Yazarlar Biyomarkörler ve IMMUNO-deneyleri katkıları kabul etmek istiyorum ürün geliştirme ekibi tahlil gelişimi için. Buna ek olarak, Vigene teknoloji, Inc veri analizi yazılım paketleri tasarlama ortak çabaları için teşekkür etmek istiyorum.

tüm hayvan deneyleri bakım ve kullanım laboratuvar hayvanları için kılavuzu içinde yer NIH öneriler göre gerçekleştirilen ve BioLegend, IACUC tarafından kabul edildi.
 <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56440/56440fig1.jpg" /> Resim 1: Filtre plaka tahlil yordamı Özeti. Filtre plakaları kullanarak tahlil gerçekleştirmek için protokol anahtar tahlil bileşenleri ve kuluçka adımları gösteren bir diyagram olarak temsil edilir. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56440/56440fig1large.jpg" target="_blank"> Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
 1. biyolojik örnek hazırlık Not: kan toplama hacmi ve seçilen anatomik site her bireysel araştırmacı takdirine bırakılır ve tahlil sonucunu etkilemez. Bir kez onlar elde edilir, ancak, örnekleri aşağıda listelenen adımları göre ele alınmalıdır.
<ol><li>Serum numuneleri hazırlık <ol><li>tercih edilen toplama tüp içine kan istenen hacmi toplamak ve en az 30 dk pıhtısı izin</li>
		<li>Örnek için oda sıcaklığında 1000 x g, 10 dk santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Çıkarın serum ve hemen tahlil veya aliquot polipropilen microcentrifuge tüpler içine ve örnekleri, saklayın &#8804; -20 ° c</li>
	</ol></li> <li>Plazma numuneleri hazırlık <ol><li>toplamak istediğiniz birimin ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) kullanarak kan kan toplama tüpler kaplı.</li>
		<li>Koleksiyonu 10 dk, 30 dk içinde oda sıcaklığında 1000 x g için santrifüj.</li>
		<li>Çıkarın plazma ve hemen tahlil veya aliquot polipropilen microcentrifuge tüpler içine ve örnekleri, saklayın &#8804; -20 ° c</li>
	</ol></li> <li>Hazırlık doku kültürü süpernatant örnekleri <ol><li>örnek için 1.500 x g 4 ° C'de hücreler ve enkaz kaldırmak için de 10 dk santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Adlı toplamanız süpernatant ve hemen tahlil veya aliquot polipropilen microcentrifuge tüpler içine ve &#8804; -20 ° c</li>
	</ol></li> <li>Çözdürme donmuş biyolojik örnekleri <ol><li>tamamen buz ve girdap kullanmadan önce kısa bir süre daha önce dondurulmuş herhangi bir biyolojik örnekler çözülme. 2'den fazla donma/çözülme döngüsü önlemek. 
		Not: Bu protokol için kullanılan örnekleri BALB/c fare splenocytes kültür tarafından elde edilmiştir (1 x 10 6 hücreler çeşitli koşullar altında 37 ° C + %5 CO 2: unstimulated, LPS (100 ng/mL), αCD3 (1 µg/plaka kaplı mL) + αCD28 (1 µg/mL çözünür), PMA (20 ng/mL) + Ionomycin (500 ng/mL). Kültür supernatants 48 saat sonra toplanmıştır ve 1.3 bölümünde açıklandığı gibi işlenebilir.</li>
	</ol></li></ol> 2. Reaktif hazırlık <ol><li>Preparation of Pre-mixed Antibody-Immobilized boncuk <ol><li>Sonicate öncesi karışık boncuk şişe bir sonicator banyoda oda sıcaklığında ve sonra girdap kullanmadan 30 s önce için 1 dk için. Sonicator banyo yok varsa, 1 dk. girdap süresini artırmak</li>
	</ol></li> <li>Hazırlık yıkama arabellek <ol><li>Bring 20 x yıkama arabellek (20 x PBS % 1 ile ara-20) oda sıcaklığında ve tüm tuzları çözümü haline getirmek için girdap kit ile sağlanan.</li>
		<li>20 x 475 mL deiyonize su ile yıkama tampon 25 mL seyreltik. 2 ° C ve bir ay boyunca 8 ° C arasında kullanılmayan kısmı mağaza.</li>
	</ol></li> <li>Matris B hazırlık (Serum ve plazma örnekleri yalnızca ile kullanmak için) <ol><li>5.0 için liyofilize matris B. izin ver en az 15 dk tam reconst için içeren şişe seti dahil mL tahlil arabellek (PBS % 1 BSA ile) ekleyin itution, o zaman girdap iyice karıştırın. Artık Sulandırılan matris B depolanan &#8804;-70 ° C en fazla bir ay için.</li>
	</ol></li></ol> 3. Standart hazırlık Not: Bu bölmedeki her analit 10.000 pg/mL bir üst standart konsantrasyonu vardır.
<ol><li>Ekleyin 250 µL tahlil lyophilized fare Th sitokin standart kokteyl reconstitute için arabellek. Mix kısaca vortexing tarafından ve oda sıcaklığında için 10 dk. oturup şişeyi sağlar</li>
	<li>Transfer standart kokteyl etiketli bir polipropilen microcentrifuge tüp &#34; C7 &#34;. Bu üst standart kullanılacaktır.</li>
	<li>Etiket 6 polipropilen microcentrifuge tüpler C6, C5, C4, C3, C2 ve C1.</li>
	<li>Her birine bu tüpler tahlil arabelleği eklemek 75 µL.</li>
	En iyi standart C7 C6 tüp ve mix de vortexing tarafından <li>transfer 25 µL. Bu C6 standart olacak.</li>
	<li>Seri performans devam yeni damlalıklı kullanarak 1:4 dilutions sonraki en düşük standart tüp vortexing tarafından takip tahlil arabelleği µL 75 25 µL önceki standart eklemek her tüp için standartlar C5, C4, C3 elde etmek için ipucu , C1 ve C2. (C0) 0 pg/mL standart olarak tahlil arabellek kullanın.</li>
</ol> 4. Örnek seyreltme Not: Bu tahlil ile birden fazla dilutions kullanarak ön pilot deneyleri biyolojik örneklerin belirli bir küme için en uygun seyreltme faktörü belirlemek için gerekli olabilir. Uygun seyreltme faktörü standart eğri sınırları içinde yalan toplama hesaplamaları için örnek üretecek. Aşağıdaki adımları yönergelerine içindir ve ampirik olarak örnek türüne bağlı olarak belirlenecek olabilir.
<ol><li>Dilute serum ya da plazma örnekleri 2 kat tahlil arabelleği ile (örn. örnek 50 µL 50 µL tahlil arabelleği ile seyreltik) polipropilen microcentrifuge tüpler. 
	Not: daha fazla Numune dilüsyonu gerekliyse, dilutions matris B ile tahlil tampon yerine doğru ölçüm sağlamak için yapılmalıdır. Seyreltme olmadan ekleyerek serum veya plazma numuneleri düşük tahlil doğruluk neden olur ve filtre plaka yapışmasına neden. Matris B havuza alınan fare serum endojen tahlil hedefleri tükenmiş oluşur. Uzun etkiler analitik duyarlılık için bilinen matris etkilerinden korunmak için bir serum veya plazma örnek seyreltici kullanılır.</li>
	<li>Test hücre kültür süpernatant örnekleri olmadan seyreltme. 
	Not: Büyük ölçüde örnek örnek analit düzeyleri farklılık gösterebilir. Gerekirse, onların karşılık gelen hücre kültür orta veya tahlil arabellek taze bir hazırlık kullanarak süpernatant örnekleri sulandırmak.</li>
</ol> 5. Tahlil yordam Not: Polipropilen filtre plakaları, mikro FACS tüpler veya V-alt Mikroplaka tahlil gerçekleştirilebilir. Filtre plaka tahlil yordamı iyi örnek için örnek nedeniyle tutarlılık, tahlil sağlamlık ve işleme kolaylığı önerilir. Bu yordam bir vakum filtrasyon ünitesi (son kullanıcı tarafından sağlanan) yıkama gerektirir.
<ol><li>Oda sıcaklığında (20-25 ° C) sıcak tüm reaktifler kullanılmadan önce izin.</li>
	<li>Kümesi filtre plaka üzerinde bir ters plaka kapak her zaman tahlil kurulum ve kuluçka adımları uyguladığınızda, böylece alt plaka sızıntı neden olabilir gibi herhangi bir yüzey dokunmatik değil.</li>
	<li>Plaka boncuk kaybetmemek için çamaşır adımlar da dahil olmak üzere tüm tahlil işlem sırasında dik tutmak.</li>
	<li>Karanlık veya tüm kuluçka adımlar için alüminyum folyo ile sarılmış plaka devam.</li>
	<li>Tüm standartları ve örnekleri çiftleri bir sırayla tabakta düzenlenmiş, farklı çalıştır.</li>
	<li>Filtre plaka her şey için 1 yıkama arabellek x 100 µL ekleyerek önceden ıslak ve oda sıcaklığında 1 dk (filtre alt Mikroplaka kullanıyorsanız) oturmak izin.</li>
	<li>Vakum manifold (5-10 lar) kullanarak Kaldır Tampon birim. 10 aşmamak &#34; Hg vakum. Fazla yıkama leke Kalenin altından bir yığın temiz kağıt havlu üzerinde plaka basarak tampon. Plaka ters plaka kapak üstüne yerleştirin. 
	Not: Eğer bir V-alt Mikroplaka veya mikro FACS borular kullanarak tahlil gerçekleştirme adımları 5.1-5.2 atlanabilir.</li>
	<li>Hücre kültür süpernatant örnekler için tahlil arabelleği 25 µL bütün wells için ekleyin. Her standart 25 µL standart wells için ekleyin. 25 µL her örneği için örnek wells ekleyin.</li>
	<li>Serum veya plazma numuneleri ölçmek için matrisin b 25 µL eklemek için standart wells. Tahlil arabelleği 25 µL örnek wells için ekleyin. Her standart 25 µL standart wells için ekleyin. 25 µL her seyreltik serum veya plazma örneği için örnek wells ekleyin.</li>
	<li>Girdap boncuk için 30 s. 25 eklemek µL karışık boncuk boncuk şişe zaman zaman yerleşme boncuk önlemek için sallayarak her de karışık. Son hacim boncuk eklenmesinden sonra her iyi 75 µL olmalıdır.</li>
	<li>Bir tabak mühürleyen ile plaka mühür. Alüminyum folyo ile ters plaka kapak dahil olmak üzere tüm plaka sarın. Plaka üzerinde bir plaka shaker yer, güvenli ve oda sıcaklığında 2 h için yaklaşık 500 rpm'de sallamak. Sızıntı önlemek için pozitif basınç plaka sealer için geçerli değildir.</li>
	<li>Ters çevirme olmadan, plaka üzerinde vakum manifold yerleştirin ve vakum daha önce olduğu gibi uygular ve her şey için 1 yıkama arabellek x 200 µL ekler.</li>
	<li>Vakum filtrasyon tarafından tahlil plaka wells içeriğini kaldırın. Fazla yıkama arabellek bir emici ped ya da kağıt havlu ile plaka altındaki leke. Bir kez daha bu işlemi tekrarlayın. 
	Not: tahlil gerçekleştirilirse V-alt Mikroplaka veya mikro FACS kullanarak atla adım 5.12 ve 5.13 tüpleri. Bunun yerine 1000 x g oda sıcaklığında 5 min için plaka santrifüj kapasitesi, daha sonra bir çok kanallı pipet kullanarak süpernatant kaldırmak.</li>
	<li>Ekle 25 µL antikorların (bkz: malzemeler tablo) algılama için her şey.</li>
	<li>Taze plaka mühürleyen ile plaka mühür. Alüminyum folyo ile ters plaka kapak dahil olmak üzere tüm plaka sarın.</li>
	<li>Plaka üzerinde bir plaka shaker yerleştirin ve yaklaşık 500 RPM oda sıcaklığında 1 h için sallamak.</li>
	<li>Vakumlama olmadan, SA-PE reaktif 25 µL doğrudan her şey için ekleyin. Hiçbir seyreltme reaktif gereklidir.</li>
	<li>Taze plaka mühürleyen ile plaka mühür. Alüminyum folyo ile ters plaka kapak dahil olmak üzere tüm plaka sarın.</li>
	<li>Plaka üzerinde bir plaka shaker yerleştirin ve yaklaşık 500 RPM, oda sıcaklığında 30 dakika çalkalanır.</li>
	<li>Adım işlemini tekrarlayın yukarıdaki 5.13.</li>
	<li>Eklemek 200 µL 1 x yıkama arabellek her şey. 1 dk. bir plaka shaker üstündeki yeniden askıya</li>
	<li>Bir çok kanallı damlalıklı kullanarak, örnekleri örnekleri üzerinde bir Akış Sitometresi okumak için FACS tüpler için filtre plaka transfer. 
	Not: Numune hacmi 200 µL için 300 µL çalışan kuru örnek önlemek için her tüp bir ekstra 100 µL yıkama arabellek x 1 ekleyerek artırılabilir. Gerekli örnekleri, depolanmış olabilir Eğer 4 ° C ışıktan korunan ve ertesi gün analiz. Ancak, uzun süreli örnek depolama için düşük sinyal açabilir.</li>
</ol> 6. Akış Sitometresi kurulum Not: güvenilir veri oluşturmak için Akış Sitometresi düzgün veri toplama önce ayarlanmış olması gerekir. Bu işlem bazı açısından belirli enstrüman tahlil gerçekleştirilir yapılandırmasına bağlı olarak tek tek kullanıcılar için değişiklik gösterir. Genelleştirilmiş kurulum işlemi bir sitometresi PE ve APC ölçmek mümkün ve her ikisi ile donatılmış için 488 ve 633 nm lazer aşağıda ele.
<ol><li>Üretici göre Akış Sitometresi ve satın alma yazılım başlatmak &#39; araç ile sağlanan s yönergeleri.</li>
	<li>Oluşturma bir nokta komplo FSC (ileri dağılım) x ekseni ve y ekseni için SSC (yan dağılım) ile. Doğrusal modu için FSC ve SSC ayarlayın.</li>
	<li>İkinci bir nokta çizim için y ekseni PE x ekseni ve APC ile oluşturma. Bu arsa bir günlük tabanlı görüntü moduna ayarlanmalıdır.</li>
	<li>Girdap ham boncuk kiti 30 dahil şişe s boncuk yeniden askıya alma. Bu boncuklar ve dahili bir APC boya içeren iki boyutu nüfus oluşmaktadır.</li>
	<li>Yeni bir FACS tüp için ham boncuk transfer 400 µL.</li>
	<li>Akış Sitometresi debisi düşük ayarla.</li>
	<li>Her iki boyutu nüfus bu boncuk gözle görülür ayrılmış ve kapı kolay olması dikkatli bir şekilde kazanç ve gerilim FSC ve SSC için ayarlama ham boncuk çalıştırın.</li>
	<li>İstenmeyen olaylar (Yani enkaz veya hava kabarcıkları) dışlamak için FSC eşik ayarlayın.</li>
	<li>İçinde FSC vs SSC arsa, tüm boncuk örneğin alınma olasılığını içerir bir kapı çizin. 
	Not: Ham boncuk boncuk, iki boyutu nüfus içeren küçük &#34; bir boncuk &#34; ve büyük &#34; B boncuk &#34; bölgeler.</li>
	<li>FSC SSC arsa geçişli boncuk gruplarından PE x ekseni ve APC ile ikinci nokta arsa üzerinde görüntülemek için y ekseni.</li>
	<li>Tüm nüfus boncuk için 1 x 10 1 ve 5 x 10 3 arasında yatıyor medyan floresan yoğunluğu (MFI) APC sinyal var APC Floresans kanal için Devresel_ödeme gerilim ayarlayın.</li>
	<li>Girdap PE kurulum şişe için 30 boncuk boncuk yeniden askıya için s.</li>
	<li>Transfer 400 µL PE boncuk yeni bir FACS tüp.</li>
	<li>Ham boncuk tüp üzerinden akış sitometresi PE ile değiştir boncuk tüp.</li>
	<li>Ayarlamak photomultiplier tüp (PMT) gerilim MFI PE boncuk bulunan çok özel Aralık arasında düşer sağlamak için PE Floresans kanal ayarı PE boncuk şişe üzerinde listelenen için. 
	Not: PE kurulum boncuk boncuk bir popülasyon boyutu içeren (&#34; bir boncuk &#34; sadece).</li>
</ol> 7. Veri toplama Not: veri belirli bir cihazda edinimi ile ilgili tam yordamlar değişebilir ve sitometresi üzerinde bağımlı olan &#39; s yapılandırma özellikleri ve kullanılan arabirim yazılımı. Aşağıdaki talimatlar bu nedenle assay olarak istihdam sitometresi ne olursa olsun tahlil alınması için gereken adımlar vurgulamak için tasarlanmıştır.
<ol><li>Sitometresi akış hızı hala olarak doğrulayın düşük.</li>
	<li>Yaklaşık 300 başına analit için elde edilebilir için boncuk olayların sayısını ayarlayın. 13-plex için bu eşittir 3900 olaylar elde etmek paneli birlikte her iki Boncuk boyutu gruplarından (A + B boncuklar).</li>
	<li>Girdap her örnek için 5 s analiz önce.</li>
	<li>Okunur örnekleri. Örnekleri okurken, Akış Sitometresi kurulum ilk modunda ve boncuk nüfus satın alma moduna geçmeden önce stabil kadar bekleyin.</li>
	<li>Basit ardışık veri dosyaları için numaralandırma ile veri çözümlemesini kolaylaştıran etmek için kullanın.</li>
	<li>Yalnızca (A + B boncuk bölgeler) geçişli olaylar yerine tüm olaylar ihracat.</li>
	<li>Tüm FCS dosyalarını her tahlil için aynı klasörde depolar. Birden çok testleri çalıştıran, her tahlil için ayrı bir klasör oluşturun.</li>
</ol> 8. Veri analizi için devam Not: Akış Sitometresi üretilen FCS dosyaları-var analiz ücretsiz 14-ebilmek var olmak downloaded veri analiz yazılımı kullanarak.
<ol><li>Veri analiz yazılımı install üstünde PC.</li>
	<li>Tüm tahlil FCS dosyaları analiz yazılımı içeren bilgisayara aktarmak.</li>
	<li>Belgili tanımlık ruhsat anahtar dongle (kit ile birlikte) bir bilgisayarın USB bağlantı noktasına takın.</li>
	<li>Veri analiz yazılımı başlatmak.</li>
	<li>Mavi tıklatın &#34; dosyaları ekle &#34; düğmesini ekranın üst kısmında bulunan.</li>
	<li>Görünür pencere açılır tahlil FCS dosyaları içeren klasöre gidin.</li>
	<li>Tıklayın ve tüm tahlil FCS dosyaları pencere açılır yazılım görüntüye sürükleyin. Tüm dosyaları şimdi bir listesinde görüntülenmesi gerekir.</li>
	<li>'I tıklatın yeşil &#34; sonraki &#34; ekranın sağ alt düğmesini. Sol tıklatın ve küçük sürüklemek için basılı tutun mavi standart eğri standart eğri tanımlamak için listeden ilgili FCS dosyalarına (C7 C0) düğmeleri.</li>
	<li>Yeşil tıklatın &#34; sonraki &#34; pencere gating açılır açmak için ekranın sağ alt düğmesini.</li>
	<li>Gating penceresinin sol tarafında her iki a girin ve B boncuk bölgeleri tahlil analit hedefleri ve onların ilişkili boncuk ID (tahlil ile sağlanan elle kurmak) artan sırada.</li>
	<li>Pencere açılır tepesinden gating aracını seçin ve FSC SSC arsa içinde 2 geçitleri, A boncuk etrafında bir ve ikinci B boncuk etrafında çizmek için kullanın.</li>
	<li>APC vs scatter araziler görünür FSC SSC arsa görünen PE gözden geçirin. A boncuk (sol çizgi) 6 analit bantlarında ve B boncuk (doğru çizgi) 7 analit bantlarında olacak. 
	Not: Gates el ile üst Silgi aracını seçip belirli bir kapı silmek için tıklatarak çizilmesi. Perdeleme aracı daha sonra seçili olabilir ve el ile bir kapı istenen bant bölgeye uygulamak için kullanılan.</li>
	<li>Yeşil tıklatın &#34; Tamam &#34; pencere gating açılır kapatmak ve FCS dosyalar listesine dönmek için düğmeyi.</li>
	<li>Tanımlamak için biyolojik örnek belirli bir dosya tıklayarak, seçerek sağ tarafından yapılan herhangi bir dilutions &#34; seyreltme kat &#34; menü ve giriş doğru değeri.</li>
	<li>Yeşil tıklatın &#34; çalıştırmak &#34; tahlil için standart eğriler oluşturmak ve bilinmeyen biyolojik örnekler konsantrasyonları hesaplamak için ekranın sağ alt düğmesini.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Stanley, A. C., Lacy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+for+cytokine+secretion.">Pathways for cytokine secretion.</a> Physiology (Bethesda). 25, 218-229 (2010).</li><li>Nicola, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+pleiotropy+and+redundancy:+a+view+from+the+receptor.">Cytokine pleiotropy and redundancy: a view from the receptor.</a> Stem Cells. 12, (1994).</li><li>Miyajima, A., Hara, T., Kitamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+subunits+of+cytokine+receptors+and+the+functional+redundancy+of+cytokines.">Common subunits of cytokine receptors and the functional redundancy of cytokines.</a> Trends Biochem Sci. 17, 378-382 (1992).</li><li>Costantini, S., Castello, G., Colonna, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Cytokinome:+a+new+challenge+for+systems+biology.">Human Cytokinome: a new challenge for systems biology.</a> Bioinformation. 5, 166-167 (2010).</li><li>Capone, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+Cytokinome+Profile+Evaluation:+A+Tool+to+Define+New+Diagnostic+and+Prognostic+Markers+of+Cancer+Using+Multiplexed+Bead-Based+Immunoassays.">Serum Cytokinome Profile Evaluation: A Tool to Define New Diagnostic and Prognostic Markers of Cancer Using Multiplexed Bead-Based Immunoassays.</a> Mediators Inflamm. , 3064643 (2016).</li><li>Schett, G., Elewaut, D., McInnes, I. B., Dayer, J. M., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+cytokine+networks+fuel+inflammation:+Toward+a+cytokine-based+disease+taxonomy.">How cytokine networks fuel inflammation: Toward a cytokine-based disease taxonomy.</a> Nat Med. 19, 822-824 (2013).</li><li>Tse, E., Kwong, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+lymphoma:+Microenvironment-related+biomarkers.">T-cell lymphoma: Microenvironment-related biomarkers.</a> Semin Cancer Biol. 34, 46-51 (2015).</li><li>Reale, M., Greig, N. H., Kamal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+chemo-cytokine+profiles+in+Alzheimer's+and+Parkinson's+diseases.">Peripheral chemo-cytokine profiles in Alzheimer's and Parkinson's diseases.</a> Mini Rev Med Chem. 9, 1229-1241 (2009).</li><li>Vistnes, M., Christensen, G., Omland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+cytokine+biomarkers+in+heart+failure.">Multiple cytokine biomarkers in heart failure.</a> Expert Rev Mol Diagn. 10, 147-157 (2010).</li><li>Gobel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+coagulation+factor+XII+drives+adaptive+immunity+during+neuroinflammation+via+CD87-mediated+modulation+of+dendritic+cells.">Blood coagulation factor XII drives adaptive immunity during neuroinflammation via CD87-mediated modulation of dendritic cells.</a> Nat Commun. 7, 11626 (2016).</li><li>Palm, A. K., Friedrich, H. C., Kleinau, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nodal+marginal+zone+B+cells+in+mice:+a+novel+subset+with+dormant+self-reactivity.">Nodal marginal zone B cells in mice: a novel subset with dormant self-reactivity.</a> Sci Rep. 6, 27687 (2016).</li><li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+Bcl11b+is+specifically+expressed+in+group+2+innate+lymphoid+cells+and+is+essential+for+their+development.">The transcription factor Bcl11b is specifically expressed in group 2 innate lymphoid cells and is essential for their development.</a> J Exp Med. 212, 865-874 (2015).</li><li>Pelly, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-4-producing+ILC2s+are+required+for+the+differentiation+of+TH2+cells+following+Heligmosomoides+polygyrus+infection.">IL-4-producing ILC2s are required for the differentiation of TH2 cells following Heligmosomoides polygyrus infection.</a> Mucosal Immunol. 9, 1407-1417 (2016).</li><li>. LEGENDplex Multiplex Assays Available from: <a target="_blank" href="https://www.biolegend.com/legendplex">https://www.biolegend.com/legendplex</a> (2017)</li><li>Autieri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-+and+anti-inflammatory+networks+in+atherosclerosis.">Pro- and anti-inflammatory networks in atherosclerosis.</a> ISRN Vascular Medicine. 2012, (2012).</li><li>West, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+cytokine+networks+in+colorectal+cancer.">Emerging cytokine networks in colorectal cancer.</a> Nat Rev Immunol. 15, 615-629 (2015).</li><li>Becher, B., Spath, S., Goverman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+networks+in+neuroinflammation.">Cytokine networks in neuroinflammation.</a> Nat Rev Immunol. 17, 49-59 (2017).</li></ol>

Yazarlar bu el yazması açıklanan Kimyasalları üreten BioLegend tarafından istihdam edilmektedir. Vigene teknoloji, Inc. bu el yazması açıklanan tahlil üretilen verileri çözümlemek için kullanılan LEGENDplex veri analiz yazılımı geliştirdi.

Bu protokol için tahlil biçimde deneyci sağlanan biyolojik örnek profillerinde çözünür arabulucu sağlam miktar için önerilen bir protokoldür aynılarını ve iyi laboratuar tekniği vardır sağlar.
Güvenilir sonuçlar sağlamak için takip edilmesi gereken birkaç temel adım vardır. İlk olarak, rekombinant standartları tahlil arabellek önerilen tam zamanlı ve sonra sadece polipropilen tüplerde seyreltilmiş reconstitute için izin gerekir. Polistren tüpler proteinler bağlılığı düşük sinyalleri için standart eğri oluşturma sırasında neden olabilir tüpler, duvarına yükseltebilirsiniz. İkinci, doğru sallayarak kuluçka adımları sırasında önemlidir. Uygun ajitasyon tahlil boncuk bağlama özellikleri ciddi engel. Buna ek olarak, kuluçka adımlar arasında uygun yıkama da gereklidir. Deneyci aşırı reaktifler kuyulardan protokol sonraki adımda başlıyor önce kaldırılır emin olmalısınız. Aletleri ayarları tahlil boncuk sorguya çekmek için kullanılan Akış Sitometresi için de optimize edilmiş olması gerekir. Özellikle, devresel_ödeme ayarları uygun boncuk ayrılık ve geniş dinamik aralığı standart Eğriler için emin olmak için ayarlanması gerekir. Son olarak, sadece üzerinde sitometresi önce analiz ediliyor, boncuk vortexed uygun süspansiyon sigorta ettirmeleri ve sonuçları çarpık toplamları oluşumunu önlemek için olmalıdır.
Bu iletişim kuralı, araştırmacı büyük, tam plaka deneyleri gerçekleştirmeden önce onların lizis protokolü en iyi duruma getirmek için istekli olması koşuluyla bu el yazması açıklanan örnek türleri yanı sıra doku homogenates de analiz için potansiyel olarak değiştirilebilir. Gerçek teknik tabii doku türüne bağlı olarak değişir; Ancak, genel olarak protokol iyonik tuzlar fizyolojik konsantrasyonları, denaturing hiçbir kimyasal madde ve tercihen hiç deterjanlar içeren bir nötr pH tampon kullanmanız gerekir. Deterjan kullanılmalıdır, non-iyonik deterjan konsantrasyonları (örneğin en fazla % 1) en azından tutulmalıdır. Arabellek aynı hedef proteinlerin proteolitik yıkımı önlemek için yeterli proteaz inhibitörleri içermelidir. Kullanılan lizis protokole bakılmaksızın son hazırlıklar tanecikleri analiz önce kaldırmak için centrifuged.
Tahlil ile ilgili sınırlamalar, biyolojik örnek türleri analit hedefleri konsantrasyonları büyük ölçüde değişebilir. Düzgün analitin konsantrasyonlarının ölçmek için onlar için standart eğri üst ve alt değerleri içinde olmalıdır. Değerleri eğrinin ekstrapolasyon mutlaka güvenilir değildir ve tavsiye etmiyorum. Araştırmacılar bu nedenle onların belirli örnekler tam plaka tahlil çalıştırmadan önce pilot deneylerde dilutions optimize etmek gerekir. Buna ek olarak, denetlesinler biyolojik örnekler dikkatli hazırlanması bu tahlil biçim başarısı için her şeyden önemlidir. Numunelerde olan, hemolyzed veya protein enkaz içeren örneklerini bu immunoassay temel prensibi tanımlamak antijen antikor etkileşimleri etkiler ve uninterpretable sonuçlar işlemek.
Bu tahlil çeşitli nedenlerden dolayı mevcut miktar yöntemler açısından önemlidir. Düzgün çalıştırdığınızda, tahlil biçim geleneksel ELISA testleri kullanarak örnek analiz etmek için gerekli olacağını daha çok küçük birimleri kullanarak bir örnek üzerinden en fazla 13 analitler quantitate. Bu tahlil biçimi de özel araçları gerçekleştirilmesi için gerek yoktur. Bu tahlil pek çok yaygın olarak kullanılan akış cytometers kullanarak çalıştırılabilir olarak piyasada bulunan diğer boncuk tabanlı uzun karşılaştırıldığında bir avantajdır.
Bilimsel araştırma rolüne salgılanan faktörler ve sitokin tarafından sağlık ağlarda oynadı ve hastalık genişletiyor. Bu el yazması tahlil biçimde bu çok yönlü ve karmaşık olayları anlamak isteyen araştırmacılar için değerli bir araç olabilir. Etkin Biyomedikal Araştırma programları sitokin ağları sadece gibi Genelleştirilmiş alanları iltihabı6rolü, aynı zamanda belirli hastalık durumlarında ateroskleroz, kanser ve neuroinflammation gibi içinde bağlamında keşfetmeye başlıyor 15,16,17. Hiç şüphesiz, soruşturma bu kronik koşulları tedavi etmek yeni tedavi için arama genişledikçe bu alanlarda büyümeye devam edecektir. Doğru ve güvenilir miktar bu hastalıklar ile ilişkili çözünür arabulucu ihtiyacını bir kritik araştırma öncelik olmaya devam edecektir.

Çözünen sinyal molekülleri olarak onların rolü, sitokinler ana bilgisayar immünolojik yanıt-e doğru yönetmek son derece koordineli ve multifaktöriyel işlemleri aracılık. İnflamatuar işleminden başlatılması için çözünürlük, tüm aşamalarında ifade edilir ve kendi sentezi ve bu onların hücresel reseptörleri1oluşan karmaşık etkileşim ağ düzenler. Bu iletişim ağı bileşenler arasında varolabilir sinerjik veya antagonistik ilişki gider bir karmaşıklığı ile katmanlı. Gerçekten de, birçok sitokinler gereksiz ya da en azından kısmen çakışan fonksiyonlar2,3paylaşmak için bilinir.
Aynı anda birden fazla sitokin analitler ölçmek entegre sistemleri Biyoloji yaklaşımlar şu anda altta yatan birden çok hastalık bağışıklık yanıtı alacak benzersiz cytokinomes giderek kapsamlı bir anlayış sağlamak 4,5devletler. Bu hastalık Birleşik arasında değişir yaygın iltihap kanser, nöro-dejeneratif koşulları ve kalp-damar hastalıkları6,7,8,9.
Böyle sitokin ağlar etkin bir şekilde kullanarak LEGENDplex boncuk tabanlı uzun sorguya çekilmeyi. Bu deneyleri sandviç Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) olarak aynı ilkeye dayanır ve kovalent bağlı onların yüzeye yakalama antikorlar ile kodlanmış Floresans mikroküreler kullanın. Bu antikorlar yüzey alanlarını çok geleneksel ELISA biçimleri tarafından gerekli olanlar daha küçük üzerinde immobilize. Bu aynı zamanda azaltılması non-spesifik bağlama ve sağlayan çeşitli analitlerin analizini multiplexed ise çok daha az numune hacmi ile gerçekleştirilecek bu tür deneyleri sağlar.
Bu protokol için açıklanan tahlil kadar 13 hedefleri aynı anda quantitate için bu teknolojiyi kullanır. Bu tahlil verilerinden çok çeşitli yaygın olarak bulunan akış cytometers kullanılarak elde edilebilir ve diğer kullanılabilir deneyleri özel tahlil özel araçları kullanımı gerektirmez. Doğrulanmış analit panelleri genişleyen bir katalog ile bu deneyleri birkaç devam eden Biyomedikal Araştırma Projeleri10,11,12,13' te kullanılmıştır.
Kolaylığı ve tahlil biçiminin bir fare T yardımcı sitokin panel quantitate için kullandığımız bu denemede yarar göstermek için sitokin konsantrasyonlarda doku kültürü supernatants altında birden çok kültürlü fare splenocytes elde edilen üzerinden 13 ayrı uyarıcı koşulları. Doku kültürü supernatants ek olarak, bu tahlil serum veya plazma numuneleri kullanılarak da gerçekleştirilebilir.

<table><tbody><tr><td>Allegra 6R Centrifuge with MICROPLUS Carrier Adaptor</td><td>Beckman Coulter</td><td>366816</td><td>For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional)</td></tr><tr><td>LEGENDplex Mouse T helper Cytokine Panel</td><td>BioLegend</td><td>740005</td><td>Multiplex Immunoassay (13-plex)</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD3&amp;epsilon; antibody</td><td>BioLegend</td><td>100314</td><td>Clone 145-2C11, low endotoxin, azide free format</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD28 antibody</td><td>BioLegend</td><td>102112</td><td>Clone 37.51, low endotoxin, azide free format</td></tr><tr><td>Vacuum Pump</td><td>EMD Millipore</td><td>WP6111560</td><td>For LEGENDplex assays using filter plates (recommended)</td></tr><tr><td>Vacuum Manifold</td><td>EMD Millipore</td><td>MSVMHTS00</td><td>For LEGENDplex assays using filter plates (recommended)</td></tr><tr><td>Sterile Disposable Reagent Reservoirs</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-130</td><td>Or equivalent</td></tr><tr><td>Polypropylene MicroFACS Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-842-90</td><td>For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional)</td></tr><tr><td>Pipette Kit</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-388-100</td><td>Four pipette sizes (0.2-2&amp;micro;L, 2-20&amp;micro;L, 20-200&amp;micro;L, 100-1000&amp;micro;L)</td></tr><tr><td>Multi-Channel Pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>FA10011G</td><td>capable of dispensing 5 &amp;mu;L to 200 &amp;mu;L</td></tr><tr><td>Microplate Shaker</td><td>Fisher Scientific</td><td>88880023</td><td>Or equivalent</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Fisher Scientific</td><td>75002410</td><td>Or equivalent</td></tr><tr><td>FACS tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9885747</td><td>12 x 75 mm round bottom</td></tr><tr><td>PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide (LPS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-8274</td><td>&lt;em&gt;Escherichia coli&lt;/em&gt; O26:B6</td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>Branson B200 Ultrasonic Cleaner</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z305359</td><td>Or equivalent</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z666505</td><td>1.5 mL polypropylene tubes</td></tr><tr><td>Flow Cytometer</td><td>Various</td><td>Various</td><td>Cytometer equipped with single laser (488nm blue) or two lasers (488nm blue or 532nm green + 633nm Red) capable of reading emission wavelengths at 575nm and 660nm</td></tr><tr><td>96-Well Polypropylene Plate</td><td>VWR</td><td>82050-662</td><td>For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional)</td></tr></tbody></table>

multiplex cytokine profiling of stimulated mouse splenocytes using a cytometric bead-based immunoassay platform

Boncuk tabanlı uzun aynı temel ilke olarak sandviç uzun istihdam. Boncuklar, boyutu ve iç allophycocyanin (APC) floresan yoğunluğu tarafından ayrıştırılan, belirli bir analit için özel antikorlar için Birleşik yakalamak. Ardından, seçilen bir panel tanımlanmış yakalama boncuk kümeleri içeren hedef analitler yakalama karşı antikorlar için belirli bir biyolojik örnek ile inkübe. Hangi yakalama boncuk analit algılama antikor sandviç oluşumuna yol açar bir biotinylated algılama antikor kokteyl eklenir.
Son olarak, hangi biotinylated algılama antikorlar, floresan sinyal şiddetlerde bağlı analit miktarı ile orantılı olarak sağlayan bağlar streptavidin-phycoerythrin (SA-PE) eklenir. PE sinyal analit özel boncuk bölgelerin Akış Sitometresi kullanarak sayısal ve belirli analitler konsantrasyonları assay olarak oluşturulan standart eğri ve veri analiz yazılımı kullanarak belirlenir floresan.
Bu deneyde, aynı anda doku kültürü supernatants fare splenocytes çeşitli uyarıcı koşullar altında kültürlü toplanan 13 ayrı sitokin hedeflerin konsantrasyon ölçmek için bir fare T yardımcı sitokin panelini kullanın.

Bu iletişim kuralı bir immunoassay boncuk tabanlı platform Akış Sitometresi kullanarak biyolojik örnekleri profillerden sitokin aynı anda quantitate için nasıl kullanılabileceğini gösterir. Tahlil biçimi de serum veya plazma numuneleri ile kullanmak için doğrulandı, ancak bu örnekte kullanılan biyolojik örnekler hücre kültür supernatants daha önce çeşitli aktive koşullarda inkübe fare splenocytes gelen vardı.
Tahlil oluşturulan veri çoğaltılmış panelindeki bütün analitler için standart eğriler oluşturmak için kullanılır. Veri analiz yazılımı bir benzersiz Boncuk boyutu ve APC yoğunluk dayalı belirli her analit sınıflandırır ve PE muhabir kullanarak quantifies. Dinamik aralıkları yanı sıra tahlil duyarlılığını çizilen şekil 2Abir günlük günlük ölçekte zaman gösterdi. Yazılım tahlil veri kullanır ve doğru bir şekilde sadece kullanıcı analitler konsantrasyonları hesaplamak için bir 5-parametre eğri uydurma algoritması biyolojik örnekler aynı zamanda algılama sınırları sağlanan her iki yüksek ve düşük üstünde son-in tüm standart eğrileri (Tablo 1 ). Bu protokol için açıklanan biçimi aynı zamanda son derece sağlam tahlil hassas sağlar. Şekil 2B ve 2 C veri her analit Intra-tahlil değişkenlik gösteren sunulmaktadır. İki ayrı standart protein konsantrasyonları (yüksek ve düşük) ile 16 çoğaltır her örnek için bir tahlil analiz edildi. Şekil 2C ve 2D hedef analitler arası tahlil değişkenliği üç bağımsız deneyleri temsil eder. Intra-tahlil hassas deneyler ile yüksek ve düşük standart konsantrasyonları 3 ile analiz edildi gibi her bağımsız deneyler çoğaltır. Hedef proteinlerin hesaplanan konsantrasyon en az değişkenlik açıkça görülmeye başlıyor.
Sitokin ifade profilleri sorguya içinde boncuk tabanlı sitometrik deneyleri programı göstermek için fare splenocytes çeşitli aktive koşullar altında inkübe. Unstimulated bir kontrol ek olarak, hücreleri de LPS, anti-CD3/anti-CD28 antikorlar, veya phorbol 12-myristate 13-asetat ve ionomycin ile inkübe. Hücre kültür supernatants 48 saat sonra ve fare T yardımcı sitokin panelini kullanarak bölümü toplanmıştır. Bu deney miktar sonuçlarından şekil 3 ' te gösterilir ve sitokin konsantrasyonları stimülasyon koşulları etkisi açıkça belirlendi.
Sürece deneyci iyi laboratuar tekniği vardır ve sağlanan tahlil iletişim kuralı izler yukarıda açıklanan sonuçlar tipiktir. Bu tahlil biçiminde hata kaynakları sapmalar kuluçka zamanlarda, yıkama, reaktif birimleri veya yanlış Devresel_ödeme ayarları örnekleri analiz etmek için kullanılan Akış Sitometresi ortaya çıkabilir. Şekil 4A bir dağılım komplo başarılı bir tahlil dan açıkça tanımlanan 2 ayrı boncuk nüfus gösterir. Bu rakam 4Bnerede zavallı çamaşır ve protokol bağlılık yol açmıştır bu iki popülasyonun bulanıklık boncuk toplamları için contrasted olabilir. Buna ek olarak, sol alt çeyrekte enkaz kanıtladığı gibi toplam sitometresi olayları analiz için tercih edilen biçim olduğu geçişli olaylar sadece yerine verildi. Uygun sitometresi kurmak güvenilir veri bu tahlil oluşturmak için önemlidir. Şekil 4 c uygun Devresel_ödeme her biri 6 analitlerin APC sınıflandırma kanaldaki çözümlenmesi için ayarlar sağlar. Yanlış Devresel_ödeme ayarları APC kanal boncuk nüfus ile örtüşen sınıflandırma yoğunluklarda bulunduğu şekil 4 d sunulan benzer veri neden olur. Analitin konsantrasyonlarının olmadan tahlil boncuk açıkça tanımlanmış örneğin alınma olasılığını hesaplamak imkansız olacağından bu tahlil geçersiz hale gelecektir.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56440/56440fig2.jpg"> 
Şekil 2: Standart eğri aralıkları ve tahlil hassas. (A) fare T yardımcı sitokin panelini kullanarak oluşturulan bir temsilcisi standart eğri. Standart bir eğri ile her tahlil çalıştırmanız gerekir. (B-C) Intra-tahlil hassas. Farklı hedef proteinler (yüksek ve düşük) konsantrasyonları ile iki örnek ile 16 çoğaltır her örnek için bir tahlil analiz edildi. Verileri ortalama + standart sapma temsil edilir. (D-E) Arası tahlil hassas. Farklı hedef proteinler (yüksek ve düşük) konsantrasyonları ile iki örnek üç bağımsız deneyleri her örnek için 3 çoğaltır ile analiz edildi. Verileri ortalama + standart sapma temsil edilir. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56440/56440fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56440/56440fig3.jpg"> 
Şekil 3: miktar temsilcisi sonuçlarının. Fare splenocytes (1 x 106 hücreler) 37 ° C + %5 CO2 çeşitli koşullarda kültürlü: unstimulated, LPS (100 ng/mL), αCD3 (1 µg/plaka kaplı mL) + αCD28 (1 µg/mL çözünür), PMA (20 ng/mL) + Ionomycin (500 ng/mL). Kültür supernatants 48 saat sonra toplanmıştır sonra fare T yardımcı sitokin panelini kullanarak sayılabilir. Fark sitokin ifade profilleri yanıt olarak uyarılması koşulları açıkça görülebilir. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56440/56440fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56440/56440fig4.jpg"> 
Şekil 4: sonuç başarılı başarısız deneyleri vs den. (A) başarılı deneyleri ayrı boncuk nüfus microsphere nüfus için olacaktır. (B) başarısız deneyleri yoksul nüfus ayırma, boncuk toplamları ve çok fazla toplanan olayların olacaktır. (C) başarılı deneyleri açıkça kapı ve ölçmek kolay sınıflandırma Floresans kanalda yoğunluklarda tanımlamaktadır. (D) başarısız deneyleri kötü ayrılmış ve birden çok boncuk nüfus miktar zorlaştırır, üst üste sınıflandırma yoğunluklarda. Bu hataların pek çok dikkatli bağlılık tahlil protokolü ile önlenebilir. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56440/56440fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">Standart eğri</td>
			<td colspan="2">Hassasiyet (pg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analit</td>
			<td>Uygun formül</td>
			<td>CV</td>
			<td>R2</td>
			<td>Min.</td>
			<td>Max.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN γ</td>
			<td>5-P.log(4.43, 14.40, 0.54, 9.11, 0.01)</td>
			<td>%1.77</td>
			<td>0,99</td>
			<td>2.1</td>
			<td>18105.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-5</td>
			<td>5-P.log(4.36, 12.68, 0.64, 5.73, 0.36)</td>
			<td>%1,32</td>
			<td>1</td>
			<td>1.9</td>
			<td>14514.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-α</td>
			<td>5-P.log(4.36, 11.63, 0.79, 5.45, 0.37)</td>
			<td>%1.48</td>
			<td>0,99</td>
			<td>1.9</td>
			<td>20109.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-2</td>
			<td>5-P.log(4.46, 12.62, 0.78, 5.07, 0.34)</td>
			<td>%1.34</td>
			<td>1</td>
			<td>1.9</td>
			<td>25109.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-6</td>
			<td>5-P.log(4.58, 11.66, 0.64, 5.77, 0.37)</td>
			</tr></tbody></table>TD>1.70%
			<td>0,99</td>
			<td>2.0</td>
			<td>7022.0</td>
		
		<tr>
			<td>IL-4</td>
			<td>5-P.log(4.27, 12.23, 0.62, 5.72, 0.36)</td>
			<td>%1,36</td>
			<td>1</td>
			<td>2.0</td>
			<td>13273.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-10</td>
			<td>5-P.log(4.67, 11.65, 1.20, 6.28, 0.61)</td>
			<td>%1.81</td>
			<td>0,99</td>
			<td>2.2</td>
			<td>5190.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-9</td>
			<td>5-P.log(4.32, 13.86, 0.86, 5.90, 0.45)</td>
			<td>%1,82</td>
			<td>1</td>
			<td>1.9</td>
			<td>12602.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-17A</td>
			<td>5-P.log(4.06, 14.03, 0.47, 6.52, 0.32)</td>
			<td>%0.99</td>
			<td>1</td>
			<td>2.0</td>
			<td>12285.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-17F</td>
			<td>5-P.log(4.52, 12.15, 0.61, 5.52, 0.34)</td>
			<td>%0.92</td>
			<td>1</td>
			<td>2.0</td>
			<td>14841.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-21</td>
			<td>5-P.log(4.90, 8.03, 1.77, 4.74, 1.11)</td>
			<td>%0,79</td>
			<td>1</td>
			<td>9.0</td>
			<td>12943.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-22</td>
			<td>5-P.log(4.57, 12.56, 0.63, 6.06, 0.39)</td>
			<td>%1,16</td>
			<td>1</td>
			<td>2.0</td>
			<td>6408.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-13</td>
			<td>5-P.log(4.40, 11.44, 0.22, 3.19, 1.45)</td>
			<td>%1.11</td>
			<td>1</td>
			<td>2.1</td>
			<td>16728.0</td>
		</tr>
	

Tablo 1: Standart eğri uydurma ve tahlil duyarlılık. Veri analiz yazılımı multiplex tahlil içinde bulunan bütün analitler için standart eğriler oluşturmak için kullanılmıştır. Bu tam otomatik analizi algoritması tahlil seyreltme serisi standartlara uygun sağlam bir 5-parametre eğrisi uygular ve ayrıca tahlil hassasiyeti algılama teorik sınırlarını kullanarak tanımlamak için kullanıldı.

Watch this Scientific Journal Video about Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform at JoVE.com

Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform

Bu iletişim kuralı birden fazla sitokin hedeflerin aynı anda doku kültürü supernatants multiplex boncuk tabanlı immunoassay platform ve bir Akış Sitometresi kullanarak uyarılmış fare splenocytes toplanan miktar açıklar.

Multiplex sitokin Immunoassay sitometrik boncuk tabanlı platformu kullanarak uyarılmış fare Splenocytes profil oluşturma

Bead-based immunoassays employ the same basic principle as sandwich immunoassays. Capture beads, which can be differentiated by size and internal ...

multiplex-cytokine-profiling-stimulated-mouse-splenocytes-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

44.8K Görüntüleme.  BioLegend. Bu iletişim kuralı birden fazla sitokin hedeflerin aynı anda doku kültürü supernatants multiplex boncuk tabanlı immunoassay platform ve bir Akış Sitometresi kullanarak uyarılmış fare splenocytes toplanan miktar açıklar.

Video: Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform

Detection and Isolation of Viable Mouse IL-17-Secreting T Cells

The MACS Cytokine Secretion Assay technology allows detection of secreted cytokines on the single cell level and sensitive isolation of viable cytokine-secreting cells. In order to label IL-17-secreting cells, a single cell suspension of mouse splenocytes is prepared and stimulated at 37&deg;C with PMA/ionomycin to induce cytokine secretion. To stop secretion cells are then placed on ice and are exposed to the IL-17 Catch Reagent   a bi-specific antibody that binds to CD45 on the cell surface of leukocytes and to IL-17 as it is secreted and caught near the cell surface. Secretion is then re-started by increasing the temperature to 37&deg;C and IL-17 is trapped by the Catch Reagent. Secretion is then stopped again, by placing cells on ice. To detect the trapped IL-17, cells are incubated with a second IL-17-specific antibody conjugated to biotin and an Anti-Biotin-PE antibody. Cells can now be directly analyzed by flow cytometry or prepared for isolation and enrichment by subsequent labeling with Anti-PE conjugated MicroBeads.

This procedure describes the detection and isolation of mouse TH17 leukocytes that actively secrete IL-17 upon stimulation.

Canlı Fare IL-17 salgılayan T Hücreler Algılama ve İzolasyonu

The MACS Cytokine Secretion Assay technology allows detection of secreted cytokines on the single cell level and sensitive isolation of viable ...

Biyoloji

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic interactions among multiple proteins in a protein interaction network is technically difficult. Here, we present a protocol for Quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI), which allows quantitative assessment of fold changes in protein interactions based on relative fluorescence measurements of Proteins in Shared Complexes detected by Exposed Surface epitopes (PiSCES). In QMI, protein complexes from cell lysates are immunoprecipitated onto microspheres, and then probed with a labeled antibody for a different protein in order to quantify the abundance of PiSCES. Immunoprecipitation antibodies are conjugated to different MagBead spectral regions, which allows a flow cytometer to differentiate multiple parallel immunoprecipitations and simultaneously quantify the amount of probe antibody associated with each. QMI does not require genetic tagging and can be performed using minimal biomaterial compared to other immunoprecipitation methods. QMI can be adapted for any defined group of interacting proteins, and has thus far been used to characterize signaling networks in T cells and neuronal glutamate synapses. Results have led to new hypothesis generation with potential diagnostic and therapeutic applications. This protocol includes instructions to perform QMI, from the initial antibody panel selection through to running assays and analyzing data. The initial assembly of a QMI assay involves screening antibodies to generate a panel, and empirically determining an appropriate lysis buffer. The subsequent reagent preparation includes covalently coupling immunoprecipitation antibodies to MagBeads, and biotinylating probe antibodies so they can be labeled by a streptavidin-conjugated fluorophore. To run the assay, lysate is mixed with MagBeads overnight, and then beads are divided and incubated with different probe antibodies, and then a fluorophore label, and read by flow cytometry. Two statistical tests are performed to identify PiSCES that differ significantly between experimental conditions, and results are visualized using heatmaps or node-edge diagrams.

Quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI) uses flow cytometry for sensitive detection of differences in the abundance of targeted protein-protein interactions between two samples. QMI can be performed using a small amount of biomaterial, does not require genetically engineered tags, and can be adapted for any previously defined protein interaction network.

Multipleksed Co-İmmünopreyağış Kullanarak Protein Etkileşim Ağı Dinamiğinin Ölçülmesi

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Biyokimya

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or cellular processes. With the advancement of biotechnologies and the high translational potential of small molecules, a number of innovative approaches in drug discovery have evolved, which explains the resurgent interest in the use of HTS. The oncology field is currently the most active research area for drug screening, with no major breakthrough made for the identification of new immunomodulatory compounds targeting transplantation-related complications or autoimmune ailments. Here, we present a novel in vitro murine fluorescent-based lymphocyte assay easily adapted for the identification of new immunomodulatory compounds. This assay uses T or B cells derived from a transgenic mouse, in which the Nur77 promoter drives GFP expression upon T- or B-cell receptor stimulation. As the GFP intensity reflects the activation/transcriptional activity of the target cell, our assay defines a novel tool to study the effect of given compound(s) on cellular/biological responses. For instance, a primary screening was performed using 4,398 compounds in the absence of a &#34;target hypothesis&#34;, which led to the identification of 160 potential hits displaying immunomodulatory activities. Thus, the use of this assay is suitable for drug discovery programs exploring large chemical libraries prior to further in vitro/in vivo validation studies.

We present in the current study a novel fluorescence-based assay using lymphocytes derived from a transgenic mouse. This assay is suitable for high-throughput screening (HTS) of small molecules endowed with the capacity of either inhibiting or promoting lymphocyte activation.

Küçük moleküllerin yüksek verimli tarama için uygun bir floresan bazlı lenfositi analizi

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bead Based Multiplex Assay for Analysis of Tear Cytokine Profiles

Tear film is a complex mixture of lipids, proteins and minerals which covers the external surface of the eye, thereby providing lubrication, nutrition and protection to the underlying cells. Analysis of tears is an emerging area for the identification of biomarkers for the prediction, diagnosis, and prognosis of various ocular diseases. Tears are easily accessible and their collection is non-invasive. Therefore, advancing technologies are gaining prominence for identification of multiple analytes in tears to study changes in protein or metabolite composition and its association with pathological conditions. Tear cytokines are ideal biomarkers for studying the health of the ocular surface and also help in understanding the mechanisms of different ocular surface disorders like dry eye disease and vernal conjunctivitis. Bead based multiplex assays have the capability of detecting multiple analytes in a small amount of sample with a higher sensitivity. Here we describe a standardized protocol of tear sample collection, extraction and analysis of cytokine profiling using a bead based multiplex assay.

Analysis of tear film cytokines helps in studying various ocular diseases. Bead based multiplex assays are simple and sensitive and enable the testing of multiple targets in samples with small volumes. Here we describe a protocol for tear film cytokine profiling a using bead based multiplex assay.

Boncuk Multiplex tahlil için gözyaşı sitokin profilleri analizi dayalı

Tear film is a complex mixture of lipids, proteins and minerals which covers the external surface of the eye, thereby providing lubrication, nutrition and ...

Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies in an attempt to understand the precise mechanisms that lead to the breakdown of self-tolerance and subsequent autoimmunity. Approaches thus far have been based on the study of one specific aspect of the immune system (a single or few cell types or cytokines), and do not offer a global assessment of complex autoimmune disease. While patient sera-based studies have afforded important insights into autoimmunity, they do not provide the specific cellular source of the dysregulated cytokines detected. A comprehensive single-cell approach to evaluate cytokine production in multiple immune cell subsets, within the context of &#34;intrinsic&#34; patient-specific plasma circulating factors, is described here. This approach enables monitoring of the patient-specific immune phenotype (surface markers) and function (cytokines), either in its native &#34;intrinsic pathogenic&#34; disease state, or in the presence of therapeutic agents (in vivo or ex vivo).

Here we describe a single-cell proteomic approach to evaluate immune phenotypic and functional (intracellular cytokine induction) alterations in peripheral whole blood samples, analyzed via mass cytometry.

Tek hücreli Immunophenotype ve sitokin üretimde kitle sitometresi ile periferik tam kan analizi

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...

Using Reference Reagents to Confirm Robustness of Cytokine Release Assays for the Prediction of Monoclonal Antibody Safety

New immunostimulatory antibody drugs designed to either directly stimulate specific immune cells or indirectly enhance the immune response by blocking or activating an endogenous regulator of the immune system have the potential to cause serious immune-related adverse events such as cytokine release syndrome (CRS). It is, therefore crucial to assess the safety profile of such drugs with a combination of in vivo and in vitro experiments before first-in-human dose administration. Cytokine release assays (CRAs), where the proposed antibody therapeutic is co-cultured with human immune cells (such as peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), whole blood, or otherwise) and the amount of inflammatory cytokine produced is measured, are critical for hazard identification. However, different labs using different control antibodies can threaten the harmonization of CRAs, and clinically relevant controls (such as TGN1412) can be difficult to source, which can lead to less accurate or reliable results or data which are difficult to compare between laboratories. The inclusion of positive and negative controls in a CRA can ensure the accuracy and reliability of the results. The National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC) has produced a panel of lyophilized antibody controls intended for use in various CRA platforms to harmonize results across various laboratories and assay methods. A set of three different positive control antibodies include anti-CD52, anti-CD3, and anti-CD28 superagonist (SA), which are known to induce dose-dependent CRS in patients. Each antibody is provided with an isotype-matched negative control antibody. This panel of reference reagents has previously been shown to have good inter-lab reproducibility and are suitable controls to increase the confidence and robustness of safety data from a variety of CRA platforms.

The use of cytokine release assay reference reagents allows for more reproducible and standardized in vitro safety profiles of immunotherapeutic monoclonal antibodies. Here we describe how cytokine release assays can be used alongside a reference reagent panel to predict the safety of some therapeutic monoclonal antibodies.

New immunostimulatory antibody drugs designed to either directly stimulate specific immune cells or indirectly enhance the immune response by blocking or ...

<meta charset="utf8"></head><body>Tek Hücreli Sitokin Sekresyon Analizi için Mikroakışkan Damlacık Testi

Microfluidic Approach to Resolve Simultaneous and Sequential Cytokine Secretion of Individual Polyfunctional Cells

Infections, autoimmune diseases, desired and adverse immunological responses to treatment can lead to a complex and dynamic cytokine response in vivo. This response involves numerous immune cells secreting various cytokines to orchestrate the immune reaction. However, the secretion dynamics, amounts, and co-occurrence of the different cytokines by various cell subtypes remain poorly understood due to a lack of appropriate tools to study them. Here, we describe a protocol using a microfluidic droplet platform that allows the time-resolved quantitative measurement of secretion dynamics for several cytokines in parallel on the single-cell level. This is enabled by the encapsulation of individual cells into microfluidic droplets together with a multiplexed immunoassay for parallel quantification of cytokine concentrations, their immobilization for dynamic fluorescent imaging, and the analysis of the respective images to derive secreted quantities and dynamics. The protocol describes the preparation of functionalized magnetic nanoparticles, calibration experiments, cell preparation, and the encapsulation of the cells and nanoparticles into droplets for fluorescent imaging and subsequent image and data analysis using the example of lipopolysaccharide-stimulated human peripheral blood mononuclear cells. The presented platform identified distinct cytokine secretion behavior for single and co-secreting cells, characterizing the expected phenotypic heterogeneity in the measured cell sample. Furthermore, the modular nature of the assay allows its adaptation and application to study a variety of proteins, cytokines, and cell samples, potentially leading to a deeper understanding of the interplay between different immune cell types and the role of the different cytokines secreted dynamically to shape the tightly regulated immune response. These new insights could be particularly interesting in the studies of immune dysregulations or in identifying target populations in therapy and drug development.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Gündemi: Bağışıklık Tepkilerinde Çok İşlevlilik ve Heterojenliğin Ortaya Çıkarılması

The protocol describes an advanced microfluidic platform to quantitatively measure cytokine secretion dynamics of individual human peripheral blood mononuclear cells. The platform measures up to three cytokines in parallel (IL-6, TNF&#945;, and IL-1&#946;) for each individual cell stimulated with lipopolysaccharide as an example.

Bireysel Çok Fonksiyonlu Hücrelerin Eşzamanlı ve Ardışık Sitokin Sekresyonunu Çözmek için Mikroakışkan Yaklaşım 

Infections, autoimmune diseases, desired and adverse immunological responses to treatment can lead to a complex and dynamic cytokine response in vivo. ...

<meta charset="utf8"></head><body>Mantar ve Viral Bağışıklığı Analiz Etmek için Optimize Edilmiş Tam Kan İmmünoanalizleri,

Whole Blood Assay with Dual Co-Stimulation for Antigen-Specific Analysis of Host Immunity to Fungal and Viral Pathogens

Rapid and resource-efficient sample processing, high throughput, and high robustness are critical for effective scientific and clinical application of advanced antigen-specific immunoassays. Traditionally, such immunoassays, especially antigen-specific T-cell analysis by flow cytometry or enzyme-linked immunosorbent spot assays, often rely on the isolation of peripheral blood mononuclear cells. This process is time-consuming, subject to many pre-analytic confounders, and requires large blood volumes. Whole blood-based assays provide a facile alternative with increased pre-analytic robustness and lower blood volume requirements. Furthermore, whole blood-based assays allow for the preservation of inter-cellular interactions that are not captured by assays using isolated cell subsets. Recently, a refined whole blood immunoassay with dual anti-CD28 and anti-CD49d co-stimulation for comprehensive analysis of both antigen-specific T-cell functions and complex intercellular interactions in response to various fungal and viral antigens has been proposed. This protocol provides guidance for the preparation of stimulation tubes, blood stimulation, and downstream sample processing for flow cytometry, cytokine secretion assays, and transcriptional analyses. This includes a validated and functionally equivalent, previously unpublished, low-volume protocol (250 &#181;L) to make flow cytometric and cytokine-based T-cell monitoring more accessible for studies in pediatric patients or preclinical studies in small animals (e.g., mice). Altogether, these protocols provide a versatile toolbox for complex antigen-specific immune analysis in both clinical and translational research settings.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: Tam Kan Tahlilleri Kullanarak Yoğun Bakım Hastalarında Bağışıklık İzlemenin İlerletilmesi

Whole blood-based immunoassays provide a facile and resource-efficient tool to analyze antigen-specific immunity for diagnostic and research purposes. This article provides an optimized whole blood-based protocol with dual co-stimulation for comprehensive analysis of host immunity to fungal and viral pathogens, including a low-volume version for pediatric patients and small animals.

Fungal ve Viral Patojenlere Karşı Konak Bağışıklığının Antijene Özgü Analizi için İkili Ko-stimülasyonlu Tam Kan Testi

Rapid and resource-efficient sample processing, high throughput, and high robustness are critical for effective scientific and clinical application of ...

Multiplex sitokin Immunoassay sitometrik boncuk tabanlı platformu kullanarak uyarılmış fare Splenocytes profil oluşturma

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Canlı Fare IL-17 salgılayan T Hücreler Algılama ve İzolasyonu

Multipleksed Co-İmmünopreyağış Kullanarak Protein Etkileşim Ağı Dinamiğinin Ölçülmesi

Küçük moleküllerin yüksek verimli tarama için uygun bir floresan bazlı lenfositi analizi

Boncuk Multiplex tahlil için gözyaşı sitokin profilleri analizi dayalı

Tek hücreli Immunophenotype ve sitokin üretimde kitle sitometresi ile periferik tam kan analizi

Using Reference Reagents to Confirm Robustness of Cytokine Release Assays for the Prediction of Monoclonal Antibody Safety

Bireysel Çok Fonksiyonlu Hücrelerin Eşzamanlı ve Ardışık Sitokin Sekresyonunu Çözmek için Mikroakışkan Yaklaşım

Bireysel Çok Fonksiyonlu Hücrelerin Eşzamanlı ve Ardışık Sitokin Sekresyonunu Çözmek için Mikroakışkan Yaklaşım

Bireysel Çok Fonksiyonlu Hücrelerin Eşzamanlı ve Ardışık Sitokin Sekresyonunu Çözmek için Mikroakışkan Yaklaşım

Fungal ve Viral Patojenlere Karşı Konak Bağışıklığının Antijene Özgü Analizi için İkili Ko-stimülasyonlu Tam Kan Testi