Name: biotinylated cell-penetrating peptides to study intracellular protein-protein interactions
Uploaded: 2017-12-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions at JoVE.com

Biz M. Morales ve J. Bravo CPPs ve JC Arévalo tasarımı onun yardımıyla açılan iletişim kuralı için onların yardım için teşekkür ederim. T. del Rey teknik yardım için sana şükrediyoruz. Bu eser "gayri resmi" de Economía y Competitividad, İspanya tarafından desteklenen; FEDER BFU2015-70040-R, cunta de Castilla y Leon, İspanya; FEDER SA026U16 ve Fundación Ramon Areces. M. Jaraíz-Rodríguez ve A. González-Sánchez cunta de Castilla y Leon bir Bursu ve Avrupa Sosyal Fonu alıcıları vardır.

Tüm deneysel prosedürler Salamanca Üniversitesi gerçekleştirilmiştir.
1. hücre
<ol>
	<li>Yordamı, başlamadan önce iki gün hücreleri denemenin gün Konfluent olmak gerekli yoğunluğu, plaka. Şişeler veya tabak hücrelerde plaka. Ancak, protein ayıklama plakalar daha kolay olacak. 78 cm2 en az 4 plakaları veya koşul deney, başına başına 150 cm2 2 Şişeler emin olmak için sonuçları tutarlı hazırlamak uygundur.</li>
	<li>Bu çalışmada, insan G166 GSCs 150 cm2ile %2 B27, %1 N2, 20 ng/mL EGF ve b-FGF Pollard ve ark.22tarafından açıklandığı gibi takıma RHB-A kök hücre ortamda kültürlü, 4 Şişeler içinde plaka. İzdiham ulaşıldığında işlemi. Örneğin, 5 x 106 G166 hücreleri bir 150 cm2 şişeye kaplama zaman, 2 gün sonra kaplama işlendi.</li>
</ol>
2. Biotinylated CPPs
<ol>
	<li>8200 x g 30 için de lyophilized biotinylated CPPs (BCPPs) içeren şişeleri spin s bazı kapağını kalan toz önlemek için. Bir denetim bulundu etkileşimleri hedef sırasını belirli olduğundan emin olmak için BCPP içerir. Bu çalışmada, kontrol BCPP TAT-biotin (TAT-B) ve tedavi BCPP TAT-Cx43266-283oldu -d. TAT yuvarlak şifreli veya mutasyona uğramış parçaları bond için biotin gibi diğer denetimleri kullanılabilir.</li>
	<li>BCPPs üretici tarafından belirtilen stok çözüm için karşılık gelen Kültür ortamında dağıtılması; Örneğin, 2 mg/mL stok bir çözüm elde etmek için BCPP GSCs tedavi etmek için ekleyin GSC kültür ortamının 0.5 mL 1 mg BCPP içeren bir şişe. Girdap ve peptid de çözünmüş emin olun.</li>
</ol>
3. tüpler
Not: Bölüm 7'gerekli koşul başına en az on iki 1,5 mL tüpler hazır olun.
<ol>
	<li>Koşul başına ilk 3 tüpler işaretleyin. 6.4. adımda elde hücresel lysates hacmi olacaktır.</li>
	<li>Koşul başına 3 tüpler içinde A işaretleyin. Bu tüpler lysing ve hücresel lysates iplik adım sonra 7,2 elde edilen ilk supernatants olacaktır.</li>
	<li>Koşul başına 3 tüpler bir B işaretle. Bu tüpler ilk supernatants küçük bir aliquot olacak. Bu lysates adım 7,3 Western blot örneklerinde olarak görev yapacak.</li>
	<li>Koşul başına 3 tüpler C'de işaretleyin. Bu tüpler sonra açılan NeutrAvidin, adım 7.7 ile elde edilen supernatants olacaktır. Not: Western blot proteinler, proteinler aşağı çekti değil veya yordamı bazı aşamada kayıp anlamına gelen sinyali yok gösterdi diye bu önemlidir. Bu durum olsaydı, proteinler çekmek için işlemi yineleyin.</li>
</ol>
4. BCPPs ile hücresel tedavi
<ol>
	<li>Kültür orta Aspire edin.</li>
	<li>Taze orta BCPPs orta göre kuluçka times en küçük olası hacmine kuluçkaya için gerekli karşılık gelen hacmi değiştirin. Böylece hücreleri dışarı, mesela 6 mL 150 cm2 30 dk kuluçka için başına kuru değil ne olursa olsun, orta tamamen plaka/şişeye tüm yüzeyini kapsar çok önemlidir.</li>
	<li>BCPP hisse senedi çözüm hacmi etkili olduğu kanıtlanmıştır toplama ulaşmak için hücre kültürleri ekleyin. Bu çalışma 50 µM TAT-Cx43266-283- B GSC nükleer silahların yayılmasına karşı azaltmak için kanıtlanmıştır.
	<ol>
		<li>Bu nedenle, 2 mg/ml TAT-Cx43266-28392.8 µL eklemek -B (MW = 3723.34 g/mol) mL 50 µM TAT-Cx43266-283son bir konsantrasyon elde etmek için kültür ortamının başına -d. Eklenecek birim denetim peptidler için farklı ise, aynı son hacim kadar kültür orta ile tamamlayın. Örneğin, 49.1 µL TAT-B (MW = 1914.31 g/mol) 43.7 µL GSC orta 50 µM son bir konsantrasyon elde etmek için kültür ortamının mL eklenen TAT-d.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>37 ° C ve % 5 CO2 BCPP ve hücre içi ortakları arasındaki etkileşimler yerini almak emin olmak 30 dk için kuluçka hücreleri yerleştirin. Etkileşim daha uzun sürerse, daha uzun süreleri için kuluçkaya veya deneme süresi tabii oluşuyordu durumunda kez ayarlayabilirsiniz. Buna ek olarak, faiz arasındaki etkileşimin terfi veya uyarıcı farklı hücre içi sinyal yolları tarafından engelledi.</li>
</ol>
5. arabellekleri ve çözümleri.
<ol>
	<li>PBS pH 7.4: 136 mM NaCl hazırlamak; 2.7 mM KCl; 7,8 mM Na2HPO4·2H2O; 1.7 mM KH2PO4.</li>
	<li>Protein lizis arabellek hazırlamak: 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 137 mM NaCl, % 1'IGEPAL, önceden kullanmak için aşağıdaki ekleyin: 1/100 (v/v) proteaz inhibitörü kokteyl, 1 mM sodyum florid, 1 mM Phenylmethanesulfonyl flor (PMSF) ve 0,1 mM sodyum orthovanadate.</li>
	<li>Laemmli arabellek hazırlamak: (4 x: 0,18 M Tris-HCl pH 6.8; 5 M gliserol; % 3.7 SDS (p/v); 0,6 M β-mercaptoethanol veya 9 mM DTT; %0,04 (v/v) bromophenol mavi (BB)).</li>
</ol>
6. protein çıkarma
Not: Protein çıkarma yukarıda açıklanan20,23gerçekleştirildi. Bu bölüm 4 ° C'de yordam yürütmek
<ol>
	<li>Kültür orta tamamen Aspire edin.</li>
	<li>Yıkama buz gibi fosfat ile 3 x 10 mL serum fizyolojik (PBS) 150 cm2 başına hücre dekolmanı önlemek için çok dikkatli bir şekilde arabelleğe alınmış.</li>
	<li>Lysate hücre elde etmek için 3 mL 150 cm2 başına lizis arabellek ekleyin ve iyice bir hücre kazıyıcı kullanarak yüzey raspa. Plaka/şişesi yaklaşık 45 derece için devirme hücre lysates onların karşılık gelen tüpler içine toplamak daha kolay hale getirecek.</li>
	<li>Üç 1,5 mL tüpler içinde hücresel tüp lysate 1 mL dökün. Bu tüpler koşul ve 3.1 adımda gösterildiği gibi çoğaltma işaretlenmiş.</li>
</ol>
7. açılan
<ol>
	<li>11.000 x g 4 ° C'de 10 dakika için de 1,5 mL tüpler santrifüj kapasitesi</li>
	<li>Supernatants yeni tüpler (A) aktarın.</li>
	<li>Bir aliquot, bu süpernatant koşul başına farklı tüpler (B), yani 50 µL tüp başına götürün. 4 x Laemmli arabellek (lysate, 50 µL için 16,6 µL) ekleyin ve -20 ° C'de dondurmak Bu lysates zamanki Western blot örnekleri görev yapacak.</li>
	<li>Çok iyi NeutrAvidin özel nazik sallayarak lunaparkçı. Kendi çapında artırmak ve boncuk pipetting geliştirmek için pipet ipuçları ipuçları kesmek.</li></ol>NeutrAvidin özel 50 µL hücre (A) tüplerde lysate mL başına ekleyin.
	<li>4 ° C'de gecede NeutrAvidin BCPPs bağlı hücre içi eşleri ile etkileşimine izin vermek için çok nazik sallayarak ile kuluçkaya.</li>
	<li>4 ° C'de NeutrAvidin kompleks protein ile toplamak için 1 dk 3000 x g , santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Dikkatle supernatants kaldırın ve temiz tüpler (C) aktarabilirsiniz. Onları aşağı açılır başarılı değil diye onları kullanmaya devam.</li>
	<li>Adımları yıkama: taze lizis arabellek granül (a tüpler) eklemek, INVERSION tarafından resuspend ve tekrarlamak belgili tanımlık merdiven 7,6) ve 7.7) 5 kez daha için. Bu supernatants göz ardı.</li>
	<li>Supernatants kaldırın ve 2 x Laemmli Arabellek istenen son hacim (1,5 mL tüp 150 cm2 şişeler Konfluent hücre elde edilen Pelet başına 40 µL) ekleyin.</li>
	<li>Proteinler ve santrifüj 30 arasındaki etkileşimler ayırmak 5 min için 100 ° C'de elute NeutrAvidin boncuk cips için 8,200 x g s.</li>
	<li>Kapiller keyif-e doğru yeni tüpler (D) ile Disosiye protein içeren supernatants, al. Boncuk elüsyon adımları gereklidir yinelenen durumunda tutulabilir. Not: Supernatants (tüpler D) Western blot yüklenecek veya -20 ° C'de dondurmak için hazırsınız</li>

8. Western Blot
Not: Western Blot yukarıda açıklanan24gerçekleştirildi.
<ol>
	<li>Bis-Tris (4-%12) midigels bir MIDI-hücre Elektroforez Sistemi Lane'de başına her örneğinin eşdeğer birim yük.</li>
	<li>Transblot protein nitroselüloz düzenli yığını kuru bir blotting sistem kullanarak.</li>
	<li>Membran % 10 ile leke Ponceau 10 dk için.</li>
	<li>Membran TTBS dakika 3 x 5 5 mL ile yıkayın.</li>
	<li>Membranlar ile yumuşak tüpler veya küçük kutular içinde sallayarak ile % 7 süt TTBS için 1 h blok. Kullanılan birimin membran kapak için yeterli olduğunu ve onlar değil kuru olduğunu, Yani tüm MIDI membran başına 40 mL emin olun.</li>
	<li>TTBS dakika 3 x 5 5 mL ile yıkayın.</li>
	<li>Gecede karşı nazik sallayarak ile ilgi protein birincil antikor ile 4 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>TTBS dakika 3 x 5 5 mL ile yıkayın.</li>
	<li>Membran ile muhabir peroksidaz Birleşik ikincil antikor TTBS içinde 1 h için oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
	<li>TTBS dakika 3 x 5 5 mL ile yıkayın.</li>
	<li>Chemiluminescent yüzey ile bir Kemiluminesan sistemi geliştirmek.</li>
</ol>
9. problem çözme
<ol>
	<li>Geliştirme sonra Western blot herhangi bir sinyal yok tüm proteinler için gösterdi örnekleri, Ponceau kontrol edin. Not: Membran Ponceau içinde tanımlanmamış göstermelidir ve şerit boyunca çok sayıda bantları yüklendi. Bantları çok fark yoksa, yüklü protein miktarı yeterli olmayabilir veya aktarım yanlış gitmiş olabilir. Western blot yinelenen göz önünde bulundurun.</li>
	<li>Hiçbir leke hiç herhangi bir şeritte Ponceau membran ise, (C) tüpler 7,4 adımdaki tüm yordamı yineleyin.</li>
	<li>Eğer Western blot geliştirme sonra protein sinyal çok zayıftır ama daha uzun süre membran ile birincil antikor kuluçkaya proteinler, Ponceau gösterdi. Sinyal hala oldukça zayıf ise, yine oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
</ol>
10. diğer teknikleri kullanılmış bu makaledeki
<ol>
	<li>BCPPs Immunocytochemistry
	<ol>
		<li>%4 paraformaldehyde (cm2başına 0.2 mL) 20 dk için hücrelerde düzeltmek.</li>
		<li>3 x 5 min PBS (cm2başına 0.2 mL) ile yıkayın.</li>
		<li>Gecede 4 ° C'de ilgi üreticinin belirtilen konsantrasyon, protein karşı antikor çözüm içinde seyreltilmiş karşılık gelen antikor (en azından cm2başına 0,15 mL) Uygula</li>
		<li>Bir fluorophore Birleşik ikincil antikor (cm2başına 0,15 mL) oda sıcaklığında 2 h ile kuluçkaya.</li>
		<li>Adımları 10.1.2-10.1.4 diğer antikorlar karşı ilgi, proteinler ile yineleyin. Farklı birincil antikorlar veya aynı dalga boyu fluorophores ikincil karşı antikorlar için aynı tür kullanmamaya dikkat et.</li>
		<li>Antifade reaktifi (cm2başına 0.005 mL) kullanarak hücreleri bağlayın.</li>
		<li>Bir dijital fotoğraf makinesi için bağlı floresan mikroskop analiz.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>MTT tahlil
	<ol>
		<li>24-şey tabak içinde 37 ° C'de hücreler kültür.</li>
		<li>Kültür Orta 0,5 mg/mL MTT içeren cm2 başına 0,15 mL ile 75 dk için karanlık hücrelerde kuluçkaya.</li>
		<li>Orta Aspire edin ve hafif sallayarak ile Dimetil sülfoksit (cm2başına 0.25 mL) ile karanlıkta 10 min için hücreleri kuluçkaya.</li>
		<li>Bir dalga boyu 570 Absorbans ölçmek Mikroplaka okuyucu kullanarak nm.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Green, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avidin.+3.+The+nature+of+the+biotin-binding+site.">Avidin. 3. The nature of the biotin-binding site.</a> Biochem J. 89, 599-609 (1963).</li><li>Wilchek, M., Bayer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+avidin-biotin+technology:+literature+survey.">Applications of avidin-biotin technology: literature survey.</a> Methods Enzymol. 184, 14-45 (1990).</li><li>Herce, H. D., Garcia, A. E., Cardoso, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+molecular+mechanism+for+the+cellular+uptake+of+guanidinium-rich+molecules.">Fundamental molecular mechanism for the cellular uptake of guanidinium-rich molecules.</a> J Am Chem Soc. 136 (50), 17459-17467 (2014).</li><li>Ramsey, J. D., Flynn, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-penetrating+peptides+transport+therapeutics+into+cells.">Cell-penetrating peptides transport therapeutics into cells.</a> Pharmacol Ther. 154, 78-86 (2015).</li><li>Fominaya, J., Bravo, J., Rebollo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+to+stabilize+cell+penetrating+peptides+for+in+vivo+applications.">Strategies to stabilize cell penetrating peptides for in vivo applications.</a> Ther Deliv. 6 (10), 1171-1194 (2015).</li><li>Vives, E., Brodin, P., Lebleu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+truncated+HIV-1+Tat+protein+basic+domain+rapidly+translocates+through+the+plasma+membrane+and+accumulates+in+the+cell+nucleus.">A truncated HIV-1 Tat protein basic domain rapidly translocates through the plasma membrane and accumulates in the cell nucleus.</a> J Biol Chem. 272 (25), 16010-16017 (1997).</li><li>Gump, J. M., Dowdy, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAT+transduction:+the+molecular+mechanism+and+therapeutic+prospects.">TAT transduction: the molecular mechanism and therapeutic prospects.</a> Trends Mol Med. 13 (10), 443-448 (2007).</li><li>Brooks, H., Lebleu, B., Vives, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tat+peptide-mediated+cellular+delivery:+back+to+basics.">Tat peptide-mediated cellular delivery: back to basics.</a> Adv Drug Deliv Rev. 57 (4), 559-577 (2005).</li><li>Cuesto, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoinositide-3-kinase+activation+controls+synaptogenesis+and+spinogenesis+in+hippocampal+neurons.">Phosphoinositide-3-kinase activation controls synaptogenesis and spinogenesis in hippocampal neurons.</a> J Neurosci. 31 (8), 2721-2733 (2011).</li><li>Schmidt, N., Mishra, A., Lai, G. H., Wong, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginine-rich+cell-penetrating+peptides.">Arginine-rich cell-penetrating peptides.</a> FEBS Lett. 584 (9), 1806-1813 (2010).</li><li>Sorgen, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+changes+in+the+carboxyl+terminus+of+the+gap+junction+protein+connexin43+indicates+signaling+between+binding+domains+for+c-Src+and+zonula+occludens-1.">Structural changes in the carboxyl terminus of the gap junction protein connexin43 indicates signaling between binding domains for c-Src and zonula occludens-1.</a> J Biol Chem. 279 (52), 54695-54701 (2004).</li><li>Giepmans, B. N., Hengeveld, T., Postma, F. R., Moolenaar, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+c-Src+with+gap+junction+protein+connexin-43.+Role+in+the+regulation+of+cell-cell+communication.">Interaction of c-Src with gap junction protein connexin-43. Role in the regulation of cell-cell communication.</a> J Biol Chem. 276 (11), 8544-8549 (2001).</li><li>Tabernero, A., Gangoso, E., Jara&#237;z-Rodr&#237;guez, M., Medina, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+connexin43-Src+interaction+in+astrocytomas:+A+molecular+puzzle.">The role of connexin43-Src interaction in astrocytomas: A molecular puzzle.</a> Neuroscience. 323, 183-194 (2016).</li><li>Giaume, C., Koulakoff, A., Roux, L., Holcman, D., Rouach, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astroglial+networks:+a+step+further+in+neuroglial+and+gliovascular+interactions.">Astroglial networks: a step further in neuroglial and gliovascular interactions.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (2), 87-99 (2010).</li><li>Shinoura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+and+messenger+RNA+expression+of+connexin43+in+astrocytomas:+implications+in+brain+tumor+gene+therapy.">Protein and messenger RNA expression of connexin43 in astrocytomas: implications in brain tumor gene therapy.</a> J Neurosurg. 84, 839-845 (1996).</li><li>Soroceanu, L., Manning, T., Sontheimer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+expression+of+connexin-43+and+functional+gap+junction+coupling+in+human+gliomas.">Reduced expression of connexin-43 and functional gap junction coupling in human gliomas.</a> Glia. 33, 107-117 (2001).</li><li>Pu, P., Xia, Z., Yu, S., Huang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+expression+of+Cx43+in+astrocytic+tumors.">Altered expression of Cx43 in astrocytic tumors.</a> Clin Neurol Neurosurg. 107 (1), 49-54 (2004).</li><li>Crespin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+gap+junction+protein,+connexin43,+in+a+large+panel+of+human+gliomas:+new+insights.">Expression of a gap junction protein, connexin43, in a large panel of human gliomas: new insights.</a> Cancer Med. 5 (8), 1742-1752 (2016).</li><li>Gangoso, E., Thirant, C., Chneiweiss, H., Medina, J. M., Tabernero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-penetrating+peptide+based+on+the+interaction+between+c-Src+and+connexin43+reverses+glioma+stem+cell+phenotype.">A cell-penetrating peptide based on the interaction between c-Src and connexin43 reverses glioma stem cell phenotype.</a> Cell Death &amp; Disease. 5, (2014).</li><li>Gonzalez-Sanchez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin43+recruits+PTEN+and+Csk+to+inhibit+c-Src+activity+in+glioma+cells+and+astrocytes.">Connexin43 recruits PTEN and Csk to inhibit c-Src activity in glioma cells and astrocytes.</a> Oncotarget. 7 (31), 49819-49833 (2016).</li><li>Jara&#237;z-Rodr&#237;guez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+short+region+of+connexin43+reduces+human+glioma+stem+cell+migration,+invasion+and+survival+through+Src,+PTEN+and+FAK.">A short region of connexin43 reduces human glioma stem cell migration, invasion and survival through Src, PTEN and FAK.</a> Stem Cell Reports. , (2017).</li><li>Pollard, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma+stem+cell+lines+expanded+in+adherent+culture+have+tumor-specific+phenotypes+and+are+suitable+for+chemical+and+genetic+screens.">Glioma stem cell lines expanded in adherent culture have tumor-specific phenotypes and are suitable for chemical and genetic screens.</a> Cell Stem Cell. 4 (6), 568-580 (2009).</li><li>Yu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+regulation+of+NGF-mediated+functions+by+Nedd4-2+ubiquitination+of+TrkA.">In vivo regulation of NGF-mediated functions by Nedd4-2 ubiquitination of TrkA.</a> J Neurosci. 34 (17), 6098-6106 (2014).</li><li>Herrero-Gonzalez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin43+inhibits+the+oncogenic+activity+of+c-Src+in+C6+glioma+cells.">Connexin43 inhibits the oncogenic activity of c-Src in C6 glioma cells.</a> Oncogene. 29 (42), 5712-5723 (2010).</li><li>Cooper, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Cell: A Molecular Approach. , (2000).</li><li>Fittipaldi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+membrane+lipid+rafts+mediate+caveolar+endocytosis+of+HIV-1+Tat+fusion+proteins.">Cell membrane lipid rafts mediate caveolar endocytosis of HIV-1 Tat fusion proteins.</a> J Biol Chem. 278 (36), 34141-34149 (2003).</li><li>Dirks, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+tumor+stem+cells:+the+cancer+stem+cell+hypothesis+writ+large.">Brain tumor stem cells: the cancer stem cell hypothesis writ large.</a> Mol Oncol. 4 (5), 420-430 (2010).</li><li>Hopp, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Short+Polypeptide+Marker+Sequence+Useful+for+Recombinant+Protein+Identification+and+Purification.">A Short Polypeptide Marker Sequence Useful for Recombinant Protein Identification and Purification.</a> Nat Biotech. 6 (10), 1204-1210 (1988).</li><li>Benard, V., Bokoch, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+Cdc42,+Rac,+and+Rho+GTPase+activation+by+affinity+methods.">Assay of Cdc42, Rac, and Rho GTPase activation by affinity methods.</a> Methods Enzymol. 345, 349-359 (2002).</li><li>Guidotti, G., Brambilla, L., Rossi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Penetrating+Peptides:+From+Basic+Research+to+Clinics.">Cell-Penetrating Peptides: From Basic Research to Clinics.</a> Trends Pharmacol Sci. 38 (4), 406-424 (2017).</li><li>Hu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma+therapy+using+tumor+homing+and+penetrating+peptide-functionalized+PEG-PLA+nanoparticles+loaded+with+paclitaxel.">Glioma therapy using tumor homing and penetrating peptide-functionalized PEG-PLA nanoparticles loaded with paclitaxel.</a> Biomaterials. 34 (22), 5640-5650 (2013).</li><li>Babu, M. M., van der Lee, R., de Groot, N. S., Gsponer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsically+disordered+proteins:+regulation+and+disease.">Intrinsically disordered proteins: regulation and disease.</a> Curr Opin Struct Biol. 21 (3), 432-440 (2011).</li><li>Anthis, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+integrin+tyrosine+phosphorylation+is+a+conserved+mechanism+for+regulating+talin-induced+integrin+activation.">Beta integrin tyrosine phosphorylation is a conserved mechanism for regulating talin-induced integrin activation.</a> J Biol Chem. 284 (52), 36700-36710 (2009).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Protein-protein etkileşimlerini incelemek için pek çok yöntem vardır. Bu çalışmada sunulan yöntem hangi biotinylated yem etkileşim kurulmasını sağlamak için hücre lysates ile inkübe yaygın olarak kullanılan biotin-avidin açılan sistemine bağlıdır. Bu çalışmada sunulan değişiklik bu teknik hücre Penetran serileri ile kombinasyonu içerir. Canlı hücreler yerine hücre lysates ile inkübe hücre Penetran yemler tasarım için teklif ve bu nedenle bulundu etkileşimleri bu hücresel bağlamı içinde gerçekleşen yansıtır.
Burada TAT hücre Penetran sıralaması, biotin açılan etiket ve hücre içi etkileşimler insan GSCs bulmak için hedef olarak amino asitler 266-283 arasında oluşan Cx43 bölge olarak kullanırız. Yapısal Cx43 ve c-Src arasındaki etkileşimi için iyi bilinen11,12temelidir. C-Src gliyom hücreleri24,13oncogenic aktivitesini inhibe önemli bir etkileşim olmasıdır. Aslında, bu bölge (TAT-Cx43266-283) içeren CPPs Cx43 antioncogenic özellikleri gliyom hücreleri19,20,21üzerinde taklit. Sıçan gliyom C6 hücrelerinde c-Src, endojen inhibitörleri CSK ve PTEN20ile birlikte alımı hangi c-Src TAT-Cx43266-283 engeller mekanizması içerir. Çünkü onlar konvansiyonel tedavilere dirençli ve bu nedenle bu kötü huylu beyin tümörü27tekrarını sorumlu bir subpopulation teşkil GSCs çok ilginç bir hedef olarak tümörü tedavisi, belirtilmelidir. Ayrıca, onlar zor transfect hücreleri ve bu nedenle hücre içi etkileşimler çalışmanın daha zor olur. CPPs hızla ve verimli bir şekilde GSCs19 kullanımları için hücre içi etkileşimler çalışmanın lehine içselleştirilmiş. Bu çalışma, biz Cx43266-283 sıra etkileşim c-Src CSK ve PTEN insan GSCs içinde endojen inhibitörleri ile birlikte onaylamak için biotin erimiş CPPs kullanarak.
Bu yöntem biyoaktif bileşiklerin hücre içi mekanizması çalışmaya çok güçlüdür. Ancak, biotinylated hücre içine işleyen yem biyolojik etkisini farklı sigara-biotinylated ile bir elde değildir onaylamak çok önemlidir. Biyoaktif bileşik etkisi ile bulundu etkileşimleri ilişkilendirmek için bu adım gereklidir. Ayrıca, bileşik, onun olası bozulma proteaz tarafından yanı sıra olası onun toksisitesi, kararlılığını olmalı dikkatle test ve deneme planlamadan önce göz önünde. Sunulan örnekte, önceden belgelenen20G166 insan GSCs anti-proliferatif TAT-Cx43266-283 etkisi olmuştur. Bu çalışmada, biz bunu teyit TAT-Cx43266-283anti-proliferatif etkisi -B ve TAT-Cx43266-283 çok benzerdir. Buna ek olarak, bu α-tübülin hücresel Morfoloji analizi ortaya ve F-aktin dağıtım çok G166 TAT-Cx43266-283ile tedavi GSCs içinde benzer -B veya TAT-Cx43266-283. Özet olarak, bu sonuçlar dahil biotin c-terminus, TAT-Cx43266-283 , insan GSCs üzerine bu bileşik etkisi değiştirmek değil gösterir. Biotin biyoaktif molekül etkilerini değiştirmek istiyorum, ancak, diğer Etiketler protein arıtma, bayrak octapeptide (DYKDDDDK)28gibi insan grip hemagglutinin kaynaklı etiket HA (YPYDVPDYA) ya da glutatyon test edilebilir S-transferaz (GST)29. Benzer şekilde, TAT faiz hücre nüfusu hedef değil, diğer penetratin, MPG (için bir daha gözden geçirme, bkz:30) gibi delici dizileri, hücre veya hücre belirli dizileri-ebilmek var olmak kullanılmış31.
Özellikle hedef sıra ile etkileşim çalışma proteinler yanı sıra, hem denetim hem hedef sıra ile etkileşim proteinler ve bileşenlerle, pozitif ve negatif denetimleri etkileşimli olarak proteinler varlığı en ideali ele. Bu anlamda Cav-1 denetimde bulunan ve daha önce26gösterilmiştir gibi caveolae içselleştirilmesi, mekanizma içinde yer düşündüren durum, tedavi. Ayrıca, c-Src ile etkileşim kurar ama Cx43 c-terminal ile etkileşimli olarak beklenir, FAK yok oldu hem denetim hem de tedavi durumu. Bu sonuçlar TAT-Cx43266-283- B, c-Src, CSK ve PTEN arasındaki etkileşimi özgüllük güçlendirmek. Bu iletişim kuralı ile elde edilen sonuçları onaylamak için confocal mikroskobu etkileşen proteinlerin dağılımını görselleştirmenizi ve onların ortak yerelleştirme eğitim için kullanılabilir. Böylece, eş yerelleştirme sonuçları teyit bazı noktaları ile benzer bir hücre içi dağıtım açılan deneylerden elde edilen bu TAT-Cx43266-283- B ve c-Src sergi bulduk. Aslında, TAT-Cx43266-283- B kargo, bu çalışmada Cx43266-283, hücre içi ortaklarına molekül yönlendirir düşündüren plazma zarı yakın dağıtılır.
Bir önerilen yöntemi sınırlamaları gibi yem düzgün pas için başarısız olabilir kullanılan molekül ve beklenen etkileri değil bulunur. Bu durumda bulunan etkileşimleri efekte ilişkili olabilir. Ancak, çünkü onlar genellikle özünde düzensiz bölgeler32 tarafından yapılır ve bu nedenle onlar bir sıralı katlama gerektirmeyen bu yöntem özellikle ilginç etkileşimleri sinyal iletim yollarının içinde dahil olabilir. Ayrıca, önerilen yöntemin avantajları, etkileşimin zaman ders, için geçici etkileşimler özellikle ilgili olduğu izlenebilir olduğunu biridir. Ayrıca, her kalıntı etkileşimi alaka kolayca okudu olabilir. Nitekim, Glutamat serin veya treonin phosphomimetic ikame tarafından protein-protein etkileşimi, örneğin, ardından değişiklikleri uygunluğunu incelemek mümkündür. Benzer şekilde, serin veya treonin alanin için veya fenilalanin tirozin ikame phosphorylatable serin, treonin veya tirozin. etkisini test sağlarFosfo-tirozin taklit etmek için Tyr ikame p-Tyr33için en doğru yoldur.
Çünkü bu sistem RNA dizileri, nano tanecikleri, virüsler veya biotin için erimiş ve CPP ile çalışmaya transduced diğer moleküller gibi biyoaktif diğer yükleri için uygulanabilir son olarak, bu iletişim kuralı çok protein-protein etkileşimi kapsamıdır onların hücre içi etki mekanizmaları.

Protein-protein etkileşimleri çok çeşitli hücresel süreçler için gereklidir. Bu işlemler tamamen anlamak için yöntemleri protein etkileşimleri karmaşık hücre içi ortamda tanımlamak için gereklidir. Bir protein etkileşim ortakları tanımlamak için en çok kullanılan yöntemlerden birini protein veya benzeşme açılan deneylerde proteinler algılama tarafından takip yem olarak protein bir parçası bir mimetic peptid kullanmaktır. Avidin-biotin sistemi yüksek afinite, özgüllük ve avidin ve biotin1,2arasında istikrarlı etkileşim nedeniyle sık sık kullanılır. Genellikle, biotin kovalent yemi (protein veya peptid) bağlıdır ve kuluçka etkileşim kurulmasını sağlamak için hücre lysates ile bir süre sonra hücre içi ortaklarına bağlı biotinylated yem avidin veya avidin aşağı çekti türevleri destek boncuk ile Birleşik. Sonra yem-protein etkileşimleri çamaşır, elüsyon ve analiz sonra Western blot tarafından takip Elektroforez denaturing tarafından tespit edilir. Bu teknik sorunlardan biri faiz protein ve hücre içi ortakları arasındaki etkileşimler hücresel bağlamı dışında yer alıyor olduğunu. Çünkü belirli hücre içi yerlerde gerçekleşecek, onlar geçici ve onlar genellikle değil bol proteinler tarafından yürütülmektedir sinyal iletim yollarının içinde ilgili etkileşimleri için önem kazanır. Bu nedenle, hücre lysates içinde bu etkileşimler daha bol diğer proteinler veya genellikle yakın değildir proteinler maskelenebilir.
Hücre Penetran peptidler (CPPs) kısa peptidler (≤40 amino asitler), hemen hemen her hücre3içine moleküllerin çeşitli taşıma kapasitesine sahip Katyonik amino asitler tarafından çoğunlukla oluşan vardır. Proteinler, plazmid DNA, siRNA, virüs, görüntüleme ajanlar ve çeşitli nano tanecikleri gibi yükleri CPPs ve verimli bir şekilde içselleştirilmiş4,5Birleşik. Bu taşıma yeteneği nedeniyle onlar da protein iletim etki alanları (PTDs), membran translocating dizileri (MTSs) ve Truva peptidler verilir. CPPs arasında TAT peptid TAT6 biri en yaygın olmuştur HIV transactivator protein üzerinden 7,8,9okudu. TAT 6 arginin ve 2 lizin kalıntılar içeren ve sonuç olarak son derece Katyonik bir nonapeptide var. İkame çalışmalar TAT pozitif net ücretten ökaryotik hücreler ve onun sonraki içselleştirilmesi10plazma membran ile Elektrostatik etkileşimler için gerekli olduğunu gösterdi. Benzer şekilde diğer CPPs için olumlu tahsil TAT şiddetle Elektrostatik çeşitli olumsuz ücret türü hücre zarlarında lipid kafa grupları, glikoproteinlerin ve Proteoglikanlar3 de dahil olmak üzere, için hücre dışı yüzeyde mevcut bağlar , 10. TAT tarafından taşınan biyoaktif yükleri sitozol hücre içi eşleri ulaşmak için hemen serbest hale.
Burada TAT CPP hücre içi etkileşimler çalışmaya biotin ile birleştirir bir yöntem mevcut. Amaç hedef biomolecule TAT ve biotin eritme tarafından hücre Penetran yemler tasarlamaktır. Bu öneri büyük avantajı yem ve ortakları arasındaki etkileşimler hücresel bağlamı içinde gerçekleşecek olduğunu. Bu yöntemin etkinliğini göstermek için protein ile proto-oncogene c-Src11,12,13intracellularly etkileşimine bildirilmiştir Cx43 küçük bir dizi yem olarak kullanılır. Cx43 astrocytes14' te yaygın olarak ifade edilir ve aşağı-yüksek dereceli gliomas düzenlenmiş bir integral membran proteini en sık görülen malign tümör merkezi sinir sistemi15,16,17 olduğunu ,18. Bu daha önce gösterilen bu c-Src (amino asitler 266-283 insan Cx43; ın etkileşim Cx43 bölge PubMed: P17302) erimiş (TAT-Cx43266-283) TAT için c-Srcin tümörü hücreleri oncogenic aktivitesini inhibe ve tümörü kök hücreleri (GSCs)19,20,21. Hücre içi yem tasarlamak için Cx43266-283 N-terminus (TAT-Cx43266-283), TAT ve biotin C-terminus adlı eritti (TAT-Cx43266-283- B). Bu stratejiyi başarıyla sıçan gliyom C6 hücre kültürünü c-Src, c-terminal Src kinaz (CSK) ve fosfataz ve homolog (PTEN) bu bölge Cx4320hücre içi ortağı olarak tensin tanımlamak için kullanılmıştır. Burada, tümörü tedavisi için ama daha zor daha olmayan kök gliyom hücre transfect için çok ilgili insan GSCs kendi etkinliğini test bu yöntem açıklanmaktadır.

<table><tbody><tr><td>G166 GSC line</td><td>BioRep</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RHB-A stem cell medium</td><td>Takara</td><td>Y40001</td><td></td></tr><tr><td>Laminin Mouse Protein</td><td>Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>23017-015</td><td>10 &amp;micro;g/ml</td></tr><tr><td>B-27 Serum free Supplement (50X)</td><td>Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>17504-044</td><td>2%</td></tr><tr><td>N-2 Supplement (100x)</td><td>Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>17502-048</td><td>1%</td></tr><tr><td>Recombinant Human EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>Recombinant Human b-FGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-18B</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>PBS pH 7.4: In deionized water, 136 mM NaCl ; 2.7 mM KCl; 7.8 mM Na2HPO4&amp;middot;2H2O ; 1.7 mM KH2PO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma</td><td>A6964</td><td></td></tr><tr><td>Cryostor CS10 cryopreservation medium</td><td>StemCell Technologies</td><td>7930</td><td></td></tr><tr><td>TAT</td><td>GenScript</td><td>-</td><td>Custom made</td></tr><tr><td>TAT-B</td><td>GenScript</td><td>-</td><td>Custom made</td></tr><tr><td>TAT-Cx43&lt;sub&gt;266-283&lt;/sub&gt;</td><td>GenScript</td><td>-</td><td>Custom made</td></tr><tr><td>TAT-Cx43&lt;sub&gt;266-283&lt;/sub&gt;-B</td><td>GenScript</td><td>-</td><td>Custom made</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Phalloidin</td><td>Molecular Probes, Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>A1275737</td><td>1/20</td></tr><tr><td>Monoclonal &amp;alpha;-tubulin mouse antibody</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9026</td><td>1/500</td></tr><tr><td>4&#039;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td><td>Molecular Probes, Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>1.25 mg/ml</td></tr><tr><td>Pierce&amp;trade; NeutrAvidin&amp;trade; Agarose</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>29200</td><td></td></tr><tr><td>Protein lysis buffer: 5 mM Tris-HCl (pH 6.8), 2% (w/v) SDS, 2 mM EDTA , 2 mM EGTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail Set III. EDTA-Free</td><td>Calbiochem, Bionova</td><td>539134</td><td>1/100 (v/v)</td></tr><tr><td>Sodium Fluoride</td><td>PanReac AppliChem</td><td>141675</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>Sodium orthovanadate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6508</td><td>0.1 mM</td></tr><tr><td>Laemmli buffer: (4x: 0.18 M Tris-HCl pH 6.8; 5 M glycerol; 3.7 % (w/v) SDS; 0.6 M &amp;beta;-mercaptoethanol or 9 mM DTT ; 0.04% (v/v) bromophenol blue (BB) .</td><td></td><td></td><td>1X</td></tr><tr><td>Xcell 4 SureLock Midi-Cell Electrophoresis System</td><td>Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>WR0100</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex Bis-Tris Midi-Gels 4-12%</td><td>Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>WG1402box</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X)</td><td>Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>NP0001</td><td>1X</td></tr><tr><td>NuPAGE Transfer Buffer 20x</td><td>Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>NP0006</td><td>1X</td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Dual Color Standard</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0374</td><td></td></tr><tr><td>iBlot 2 NC Regular Stacks (nitrocellulose membranes)</td><td>Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>IB23001</td><td></td></tr><tr><td>iBlot 2 Dry Blotting System - Gel transfer device</td><td>Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>IB21001</td><td></td></tr><tr><td>10% Ponceau S Solution (0.1% Ponceau (w/v) in 5% acetic acid (v/v)) in water</td><td>Sigma</td><td>P7170</td><td></td></tr><tr><td>FAK polyclonal rabbit antibody</td><td>Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>AHO0502</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Src polyclonal rabbit antibody</td><td>Cell Signalling (WERFEN)</td><td>2108S</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Csk polyclonal rabbit antibody</td><td>Cell Signalling (WERFEN)</td><td>4980</td><td>1/500</td></tr><tr><td>PTEN polyclonal mouse antibody</td><td>Cell Signalling (WERFEN)</td><td>9552</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Caveolin-1 polyclonal rabbit antibody</td><td>Abcam</td><td>ab2910</td><td>1/1000</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG-HRP antibody</td><td>Quimigen, Santa Cruz Biotechnology</td><td>Sc-2005</td><td>1/5000</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG-HRP antibody</td><td>Quimigen, Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-2030</td><td>1/5000</td></tr><tr><td>Western Blotting Luminol Reagent</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-2048</td><td></td></tr><tr><td>Src polyclonal rabbit antibody</td><td>Cell Signalling (WERFEN)</td><td>2108S</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Antibody solution: PBS, 10% FBS, 0.1 M lysine, 0.02% sodium azide</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG</td><td>Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>A11029</td><td>1/1000</td></tr><tr><td>Cy2-conjugated streptavidin</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>016-220-089</td><td>1/500</td></tr><tr><td>MicroChemi Luminescence system</td><td>DNA Bio-Imaging Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V Alexa Fluor&amp;reg; 488 &amp;amp; Propidium Iodide (PI)</td><td>Molecular Probes, Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>V13241</td><td>1/500</td></tr><tr><td>SlowFade Gold antifade reagent</td><td>Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>S36936</td><td></td></tr><tr><td>Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2128</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide for UV-spectroscopy, &gt;=99.8% (GC)</td><td>Honeywell</td><td>41641-1L</td><td></td></tr><tr><td>Appliskan 2001</td><td>Thermo Electron Corporation, Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

biotinylated cell-penetrating peptides to study intracellular protein-protein interactions

Burada yaygın olarak kullanılan biotin-avidin açılan sistemi temelinde intraselüler protein-protein etkileşimleri çalışma Protokolü mevcut. Sunulan değişiklik bu teknik hücre Penetran serileri ile kombinasyonu içerir. Canlı hücreler yerine hücre lysates ile inkübe hücre Penetran yemler tasarım için teklif ve bu nedenle bulundu etkileşimleri hücre içi bağlamı içinde ortaya yansıtır. Connexin43 (Cx43), formları gap junction kanalları ve hemichannels bir protein yüksek kalitede gliomas aşağı düzenlenir. Amino asitler 266-283 oluşan Cx43 bölge c-Src gliyom hücrelerdeki oncogenic aktivitesinin inhibisyonu için sorumludur. Burada TAT hücre Penetran sıralaması, biotin açılan etiket ve amino asitler 266-283 insan gliyom zor transfect kök hücre hücre içi etkileşimler bulmak için hedef olarak arasında oluşan Cx43 bölge olarak kullanırız. Önerilen yöntem sınırlamaları gibi yem fold düzgün ve sonuç olarak başarısız kullanılan molekül bulundu etkileşimleri etkisi ile ilişkili olamazdı biridir. Ancak, onlar genellikle özünde düzensiz bölgeler tarafından yapılır ve bu nedenle, onlar bir sıralı katlama gerek yoktur çünkü bu yöntem özellikle ilginç etkileşimleri sinyal iletim yollarının içinde dahil olabilir. Ayrıca, önerilen yöntemin avantajları, etkileşimin her kalıntı alaka kolayca okudu biridir. Bu modüler bir sistemdir; Bu nedenle, diğer hücre Penetran dizileri, diğer etiketleri ve diğer hücre içi hedefleri istihdam edilebilir. Çünkü bu sistem RNA dizileri, nano tanecikleri, virüsler veya hücre Penetran dizileri ile transduced herhangi bir molekül gibi biyoaktif diğer yükleri için uygulanabilir son olarak, bu iletişim kuralı çok protein-protein etkileşimi kapsamıdır ve onların hücre içi etki mekanizması çalışmaya açılan Etiketler erimiş.

Hücre içi etkileşim çalışmaya BCPPs kullanmadan önce BCPP vs BCPP ile elde edilen sonuçları doğrulamak için CPP etkileri karşılaştırmak için önemlidir. Sonuç olarak, hedef sıra aktivite dahil biotin değiştirir olup olmadığını incelemek için biz ilk TAT-Cx43266-283etkisini analiz -B karşılaştırıldığında TAT-Cx43266-283 G166 GSCs Morfoloji tarih ile. Bunu yapmak için bazı ayirt analizleri iki hücre iskeleti proteinleri, F-aktin ve α-tübülin tedavinin 24 saat sonra yapılır. Şekil 1 gösterir bu G166 GSCs 50 µM TAT-Cx43266-283 veya TAT-Cx43266-283huzurunda -B denetim (TAT veya TAT-B) gösterilen daha uzun ve genişletilmiş hücresel prolongations kıyasla daha yuvarlak bir şekil almak. Aslında, Şekil 1b hücreleri TAT-Cx43266-283 veya TAT-Cx43266-283ile tedavi edildi zaman aktin filamentleri çoğunlukla aktin ağlar olarak monte edilir gösterir -B sahipken onlar kontrol hücreleri daha fazla aktin demetleri (TAT ile tedavi veya TAT-B)25. Buna ek olarak, α-tübülin dağıtım arasında farklı koşulları farklı değil. Bu sonuçlar biotin varlığı hedef sıra etkisi G166 GSCs Morfoloji değiştirmek değil gösterdi. Önceki çalışmalar20,21', TAT-Cx43266-283 G166 GSCs yayılması azalma göstermiştir. Bu çalışmada, biz araştırdık olup olmadığını TAT-Cx43266-283- B giderek artan büyüme TAT-Cx43266-283olarak aynı etkileri. Bunu yapmak için G166 GSCs yayılması MTT tahlil tarafından tedavi 72 h sonra analiz ettik. MTT tahlil hücre metabolik etkinliğini değerlendirmek için kolorimetrik bir tahlil olduğunu. MTT hücrelerin mevcut sayısı yansıtan mitokondri içinde NAD (P) H oxidoreductase enzimler tarafından metabolize edilir. Şekil 2 gösterir hücreleri 50 µM TAT-Cx43266-283 veya 50 µM TAT-Cx43266-283ile tedavi edildi zaman G166 GSCs hücre canlılığı azalma önemli ölçüde farklı olmadığını -d. Gerçekten de, her ikisi de önemli ölçüde azalmış G166 GSCs yayılma denetimi, TAT veya TAT-d. karşılaştırıldığında
Biz G166 GSCs (TAT-Cx43266-283) bizim hedef sırada etkisini dahil biotin C-terminus adlı tarafından değiştirilmedi onayladıktan sonra (TAT-Cx43266-283- B), biz bu dizi hücre içi ortaklarının araştırdık Protokol sonrası açıklanan bu çalışmada (şekil 3). Caveolae dahil çünkü TAT içselleştirilmesi26yönteminde, caveolin-1 (Cav-1) çekme-çıkışlar'varlığı analiz ettik. Western blot analizi (şekil 4) gösterdi o TAT-B ve TAT-Cx43266-283- B Cav-1 ile etkileşim. Ancak, TAT-Cx43266-283yeteneği -B-c-Src, PTEN ve CSK askere TAT-b ile bulunan daha güçlü Odak yapışma kinaz (FAK) Cx43 ile etkileşim gösterilen değil c-Src substrat var. Nitekim, FAK TAT-B ya da TAT-Cx43266-283önemli herhangi bir etkileşim yoktu -d.
TAT-Cx43266-283arasındaki etkileşimi onaylamak için -B ve c-Src, G166 GSCs inkübe ile 50 µM TAT-Cx43266-283- B 30 dk ve onların yerelleştirme için confocal mikroskobu (şekil 5 ile floresan streptavidin izledi ). Bizim sonuçları gösterdi ki hücre içi dağıtım TAT-Cx43266-283- B plazma zarı (Fosfatidilserin boyama tarafından gösterilen) yakındır ve c-Src ile eşleşecek. Aslında, co yerelleştirme analizleri co yerelleştirme (beyaz) arasında TAT-Cx43266-283bazı noktaları ortaya -B ve c-Src birleştirme görüntü. Sonuç olarak, confocal mikroskobu çalışmalar bu çalışmada açıklanan BCPP açılan iletişim kuralı ile elde edilen sonuçları desteklemektedir.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56457/56457fig1.jpg"> 
Resim 1: BCPP ve CPP üzerindeki etkisini GSC morfolojisi. G166 GSCs düşük yoğunluklu kaplama (2 x 104 hücreleri / cm2) ve BCPP (TAT-B), tedavi CPP (TAT-Cx43266-283) ya da tedavi BCPP onlar 50 µM denetim CPP (TAT) ile inkübe 24 saat sonra kontrol (TAT-Cx43266-283- B) . a) F-aktin (kırmızı), α-tübülin (yeşil) ve birleştirilmiş + G166 GSCs Morfoloji gösteren aynı alanın DAPI immunostaining. Barlar 50 µm. b =) F-aktin immunostaining F-aktin G166 GSCs sonra kuluçka için 50 µM ile 24 saat içinde farklı dağılımını gösteren CPP (TAT) kontrol ya da BCPP (TAT-B) ile karşılaştırıldığında 50 µM tedavi CPP (TAT-Cx43266-283) veya BCPP (TAT-Cx43 kontrol 266-283-B). Barlar 10 µm. = <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56457/56457fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56457/56457fig2.jpg"> 
Resim 2: BCPP ve CPP üzerindeki etkisini GSC canlılığı. G166 GSCs 5500 hücreler/cm2 24-multiwell plakaları'de kaplama ve 50 µM denetim peptidler, CPP (TAT) veya BCPP (TAT-B), veya 50 µM tedavi peptidler, CPP (TAT-Cx43266-283) ya da BCPP ile inkübe (TAT-Cx43266-283- B). Hücre canlılığı bir ÇMT tahlil 72 h sonra kullanılarak analiz. Sonuçları MTT absorbances ifade edilir ve en az 3 deneyler ortalama ± s.e.m. vardır (++ p˂0.01 vs denetim. ** p˂0.01, *** TAT veya TAT-B p˂0.001 vs; tek yönlü ANOVA withTukey sonrası test). CPPs vs BCPPs. etkileri arasında önemli farklılıklar Not <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56457/56457fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56457/56457fig3.jpg"> 
Resim 3: Protokol şeması. Eluted BCPPs ve onların etkileşen proteinler obtained.1 olana BCPPs bölümünü "Protokol", kuluçka üzerinden yordamda açıklandığı gibi adım adım grafik gösterimi) için istenen konsantrasyon BCPPs ile Kültür hücreleri kuluçkaya gerekli zaman. 2) sırasında kuluçka BCPPs içselleştirilmiş ve hücre içi eşleri ile etkileşim. 3) hücreleri üç kez on Ice buz gibi PBS ile yıkayın. 4) proteinler ayıklamak için hücreleri parçalayıcı. 5) hücre lysates tüpler için transfer.6) 11000 x g 4 ° C'de 10 dakika için de spin 7) «««tüp (B) transfer örnekleri yeni tüpler (A) ve devam düzenli Western işlemek için lysates küçük bir aliquot supernatants leke. 8) resuspend NeutrAvidin özel boncuk ve 50 µL her tüp kesme pipet ucu kullanarak ekleyin. 9) 12 h 4 ° C'de NeutrAvidin özel boncuk BCPPs ve eşleri ile etkileşimine izin vermek için hafifçe sallayarak ile kuluçkaya. 10) boncuk biotinylated ile cips için spin için 1 dk 3000 x g , Yemler ve onların etkileşen proteinler onlara bağlı. 11) transfer supernatants yeni tüpler (C) ve aşağı açılır gerekebileceğinden yinelenmesi kullanmak üzere saklayın. 12) Pelet beş kez taze lizis arabelleği ile yıkayın, inversiyon, 1 dk, 3000 x g tur tarafından resuspend ve süpernatant atın. 13) tüm süpernatant dikkatli bir şekilde çıkarın. 14) 4 x Laemmli Arabellek istenen birim ekleme ve proteinler için 5 dk. 15 100 ° C'de elute) Spin, 8200 x g 30 s boncuk cips. 16) bulunan süpernatant kapiller keyif-e doğru yeni tüpler (D) ile eluted proteinler aktarın. 17) Western blot analizi için jeller üzerine yükleyin. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56457/56457fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56457/56457fig4.jpg"> 
Şekil 4: Çalışma TAT-Cx43266-283hücre içi etkileşimlerinin -B G166 GSCs tarafından açılan takip tarafından Western blot. G166 GSCs 50 µM TAT-B veya TAT-Cx43266-283ile inkübe -d. Sonra 30 dk hücreleri lysed ve TAT-B ya da TAT-Cx43266-283- B hücre içi eşleri bağlı indirdi NeutrAvidin boncuk ile. Eluted protein yüklü ve Western blot tarafından FAK, c-Src, CSK, düzeyde çalışmaya analiz PTEN ve Cav-1. CAV-1 her iki TAT-B ile etkileşim ve TAT-Cx43266-283- B, c-Src, PTEN ve CSK etkileşim tercihen ile TAT-Cx43266-283- B ve FAK Not TAT-B ya da TAT-Cx43266-283herhangi bir etkileşimi göstermektedir değil-B. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56457/56457fig4large.jpg" target="_blank">lütfen Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için burayı tıklatın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56457/56457fig5.jpg"> 
Şekil 5: TAT-Cx43266-283- B hücre içi etkileşimler G166 GSCs confocal mikroskobu tarafından doğrulanması. G166 GSCs 50 µM TAT-Cx43266-283ile inkübe -d. 30 dakika sonra hücreleri sabit ve TAT-Cx43266-283yerelleştirmek için işlenen -B ile Cy2-Streptavidin (yeşil), c-Src ayirt (kırmızı) ve V (mavi) annexin ile Fosfatidilserin. Co yerelleştirme (beyaz) arasında TAT-Cx43266-283bazı noktalara dikkat edin -B ve c-Src plazma zarı birleştirme görüntüleri yakın. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56457/56457fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions at JoVE.com

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

İntraselüler Protein-protein etkileşimleri çalışmaya Biotinylated hücre Penetran peptidler

Bu hücre Penetran dizileri birleştirme biotin avidin açılan yenilik ile tabanlı sisteme intraselüler protein-protein etkileşimleri çalışmaya bir protokoldür. Ana avantajdır hedef sıra canlı hücreler yerine hücre lysates ile inkübe ve bu nedenle etkileşimleri hücresel bağlamı içinde ortaya çıkar.

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

biotinylated-cell-penetrating-peptides-to-study-intracellular-protein

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

9.4K Görüntüleme.  Universidad de Salamanca. Bu hücre Penetran dizileri birleştirme biotin avidin açılan yenilik ile tabanlı sisteme intraselüler protein-protein etkileşimleri çalışmaya bir protokoldür. Ana avantajdır hedef sıra canlı hücreler yerine hücre lysates ile inkübe ve bu nedenle etkileşimleri hücresel bağlamı içinde ortaya çıkar.

Video: Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced that allow the proximity-dependent labeling of proteins in living cells. One such enzyme, BirA* (used in the BioID approach), mediates the biotinylation of proteins within a range of approximately 10 nm. Hence, when fused to a protein of interest and expressed in cells, it allows the labeling of proximal proteins in their native environment. As opposed to AP that relies on the purification of assembled protein complexes, BioID detects proteins that have been marked within cells no matter whether they are still interacting with the protein of interest when they are isolated. Since it biotinylates proximal proteins, one can moreover capitalize on the exceptional affinity of streptavidin for biotin to very efficiently isolate them. While BioID performs better than AP for identifying transient or weak interactions, both AP- and BioID-mass spectrometry approaches provide an overview of all possible interactions a given protein may have. However, they do not provide information on the context of each identified PPI. Indeed, most proteins are typically part of several complexes, corresponding to distinct maturation steps or different functional units. To address this common limitation of both methods, we have engineered a protein-fragments complementation assay based on the BirA* enzyme. In this assay, two inactive fragments of BirA* can reassemble into an active enzyme when brought in close proximity by two interacting proteins to which they are fused. The resulting split-BioID assay thus allows the labeling of proteins that assemble around a pair of interacting proteins. Provided these two only interact in a given context, split-BioID then allows the analysis of specific context-dependent functional units in their native cellular environment. Here, we provide a step-by-step protocol to test and apply split-BioID to a pair of interacting proteins.

We provide a step-by-step protocol for split-BioID, a protein fragments-complementation assay based on the proximity-labeling technique BioID. Activated on the interaction of two given proteins, it allows the proteomics analysis of context-dependent protein complexes in their native cellular environment. The method is simple, cost-effective and only requires standard laboratory equipment.

Split-BioID — Proteomik analiz onların yerel hücresel ortamında içeriğe özel Protein kompleksleri

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Biyokimya

Fluorescent Leakage Assay to Investigate Membrane Destabilization by Cell-Penetrating Peptide

Cell-penetrating peptides (CPPs) are defined as carriers that are able to cross the plasma membrane and to transfer a cargo into cells. One of the main common features required for this activity resulted from the interactions of CPPs with the plasma membrane (lipids) and more particularly with components of the extracellular matrix of the membrane itself (heparan sulphate). Indeed, independent of the direct translocation or the endocytosis-dependent internalization, lipid bilayers are involved in the internalization process both at the level of the plasma membrane and at the level of intracellular traffic (endosomal vesicles). In this article, we present a detailed protocol describing the different steps of a large unilamellar vesicles (LUVs) formulation, purification, characterization, and application in fluorescence leakage assay in order to detect possible CPP-membrane destabilization/interaction and to address their role in the internalization mechanism. LUVs with a lipid composition reflecting the plasma membrane content are generated in order to encapsulate both a fluorescent dye and a quencher. The addition of peptides in the extravesicular medium and the induction of peptide-membrane interactions on the LUVs might thus induce in a dose-dependent manner a significant increase in fluorescence revealing a leakage. Examples are provided here with the recently developed tryptophan (W)- and arginine (R)-rich Amphipathic Peptides (WRAPs), which showed a rapid and efficient siRNA delivery in various cell lines. Finally, the nature of these interactions and the affinity for lipids are discussed to understand and to improve the membrane translocation and/or the endosomal escape.

The fluorescence leakage assay is a simple method that enables the investigation of peptide/membrane interactions in order to understand their involvement in several biological processes and especially the ability of cell-penetrating peptides to disturb phospholipids bilayers during a direct cellular translocation process.

Hücre Delici Peptit ile Membran Dengesizleşmesini Araştırmak için Floresan Sızıntı Tahlil

Cell-penetrating peptides (CPPs) are defined as carriers that are able to cross the plasma membrane and to transfer a cargo into cells. One of the main ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of methodological options for addressing molecular interactions in cells have been developed, but most of these methods suffer from being rather indirect and therefore hardly quantitative. On the contrary, a few high-end quantitative approaches were introduced, which however are difficult to extend to high throughput. To combine high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information, we recently developed a new concept for identifying protein-protein interactions (Schwarzenbacher et al., 2008). Here, we describe a detailed protocol for the design and the construction of this system which allows for analyzing interactions between a fluorophore-labeled protein ("prey") and a membrane protein ("bait") in-vivo. Cells are plated on micropatterned surfaces functionalized with antibodies against the bait exoplasmic domain. Bait-prey interactions are assayed via the redistribution of the fluorescent prey. The method is characterized by high sensitivity down to the level of single molecules, the capability to detect weak interactions, and high throughput capability, making it applicable as screening tool.

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

This video shows experiments with subsequent analysis of protein-protein interactions by the use of micro-patterned surfaces. The approach offers the possibility to detect protein interactions in living cells and combines high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information.

Mikro desenli Yüzeyler, protein-protein etkileşimleri-vivo Algılama

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Biyoloji

Construction of Cyclic Cell-Penetrating Peptides for Enhanced Penetration of Biological Barriers

Cancer has been a grand challenge in global health. However, the complex tumor microenvironment generally limits the access of therapeutics to deeper tumor cells, leading to tumor recurrence. To conquer the limited penetration of biological barriers, cell-penetrating peptides (CPPs) have been discovered with excellent membrane translocation ability and have emerged as useful molecular transporters for delivering various cargoes into cells. However, conventional linear CPPs generally show compromised proteolytic stability, which limits their permeability across biological barriers. Thus, the development of novel molecular transporters that can penetrate biological barriers and exhibit enhanced proteolytic stability is highly desired to promote drug delivery efficiency in biomedical applications. We have previously synthesized a panel of short cyclic CPPs with aromatic crosslinks, which exhibited superior permeability in cancer cells and tissues compared to their linear counterparts. Here, a concise protocol is described for the synthesis of the fluorescently labeled cyclic polyarginine R8 peptide and its linear counterpart, as well as key steps for investigating their cell permeability.

This protocol describes the synthesis of cyclic cell-penetrating peptides with aromatic cross-links and the evaluation of their permeability across biological barriers.

Biyolojik Bariyerlerin Daha İyi Penetrasyonu için Siklik Hücre Nüfuz Eden Peptitlerin Yapımı

Cancer has been a grand challenge in global health. However, the complex tumor microenvironment generally limits the access of therapeutics to deeper ...

Kimya

Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1. Many of these are referred to as cell-penetrating peptides, which are frequently noted for their potential as drug delivery vectors1-3. Moreover, there is increasing interest in antimicrobial peptides that operate via non-membrane lytic mechanisms4,5, particularly those that cross bacterial membranes without causing cell lysis and kill cells by interfering with intracellular processes6,7. In fact, authors have increasingly pointed out the relationship between cell-penetrating and antimicrobial peptides1,8. A firm understanding of the process of membrane translocation and the relationship between peptide structure and its ability to translocate requires effective, reproducible assays for translocation. Several groups have proposed methods to measure translocation into large unilamellar lipid vesicles (LUVs)9-13. LUVs serve as useful models for bacterial and eukaryotic cell membranes and are frequently used in peptide fluorescent studies14,15. Here, we describe our application of the method first developed by Matsuzaki and co-workers to consider antimicrobial peptides, such as magainin and buforin II16,17. In addition to providing our protocol for this method, we also present a straightforward approach to data analysis that quantifies translocation ability using this assay. The advantages of this translocation assay compared to others are that it has the potential to provide information about the rate of membrane translocation and does not require the addition of a fluorescent label, which can alter peptide properties18, to tryptophan-containing peptides. Briefly, translocation ability into lipid vesicles is measured as a function of the Foster Resonance Energy Transfer (FRET) between native tryptophan residues and dansyl phosphatidylethanolamine when proteins are associated with the external LUV membrane (Figure 1). Cell-penetrating peptides are cleaved as they encounter uninhibited trypsin encapsulated with the LUVs, leading to disassociation from the LUV membrane and a drop in FRET signal. The drop in FRET signal observed for a translocating peptide is significantly greater than that observed for the same peptide when the LUVs contain both trypsin and trypsin inhibitor, or when a peptide that does not spontaneously cross lipid membranes is exposed to trypsin-containing LUVs. This change in fluorescence provides a direct quantification of peptide translocation over time.

This protocol details a method for the quantitative measure of peptide translocation into large unilamellar lipid vesicles. This method also provides information about the rate of membrane translocation and can be used to identify peptides that efficiently and spontaneously cross lipid bilayers.

Büyük Unilamellar Veziküller Ölçme Peptid Translokasyon

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1.  Many of these are referred ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

Peptit Diziler protein-protein etkileşim Siteleri belirlenmesi

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

In Vivo Imaging of Transduction Efficiencies of Cardiac Targeting Peptide

Since the initial description of protein transduction domains, also known as cell penetrating peptides, over 25 years ago, there has been intense interest in developing these peptides, especially cell-specific ones, as novel vectors for delivering diagnostic and therapeutic materials. Our past work involving phage display identified a novel, nonnaturally occurring, 12 amino acid-long peptide that we named cardiac targeting peptide (CTP) due to its ability to transduce normal heart tissue in vivo with peak uptake seen in as little as 15 min after an intravenous injection. We have undertaken detailed biodistribution studies by injecting CTP labeled with fluorophore cyanine5.5, allowing it to circulate for various periods of time, and euthanizing, fixing, and sectioning multiple organs followed by fluorescent microscopy imaging. In this publication, we describe these processes as well as ex vivo imaging of harvested organs using an in vivo imaging system in detail. We provide detailed methodologies and practices for undertaking transduction as well as biodistribution studies using CTP as an example.

We describe protocols for assessing the degree of transduction by cell-penetrating peptides utilizing ex vivo imaging systems followed by paraffin embedding, sectioning, and confocal fluorescent microscopy using cardiac targeting peptide as an example. In our protocol, a single animal can be used to acquire both types of imaging assessment of the same organs, thereby cutting the number of animals needed for studies by half.

Kardiyak Hedefleme Peptidin Transdüksiyon Verimlerinin Vivo Görüntülemesinde

Since the initial description of protein transduction domains, also known as cell penetrating peptides, over 25 years ago, there has been intense interest ...

Protein Etkileşimlerinin Canlı Hücre Tek Moleküllü Görüntüleme Tabanlı Miktar Tayini

Single-Molecule Measurement of Protein Interaction Dynamics Within Biomolecular Condensates

Biomolecular condensates formed via liquid-liquid phase separation (LLPS) have been considered critical in cellular organization and an increasing number of cellular functions. Characterizing LLPS in live cells is also important because aberrant condensation has been linked to numerous diseases, including cancers and neurodegenerative disorders. LLPS is often driven by selective, transient, and multivalent interactions between intrinsically disordered proteins. Of great interest are the interaction dynamics of proteins participating in LLPS, which are well-summarized by measurements of their binding residence time (RT), that is, the amount of time they spend bound within condensates. Here, we present a method based on live-cell single-molecule imaging that allows us to measure the mean RT of a specific protein within condensates. We simultaneously visualize individual protein molecules and the condensates with which they associate, use single-particle tracking (SPT) to plot single-molecule trajectories, and then fit the trajectories to a model of protein-droplet binding to extract the mean RT of the protein. Finally, we show representative results where this single-molecule imaging method was applied to compare the mean RTs of a protein at its LLPS condensates when fused and unfused to an oligomerizing domain. This protocol is broadly applicable to measuring the interaction dynamics of any protein that participates in LLPS.

Yazar Spotlight: Canlı İnsan Hücrelerinde Protein-Kondensat Dinamiklerinin Değerlendirilmesi

Many intrinsically disordered proteins have been shown to participate in the formation of highly dynamic biomolecular condensates, a behavior important for numerous cellular processes. Here, we present a single-molecule imaging-based method for quantifying the dynamics by which proteins interact with each other in biomolecular condensates in live cells.

Biyomoleküler Kondensatlarda Protein Etkileşim Dinamiğinin Tek Moleküllü Ölçümü

Biomolecular condensates formed via liquid-liquid phase separation (LLPS) have been considered critical in cellular organization and an increasing number ...

İntraselüler Protein-protein etkileşimleri çalışmaya Biotinylated hücre Penetran peptidler

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Split-BioID — Proteomik analiz onların yerel hücresel ortamında içeriğe özel Protein kompleksleri

Hücre Delici Peptit ile Membran Dengesizleşmesini Araştırmak için Floresan Sızıntı Tahlil

Mikro desenli Yüzeyler, protein-protein etkileşimleri-vivo Algılama

Biyolojik Bariyerlerin Daha İyi Penetrasyonu için Siklik Hücre Nüfuz Eden Peptitlerin Yapımı

Büyük Unilamellar Veziküller Ölçme Peptid Translokasyon

Peptit Diziler protein-protein etkileşim Siteleri belirlenmesi

Kardiyak Hedefleme Peptidin Transdüksiyon Verimlerinin Vivo Görüntülemesinde

Biyomoleküler Kondensatlarda Protein Etkileşim Dinamiğinin Tek Moleküllü Ölçümü

Biyomoleküler Kondensatlarda Protein Etkileşim Dinamiğinin Tek Moleküllü Ölçümü

Biyomoleküler Kondensatlarda Protein Etkileşim Dinamiğinin Tek Moleküllü Ölçümü