Yazarlar, makalenin eleştirel incelemesi için Emilie Josse'ye teşekkür eder. Bu çalışma "La Ligue contre le Cancer", "Fondation ARC pour la Recherche sur le Cancer" ve "Centre National de la Recherche Scientifique" (CNRS) vakfı tarafından desteklendi.

1. Büyük Unilamellar Vezikles (LUVs) hazırlanması
<ol><li>Luv'ları floresan sızıntı tahlilleri için hücre zarı taklitleri olarak kullanımları için hazırlayın.</li>
	<li>Hamilton cam şırıngar fosfatidylcholine (DOPC, 786.11 g/mol), sphingomyelin (SM, 760.22 g/mol) ve Kolesterol (Chol, 386.65 g/mol) ile molar oranında 4:4:2 karıştırın. Lipid çözeltisi, 25 mL'lik cam yuvarlak alt şişede 25 mg/mL'de bir metanol/kloroform (3/1; hacim/hacim) çözücüde çözünen her lipitin stok çözeltisinden elde edilir. 4 μmol DOPC, 4 μmol SM ve 2 μmol Chol'a dayanan lipid çözeltisi, sırasıyla 126 μL, 117 μL ve 31 μL karıştırılarak stok çözeltisinden elde edilir. DİkKAT: Metanol toksik ve yanıcı bir çözücüdür ve kloroform toksik ve kanserojendir. Her ikisi de bir başlık altında uygun koruma ile ele alınmalıdır.</li>
	<li>Kurutulmuş bir lipit filmi oluşana kadar 60 °C'de 45-60 dakika boyunca vakum altında bir döner evaporatör kullanarak metanol / kloroform buharlaştırın.</li>
	<li>İki stok HEPES tampon çözümü hazırlayın. 20 mM HEPES (238,3 g/mol) ve 75 mM NaCl (58,44 g/mol) karıştırarak HEPES tampon 1'i hazırlayın ve pH'ı 7,4'e ayarlayın. 20 mM HEPES ve 145 mM NaCl karıştırarak HEPES tampon 2'yi hazırlayın ve pH'ı 7,4'e ayarlayın. HEPES tamponları 1 ay boyunca 4 °C'de saklanabilir. NOT: Bir kilometre sayacı kullanarak tamponların ozmolaritesinin kontrol etmesi önerilir.</li>
	<li>Membran geçirimsiz floresan boya-quencher çiftini çözerek lipid hidrasyon çözeltisi hazırlayın, HEPES tampon çözeltisinde 8-aminonaftafen-1, 3, 6-trisülfiyonik asit, 12,5 mM'de disodium tuzu (ANTS, 427,33 g/mol) ve 45 mM'de p-ksilen-bispyridinium bromür (DPX, 422,16 g/mol). ANTS'ı DPX ile karıştırmak sarı renkli bir çözeltiye yol açar. 12,5 mM ANTS ve 45 mM DPX konsantrasyonlarına ulaşmak için, 4 mL HEPES tampon 1'de sırasıyla 21,4 mg ve 76 mg çözün. NOT: Lipid hidrasyon çözeltisi, tüpün alüminyum folyo ile sarılmasıyla 4 °C'de 2 hafta saklanabilir.</li>
	<li>Kurutulmuş lipid filmini lipid hidrasyon çözeltisinin 1 mL'si ile yeniden canlandırarak ve kurutulmuş lipid filminin çözünmesine kadar girdaplayarak çokmeller veziklinleri (MLV) yeniden oluşturun. Küçük lipid agregaları önceki adımları olumsuz etkileyeceğinden çözümün tamamen çözündüğünden emin olun. Ayrıca, kalan lipit filmi olmadığından emin olmak için cam yuvarlak alt şişenin duvarını kontrol edin. NOT: Çözelti, çözünürleşmeden sonra opalescent ve açık sarı görünecektir.</li>
	<li>Unilamellar vesicles elde etmek için veziklikleri beş dondurma/çözme döngüsüne tabi edin. Her döngüyü, dondurma adımı için 30 s sıvı nitrojene 30 sn boyunca cam yuvarlak alt şişe koyarak, ardından çözme adımı için 2 dakika boyunca bir su banyosunda bırakarak gerçekleştirin. NOT: Banyo suyunun sıcaklığı lipitlerin erime sıcaklığından 5-10°C daha yüksek olmalıdır.</li>
	<li>Metal ekstrüder kutusuna yerleştirilen her politetrafloroetilen (PTFE) ekstrüder parçasına HEPES tamponu ile ön nemlendirilmiş iki filtre desteği yerleştirerek lipid ekstrüder hazırlayın.</li>
	<li>Bir filtre desteğinin üstüne HEPES nemlendirilmiş polikarbonat membran (0,1 μm gözenek boyutu, 25 mm çapında) koyun.</li>
	<li>İki metal ekstrüder bidonlarını monte edin ve vidalayın.</li>
	<li>Monte edilen ekstrüderi tutucuya yerleştirin ve her politetrafloroetilen ekstrüder parçasının ekstremitesinde uygun deliğe 1 mL şırıngır sokun. Ekstrüzyon, bir şırıncadan diğerine test edilen sıvının polikarbonat membrandan geçişine karşılık gelir.</li>
	<li>Sızıntı veya sorun olmadığından emin olmak için ekstrüderi 1 mL şırınnadan birine yüklenmiş 1 mL HEPES tamponu ile test edin.</li>
	<li>1 mL HEPES tamponu MLV örneği ile değiştirin.</li>
	<li>MLV örneğini bir şırıncadan diğerine polikarbonat membrandan en az 21 kez geçirerek aynı boyutta düzgün SUV'ler elde ederek ekstrüzyon gerçekleştirin. NOT: Ekstrüzyon lipit karışımının erime sıcaklığından daha yüksek bir sıcaklıkta yapılmalıdır.</li>
</ol>2. LUV'ların Saflaştırılması
<ol><li>Kapsüllenmemiş ANTS ve DPX fazlalığını gidermek için bir sütun saflaştırması hazırlayın.</li>
	<li>Sıvı kromatografi sütununda (Luer Lock, Ceketsiz, 1,0 cm x 20 cm, yatak hacmi 16 mL) sütun renksiz kısmının 1 cm altına kadar %0,01 NaN3 (65 g/mol) ile sulu ortamda yeniden sulanan çapraz bağlı dektran jelini (G-50) tanıtın.</li>
	<li>Musluğu açın ve çapraz bağlı dektran jelini yerleştirmek için sıvının akmasına izin verin.</li>
	<li>20 mL HEPES arabelleği 2 ile eluting yaparak sütunu yıkayın ve sütunun çıkış akışını atın.</li>
	<li>Kolonun üzerindeki ölü çözücü hacmi en aza indirildikten sonra (<100 μL) ancak çapraz bağlı dektran jelinin kurumasını önlemek için yeterli olduğunda musluğu kapatın.</li>
	<li>Yeni ekstrüde LUV'ları (sarı) sütuna yerleştirin ve çapraz bağlı dektran jeline girmelerine izin verin.</li>
	<li>LUV saflaştırmasını gerçekleştirmek için sütuna sürekli hepes arabelleği 2 ekleyin.</li>
	<li>Yaklaşık 2 mL HEPES tampon 2'yi boşaltın (çapraz bağlı dektran jelinin kurumasını önlemek için sütunun üst kısmını düzenli olarak doldurmayı unutmayın): serbest sarı ANTS ve DPX çözeltisi lipozomlardan daha yavaş göç eder.</li>
	<li>Saflaştırılmış LUV'ları tüplerde toplamaya başlayın (1,5 mL).</li>
	<li>Sütundan gelen yılan balığı damlalarını gözlemleyin ve opalescent olduklarında lipozomlar içerirler. LUV içeren fraksiyonu kurtarmak için tüpü değiştirin.</li>
	<li>Damlalar artık opalescent olmayana kadar elute (~1 mL). Daha sonra, ayrı bir kesirde 0,5 mL daha elute edin ve sonra kaçmayı bırakın. NOT: Standartlar artık LUV'ların elüasyon hacmini kalibre etmek için kitler veya bireysel moleküler ağırlıklar olarak çok çeşitli moleküler ağırlıklarda mevcuttur.</li>
	<li>Floresan boyasının ağartılmasını önlemek için tüpleri LÜV'lerle birlikte alüminyum folyoya sarın.</li>
	<li>Kolonu 20 mL HEPES tampon 2 ile yıkayın.</li>
	<li>SUV'ler daha sonra 4 °C'de bir hafta saklanabilir. NOT: LUV stabilitesi LUV konsantrasyonuna ve bileşimine ve iyonik mukavemete bağlı olabileceğinden, LUV'lerin boyutu dinamik bir ışık saçılma (DLS) cihazı kullanılarak kontrol edilmelidir (bkz. bölüm 4). LUV Boyutunun ve Homojenliğin Karakterizasyonu) her test öncesi.</li>
</ol>3. LUV konsantrasyonunun ölçülmesi
<ol><li>Kolin konsantrasyonunun değerlendirilmesini sağlayan fosfolipid nicelleştirme kiti ile LUV konsantrasyonunun tahmin edilmesi19. Bu test, polar kafa içeren kolin içeren fosfolipidler önemli olduğunda uygulanabilir (7'lerin% >50'si).</li>
	<li>Sağlanan 3 mL tamponda 18 mg kromojen substratını eriterek renk reaktifini hazırlayın.</li>
	<li>3 mL renkli reaktif ile 10 x 10 x 45 mm'lik bir polistiren cuvette yükleyin.</li>
	<li>Saf renk reaktifini boş koşul olarak kullanın (Boş). 20 μL LUV numunesi (Test) veya 20 μL bilinen kolin konsantrasyonu standart çözeltisi (Standart) ekleyin.</li>
	<li>İyice karıştırın ve 37 °C'de tüm koşullarda (Boş, Test ve Standart) 5 dakika kuluçkaya yatırarak kuluçkaya yatırarak.</li>
	<li>Test numunesinin ve standart çözümün emiciliğini (optik yoğunluk, OD) bir spektrofotometre ile 600 nm'de kontrol olarak boş çözelti ile ölçün.</li>
	<li>BILINEN konsantrasyon standardına kıyasla LUV'ların lipid konsantrasyonu olan C[LUV]'un kolin eşdeğerini tahmin etmeyi sağlayan OD değerlerini kontrol edin.</li>
	<li>Aşağıdaki denklemi kullanarak hesaplamayı gerçekleştirin: C[LUV] (mol / l) = (OD Örneği / OD Standardı) x C[Standart] (mol / l) NOT: Fosfolipid nicelleştirme kiti, C[Standart] = 3.87 mmol/L molar konsantrasyonuna karşılık gelen 54 mg/dL'de Kolin Klorür (139.6 mg/l) standart çözeltisi sağlamıştır.</li>
</ol>4. LUV boyutunun ve homojenliğinin karakterizasyonu
<ol><li>LUV boyutunu (nm cinsinden) ve çok disiplinlilik indeksini (PdI) belirlemek için bir DLS cihazı kullanarak ölçüm gerçekleştirin.</li>
	<li>Çözücü/tamponun ve kullanılan cuvette'in viskozitesini belirterek uygun "standart çalışma prosedürünü" (SÇP) programlayın.</li>
	<li>LUV çözeltisinin 500 μL'sini bir polistiren yarı mikro cuvette yerleştirin.</li>
	<li>Polistiren yarı mikro cuvette'i bir DLS cihazına yerleştirin.</li>
	<li>Oda sıcaklığında, boyut dağılımını parçacık dağılımının ortalama büyüklüğü (Z-ortalama) ve homojenlik (polidisperlik indeksi, PdI) açısından ölçün.</li>
	<li>Tüm sonuçlar, her biri üç tekrarlayan döngüde gerçekleştirilen iki bağımsız ölçümden elde edilir. NOT: 0,149 ± 0,041 PDI ile 137 ± 7 nm ortalama boyutlarında olacaktır.</li>
</ol>5. Peptit çözeltileri hazırlama
<ol><li>Sızıntı tahlil için analiz edilmesi gereken peptitin bir stok çözeltisini hazırlayın.</li>
	<li>Peptit tozluğunu (%>95 saflıkta) saf suda çözün (örneğin, 500 μL saf suda 1 mg peptit). NOT: Peptitlerin saf suda seyreltilmeleri ve eserleri teşvik edebilecek dimetil sülfit (DMSO) çözünürlüğünden kaçınmanız önerilir (örneğin, membran permeabilizasyonu20).</li>
	<li>Vortex 5 s için peptit çözeltisi.</li>
	<li>Peptit çözeltisini bir su sonikasyon banyosunda 5 dakika ve daha sonra 12.225 x g'da5 dakika santrifüjde sonicate edin. Konsantrasyon tespiti için süpernatant toplayın.</li>
	<li>Emiciliği üç bağımsız peptit seyreltmenin 280 nm'sinde ölçün ve ardından molar yok olma katsayısı ε (peptit dizisindeki triptofan ve tirozin içeriğine bağlı olarak) ve Bira-Lambert kuralını kullanarak peptit konsantrasyonunu hesaplayın. NOT: Peptit triptofan ve tirozin içeriyorsa, molar yok olma katsayısı ε Triptofan ε = 5.690 M-1cm-1 ve Tirozin ε = 1.280 M-1cm-1temel alınarak hesaplanır. Peptit dizisi triptofan veya tirozin içermezse, konsantrasyonu ölçmek için başka kolorimetrik test yapılabilir (örneğin, BCA veya Bradford).</li>
	<li>Peptit çözeltisini saf suda 100 μM'lik nihai bir çözeltiye seyreltin ve 4 °C'de saklayın. NOT: Saf suda, 4 °C depolama sırasında peptit bozulması meydana gelmez. Bununla birlikte, su buharlaşmasının oluşmamasını sağlamak için peptit konsantrasyonu her 2 haftada bir ölçülmelidir.</li>
</ol>6. Floresan sızıntı tahlil
<ol><li>Floresan sızıntı tahlili oda sıcaklığında spektrofluorometre üzerinde ölçülür. Ekscitasyon ve emisyon dalga boyu sırasıyla Ex = 360 nm ± 3 nm ve Em = 530 nm ± 5 nm olarak sabitlenir.</li>
	<li>1 mL HEPES tampon 2'deki LUV'ları kuvars floresan cuvette 100 μM'lik son konsantrasyona seyreltin. Deney sırasında çözeltiyi homojenize etmek için manyetik bir karıştırıcı ekleyin.</li>
	<li>Arka plan floresanlarına erişmek için luv'ları ilk 100 s boyunca t = 0 s ve t = 99 s arasında tek başına ölçün. NOT: Arka plan floresan ve potansiyel sızıntılara erişmek için tüm deney sırasında (15 dk) tek başına LUV'lar da ölçülebilir.</li>
	<li>Bundan sonra, sızıntıyı, sonraki 900 s (15 dk) için peptit çözeltisinin aliquotlarının eklenmesi üzerine floresan yoğunluğunda bir artış olarak ölçün. Bu protokol, 0,1 μM ila 2,5 μM arasında test edilen her peptit konsantrasyonu için gerçekleştirilir.</li>
	<li>Son olarak, 1 μL Triton X-100 (%0,1, v/v) eklenerek LUV'ların çözünmesiyle %100 floresan elde edildi ve bu da t = 1.000 s ile t = 1.100 s arasında tamamen söndürülmemiş prob ile sonuçlandı.</li>
</ol>7. Sızıntının nicelleştirilmesi
<ol><li>Test edilen her koşul için aynı sayıda noktayı korumak için t = 1.090 sn'den sonra elde edilen değerleri bastırın.</li>
	<li>T = 0 s ve t = 49 s (yalnızca LUV'lar) arasında ortalama 50 puan yaparak minimum floresan, Fdk'yı hesaplayın.</li>
	<li>T = 1.041 s ve t = 1.090 s (Triton X-100 ile LUV'lar) arasında ortalama 50 puan yaparak maksimum floresan, Fmaks.</li>
	<li>Aşağıdaki denkleme göre, her zaman noktasında (t = x) sızıntı yüzdesini (%Sızıntı) hesaplayın: %Sızıntı(t=x) = (F(t=x) - Fdk) / (Fmaks . - Fdk) x 100</li>
	<li>Aynı koşul için farklı LUV hazırlığı (n ≥ 2) ile elde edilen değerler için ortalama ve standart sapmayı hesaplayın.</li>
	<li>%Leak(t=x)sızıntı yüzdesini zaman (lar) işlevinde çizin.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Langel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Cell-Penetrating Peptides. , (2006).</li><li>Deshayes, S., Morris, M. C., Divita, G., Heitz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-penetrating+peptides:+tools+for+intracellular+delivery+of+therapeutics.">Cell-penetrating peptides: tools for intracellular delivery of therapeutics.</a> Cellular and Molecular Life Sciences CMLS. 62 (16), 1839-1849 (2005).</li><li>Richard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-penetrating+peptides.+A+reevaluation+of+the+mechanism+of+cellular+uptake.">Cell-penetrating peptides. A reevaluation of the mechanism of cellular uptake.</a> The Journal of Biological Chemistry. , (2003).</li><li>Jones, A., Sayers, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+entry+of+cell+penetrating+peptides:+tales+of+tails+wagging+dogs.">Cell entry of cell penetrating peptides: tales of tails wagging dogs.</a> Journal of Controlled Release Official Journal of the Controlled Release Society. , (2012).</li><li>T&#252;nnemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+analysis+of+cell+penetration+ability+and+toxicity+of+oligo-arginines.">Live-cell analysis of cell penetration ability and toxicity of oligo-arginines.</a> Journal of Peptide Science. 14 (4), 469-476 (2008).</li><li>Jiao, C. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+and+endocytosis+for+cell-penetrating+peptide+internalization.">Translocation and endocytosis for cell-penetrating peptide internalization.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (49), 33957-33965 (2009).</li><li>Deshayes, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+internalization+mechanism+of+WRAP:siRNA+nanoparticles.">Deciphering the internalization mechanism of WRAP:siRNA nanoparticles.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. Biomembranes. 1862 (6), 183252 (2020).</li><li>Konate, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimisation+of+vectorisation+property:+A+comparative+study+for+a+secondary+amphipathic+peptide.">Optimisation of vectorisation property: A comparative study for a secondary amphipathic peptide.</a> International Journal of Pharmaceutics. 509 (1-2), 71-84 (2016).</li><li>Lehto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+trafficking+determines+the+exon+skipping+activity+of+Pip6a-PMO+in+mdx+skeletal+and+cardiac+muscle+cells.">Cellular trafficking determines the exon skipping activity of Pip6a-PMO in mdx skeletal and cardiac muscle cells.</a> Nucleic Acids Research. 42 (5), 3207-3217 (2014).</li><li>Hoyer, J., Neundorf, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+vectors+for+the+nonviral+delivery+of+nucleic+acids.">Peptide vectors for the nonviral delivery of nucleic acids.</a> Accounts of Chemical Research. 45 (7), 1048-1056 (2012).</li><li>Milletti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-penetrating+peptides:+classes,+origin,+and+current+landscape.">Cell-penetrating peptides: classes, origin, and current landscape.</a> Drug Discovery Today. 17 (15-16), 850-860 (2012).</li><li>Mueller, J., Kretzschmar, I., Volkmer, R., Boisguerin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+cellular+uptake+using+22+CPPs+in+4+different+cell+lines.">Comparison of cellular uptake using 22 CPPs in 4 different cell lines.</a> Bioconjugate Chemistry. 19 (12), 2363-2374 (2008).</li><li>Ramaker, K., Henkel, M., Krause, T., R&#246;ckendorf, N., Frey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+penetrating+peptides:+a+comparative+transport+analysis+for+474+sequence+motifs.">Cell penetrating peptides: a comparative transport analysis for 474 sequence motifs.</a> Drug Delivery. 25 (1), 928-937 (2018).</li><li>Maget-Dana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+monolayer+technique:+a+potent+tool+for+studying+the+interfacial+properties+of+antimicrobial+and+membrane-lytic+peptides+and+their+interactions+with+lipid+membranes.">The monolayer technique: a potent tool for studying the interfacial properties of antimicrobial and membrane-lytic peptides and their interactions with lipid membranes.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1462 (1-2), 109-140 (1999).</li><li>Alves, A. C., Ribeiro, D., Nunes, C., Reis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysics+in+cancer:+The+relevance+of+drug-membrane+interaction+studies.">Biophysics in cancer: The relevance of drug-membrane interaction studies.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1858 (9), 2231-2244 (2016).</li><li>Konate, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide-based+nanoparticles+to+rapidly+and+efficiently+"Wrap+'n+Roll"+siRNA+into+cells.">Peptide-based nanoparticles to rapidly and efficiently "Wrap 'n Roll" siRNA into cells.</a> Bioconjugate Chemistry. 30 (3), 592-603 (2019).</li><li>Seisel, Q., Pelletier, F., Deshayes, S., Boisguerin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+evaluate+the+cellular+uptake+of+CPPs+with+fluorescence+techniques:+Dissecting+methodological+pitfalls+associated+to+tryptophan-rich+peptides.">How to evaluate the cellular uptake of CPPs with fluorescence techniques: Dissecting methodological pitfalls associated to tryptophan-rich peptides.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. Biomembranes. 1861 (9), 1533-1545 (2019).</li><li>Derossi, D., Joliot, A. H., Chassaing, G., Prochiantz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+third+helix+of+the+Antennapedia+homeodomain+translocates+through+biological+membranes.">The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (14), 10444-10450 (1994).</li><li>Takayama, M., Itoh, S., Nagasaki, T., Tanimizu, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+enzymatic+method+for+determination+of+serum+choline-containing+phospholipids.">A new enzymatic method for determination of serum choline-containing phospholipids.</a> Clinica Chimica Acta; International Journal of Clinical Chemistry. 79 (1), 93-98 (1977).</li><li>Notman, R., Noro, M., O'Malley, B., Anwar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+for+Dimethylsulfoxide+(DMSO)+action+on+lipid+membranes.">Molecular basis for Dimethylsulfoxide (DMSO) action on lipid membranes.</a> Journal of the American Chemical Society. 128 (43), 13982-13983 (2006).</li><li>Konate, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insight+into+the+cellular+uptake+mechanism+of+a+secondary+amphipathic+cell-penetrating+peptide+for+siRNA+delivery.">Insight into the cellular uptake mechanism of a secondary amphipathic cell-penetrating peptide for siRNA delivery.</a> Biochemistry. 49 (16), 3393-3402 (2010).</li><li>Vaissi&#232;re, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+retro-inverso+cell-penetrating+peptide+for+siRNA+delivery.">A retro-inverso cell-penetrating peptide for siRNA delivery.</a> Journal of Nanobiotechnology. 15 (1), 34 (2017).</li><li>Eir&#237;ksd&#243;ttir, E., Konate, K., Langel, &. #. 2. 2. 0. ;., Divita, G., Deshayes, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secondary+structure+of+cell-penetrating+peptides+controls+membrane+interaction+and+insertion.">Secondary structure of cell-penetrating peptides controls membrane interaction and insertion.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1798 (6), 1119-1128 (2010).</li><li>Ziegler, A., Li Blatter, X., Seelig, A., Seelig, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+transduction+domains+of+HIV-1+and+SIV+TAT+interact+with+charged+lipid+vesicles.+Binding+mechanism+and+thermodynamic+analysis.">Protein transduction domains of HIV-1 and SIV TAT interact with charged lipid vesicles. Binding mechanism and thermodynamic analysis.</a> Biochemistry. 42 (30), 9185-9194 (2003).</li><li>Thor&#233;n, P. E. G., Persson, D., Karlsson, M., Nord&#233;n, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Antennapedia+peptide+penetratin+translocates+across+lipid+bilayers+-+the+first+direct+observation.">The Antennapedia peptide penetratin translocates across lipid bilayers - the first direct observation.</a> FEBS Letters. 482 (3), 265-268 (2000).</li><li>Mishra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+HIV+TAT+peptide+and+analogues+induced+by+multiplexed+membrane+and+cytoskeletal+interactions.">Translocation of HIV TAT peptide and analogues induced by multiplexed membrane and cytoskeletal interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (41), 16883-16888 (2011).</li><li>Rouser, G., Fleischer, S., Yamamoto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+dimensional+thin+layer+chromatographic+separation+of+polar+lipids+and+determination+of+phospholipids+by+phosphorus+analysis+of+spots.">Two dimensional thin layer chromatographic separation of polar lipids and determination of phospholipids by phosphorus analysis of spots.</a> Lipids. 5 (5), 494-496 (1970).</li><li>Bartlett, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorus+assay+in+column+chromatography.">Phosphorus assay in column chromatography.</a> Journal of Biological Chemistry. 234 (3), 466-468 (1959).</li><li>Stewart, J. C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+determination+of+phospholipids+with+ammonium+ferrothiocyanate.">Colorimetric determination of phospholipids with ammonium ferrothiocyanate.</a> Analytical Biochemistry. 104 (1), 10-14 (1980).</li><li>Spinella, S. A., Nelson, R. B., Elmore, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+peptide+translocation+into+large+unilamellar+vesicles.">Measuring peptide translocation into large unilamellar vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3571 (2012).</li><li>Wimley, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+effects+of+membrane-interacting+peptides+on+membrane+integrity.">Determining the effects of membrane-interacting peptides on membrane integrity.</a> Cell-Penetrating Peptides. 1324, 89-106 (2015).</li><li>B&#225;r&#225;ny-Wallje, E., Gaur, J., Lundberg, P., Langel, U., Gr&#228;slund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+membrane+perturbation+caused+by+the+cell+penetrating+peptide+Tp10+depending+on+attached+cargo.">Differential membrane perturbation caused by the cell penetrating peptide Tp10 depending on attached cargo.</a> FEBS Letters. 581 (13), 2389-2393 (2007).</li><li>van Rooijen, B. D., Claessens, M. M. A. E., Subramaniam, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+permeabilization+by+oligomeric+&#945;-Synuclein:+in+search+of+the+mechanism.">Membrane permeabilization by oligomeric &#945;-Synuclein: in search of the mechanism.</a> PloS One. 5 (12), 14292 (2010).</li><li>Hassane, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+cellular+trafficking+of+splice+redirecting+oligonucleotides+complexed+with+chemically+modified+cell-penetrating+peptides.">Insights into the cellular trafficking of splice redirecting oligonucleotides complexed with chemically modified cell-penetrating peptides.</a> Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 153 (2), 163-172 (2011).</li><li>Asciolla, J. J., Renault, T. T., Chipuk, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examining+BCL-2+family+function+with+large+unilamellar+vesicles.">Examining BCL-2 family function with large unilamellar vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (68), e4291 (2012).</li><li>Grewer, C., Gameiro, A., Mager, T., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+characterization+of+membrane+transport+proteins.">Electrophysiological characterization of membrane transport proteins.</a> Annual Review of Biophysics. 42 (1), 95-120 (2013).</li></ol>

Yazarların çıkar çatışması yoktur.

Sunulan floresan sızıntı tahlili, hücreye nüfuz eden peptit ile membran dengesinin bozulmasını gidermek için basit ve hızlı bir yöntemdir. Yapması kolay, aynı zamanda farklı membran etkileşimi olan peptitler veya diğer membran etkileşimi molekülleri arasında dolaylı bir karşılaştırma sağlar. Protokolün kritik adımlarıyla ilgili olarak, bu test taban çizgisi (tek başına LUV'lar) ve maksimum floresan salınımı (Triton durumu) arasında göreceli değerler sağladığından, genellikle LUV'l...

Doksanlı yıllardaki keşiflerinden sonra, plazma membran 1,2aracılığıyla kargoların verimli bir hücresel teslimatını teşvik etmek için hücre nüfuz eden peptitler (CPP'ler) geliştirilmiştir. CPP'ler genellikle çok çeşitli kökenlere sahip, genellikle 8 ila 30 amino asit olan kısa peptitlerdir. İlk olarak "doğrudan translokasyon" taşıyıcıları olarak tanımlandılar, yani plazma zarını geçebildiler ve herhangi bir endositotik yoldan bağımsız olarak hücrelere bir yük aktarabildiler ne enerji gereksinimi ne de reseptör tutulumu. Bununla birlikte, daha fazla araştırma, bu ilk gözlemlerin esas olarak deneysel eser nedeniyle floresan aşırı tahmininden ve / veya metanol3kullanarak sabitleme protokollerinden geldiğini ortaya koydu. Günümüzde, CPP alımının, kargonun doğası, CPP ve kargo arasındaki kullanılanbağlantı,çalışılan hücre hattı vb.
CPP'ler, CPP ile kargosu 8 ,9,10,11arasında kimyasal bir bağlantı (kurevi strateji) veya elektrostatik/hidrofobik etkileşimler (kurda olmayan strateji) içeren iki stratejiye göre transfeksiyon ajanları olarak kullanılabilir. Her iki strateji de birkaç kargonun hücre transferinde verimliliklerini göstermiş olsa da, CPP'ler tarafından içselleştirme mekanizmasının anlaşılması hala tartışma altındadır ve endositoz yolları veya doğrudan penetrasyon arasındaki dengenin ölçülmesi hala zordur12,13. Endosit süreçlerin katılımını net bir şekilde ele almak için bir dizi deneysel araç ve strateji mevcut olsa da, plazma membran bileşenleriyle daha ayrı etkileşimler anlamına gelir, ancak doğrudan translokasyonun karakterize etmesi daha zor görünmektedir. Biyolojik membranlar genellikle fosfolipidlerden membran proteinlerine kadar hücresel tipe ve/veya ortama (stres koşulları, hücre bölünmesi vb.) göre değişebilen çok sayıda bileşenden oluşur. Bu kompozisyon çeşitliliği ve sonuç olarak evrensel bir hücresel membran modelinin bulunmaması çalışmaları tek bir şekilde etkinleştirmez. Bununla birlikte, bu sınırlamaları atlatmak için yapay membran veya membran özleri ile adım adım yaklaşımlar geliştirilmiştir. Küçük unilamellar vesicles monolayer yaklaşımlara kadar, her model açıkça belirli soruları cevaplamak için uygundu14,15. Bunlar arasında, büyük unilameller vesicles (LUVs), peptit / membran etkileşimlerini içselleştirme sürecinde önemli bir nokta olarak incelemek için uygun bir membran taklit modeli oluşturur.
Bu bağlamda, aşağıdaki protokolde hem aniyonik bir floresan boyanın hem de lipozomlarda kapsüllenmiş karşılık gelen poli-katyonik quencher'in izlenmesi yoluyla peptitlerin ve peptit/membran etkileşimlerinin LUVs bütünlüğü üzerindeki etkilerinin araştırılması açıklanmaktadır. Bu araç, doğrudan membran translokasyonu yapıp yapamayacaklarını anlamak için CPP / membran etkileşimlerini incelemek için kullanılır. Genellikle farklı membran etkileşimli peptitleri karşılaştırmak için uygulansa da, bu LUV floresan sızıntı tahlili hem CPP-kargo konjugelerini (kurcalama stratejisi) hem de CPP:cargo komplekslerini (kurvalent olmayan strateji) araştırmak için de kullanılabilir.
Bu nedenle mevcut protokol ilk olarak yakın zamanda geliştirilen triptofan (W) ve arginin (R)- zengin Amfipatik Peptitler (WRAP)16ile örneklenecektir. WRAP, birkaç hücre hattında hızlı ve verimli bir şekilde küçük müdahale RNA 'sı (siRNA) sunmak için peptit bazlı nanopartiküller oluşturabilir16. Wrap peptidinin floresan sızıntı özellikleri tek başına veya siRNA yüklü WRAP bazlı nanopartiküller hücresel içselleştirme mekanizmalarını karakterize etmek için izlendi. İçselleştirme mekanizmalarının esas olarak doğrudan translokasyon içerdiğini gösterdik7. İkinci bir örnekte, WRAP peptidi protein/proteine müdahale eden peptit iCAL36 (WRAP-iCAL36)17'ye eş zamanlı olarak konjuge edildi ve membranların dengesini bozma yeteneği, başka bir CPP olan Penetratin18 (Penetratin-iCAL36) ile birleştirilen iCAL36'ya floresan sızıntısı testinde karşılaştırıldı.
Son olarak, yöntemin avantajları ve sınırlamaları hem teknolojik açıdan hem de biyolojik alaka açısından tartışılacaktır.

<table><tbody><tr><td>25 mL glass round-bottom flask</td><td>Pyrex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8-aminonaphthalene-1, 3, 6-trisulfonic acid, disodium salt (ANTS)</td><td>Invitrogen</td><td>A350</td><td>Protect from light&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Chloroform&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>288306</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>DOPC (dioleoylphosphatidylcholine)</td><td>Avanti Polar</td><td>850375P</td><td>Protect from air</td></tr><tr><td>Extruder</td><td>Avanti Polar</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>Fluorimeter</td><td>PTI Serlabo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 &amp;micro;L glass syringe</td><td>Hamilton</td><td>705N</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>LabAssay Phospholipid&amp;nbsp;</td><td>WAKO&amp;nbsp;</td><td>296-63801</td><td></td></tr><tr><td>liquid chromatography column</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Carlo Erba</td><td>414902</td><td></td></tr><tr><td>Nuclepore polycarbonate membrane (0.1 &amp;micro;m pore size, 25 mm diameter)</td><td>Whatman</td><td>800309</td><td></td></tr><tr><td>polystyrene cuvette, 10 x 10 x 45 mm</td><td>Grener Bio-One</td><td>614101</td><td></td></tr><tr><td>polystyrene semi-micro cuvette, DLS</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB55924</td><td></td></tr><tr><td>p-xylene-bispyridinium bromide (DPX)</td><td>Invitrogen</td><td>X1525</td><td>Protect from light&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>quartz fluorescence cuvette</td><td>Hellma</td><td>109.004F-QS</td><td></td></tr><tr><td>rotavapor system&amp;nbsp;</td><td>Heidolph</td><td>Z334898</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-50 resin</td><td>Amersham</td><td>17-0042-01</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide (NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chlorid (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator bath USC300T</td><td>VWR</td><td>142-6001</td><td></td></tr><tr><td>Sphingomyelin</td><td>Avanti Polar</td><td>860062P</td><td>Protect from air</td></tr><tr><td>Triton X-100&amp;nbsp;</td><td>Eromedex</td><td>2000-B</td><td></td></tr><tr><td>Zetaziser NanoZS&amp;nbsp;</td><td>Malvern</td><td>ZEN3500</td><td></td></tr></tbody></table>

fluorescent leakage assay to investigate membrane destabilization by cell-penetrating peptide

Hücreye nüfuz eden peptitler (CPP'ler), plazma zarını geçebilen ve bir kargoyu hücrelere aktarabilen taşıyıcılar olarak tanımlanır. Bu aktivite için gerekli olan temel ortak özelliklerden biri, CPP'lerin plazma membranı (lipitler) ve daha çok membranın hücre dışı matrisinin bileşenleri (heparan sülfat) ile etkileşimlerinden kaynaklanandır. Nitekim, doğrudan translokasyon veya endositoza bağımlı içselleştirmeden bağımsız olarak, lipid bilayerleri hem plazma zarı seviyesinde hem de hücre içi trafik (endosomal veziküller) düzeyinde içselleştirme sürecine dahil olurlar. Bu yazıda, olası CPP-membran dengesizliğini/etkileşimini tespit etmek ve içselleştirme mekanizmasındaki rollerini ele almak için floresan sızıntı testinde büyük bir unilamellar veziküllerin (LUV' ler) formülasyonu, saflaştırılması, karakterizasyonu ve uygulamasının farklı adımlarını açıklayan ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Plazma membran içeriğini yansıtan lipid bileşimine sahip LUV'lar, hem floresan boyayı hem de bir quencher'ı kapsüllemek için üretilir. Ekstravesiküler ortamda peptitlerin eklenmesi ve OV'ler üzerinde peptit-membran etkileşimlerinin indüksiyonu, böylece bir sızıntıyı ortaya çıkaran floresanlarda doza bağlı bir şekilde önemli bir artışa neden olabilir. Örnekler burada, çeşitli hücre hatlarında hızlı ve verimli bir siRNA teslimatı gösteren yakın zamanda geliştirilen triptofan (W) ve arginin (R) zengin Amfipatik Peptitler (WRAP'ler) ile sağlanmaktadır. Son olarak, bu etkileşimlerin doğası ve lipitlere olan yakınlık, membran translokasyonunu ve/veya endosomal kaçışı anlamak ve iyileştirmek için tartışılır.

Floresan kaçak tahlili prensibi Şekil 1'de gösterilmiştir. Ayrıntılı olarak, floresan bir boyayı ve bir quencher'ı (floresan sinyali yok) kapsülleyen büyük unilameller vesicles (LUV'lar) ilgi çekici biyomolekül ile tedavi edilir. Peptidin lipid zarları ile etkileşimi nedeniyle, membran geçirgenliği, yeniden yapılanma ve hatta yırtılma anlamına gelebilir, floresan boyası ve quencher LUV'lardan salınır. Tampondaki sonraki seyreltmeler f...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Leakage Assay to Investigate Membrane Destabilization by Cell-Penetrating Peptide at JoVE.com

Fluorescent Leakage Assay to Investigate Membrane Destabilization by Cell-Penetrating Peptide

Floresan sızıntı tahlili, peptit/membran etkileşimlerinin araştırılmasını sağlayan basit bir yöntemdir, böylece çeşitli biyolojik süreçlere dahil olmaları ve özellikle hücre nüfuz eden peptitlerin doğrudan hücresel translokasyon işlemi sırasında fosfolipid bilayerleri rahatsız etme yeteneği.

Hücre Delici Peptit ile Membran Dengesizleşmesini Araştırmak için Floresan Sızıntı Tahlil

Cell-penetrating peptides (CPPs) are defined as carriers that are able to cross the plasma membrane and to transfer a cargo into cells. One of the main ...

fluorescent-leakage-assay-to-investigate-membrane-destabilization

Research

JoVE Journal

Biochemistry

6.2K Görüntüleme.  INSERM U1046 - CNRS UMR 9214 - University of Montpellier. Floresan sızıntı tahlili, peptit/membran etkileşimlerinin araştırılmasını sağlayan basit bir yöntemdir, böylece çeşitli biyolojik süreçlere dahil olmaları ve özellikle hücre nüfuz eden peptitlerin doğrudan hücresel translokasyon işlemi sırasında fosfolipid bilayerleri rahatsız etme yeteneği.

Video: Fluorescent Leakage Assay to Investigate Membrane Destabilization by Cell-Penetrating Peptide

Construction of Cyclic Cell-Penetrating Peptides for Enhanced Penetration of Biological Barriers

Cancer has been a grand challenge in global health. However, the complex tumor microenvironment generally limits the access of therapeutics to deeper tumor cells, leading to tumor recurrence. To conquer the limited penetration of biological barriers, cell-penetrating peptides (CPPs) have been discovered with excellent membrane translocation ability and have emerged as useful molecular transporters for delivering various cargoes into cells. However, conventional linear CPPs generally show compromised proteolytic stability, which limits their permeability across biological barriers. Thus, the development of novel molecular transporters that can penetrate biological barriers and exhibit enhanced proteolytic stability is highly desired to promote drug delivery efficiency in biomedical applications. We have previously synthesized a panel of short cyclic CPPs with aromatic crosslinks, which exhibited superior permeability in cancer cells and tissues compared to their linear counterparts. Here, a concise protocol is described for the synthesis of the fluorescently labeled cyclic polyarginine R8 peptide and its linear counterpart, as well as key steps for investigating their cell permeability.

This protocol describes the synthesis of cyclic cell-penetrating peptides with aromatic cross-links and the evaluation of their permeability across biological barriers.

Biyolojik Bariyerlerin Daha İyi Penetrasyonu için Siklik Hücre Nüfuz Eden Peptitlerin Yapımı

Cancer has been a grand challenge in global health. However, the complex tumor microenvironment generally limits the access of therapeutics to deeper ...

Kimya

Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope

Numerous pathophysiological insults can cause damage to cell membranes and, when coupled with innate defects in cell membrane repair or integrity, can result in disease. Understanding the underlying molecular mechanisms surrounding cell membrane repair is, therefore, an important objective to the development of novel therapeutic strategies for diseases associated with dysfunctional cell membrane dynamics. Many in vitro and in vivo studies aimed at understanding cell membrane resealing in various disease contexts utilize two-photon laser ablation as a standard for determining functional outcomes following experimental treatments. In this assay, cell membranes are subjected to wounding with a two-photon laser, which causes the cell membrane to rupture and fluorescent dye to infiltrate the cell. The intensity of fluorescence within the cell can then be monitored to quantify the cell's ability to reseal itself. There are several alternative methods for assessing cell membrane response to injury, as well as great variation in the two-photon laser wounding approach itself, therefore, a single, unified model of cell wounding would beneficially serve to decrease the variation between these methodologies. In this article, we outline a simple two-photon laser wounding protocol for assessing cell membrane repair in vitro in both healthy and dysferlinopathy patient fibroblast cells transfected with or without a full-length dysferlin plasmid.

Cell membrane wounding via two-photon laser is a widely used method for assessing membrane resealing ability and can be applied to multiple cell types. Here, we describe a protocol for in vitro live-imaging of membrane resealing in dysferlinopathy patient cells following two-photon laser ablation.

İki fotonlu lazer mikroskop kullanarak hücre zarı tamir tahlil

Numerous pathophysiological insults can cause damage to cell membranes and, when coupled with innate defects in cell membrane repair or integrity, can ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1. Many of these are referred to as cell-penetrating peptides, which are frequently noted for their potential as drug delivery vectors1-3. Moreover, there is increasing interest in antimicrobial peptides that operate via non-membrane lytic mechanisms4,5, particularly those that cross bacterial membranes without causing cell lysis and kill cells by interfering with intracellular processes6,7. In fact, authors have increasingly pointed out the relationship between cell-penetrating and antimicrobial peptides1,8. A firm understanding of the process of membrane translocation and the relationship between peptide structure and its ability to translocate requires effective, reproducible assays for translocation. Several groups have proposed methods to measure translocation into large unilamellar lipid vesicles (LUVs)9-13. LUVs serve as useful models for bacterial and eukaryotic cell membranes and are frequently used in peptide fluorescent studies14,15. Here, we describe our application of the method first developed by Matsuzaki and co-workers to consider antimicrobial peptides, such as magainin and buforin II16,17. In addition to providing our protocol for this method, we also present a straightforward approach to data analysis that quantifies translocation ability using this assay. The advantages of this translocation assay compared to others are that it has the potential to provide information about the rate of membrane translocation and does not require the addition of a fluorescent label, which can alter peptide properties18, to tryptophan-containing peptides. Briefly, translocation ability into lipid vesicles is measured as a function of the Foster Resonance Energy Transfer (FRET) between native tryptophan residues and dansyl phosphatidylethanolamine when proteins are associated with the external LUV membrane (Figure 1). Cell-penetrating peptides are cleaved as they encounter uninhibited trypsin encapsulated with the LUVs, leading to disassociation from the LUV membrane and a drop in FRET signal. The drop in FRET signal observed for a translocating peptide is significantly greater than that observed for the same peptide when the LUVs contain both trypsin and trypsin inhibitor, or when a peptide that does not spontaneously cross lipid membranes is exposed to trypsin-containing LUVs. This change in fluorescence provides a direct quantification of peptide translocation over time.

This protocol details a method for the quantitative measure of peptide translocation into large unilamellar lipid vesicles. This method also provides information about the rate of membrane translocation and can be used to identify peptides that efficiently and spontaneously cross lipid bilayers.

Büyük Unilamellar Veziküller Ölçme Peptid Translokasyon

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1.  Many of these are referred ...

Biyoloji

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Membran proteinlerinin Yeşil floresan proteini temelli Ekspresyon elemesinde<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established for many membrane proteins. A simple technique called fluorescence protease protection (FPP) is presented, which permits the determination of membrane protein topology in living cells. This technique has numerous advantages over other methods for determining protein topology, in that it does not require the availability of multiple antibodies against various domains of the membrane protein, does not require large amounts of protein, and can be performed on living cells. The FPP method employs the spatially confined actions of proteases on the degradation of green fluorescent protein (GFP) tagged membrane proteins to determine their membrane topology and orientation. This simple approach is applicable to a wide variety of cell types, and can be used to determine membrane protein orientation in various subcellular organelles such as the mitochondria, Golgi, endoplasmic reticulum and components of the endosomal/recycling system. Membrane proteins, tagged on either the N-termini or C-termini with a GFP fusion, are expressed in a cell of interest, which is subject to selective permeabilization using the detergent digitonin. Digitonin has the ability to permeabilize the plasma membrane, while leaving intracellular organelles intact. GFP moieties exposed to the cytosol can be selectively degraded through the application of protease, whereas GFP moieties present in the lumen of organelles are protected from the protease and remain intact. The FPP assay is straightforward, and results can be obtained rapidly.

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP

Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP.

Floresan Proteaz Koruma Kullanma Membran Protein topolojisini belirlenmesi (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded proteins may serve as potential therapeutic targets. To distinguish degradation of misfolding-prone proteins from other mechanisms that regulate their levels, one important method is to measure protein half-life in cells. However, this can be challenging because misfolding-prone proteins may exist in different forms, including the native form and misfolded forms of distinct characteristics. Here we describe assays to examine the half-life of misfolded proteins in mammalian cells using a highly aggregation-prone protein, Ataxin-1 with an extended polyglutamine (polyQ) stretch, and a conformationally unstable luciferase mutant as models. Cycloheximide chase is combined with cell fractionation to examine the turnover rate of misfolding-prone proteins in various cellular fractions. We further depict a fluorescence-based assay using an enhanced green fluorescence protein (EGFP)-fusion of the luciferase mutant, which can be adapted for high throughput screening on a microplate-reader.

This report describes protocols for measuring degradation rates of misfolded proteins by either western blot or fluorescence-based assays. The methods can be applied to analysis of other misfolded proteins and for high throughput screening.

Hücreler yanlış katlanmış proteinlerle degradasyonundan Tahliller

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded ...

Utilizing pHluorin-tagged Receptors to Monitor Subcellular Localization and Trafficking

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular organelles and those localized on the plasma membrane. Traditional fluorescence-based measurements lack the capability to distinguish membrane proteins residing in different organelles. Cutting edge methodologies transcend traditional methods by coupling pH-sensitive fluorophores with total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). TIRF illumination excites the sample up to approximately 150 nm from the glass-sample interface, thus decreasing background, increasing the signal to noise ratio, and enhancing resolution. The excitation volume in TIRFM encompasses the plasma membrane and nearby organelles such as the peripheral ER. Superecliptic pHluorin (SEP) is a pH sensitive version of GFP. Genetically encoding SEP into the extracellular domain of a membrane protein of interest positions the fluorophore on the luminal side of the ER and in the extracellular region of the cell. SEP is fluorescent when the pH is greater than 6, but remains in an off state at lower pH values. Therefore, receptors tagged with SEP fluoresce when residing in the endoplasmic reticulum (ER) or upon insertion in the plasma membrane (PM) but not when confined to a trafficking vesicle or other organelles such as the Golgi. The extracellular pH can be adjusted to dictate the fluorescence of receptors on the plasma membrane. The difference in fluorescence between TIRF images at neutral and acidic extracellular pH for the same cell corresponds to a relative number of receptors on the plasma membrane. This allows a simultaneous measurement of intracellular and plasma membrane resident receptors. Single vesicle insertion events can also be measured when the extracellular pH is neutral, corresponding to a low pH trafficking vesicle fusing with the plasma membrane and transitioning into a fluorescent state. This versatile technique can be exploited to study localization, expression, and trafficking of membrane proteins.

Labeling the extracellular domain of a membrane protein with a pH sensitive fluorophore, superecliptic pHluorin (SEP), allows subcellular localization, expression, and trafficking to be determined. Imaging SEP-labeled proteins with total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) enables the quantification of protein levels in the peripheral ER and plasma membrane.

pHluorin etiketli Reseptör kullanarak Subselüler Yerelleşme ve Ticareti Monitör

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular ...

Fluorescence Microplate-Based Cycloheximide Chase Assay: A Technique to Monitor the Degradation Kinetics of Fluorescent Nuclear Misfolded Proteins

Source: Guo, L. et. al., <a href="https://app.jove.com/v/54266">Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells.</a> J. Vis. Exp. (2016)
This video describes an in vitro fluorescence-based microplate assay to study the degradation kinetics of a fluorescently-labeled misfolded luciferase mutant protein expressed in the nuclei of transfected mammalian cells. The assay involves the treatment of cells expressing the fluorescent mutant protein with a translation inhibitor and a proteasome inhibitor to assess the proteasome-mediated degradation of the misfolded protein.

Floresan Mikroplaka Bazlı Sikloheksimid Takip Testi: Floresan Nükleer Yanlış Katlanmış Proteinlerin Bozunma Kinetiğini İzlemek İçin Bir Teknik

Source: Guo, L. et. al., Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells. J. Vis. Exp. (2016)
This video describes an in vitro ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biyolojik Teknikler

Tahlil Teknikleri

Biyokimyasal analizler

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen the Proteolytic Activity of Proteases

Source: Jaimes, J. A., et al. <a href="https://app.jove.com/v/58892">A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video demonstrates an assay to screen for the proteolytic activity of proteases using fluorogenic peptides. The protease recognizes its cleavage site on the peptide, cleaving it and separating the quencher from the fluorophore, enabling its fluorescence emission. The fluorescence signal is detected and analyzed to check for the cleavage efficiency of different peptide variants.

Proteazların proteolitik aktivitesini taramak için bir florojenik peptit bölünme testi

1. Designing and Preparing the Peptides

	Acquire the sequence of the fusion protein of interest from a public database such as NCBI ...

İmmünoloji

İmmünodiyagnostik

Özelleşmiş Analizleri

Fluorescence Leakage Assay to Study Cell-Penetrating Peptide Interaction with Membrane

Source: Konate, K. et al. <a href="https://app.jove.com/v/62028">Fluorescent Leakage Assay to Investigate Membrane Destabilization by Cell-Penetrating Peptide.</a> J. Vis. Exp. (2020)
This video discusses the fluorescence leakage assay to study the interactions of cell-penetrating peptides with cell membranes using cell membrane mimics &#8212; large unilamellar vesicles, or LUVs, encapsulated with a fluorescent dye and a quencher.

Membran ile Hücreye Nüfuz Eden Peptit Etkileşimini İncelemek için Floresan Sızıntı Testi

Source: Konate, K. et al. Fluorescent Leakage Assay to Investigate Membrane Destabilization by Cell-Penetrating Peptide. J. Vis. Exp. (2020)
This video ...