저자 바이오 마커 및 면역 분석 실험의 기여를 인정 하고자 제품 개발 팀의 분석 결과 개발. 또한, 우리는 데이터 분석 소프트웨어 패키지 설계에 그들의 공동 노력에 대 한 Vigene 기술, i n c.를 감사 하 고 싶습니다.

모든 동물 실험 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 가이드에 포함 된 NIH 권장 사항에 따라 수행 하 고 BioLegend에 IACUC에 의해 승인 했다.
 <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56440/56440fig1.jpg" /> 그림 1: 필터 플레이트 분석 결과 절차 요약. 필터 플레이트를 사용 하 여 분석 결과 수행 하기 위한 프로토콜 분석 결과 주요 구성 요소와 인큐베이션 단계를 묘사한 다이어그램으로 표시 됩니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56440/56440fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
 1. 생물학 견본 준비 참고: 선택한 해 부 사이트와 혈액 컬렉션의 볼륨은 각 개별 수 사관의 재량에 왼쪽과 분석 결과의 결과는 영향을 미치지 것입니다. 그러나, 그들은 얻을 수 있습니다, 일단 샘플 처리 아래에 나열 된 단계에 따라.
<ol><li>혈 청 샘플의 준비 <ol><li>원하는 양의 기본 컬렉션 튜브에 혈액을 수집 하 고 적어도 30 분에 대 한 응고</li>
		<li>샘플 실 온에서 1000 x g에서 10 분 원심.</li>
		<li>폴 리 프로필 렌 microcentrifuge 튜브로 혈 청 및 분석 결과 즉시 또는 약 수를 제거 하 고 저장에서 샘플 &#8804;-20 ° c.</li>
	</ol></li> <li>플라즈마 샘플 준비 <ol><li>혈액 ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)를 사용 하 여 원하는 양의 혈액 컬렉션 튜브를 코팅 하는 수집.</li>
		<li>컬렉션의 실내 온도 30 분 이내에 1000 x g에서 10 분 원심 분리기.</li>
		<li>폴 리 프로필 렌 microcentrifuge 튜브로 플라즈마와 분석 결과 즉시, 또는 약 수를 제거 하 고 저장에서 샘플 &#8804;-20 ° c.</li>
	</ol></li> <li>조직 문화 표면에 뜨는 샘플의 준비 <ol><li>샘플 셀 및 파편 제거 하 4 ° C에서 1500 x g에서 10 분 원심.</li>
		<li>폴 리 프로필 렌 microcentrifuge 튜브로 상쾌한 및 분석 결과 즉시 또는 약 수를 수집 하 고 저장 &#8804;-20 ° c.</li>
	</ol></li> <li>녹고 냉동 생물 샘플의 <ol><li>완전히 녹여 얼음, 그리고 사용의 앞에 짧게 소용돌이에 모든 이전 냉동된 생물 학적 샘플. 2 개 이상의 동결/해 동 주기를 방지. 
		참고:이 프로토콜에 사용 되는 샘플 BALB/c 마우스 splenocytes를 경작 하 여 얻은 했다 (37 ° C + 5% CO 2 다양 한 조건에서 1 x 10 6 셀: unstimulated, LPS (100 ng/mL), αCD3 (1 µ g/mL 플레이트 코팅) + αCD28 (1 µ g/mL 녹는), PMA (20 ng/mL) + Ionomycin (500 ng/mL). 문화 supernatants 48 h 후 수집 된 고 1.3 섹션에서 설명한 대로.</li>
	</ol></li></ol> 2. 시 약 준비 <ol><li>Preparation of Pre-mixed Antibody-Immobilized 구슬 <ol><li>Sonicate 미리 혼합된 구슬 병 실 온에 30 s 이전 사용에 대 한 다음 소용돌이 sonicator 목욕에서 1 분. Sonicator 목욕을 사용할 수 있는 경우와 동 시간 1 분을 증가</li>
	</ol></li> <li>준비의 워시 버퍼 <ol><li>가져와 20 x 워시 버퍼 (1 %20 x PBS 트윈-20) 실내 온도와 솔루션으로 모든 염 려 소용돌이 키트와 함께 제공 된.</li>
		<li>475 mL 이온된 물으로 워시 버퍼 x 20의 25 mL를 희석. 2 ° C와 1 달까지를 위한 8 ° C 사이 저장소 사용 하지 않는 부분.</li>
	</ol></li> <li>매트릭스 B 준비 (사용을 위해 혈 청 및 혈장 샘플만) <ol><li>분석 결과 버퍼 (1 %BSA PBS)의 완전 한 reconst에 대 한 동결 건조 된 매트릭스 B. 허용 최소 15 분을 포함 하는 병을 키트에 포함 된 5.0 mL를 추가 itution, 다음 잘 섞어 소용돌이 남은 재구성된 매트릭스 B에 저장 될 수 있다 &#8804;-70 ° C 까지의 한 달.</li>
	</ol></li></ol> 3. 표준 준비 참고:이 패널에서 각 분석은 10000 pg/mL의 최고 표준 농도.
<li>추가 250 µ L는 동결 건조 된 마우스 일 Cytokine 표준 칵테일 다시 구성할 분석 결과 버퍼의 <ol>. 짧게 vortexing에 의해 혼합 고 10 분 동안 실내 온도에 앉아 유리병</li>
	<li>전송 표준 칵테일 표시 된 폴 리 프로필 렌 microcentrifuge 튜브 &#34; C7 &#34;. 상위 표준으로 사용 됩니다.</li>
	<li>C6, C5, C4, c 3, C2, 및 c 1으로 라벨 6 폴 리 프로필 렌 microcentrifuge 튜브.</li>
	<li>이러한 튜브의 각 분석 결과 버퍼의 추가 75 µ L.</li>
	<li>전송 25 µ L의 C6 튜브를 vortexing에 의해 잘 믹스 최고 표준 C7. 이 C6 표준 될 것입니다.</li>
	<li>직렬 수행 계속 새로운 피펫으로 사용 하 여 1:4 희석 기준 C5, C4, c 3를 이전 표준의 25 µ L 다음 가장 낮은 표준 튜브 vortexing 뒤에 분석 결과 버퍼의 75 µ L에 추가할 각 튜브에 대 한 팁 C2, 및 C1. 분석 결과 버퍼를 사용 하 여 0 pg/mL의 표준 (C0).</li>
</ol> 4. 샘플 희석 참고:이 분석 결과 사용 하 여 여러 희석과 예비 파일럿 실험 생물 샘플의 특정 집합에 대 한 가장 적절 한 희석 비율을 결정 하는 데 필요한 수 있습니다. 적절 한 희석 요소 농도 계산 샘플에 대 한 표준 곡선의 범위 내에서 거짓말을 생산할 예정 이다. 다음 단계 지침으로 의미 되 고 샘플 유형에 따라 실험적으로 결정 되어야 할 수 있습니다.
<ol><li>Dilute 혈 청 또는 플라스마 2-fold 샘플 분석 결과 버퍼 (예. 50 µ L의 샘플 분석 결과 버퍼의 50 µ L로 희석) microcentrifuge 폴 리 프로필 렌 튜브에. 
	참고: 추가 샘플 희석 해야 하는 경우 희석 할 수 매트릭스 b 정확 하 게 측정 하도록 분석 결과 버퍼 대신. 희석 하지 않고 추가 혈 청 또는 혈장 샘플 분석 결과 낮은 정확도 되며 필터 플레이트를 방해할 수 있습니다. 매트릭스 B는 풀링된 마우스 혈 청 내 생 분석 결과 대상의 고갈로 구성 됩니다. 그것 immunoassays의 영향 분석 감도에 알려져 있습니다 매트릭스 효과 피하기 위해 혈 청 또는 혈장 샘플 희석제로 사용 됩니다.</li>
	<li>테스트 셀 희석 하지 않고 문화 표면에 뜨는 샘플. 
	참고: 분석의 수준 샘플 샘플에서 크게 달라질 수 있습니다. 필요한 경우 해당 세포 배양 매체 또는 분석 결과 버퍼의 신선한 준비를 사용 하 여 표면에 뜨는 샘플 희석.</li>
</ol> 5. 시험의 절차 참고: 폴 리 프로필 렌 필터, 마이크로 FACS 튜브, 또는 V 아래 microplates에서 분석 결과 수행할 수 있습니다. 필터 플레이트 분석 결과 절차 일관성, 분석 결과 견고성 및 취급의 용이성 때문에 좋은 샘플 샘플 좋습니다. 이 절차 (최종 사용자가 제공)에 진공 여과 장치를 필요로.
<ol><li>따뜻한 실내 온도 (20-25 ° C) 모든 시 약을 사용 하기 전에 허용.</li>
	<li>거꾸로 플레이트 커버에 필터 플레이트 항상 분석 결과 설치 및 인큐베이션 단계는 플레이트의 하단 만지지 않는다 어떤 표면 든 지 그것은 누수를 일으킬 수 있도록 세트.</li>
	<li>구슬 유실을 방지 세척 단계를 포함 하 여 전체 분석 결과 절차 동안 접시를 똑바로 유지.</li>
	<li>어두운 또는 모든 인큐베이션 단계에 대 한 알루미늄 호 일 포장에 접시를 유지.</li>
	<li>순차적 순서로 접시에 배열 하는 중복으로 모든 표준 및 샘플을 실행.</li>
	<li>미리 각 우물에 워시 버퍼 x 1의 100 µ L을 추가 하 여 필터 플레이트를 젖은 및 (해당 되는 경우 사용 하는 필터-하단 microplate) 실 온에서 1 분 동안 앉아 보자.</li>
	<li>진공 매니폴드 (5-10 s)를 사용 하 여 제거 버퍼 볼륨. 10을 초과 하지 마십시오 &#34; Hg 진공의. 오 점 초과 워시 깨끗 한 종이 수건의 스택에 접시를 눌러 접시의 아래쪽에서 버퍼. 거꾸로 플레이트 커버 위에 접시를 놓습니다. 
	참고: V-하단 microplate 또는 마이크로 FACS 튜브를 사용 하 여 분석 결과 수행 하는 경우 생략 될 수 있습니다 단계 5.1-5.2.</li>
	<li>셀 문화 표면에 뜨는 샘플에 대 한 추가 분석 결과 버퍼의 25 µ L 모든 우물. 표준 우물에 각 표준의 25 µ L를 추가 합니다. 각 샘플의 25 µ L 샘플 우물을 추가.</li>
	<li>혈 청 또는 혈장 샘플을 측정, 표준 우물을 행렬 B의 25 µ L을 추가. 샘플 우물에 분석 결과 버퍼의 25 µ L를 추가 합니다. 표준 우물에 각 표준의 25 µ L를 추가 합니다. 각 희석된 혈 청 또는 혈장 샘플의 25 µ L 샘플 우물을 추가.</li>
	<li>소용돌이 구슬 구슬 정착 하지 않으려면 일시적으로 구슬 병을 흔들어 각 잘 혼합된 구슬의 30 s. 추가 25 µ L에 대 한 혼합. 마지막 볼륨 구슬의 추가 후 75 µ L에 각 잘 되어야 합니다.</li>
	<li>접시 마감재와 접시를 봉인. 거꾸로 플레이트 커버, 알루미늄 호 일을 포함 하 여 전체 접시를 바꿈. 판 통에 접시를 놓고, 보안 및 실 온에서 2 h에 대 한 약 500 rpm에서 흔들어. 누수를 방지 하려면에 적용 되지 않는 긍정적인 압력 판 마감재.</li>
	<li>반전, 없이 접시에 진공 매니폴드 및 이전과 진공을 적용 놓고 각 잘 워시 버퍼 x 1의 200 µ L 추가.</li>
	<li>진공 여과 분석 결과 격판덮개 우물의 내용을 제거합니다. 오 점 흡수 성 패드 또는 종이 수건을 가진 격판덮개의 바닥에서 과잉 워시 버퍼. 이 단계를 한 번 더 반복. 
	참고: 분석 결과 수행 하는 경우 건너뛰기 단계 5.12 및 5.13 튜브 V 하단 microplate 또는 마이크로 FACS를 사용 하 여 합니다. 대신 실 온에서 5 분 동안 1000 x g에서 격판덮개 원심 다음 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 상쾌한 제거.</li>
	<li>탐지 항 체 (재료의 표 참조)를 각 잘의 추가 25 µ L.</li>
	<li>신선한 플레이트 마감재와 접시를 봉인. 거꾸로 플레이트 커버, 알루미늄 호 일을 포함 하 여 전체 접시 포장.</li>
	<li>판 통에 접시를 놓고 실 온에서 1 시간에 약 500 rpm 동요.</li>
	<li>진공 청소기, 없이 각 우물에 직접 25 µ L SA PE 시 약의 추가. 없음 희석 시 약의 필요 하다.</li>
	<li>신선한 플레이트 마감재와 접시를 봉인. 거꾸로 플레이트 커버, 알루미늄 호 일을 포함 하 여 전체 접시 포장.</li>
	<li>판 통에 접시를 놓고 실 온에서 30 분 동안 약 500 rpm 동요.</li>
	<li>반복 단계 위의 5.13.</li>
	<li>워시 버퍼 각 x 1의 추가 200 µ L 음. 다시 1 분에 대 한 접시 통에 구슬 중단</li>
	<li>샘플을 필터 플레이트에서 교류 cytometer에 샘플을 읽을 FACS 튜브 전송 다채널 피펫으로 사용 하 여,. 
	참고: 샘플 볼륨 증가 200 µ L에서 300 µ L에 건조를 실행 하는 샘플을 피하기 위해 각 튜브를 워시 버퍼 x 1의 추가 100 µ L을 추가 하 여. 필요한 샘플에 저장 될 수 있습니다 4 ° C 빛에서 보호 하 고 다음 날 분석. 그러나, 장기간된 샘플 저장 감소 된 신호를 발생할 수 있습니다.</li>
</ol> 6. Flow Cytometer 설정 참고: 신뢰할 수 있는 데이터를 생성 하기 위해 교류 cytometer 설정 해야 합니다 제대로 데이터 수집 전에. 이 과정에 일부 분석 결과에 수행 하는 특정 악기의 구성에 따라 개별 사용자에 대 한 달라질 수 있습니다. PE와 APC를 측정할 수 및 둘 다 갖춘 cytometer에 대 한 일반적인된 설치 과정 488 고 633 nm 레이저 아래 설명.
<ol><li>흐름 cytometer 및 수집 소프트웨어는 제조 업체에 따라 시동 &#39; 악기와 함께 제공 된 s 지침.</li>
	<li>만들기 점 x 축 및 y 축에 대 한 SSC (사이드 분산형) FSC (앞으로 분산형)와 음모. FSC 그리고 SSC를 선형 모드로 설정.</li>
	<li>Y 축 x 축과 APC에 PE와 함께 두 번째 점 음모를 만듭니다. 이 음모는 로그 기반 디스플레이 모드를 설정 해야 합니다.</li>
	<li>소용돌이 30 키트에 포함 된 원시 구슬의 유리병 다시 구슬을 일시 중단 하는 s. 이 구슬 내부 APC 염료를 포함 하 고 두 크기 인구의 구성.</li>
	<li>새 FACS 튜브를 원시 구슬의 전송 400 µ L.</li>
	<li>낮은 교류 cytometer 유량 설정.</li>
	<li>원시 구슬, 신중 하 게 조정 이득 및 전압 FSC 그리고 SSC는이 구슬의 크기 인구 두 가시 분리 하 고 게이트를 쉽게 실행.</li>
	<li>원치 않는 이벤트 (예: 파편 또는 공기 거품)를 제외 하는 FSC 임계값 조정.</li>
	<li>SSC 대 FSC에 음모, 그리는 모든 비드 인구를 포함 하는 문. 
	참고: 원시 구슬 포함 구슬의 두 개의 크기 인구 더 작은 &#34;는 구슬 &#34; 및 큰 &#34; B 구슬 &#34; 지역.</li>
	<li>Y 축 x 축과 APC에 PE와 함께 두 번째 점 플롯에 FSC 대 SSC 줄거리에서 문이 비드 인구 표시.</li>
	<li>송출 신호 모든 인구를 구슬에 1 x 10 1와 5 x 10 3 사이 중간 형광 강도 (MFI) APC 형광 채널 PMT 전압 조정.</li>
	<li>소용돌이 PE 설치의 유리병 30 비즈 구슬 다시 중단 s.</li>
	<li>새 FACS 관에 PE의 전송 400 µ L 비즈.</li>
	<li>바꾸기 원시 구슬 PE와 교류 cytometer에서 튜브 튜브 비즈.</li>
	<li>PE 구슬 유리병에 표시는 PE 형광 채널 설정 있도록 PE 구슬의 MFI 폭포 발견 많은 특정 범위 사이의 광 전 증폭 관 관 (PMT) 전압 조정. 
	참고: PE 설치 구슬 포함 한 인구 크기의 구슬 (&#34;는 구슬 &#34;만).</li>
</ol> 7. 데이터 수집 참고: 특정된 악기에 대 한 데이터의 수집와 관련 된 정확한 절차 다를 수 있습니다 고는 cytometer에 &#39; s 구성 사양 및 사용 하는 인터페이스 소프트웨어. 아래의 지침 따라서 cytometer 분석 결과 관계 없이 분석 결과에 주의가 필요한 단계를 강조 하기 위한 것.
<ol><li>Cytometer 유량 설정 아직 확인을.</li>
	<li>약 300 실정이 획득 구슬 이벤트의 수를 설정 합니다. 13-플렉스에 대 한이 3900 이벤트 습득에 상당 하는 패널 두 구슬 크기 인구 (A + B 구슬)에서 결합.</li>
	<li>소용돌이 5 각 샘플 분석 하기 전에 s.</li>
	<li>읽기 샘플입니다. 샘플을 읽을 때 먼저 교류 cytometer 설치 모드를 설정 하 고 비드 인구 수집 모드로 전환 하기 전에 안정화 될 때까지 기다립니다.</li>
	<li>간단한 이름을 데이터 파일에 대 한 연속 번호와 함께 사용 하 여 데이터 분석을 용이 하 게.</li>
	<li>총 이벤트 보다 (A + B 구슬 지역) 문이 이벤트만 내보냅니다.</li>
	<li>각 분석 결과 대 한 동일한 폴더에 모든 FCS 파일을 저장합니다. 여러 분석 실험을 실행 하는 경우 각 분석 결과 대 한 별도 폴더를 만듭니다.</li>
</ol> 8. 데이터 분석 진행 참고: 교류 cytometer에서 생성 되는 FCS 파일 다운로드 받을 수 있는 무료 14 데이터 분석 소프트웨어를 사용 하 여 분석 해야 합니다.
<ol><li>데이터 분석 소프트웨어는 PC에 설치.</li>
	<li>분석 소프트웨어를 포함 하는 컴퓨터에 모든 시험 FCS 파일 전송.</li>
	<li>컴퓨터의 USB 포트에 꽂습니다 (키트에 포함) 라이센스 키 동글.</li>
	<li>데이터 분석 소프트웨어 출시.</li>
	<li>파란색을 클릭 &#34; 파일 추가 &#34; 버튼 화면의 상단에 있는.</li>
	<li>팝업 표시 되는 창에에서 분석 결과에서 FCS 파일이 들어 있는 폴더를 탐색.</li>
	<li>클릭 소프트웨어 디스플레이 팝업 창에서에서 모든 분석 결과 FCS 파일을 드래그. 모든 파일을 목록에 이제 나타납니다.</li>
	<li>클릭 녹색 &#34; 다음 &#34; 디스플레이의 오른쪽 하단에 있는 버튼. 작은 드래그를 누르고 클릭 블루 표준 곡선 표준 곡선을 정의 하 고 목록에서 해당 FCS 파일 (C0에 C7) 버튼.</li>
	<li>녹색을 클릭 &#34; 다음 &#34; 제어 팝업 창이 열 디스플레이의 오른쪽 하단에 버튼.</li>
	<li>제어 윈도우의 왼쪽에 A의 이름을 입력 하 고 B 비드 지역 분석 결과 분석 대상과 (분석 결과 함께 제공 된 설명서에서 발견 되는) 그들의 관련 된 비드 ID 오름차순.</li>
	<li>팝업 창 상단에서 제어 도구를 선택 하 고 금감위 대 SSC 음모에 2 문, A 구슬 주위 1와 B 구슬 주위 그릴 사용.</li>
	<li>는 APC 대 PE 점도 나타나는 FSC 대 SSC 음모 아래 표시를 검토 합니다. A 구슬 (왼쪽된 그림)에서 6 실정이 밴드와 7 실정이 밴드 B 구슬 (오른쪽 그림)에 있을 것입니다. 
	참고: 게이츠 상단에 지우개 도구를 선택 하 고 주어진된 문 삭제를 클릭 하 여 수동으로 다시 수 있습니다. 제어 도구 수 있습니다 다음 선택 하 고 수동으로 원하는 밴드 영역에는 게이트를 적용 하는 데 사용.</li>
	<li>녹색을 클릭 &#34; 확인 &#34; 버튼 제어 팝업 창 닫고 FCS 파일의 목록으로 돌아갑니다.</li>
	<li>정의 오른쪽 클릭 하면 지정 된 파일을, 선택 하 여 생물 학적 샘플으로 만들어진 모든 희석 &#34; 희석 배 &#34; 메뉴를 입력 올바른 값.</li>
	<li>녹색을 클릭 &#34; 실행 &#34; 분석 결과 대 한 표준 곡선을 생성 하 고 알 수 없는 생물학 샘플의 농도 계산 하는 디스플레이의 오른쪽 하단에 버튼.</li>
</ol>

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저자는이 원고에 설명 된 시 약을 제조 하는 BioLegend에 의해 고용 됩니다. Vigene 기술, i n c.는이 원고에 설명 된 분석에서 생성 된 데이터를 분석 하는 데 사용 되는 LEGENDplex 데이터 분석 소프트웨어를 개발 했다.

실험을 제공 하는 생물 학적 샘플 프로 파일 녹는 중재자의 강력한 정량화는 좋은 실험실 기술 및 권장된 프로토콜에 부합이 프로토콜에서 설명 하는 분석 결과 형식을 제공할 수 있습니다.
신뢰할 수 있는 결과 보장 하기 위하여 따라야 하는 몇 가지 주요 단계가 있습니다. 첫째, 재조합 형 기준 분석 결과 버퍼 권장, 풀 타임에만 폴 리 프로필 렌 튜브에 희석 후 다시 구성할 허용 되어야 합니다. 폴리스 티 렌 튜브는 표준 곡선을 생성할 때 낮은 신호를 이어질 수 있는 튜브의 벽에는 단백질의 준수를 홍보할 수 있습니다. 둘째, 적절 한 인큐베이션 단계 동안 떨고 하는 것이 중요 합니다. 적절 한 동요 없이 분석 결과 구슬의 바인딩 특성은 심각 하 게 방해 될 수 있습니다. 또한, 인큐베이션 단계 사이의 적절 한 세척 필요 이기도합니다. 실험 프로토콜에는 다음 단계를 시작 하기 전에 우물에서 초과 시 약 제거 됩니다 확인 해야 합니다. 분석 결과 구슬 심문 하는 데 사용 하는 교류 cytometer 악기 설정 또한 낙관 되어야 한다. 특히, PMT 설정은 적절 한 비드 분리 하 고 표준 곡선에 대 한 광범위 한 동적 범위를 조정 해야 합니다. 마지막으로,는 cytometer에 분석 되 고, 직전 구슬 vortexed 적절 한 정지를 보장 하 고 집계 결과 왜곡 수는의 형성을 피하기 위해 해야 합니다.
이 프로토콜 연구원은 크고, 전체 격판덮개 분석 실험을 수행 하기 전에 그들의 세포의 용 해 프로토콜을 최적화 하고자 제공이 원고에서 설명 하는 샘플 형식으로 조직 homogenates 분석 하 잠재적으로 수정할 수 있습니다. 실제 기술 과정에 따라 달라질 수 조직 유형; 그러나, 일반적으로 프로토콜 중립 pH 버퍼 이오니아 소금의 생리 적 농도, 아니 변성 화학 물질, 그리고 가급적 이면 아무 세제 사용 해야 합니다. 세제를 사용 해야 하는 경우 비 이온 세제 농도 최소 (예: 더 이상 1%)에서 유지 되어야 한다. 버퍼 또한 대상 단백질의 분해 성능 저하를 방지 하기 위해 충분 한 protease 억제제를 포함 해야 합니다. 사용 되는 세포의 용 해 프로토콜에 최종 준비 분석 전에 미 립 자 제거를 centrifuged 한다.
분석 결과 제한에 관한 생물 학적 샘플 유형에서 분석 대상의 농도 크게 달라질 수 있습니다. 제대로 계량 분석 농도, 하기 위해서는 그들이 표준 곡선에 대 한 위쪽 및 아래쪽 값에를을 해야 합니다. 곡선의 값의 추정은 반드시 신뢰할 수 고 하지 것이 좋습니다. 조사자는 따라서 풀 플레이트 분석 결과 실행 하기 전에 파일럿 실험에 그들의 특정 샘플의 희석을 최적화 해야 합니다. 또한, 수 분석을 생물 학적 샘플의 주의 준비는이 분석 결과의 성공에 있어서 최우선 이다. Lipemic, hemolyzed, 또는 단백질 파편을 포함 하는 샘플이이 immunoassay의 핵심 원칙을 정의 하는 항 원 항 체 상호 작용에 영향을 미칠 하 고 해석할 수 있는 결과 렌더링.
이 분석 여러 가지 이유로 기존의 정량화 방법에 관하여 중요 하다. 제대로 실행 될 때 시험 형식 전통적인 ELISA 분석 실험을 사용 하 여 샘플을 분석 하는 데 필요한 것 보다 훨씬 작은 볼륨을 사용 하 여 샘플에서 최대 13 analytes를 quantitate 수 있습니다. 이 분석 결과 형식은 또한 수행 하려면 전용된 장비를 필요 하지 않습니다. 이것은 일반적으로 사용 되는 교류 cytometers의 어떤 숫자를 사용 하 여 분석 결과 실행할 수 있는 다른 상용 구슬 기반 immunoassays에 비해 이점이 다.
역할에 과학적 탐구 분 비 요소와 cytokine 네트워크 건강에서 하 고 질병 확대. 분석 결과 형식이이 원고에 설명 된 이러한 다양 하 고 복잡 한 현상을 이해 하고자 하는 연구자에 대 한 유용한 도구 수 있습니다. 활성 생물 의학 연구 프로그램 뿐만 아니라 지역 같은 일반 염증6, cytokine 네트워크의 역할 뿐만 아니라 동맥 경화, 암, neuroinflammation 등 특정 질병 상태에 맥락을 탐구 하기 시작 15,,1617. 의심할 여 지 없이, 조사는 이러한 만성 질환 치료에 새로운 치료제에 대 한 검색 확장으로이 지역에서 성장 계속 됩니다. 이 질병와 관련 된 성 중재자의 정확 하 고 신뢰할 수 있는 정량화에 대 한 필요성은 중요 한 연구 우선권 유지 됩니다.

그들의 역할에서 녹는 신호 분자, cytokines 높게 조정 하 고 multifactorial 프로세스 호스트 면역학 응답을 제어 하는 중재. 그들은 해상도, 개시에서 선 동적인 과정의 모든 단계 동안 표명 하 고 그들의 자신의 합성과 그들의 세포질 수용 체1의 포함 하는 복잡 한 상호 작용 네트워크 규제. 이 통신 네트워크는 개별 구성 요소 간에 존재할 수 있는 시너지 또는 대립 관계를 넘어 복잡 계층입니다. 실제로, 많은 cytokines 공유 중복 또는 적어도 부분적으로 겹치는 기능2,3으로 알려져 있습니다.
동시에 여러 cytokine analytes 계량 통합된 시스템 생물학 접근 현재이 여러 질병을 기본 면역 응답을 통합 하는 독특한 cytokinomes의 점점 더 포괄적인 이해를 제공 하는 4,5상태. 이러한 질병 상태에 이르기까지 일반적인된 염증 암, 신경 퇴행 성 조건, 및 심혈 관 질환6,7,,89.
이러한 사이토카인 네트워크 LEGENDplex 구슬 기반 immunoassays를 사용 하 여 효과적으로 심문 수 있습니다. 이 분석 실험 Enzyme-Linked Immunosorbent 분석 결과 (ELISA), 샌드위치와 같은 원리에 기반 하 고 covalently 그들의 표면에 부착 된 캡처 항 체와 형광 인코딩된 스피어를 사용 합니다. 이 항 체는 전통적인 ELISA 형식으로 필요한 것 보다 훨씬 더 작은 표면 영역에 움직일 수 있습니다. 이 같은 분석 실험을 훨씬 적은 샘플 볼륨으로 동시에 여러 analytes의 분석 다중화 일반적인 바인딩 및 제공 하는 동안 수행할 수 있습니다.
이 프로토콜에서 설명 하는 분석 결과 13 목표까지 동시에 quantitate에이 기술을 활용 합니다. 이 분석 결과에서 데이터 다양 한 일반적으로 사용 가능한 흐름 cytometers 사용 하 여 얻어질 수 있다 고 다른 사용 가능한 분석 실험과 달리 전용된 분석 결과 특정 장비를 사용 하 여를 필요 하지 않습니다. 유효한 분석 패널의 확대 카탈로그,이 분석 실험 몇 가지 지속적인 생물 의학 연구 프로젝트10,11,,1213에 사용 되었습니다.
용이성 및 유틸리티 분석 결과 형식 마우스 도우미 cytokine 패널 quantitate를 사용 하 여이 실험의 13 마우스 splenocytes 다중 아래 양식에서 얻은 조직 문화 supernatants에서 사이토카인 농도 분리 물질로 조건입니다. 조직 문화 supernatants 이외에이 분석 결과 또한 수행할 수 있습니다 혈 청 또는 혈장 샘플을 사용 하 여.

<table><tbody><tr><td>Allegra 6R Centrifuge with MICROPLUS Carrier Adaptor</td><td>Beckman Coulter</td><td>366816</td><td>For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional)</td></tr><tr><td>LEGENDplex Mouse T helper Cytokine Panel</td><td>BioLegend</td><td>740005</td><td>Multiplex Immunoassay (13-plex)</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD3&amp;epsilon; antibody</td><td>BioLegend</td><td>100314</td><td>Clone 145-2C11, low endotoxin, azide free format</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD28 antibody</td><td>BioLegend</td><td>102112</td><td>Clone 37.51, low endotoxin, azide free format</td></tr><tr><td>Vacuum Pump</td><td>EMD Millipore</td><td>WP6111560</td><td>For LEGENDplex assays using filter plates (recommended)</td></tr><tr><td>Vacuum Manifold</td><td>EMD Millipore</td><td>MSVMHTS00</td><td>For LEGENDplex assays using filter plates (recommended)</td></tr><tr><td>Sterile Disposable Reagent Reservoirs</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-130</td><td>Or equivalent</td></tr><tr><td>Polypropylene MicroFACS Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-842-90</td><td>For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional)</td></tr><tr><td>Pipette Kit</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-388-100</td><td>Four pipette sizes (0.2-2&amp;micro;L, 2-20&amp;micro;L, 20-200&amp;micro;L, 100-1000&amp;micro;L)</td></tr><tr><td>Multi-Channel Pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>FA10011G</td><td>capable of dispensing 5 &amp;mu;L to 200 &amp;mu;L</td></tr><tr><td>Microplate Shaker</td><td>Fisher Scientific</td><td>88880023</td><td>Or equivalent</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Fisher Scientific</td><td>75002410</td><td>Or equivalent</td></tr><tr><td>FACS tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9885747</td><td>12 x 75 mm round bottom</td></tr><tr><td>PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide (LPS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-8274</td><td>&lt;em&gt;Escherichia coli&lt;/em&gt; O26:B6</td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>Branson B200 Ultrasonic Cleaner</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z305359</td><td>Or equivalent</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z666505</td><td>1.5 mL polypropylene tubes</td></tr><tr><td>Flow Cytometer</td><td>Various</td><td>Various</td><td>Cytometer equipped with single laser (488nm blue) or two lasers (488nm blue or 532nm green + 633nm Red) capable of reading emission wavelengths at 575nm and 660nm</td></tr><tr><td>96-Well Polypropylene Plate</td><td>VWR</td><td>82050-662</td><td>For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional)</td></tr></tbody></table>

multiplex cytokine profiling of stimulated mouse splenocytes using a cytometric bead-based immunoassay platform

비드 기반 immunoassays 샌드위치 immunoassays로 동일한 기본 원칙을 사용합니다. 구슬, 크기와 내부 allophycocyanin (APC) 형광 강도 의해 분화 될 수 있다, 항 체는 특정 분석에 활용 된 캡처. 다음, 정의 된 캡처 구슬 세트의 선택한 패널 캡처 항 체를 특정 대상 analytes를 포함 하는 생물 학적 샘플 알을 품는. 칵테일는 biotinylated 탐지 항 체에 추가, 캡처 구슬-분석-탐지 항 체 샌드위치의 형성에 이르게 합니다.
마지막으로, streptavidin phycoerythrin (SA-PE) 추가 됩니다, biotinylated 탐지 항 체, 바운드 분석의 금액에 비례하여 형광 신호 강도 제공 하는 바인딩. PE는 형광 분석 관련 구슬 영역의 신호 cytometry를 사용 하 여 계량은 및 특정 analytes의 농도 데이터 분석 소프트웨어와 분석 결과에서 생성 된 표준 곡선을 사용 하 여 결정 됩니다.
이 실험에서 사용 마우스 T 도우미 cytokine 패널 마우스 splenocytes 다양 한 물질로 조건 하에서 경작된에서 수집 하는 조직 문화 supernatants의 13 별도 cytokine 대상 들의 농도 동시에 계량 합니다.

이 프로토콜은 동시에 교류 cytometer를 사용 하 여 생물 학적 샘플에서 cytokine 프로필을 quantitate 하 immunoassay 구슬-기반 플랫폼을 사용 하는 방법을 보여 줍니다. 이 예제에서 사용 하는 생물 학적 샘플 분석 결과 형식 또한 혈 청 또는 혈장 샘플 사용에 대 한 검증 된 있지만 셀 문화 supernatants 했다 이전 다양 한 활성화 조건에서 알을 품는 마우스 splenocytes에서 했다.
분석 결과에서 생성 된 데이터는 멀티플렉스 패널에 모든 analytes에 대 한 표준 곡선을 생성 하는 데 사용 됩니다. 데이터 분석 소프트웨어 각 특정 분석 독특한 구슬 크기와 APC 강도에 따라 분류 하 고 체육 기자를 사용 하 여 그들을 단정. 그림 2A에서 로그-로그 규모에 때 분석 결과의 감도 서 동적 범위는 설명 했다. 소프트웨어 분석 결과 데이터를 사용 하 여 및를 정확히 계산 하는 사용자에 analytes의 농도 뿐만 아니라 5 매개 변수 곡선 맞춤 알고리즘 제공 모든 표준 곡선 (표 1의 높고 낮은 끝에 생물 학적 샘플 뿐만 아니라 탐지의 한계 ). 이 프로토콜에서 설명 하는 형식 또한 매우 강력한 분석 결과 정밀도를 제공 합니다. 그림 2B 와 2c 에서 데이터의 각 분석 내부 분석 결과 다양성 묘사 되 게 됩니다. 두 개의 별도 표준 단백질 농도 (높거나 낮은) 한 분석 결과 각 샘플에 대 한 16 복제에에서 분석 되었다. 그림 2C 와 2D 3 개의 독립적인 분석 실험에서 대상 analytes 간 분석 결과 변화를 나타냅니다. 내부 분석 결과 정밀 실험과 높고 낮은 표준 농도 3 분석 했다 독립적인 실험의 각 복제 합니다. 대상 단백질의 계산 된 농도에서 최소한의 변화 명확 하 게 표시 됩니다.
Cytokine 식 프로필 질문에서 구슬 기반 cytometric 분석 유틸리티를 보여 주기 위해 마우스 splenocytes 다양 한 활성화 조건 하에서 인 큐베이 팅 했다. Unstimulated 컨트롤 뿐만 아니라 셀 LPS, 안티-CD3/안티-CD28 항 체 또는 phorbol myristate 12 13-아세테이트와 ionomycin incubated도 했다. 셀 문화 supernatants 48 h 나중 및 마우스 도우미 cytokine 패널을 사용 하 여 분석을 수집 했다. 이 실험에서 정량화 결과 그림 3 에 표시 되 고 사이토카인 농도에 자극의 효과 명확 하 게 delineated.
위에서 설명한 결과 실험 좋은 실험실 기술을 하 고 제공 된 분석 결과 프로토콜을 다음과 같이 전형적, 이다. 이 분석 결과 형식 오류의 소스 샘플을 분석 하는 데 사용 하는 교류 cytometer에서 보육 시간, 시 약 볼륨, 세척, 편차 또는 부적 절 한 PMT 설정에서 발생할 수 있습니다. 그림 4A 분산형 플롯 성공적인 분석 결과에서 명확 하 게 정의 된 2 가지 구슬 인구를 보여줍니다. 이 그림 4B, 어디 가난한 세척 및 프로토콜 준수 이끌어 두 개의 인구 블러 비드 집계에 대조 될 수 있다. 또한, 낮은 왼쪽된 사분면에서 파편에 의해 입증, 총 cytometer 이벤트 분석 보다는 문이 이벤트만의 기본 형식에 대 한 수출 되었다. 적절 한 cytometer 설정 신뢰할 수 있는 데이터를 생성 하는이 분석 결과에 중요 하다. APC 분류 채널에서 6 analytes의 각각의 해상도 그림 4C 적절 한 PMT 설정을 사용 하 고. 부적 절 한 PMT 설정 비슷한 그림 4D 어디 송출 채널은 겹치는 분류 농도와 구슬 인구에에서 제공 된 데이터에서 발생 합니다. 분석 농도 분석 결과 구슬의 명확 하 게 정의 된 인구 없이 계산 가능한 것이 분석 결과 무효화 됩니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56440/56440fig2.jpg"> 
그림 2: 표준 곡선 범위와 분석 결과 정밀도. (A)는 대표적인 표준 곡선 마우스 도우미 cytokine 패널을 사용 하 여 생성. 표준 곡선 각 분석 결과 함께 실행 되어야 합니다. (B-C) 내부 분석 결과 정밀도입니다. (높고 낮음) 대상 단백질의 다른 농도 함께 두 개의 샘플은 각 샘플에 대 한 16 복제 한 분석 결과에 분석 되었다. 데이터는 평균 + 표준 편차로 표시 됩니다. (D-E) 간 분석 결과 전체 자릿수입니다. 대상 단백질 (높고 낮음)의 다른 농도 함께 두 개의 샘플은 각 샘플에 대 한 3 복제와 3 개의 독립적인 분석에 분석 되었다. 데이터는 평균 + 표준 편차로 표시 됩니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56440/56440fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56440/56440fig3.jpg"> 
그림 3: 대표 결과의 정량화. 마우스 splenocytes (1 x 106 셀) 37 ° C + 5% CO2 다양 한 조건 하에서 경작 했다: unstimulated, LPS (100 ng/mL), αCD3 (1 µ g/mL 플레이트 코팅) + αCD28 (1 µ g/mL 녹는), PMA (20 ng/mL) + Ionomycin (500 ng/mL). 문화 supernatants 48 h 후 수집 된 다음 마우스 도우미 cytokine 패널을 사용 하 여 계량 합니다. 차동 cytokine 식 프로필 자극 조건에서 명확 하 게 볼 수 있습니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56440/56440fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56440/56440fig4.jpg"> 
그림 4: 실패 분석 실험 대 성공에서 유래한 다. (A) 성공적인 분석 스피어 인구에 대 한 뚜렷한 비드 인구 있을 것 이다. (B) 가난한 인구의 분리, 비드 집계 및 너무 많은 수집된 이벤트 실패 분석 할 것 이다. (C) 성공적인 분석은 명확 하 게 정의 농도 게이트, 계량 하기 쉬운 분류 형광 채널에서. (D) 실패 분석은 제대로 분리 및 정량화를 어렵게 만드는 여러 구슬 인구 중복 분류 농도. 이러한 오류 분석 결과 프로토콜에 주의 깊은 부착을 통해 피할 수 있습니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56440/56440fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">표준 곡선</td>
			<td colspan="2">감도 (pg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>실정이</td>
			<td>맞춤된 수식</td>
			<td>이력서</td>
			<td>R2</td>
			<td>분입니다.</td>
			<td>최대입니다.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-Γ</td>
			<td>5-P.log(4.43, 14.40, 0.54, 9.11, 0.01)</td>
			<td>1.77%</td>
			<td>0.99</td>
			<td>2.1</td>
			<td>18105.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-5</td>
			<td>5-P.log(4.36, 12.68, 0.64, 5.73, 0.36)</td>
			<td>1.32%</td>
			<td>1</td>
			<td>1.9</td>
			<td>14514.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-Α</td>
			<td>5-P.log(4.36, 11.63, 0.79, 5.45, 0.37)</td>
			<td>1.48%</td>
			<td>0.99</td>
			<td>1.9</td>
			<td>20109.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>일리노이-2</td>
			<td>5-P.log(4.46, 12.62, 0.78, 5.07, 0.34)</td>
			<td>1.34%</td>
			<td>1</td>
			<td>1.9</td>
			<td>25109.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>일리노이-6</td>
			<td>5-P.log(4.58, 11.66, 0.64, 5.77, 0.37)</td>
			</tr></tbody></table>td>1.70%
			<td>0.99</td>
			<td>2.0</td>
			<td>7022.0</td>
		
		<tr>
			<td>IL-4</td>
			<td>5-P.log(4.27, 12.23, 0.62, 5.72, 0.36)</td>
			<td>1.36%</td>
			<td>1</td>
			<td>2.0</td>
			<td>13273.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-10</td>
			<td>5-P.log(4.67, 11.65, 1.20, 6.28, 0.61)</td>
			<td>1.81%</td>
			<td>0.99</td>
			<td>2.2</td>
			<td>5190.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-9</td>
			<td>5-P.log(4.32, 13.86, 0.86, 5.90, 0.45)</td>
			<td>1.82%</td>
			<td>1</td>
			<td>1.9</td>
			<td>12602.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-17A</td>
			<td>5-P.log(4.06, 14.03, 0.47, 6.52, 0.32)</td>
			<td>0.99%</td>
			<td>1</td>
			<td>2.0</td>
			<td>12285.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-17F</td>
			<td>5-P.log(4.52, 12.15, 0.61, 5.52, 0.34)</td>
			<td>0.92%</td>
			<td>1</td>
			<td>2.0</td>
			<td>14841.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-21</td>
			<td>5-P.log(4.90, 8.03, 1.77, 4.74, 1.11)</td>
			<td>0.79%</td>
			<td>1</td>
			<td>9.0</td>
			<td>12943.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-22</td>
			<td>5-P.log(4.57, 12.56, 0.63, 6.06, 0.39)</td>
			<td>1.16%</td>
			<td>1</td>
			<td>2.0</td>
			<td>6408.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-13</td>
			<td>5-P.log(4.40, 11.44, 0.22, 3.19, 1.45)</td>
			<td>1.11%</td>
			<td>1</td>
			<td>2.1</td>
			<td>16728.0</td>
		</tr>
	

표 1: 표준 곡선 피팅 및 분석 결과 감도. 데이터 분석 소프트웨어는 다중 분석 결과에 포함 된 모든 analytes에 대 한 표준 곡선을 생성 하기 위해 사용 되었다. 이 완전 자동화 된 분석 분석 결과에서 희석 시리즈 표준 알고리즘을 피팅 강력한 5 매개 변수 곡선을 적용 하 고 또한 분석 결과 감도 검색의 이론적인 한계를 사용 하 여 정의 하는 데 사용 했다.

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Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform

이 프로토콜에서는 조직 문화 supernatants 자극된 마우스 splenocytes 다중 구슬 기반된 immunoassay 플랫폼 및 교류 cytometer 사용 하 여에서 수집에 동시에 여러 cytokine 목표의 정량화를 설명 합니다.

Cytokine Profiling Immunoassay Cytometric 구슬-기반 플랫폼을 사용 하 여 자극된 마우스 Splenocytes의 다중화

Bead-based immunoassays employ the same basic principle as sandwich immunoassays. Capture beads, which can be differentiated by size and internal ...

multiplex-cytokine-profiling-stimulated-mouse-splenocytes-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

44.8K 조회수.  BioLegend. 이 프로토콜에서는 조직 문화 supernatants 자극된 마우스 splenocytes 다중 구슬 기반된 immunoassay 플랫폼 및 교류 cytometer 사용 하 여에서 수집에 동시에 여러 cytokine 목표의 정량화를 설명 합니다.

비디오: Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform

Detection and Isolation of Viable Mouse IL-17-Secreting T Cells

The MACS Cytokine Secretion Assay technology allows detection of secreted cytokines on the single cell level and sensitive isolation of viable cytokine-secreting cells. In order to label IL-17-secreting cells, a single cell suspension of mouse splenocytes is prepared and stimulated at 37&deg;C with PMA/ionomycin to induce cytokine secretion. To stop secretion cells are then placed on ice and are exposed to the IL-17 Catch Reagent   a bi-specific antibody that binds to CD45 on the cell surface of leukocytes and to IL-17 as it is secreted and caught near the cell surface. Secretion is then re-started by increasing the temperature to 37&deg;C and IL-17 is trapped by the Catch Reagent. Secretion is then stopped again, by placing cells on ice. To detect the trapped IL-17, cells are incubated with a second IL-17-specific antibody conjugated to biotin and an Anti-Biotin-PE antibody. Cells can now be directly analyzed by flow cytometry or prepared for isolation and enrichment by subsequent labeling with Anti-PE conjugated MicroBeads.

This procedure describes the detection and isolation of mouse TH17 leukocytes that actively secrete IL-17 upon stimulation.

가능한 마우스 IL - 17 - Secreting의 T 세포 탐지 및 격리

The MACS Cytokine Secretion Assay technology allows detection of secreted cytokines on the single cell level and sensitive isolation of viable ...

연구

생물학

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic interactions among multiple proteins in a protein interaction network is technically difficult. Here, we present a protocol for Quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI), which allows quantitative assessment of fold changes in protein interactions based on relative fluorescence measurements of Proteins in Shared Complexes detected by Exposed Surface epitopes (PiSCES). In QMI, protein complexes from cell lysates are immunoprecipitated onto microspheres, and then probed with a labeled antibody for a different protein in order to quantify the abundance of PiSCES. Immunoprecipitation antibodies are conjugated to different MagBead spectral regions, which allows a flow cytometer to differentiate multiple parallel immunoprecipitations and simultaneously quantify the amount of probe antibody associated with each. QMI does not require genetic tagging and can be performed using minimal biomaterial compared to other immunoprecipitation methods. QMI can be adapted for any defined group of interacting proteins, and has thus far been used to characterize signaling networks in T cells and neuronal glutamate synapses. Results have led to new hypothesis generation with potential diagnostic and therapeutic applications. This protocol includes instructions to perform QMI, from the initial antibody panel selection through to running assays and analyzing data. The initial assembly of a QMI assay involves screening antibodies to generate a panel, and empirically determining an appropriate lysis buffer. The subsequent reagent preparation includes covalently coupling immunoprecipitation antibodies to MagBeads, and biotinylating probe antibodies so they can be labeled by a streptavidin-conjugated fluorophore. To run the assay, lysate is mixed with MagBeads overnight, and then beads are divided and incubated with different probe antibodies, and then a fluorophore label, and read by flow cytometry. Two statistical tests are performed to identify PiSCES that differ significantly between experimental conditions, and results are visualized using heatmaps or node-edge diagrams.

Quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI) uses flow cytometry for sensitive detection of differences in the abundance of targeted protein-protein interactions between two samples. QMI can be performed using a small amount of biomaterial, does not require genetically engineered tags, and can be adapted for any previously defined protein interaction network.

멀티플렉스 동시 면역 침전을 이용한 단백질 상호 작용 네트워크 역학의 정량화

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

생화학

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or cellular processes. With the advancement of biotechnologies and the high translational potential of small molecules, a number of innovative approaches in drug discovery have evolved, which explains the resurgent interest in the use of HTS. The oncology field is currently the most active research area for drug screening, with no major breakthrough made for the identification of new immunomodulatory compounds targeting transplantation-related complications or autoimmune ailments. Here, we present a novel in vitro murine fluorescent-based lymphocyte assay easily adapted for the identification of new immunomodulatory compounds. This assay uses T or B cells derived from a transgenic mouse, in which the Nur77 promoter drives GFP expression upon T- or B-cell receptor stimulation. As the GFP intensity reflects the activation/transcriptional activity of the target cell, our assay defines a novel tool to study the effect of given compound(s) on cellular/biological responses. For instance, a primary screening was performed using 4,398 compounds in the absence of a &#34;target hypothesis&#34;, which led to the identification of 160 potential hits displaying immunomodulatory activities. Thus, the use of this assay is suitable for drug discovery programs exploring large chemical libraries prior to further in vitro/in vivo validation studies.

We present in the current study a novel fluorescence-based assay using lymphocytes derived from a transgenic mouse. This assay is suitable for high-throughput screening (HTS) of small molecules endowed with the capacity of either inhibiting or promoting lymphocyte activation.

작은 분자의 높은 처리량 스크리닝 적합한 형광 계 분석 림프구

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

면역학 및 감염병학

Bead Based Multiplex Assay for Analysis of Tear Cytokine Profiles

Tear film is a complex mixture of lipids, proteins and minerals which covers the external surface of the eye, thereby providing lubrication, nutrition and protection to the underlying cells. Analysis of tears is an emerging area for the identification of biomarkers for the prediction, diagnosis, and prognosis of various ocular diseases. Tears are easily accessible and their collection is non-invasive. Therefore, advancing technologies are gaining prominence for identification of multiple analytes in tears to study changes in protein or metabolite composition and its association with pathological conditions. Tear cytokines are ideal biomarkers for studying the health of the ocular surface and also help in understanding the mechanisms of different ocular surface disorders like dry eye disease and vernal conjunctivitis. Bead based multiplex assays have the capability of detecting multiple analytes in a small amount of sample with a higher sensitivity. Here we describe a standardized protocol of tear sample collection, extraction and analysis of cytokine profiling using a bead based multiplex assay.

Analysis of tear film cytokines helps in studying various ocular diseases. Bead based multiplex assays are simple and sensitive and enable the testing of multiple targets in samples with small volumes. Here we describe a protocol for tear film cytokine profiling a using bead based multiplex assay.

구슬 눈물 Cytokine 프로 파일의 분석에 대 한 다중 분석 결과 기반으로

Tear film is a complex mixture of lipids, proteins and minerals which covers the external surface of the eye, thereby providing lubrication, nutrition and ...

Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies in an attempt to understand the precise mechanisms that lead to the breakdown of self-tolerance and subsequent autoimmunity. Approaches thus far have been based on the study of one specific aspect of the immune system (a single or few cell types or cytokines), and do not offer a global assessment of complex autoimmune disease. While patient sera-based studies have afforded important insights into autoimmunity, they do not provide the specific cellular source of the dysregulated cytokines detected. A comprehensive single-cell approach to evaluate cytokine production in multiple immune cell subsets, within the context of &#34;intrinsic&#34; patient-specific plasma circulating factors, is described here. This approach enables monitoring of the patient-specific immune phenotype (surface markers) and function (cytokines), either in its native &#34;intrinsic pathogenic&#34; disease state, or in the presence of therapeutic agents (in vivo or ex vivo).

Here we describe a single-cell proteomic approach to evaluate immune phenotypic and functional (intracellular cytokine induction) alterations in peripheral whole blood samples, analyzed via mass cytometry.

Immunophenotype 및 Cytokine 생산 대량 Cytometry 통해 주변 전 혈의 단일 세포 분석

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...

Using Reference Reagents to Confirm Robustness of Cytokine Release Assays for the Prediction of Monoclonal Antibody Safety

New immunostimulatory antibody drugs designed to either directly stimulate specific immune cells or indirectly enhance the immune response by blocking or activating an endogenous regulator of the immune system have the potential to cause serious immune-related adverse events such as cytokine release syndrome (CRS). It is, therefore crucial to assess the safety profile of such drugs with a combination of in vivo and in vitro experiments before first-in-human dose administration. Cytokine release assays (CRAs), where the proposed antibody therapeutic is co-cultured with human immune cells (such as peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), whole blood, or otherwise) and the amount of inflammatory cytokine produced is measured, are critical for hazard identification. However, different labs using different control antibodies can threaten the harmonization of CRAs, and clinically relevant controls (such as TGN1412) can be difficult to source, which can lead to less accurate or reliable results or data which are difficult to compare between laboratories. The inclusion of positive and negative controls in a CRA can ensure the accuracy and reliability of the results. The National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC) has produced a panel of lyophilized antibody controls intended for use in various CRA platforms to harmonize results across various laboratories and assay methods. A set of three different positive control antibodies include anti-CD52, anti-CD3, and anti-CD28 superagonist (SA), which are known to induce dose-dependent CRS in patients. Each antibody is provided with an isotype-matched negative control antibody. This panel of reference reagents has previously been shown to have good inter-lab reproducibility and are suitable controls to increase the confidence and robustness of safety data from a variety of CRA platforms.

The use of cytokine release assay reference reagents allows for more reproducible and standardized in vitro safety profiles of immunotherapeutic monoclonal antibodies. Here we describe how cytokine release assays can be used alongside a reference reagent panel to predict the safety of some therapeutic monoclonal antibodies.

New immunostimulatory antibody drugs designed to either directly stimulate specific immune cells or indirectly enhance the immune response by blocking or ...

<meta charset="utf8"></head><body>single-cell cytokine secretion 분석을 위한 미세유체 액적 분석

Microfluidic Approach to Resolve Simultaneous and Sequential Cytokine Secretion of Individual Polyfunctional Cells

Infections, autoimmune diseases, desired and adverse immunological responses to treatment can lead to a complex and dynamic cytokine response in vivo. This response involves numerous immune cells secreting various cytokines to orchestrate the immune reaction. However, the secretion dynamics, amounts, and co-occurrence of the different cytokines by various cell subtypes remain poorly understood due to a lack of appropriate tools to study them. Here, we describe a protocol using a microfluidic droplet platform that allows the time-resolved quantitative measurement of secretion dynamics for several cytokines in parallel on the single-cell level. This is enabled by the encapsulation of individual cells into microfluidic droplets together with a multiplexed immunoassay for parallel quantification of cytokine concentrations, their immobilization for dynamic fluorescent imaging, and the analysis of the respective images to derive secreted quantities and dynamics. The protocol describes the preparation of functionalized magnetic nanoparticles, calibration experiments, cell preparation, and the encapsulation of the cells and nanoparticles into droplets for fluorescent imaging and subsequent image and data analysis using the example of lipopolysaccharide-stimulated human peripheral blood mononuclear cells. The presented platform identified distinct cytokine secretion behavior for single and co-secreting cells, characterizing the expected phenotypic heterogeneity in the measured cell sample. Furthermore, the modular nature of the assay allows its adaptation and application to study a variety of proteins, cytokines, and cell samples, potentially leading to a deeper understanding of the interplay between different immune cell types and the role of the different cytokines secreted dynamically to shape the tightly regulated immune response. These new insights could be particularly interesting in the studies of immune dysregulations or in identifying target populations in therapy and drug development.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: Unveiling the Polyfunctionality and Heterogeneity in Immune Responses

The protocol describes an advanced microfluidic platform to quantitatively measure cytokine secretion dynamics of individual human peripheral blood mononuclear cells. The platform measures up to three cytokines in parallel (IL-6, TNF&#945;, and IL-1&#946;) for each individual cell stimulated with lipopolysaccharide as an example.

개별 다기능성 세포의 동시 및 순차적 사이토카인 분비를 해결하기 위한 미세유체 접근법 

Infections, autoimmune diseases, desired and adverse immunological responses to treatment can lead to a complex and dynamic cytokine response in vivo. ...

<meta charset="utf8"></head><body>진균 및 바이러스 면역 분석을 위해 최적화된 전혈 면역분석법

Whole Blood Assay with Dual Co-Stimulation for Antigen-Specific Analysis of Host Immunity to Fungal and Viral Pathogens

Rapid and resource-efficient sample processing, high throughput, and high robustness are critical for effective scientific and clinical application of advanced antigen-specific immunoassays. Traditionally, such immunoassays, especially antigen-specific T-cell analysis by flow cytometry or enzyme-linked immunosorbent spot assays, often rely on the isolation of peripheral blood mononuclear cells. This process is time-consuming, subject to many pre-analytic confounders, and requires large blood volumes. Whole blood-based assays provide a facile alternative with increased pre-analytic robustness and lower blood volume requirements. Furthermore, whole blood-based assays allow for the preservation of inter-cellular interactions that are not captured by assays using isolated cell subsets. Recently, a refined whole blood immunoassay with dual anti-CD28 and anti-CD49d co-stimulation for comprehensive analysis of both antigen-specific T-cell functions and complex intercellular interactions in response to various fungal and viral antigens has been proposed. This protocol provides guidance for the preparation of stimulation tubes, blood stimulation, and downstream sample processing for flow cytometry, cytokine secretion assays, and transcriptional analyses. This includes a validated and functionally equivalent, previously unpublished, low-volume protocol (250 &#181;L) to make flow cytometric and cytokine-based T-cell monitoring more accessible for studies in pediatric patients or preclinical studies in small animals (e.g., mice). Altogether, these protocols provide a versatile toolbox for complex antigen-specific immune analysis in both clinical and translational research settings.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: Advancing Immune Monitoring in Critical Care Patients Using Whole Blood Assays (전혈 분석을 사용한 중환자 치료의 면역 모니터링 발전)

Whole blood-based immunoassays provide a facile and resource-efficient tool to analyze antigen-specific immunity for diagnostic and research purposes. This article provides an optimized whole blood-based protocol with dual co-stimulation for comprehensive analysis of host immunity to fungal and viral pathogens, including a low-volume version for pediatric patients and small animals.

진균 및 바이러스성 병원체에 대한 숙주 면역의 항원 특이적 분석을 위한 이중 공동 자극을 사용한 전혈 분석

Rapid and resource-efficient sample processing, high throughput, and high robustness are critical for effective scientific and clinical application of ...

Cytokine Profiling Immunoassay Cytometric 구슬-기반 플랫폼을 사용 하 여 자극된 마우스 Splenocytes의 다중화

요약

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이 비디오의 챕터

가능한 마우스 IL - 17 - Secreting의 T 세포 탐지 및 격리

멀티플렉스 동시 면역 침전을 이용한 단백질 상호 작용 네트워크 역학의 정량화

작은 분자의 높은 처리량 스크리닝 적합한 형광 계 분석 림프구

구슬 눈물 Cytokine 프로 파일의 분석에 대 한 다중 분석 결과 기반으로

Immunophenotype 및 Cytokine 생산 대량 Cytometry 통해 주변 전 혈의 단일 세포 분석

Using Reference Reagents to Confirm Robustness of Cytokine Release Assays for the Prediction of Monoclonal Antibody Safety

개별 다기능성 세포의 동시 및 순차적 사이토카인 분비를 해결하기 위한 미세유체 접근법

개별 다기능성 세포의 동시 및 순차적 사이토카인 분비를 해결하기 위한 미세유체 접근법

개별 다기능성 세포의 동시 및 순차적 사이토카인 분비를 해결하기 위한 미세유체 접근법

진균 및 바이러스성 병원체에 대한 숙주 면역의 항원 특이적 분석을 위한 이중 공동 자극을 사용한 전혈 분석