %4-12 Bis-Tris protein jelinde kopya olarak yükleyin ve bir SDS-PAGE çalıştırın.
Sekiz mililitre kandan elde edilen hücre sayısı hasta ve hastalık ayarına göre değişmektedir. Genel olarak, hücre peleli küçük boyutlu ve şeffaf beyaz renktedir. Bazen peletler, preparatın kalitesi üzerinde olumsuz bir etkiye sahip olan bazı kırmızı kan hücresi kirlenmesine sahip olabilir.
Bu protokolü kullanan kronik lenfositik lösemi hastasından tipik bir verim, mililitre başına 1,62 ila 19,77 miligram arasında değişen nihai protein konsantrasyonu ile sekiz mililitre mononükleer hücre preparabı başına 1,62 çarpı 10 ila 1,99 çarpı 10 ila dokuzuncu hücreler arasında değişir. Üç hasta örneğinin bu temsili analizinde, daha yüksek iyonlaştırıcı radyasyon dozlarında çeviri sonrası modifikasyonlarda bir artış gözlenmiştir. İlginçtir ki, ataksi-telanjiektazi fosforilasyonu mutasyona uğradı ve RAD50, 0.2 grinin düşük dozunda önemliydi, bu da çeviri sonrası bu değişikliklerin tümörde iyi bir dinamik aralıkta DNA çift iplikçik kırılmalarının yanı sıra periferik kan örneklerinin üretilmesini içeren tedaviler için farmakodinamik biyobelirteçler olarak uygulanabilir bir şekilde sorgulanabileceğini göstermektedir.
En uygun numune hazırlığı için, kanı oda sıcaklığında toplamadan sonraki bir saat içinde işleyin, numuneleri doğru bir şekilde santrifüjleyin ve buffy paltoyu ayırt edebilmek için tüpü karanlık arka plana doğru görüntüleyin.
